ESTRS OXIDATIVO COMO POSIBLE CAUSANTE DE RETINOPATA EN RATAS EN DESARROLLO SOMETIDAS A HIPEROXIALUZ MARINA ROJAS, SOR MARIL SUREZ, MAIRN LEMUS, KATIUSKA BENTEZ, YLEANA RAMREZ, MAKERYS MITCHELL y ALPIDIO BOADA-SUCRE

557OCT 2004, VOL. 29 N 10l desarrollo de la red sangunea del ojo co- mienza desde la partecentral-posterior hacia la periferia yculmina justo antes de nacer el nio(Ben-Sira et al., 1988). Cuando el nio nace prematuro, la retina no ha comple-tado an su desarrollo y la periferia del ojo carece de vasos sanguneos. Por ra-zones desconocidas, una vez que el fetoes sacado del vientre de la madre y so- metido a regmenes de cuidados inten-sivos, la red sangunea del ojo detienesu crecimiento y se produce la Retino- pata del Prematuro (ROP; Silverman yFlynn, 1985).La ROP es una retinopa- ta proliferativa inducida por isquemiaque afecta nios prematuros de bajo peso(Mechoulam y Pierce, 2003). La ROP se inicia con un retardo en el crecimiento

vascular retiniano despus del nacimiento del prematuro (Smith, 2002) y se carac- teriza por dilatacin, proliferacin y tor- tuosidad vascular, edema y desprendi- miento retiniano, y conversin definitiva de la retina en una masa fibrosa que pue- de verse como una densa membrana re- trolental; habitualmente, el crecimiento del ojo se detiene y puede traer como consecuencia microftalmia y sobrevenir ceguera (Dorland, 1997).El nivel de antioxidan- tes en la retina inmadura es relativa- mente bajo, por lo que los radicales li- bres de O2 se acumulan en la retina de nios pretrminos y pueden jugar un papel importante en la patognesis de la ROP (Papp et al., 1999; Keys y Zim- merman, 1999).Los radicales libres son especies que contienen un nmero impar

de electrones, volvindose estos qumica- mente reactivos (Ashton, 1966; Riley y Slater, 1969; Slater y Riley, 1970). Daan el ADN mitocondrial y tambin atacan a las protenas, transformndolas y destru- yendo las membranas celulares (Collins,1996). La formacin de radicales libres est probablemente influenciada tanto por altos niveles de O2 arterial, como por la presin parcial de CO2, pH, luz brillante y la baja disponibilidad de varios antioxi- dantes en la retina inmadura (Ben-Sira et al., 1988).En la retinopata induci- da por el O2 (OIR), la hipoxia relativa que tiene lugar despus de los eventos hiperxicos podra inducir la formacin desorganizada de nuevos vasos sangu- neos (neovascularizacin), que son el origen de las consecuencias ms severas de estos desrdenes retinianos (Alon et

PALABRAS CLAVE / Estrs Oxidativo / Glutatin Reducido / Hiperoxia / Retinopata /

Recibido: 01/11/2003. Modificado: 31/03/2004. Aceptado: 19/08/2004.

Luz Marina Rojas. M.Sc. en Microscopa Electrnica Aplicada a las Ciencias Biomdicas, Universidad de Oriente (UDO), Venezuela. Ph.D. en Ciencias Biolgicas, Universidad de Montreal, Canada. Profesora, Insti- tuto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCA-UDO), Venezuela. Direccin: Universidad de Oriente, Ncleo de Sucre, IIBCA-UDO, Cerro del Medio, Cuman, C.P. 6101. Edo. Sucre, Venezuela. e-mail: lmarinarojas@hotmail.com

UDO, Venezuela.

Sor Maril Surez Jimnez. Licenciada en Bioanlisis, UDO, Venezuela. Pasante, IIBCA-

Mairn Lemus. M.Sc. En Contaminacin Ambiental, UDO, Venezuela. Ph.D. en CienciasBiolgicas, Universidad Simn Bolvar, Venezuela. Profesora, Escuela de Ciencias, UDO, Venezuela. e-mail:mlemus@sucre.udo.edu.ve

IIBCA-UDO, Venezuela.

Katiuska Jos Bentez Espinoza. Licenciada en Bioanlisis, UDO, Venezuela. Pasante,

Yleana Mara Ramrez Figueroa. Licenciada en Biologa, UDO, Venezuela. Pasante, IIBCA-UDO, Venezuela. e-mail: yleana@cantv.netMakerys Adriana Mitchel Cabello. Licenciada en Biologa, UDO, Venezuela. Profesora, UDO, Ncleo Anzotegui, Venezuela. e-mail: makerys@cantv.netAlpidio A. Boada-Sucre. Licenciado en Biologa, UDO, Venezuela. Profesor, UniversidadSimn Rodrguez, Venezuela. Estudiante de Doctorado, Universidad Central de Venezuela. e-mail: alboada@hotmail.comal., 1995; Nomura et al., 1995; Hber et al., 1996; Lutty y McLeod, 2003; Zhang et al., 2003).En la ROP, la exposicin de los vasos sanguneos retinianos a altos niveles de O2 parece conducir al cese de su crecimiento. Se ha postulado que el estado indiferenciado de los vasos produ- cidos, incluyendo la inadecuada capaci- dad para barrer los bioproductos txicos de O2, los vuelve a ellos mismos vulnera- bles a la hiperoxia (D'Amore, 1994; Lutty y McLeod, 2003).Existe una alta similitud entre las clulas de la retina humana y los glbulos rojos en lo que respecta a la estructura de su membrana (cadenas muy largas de cidos grasos poliinsaturados, susceptibles a la oxidacin), su meta- bolismo (alta demanda de glucosa y O2) y sus mecanismos antioxidantes (Puertas et al., 1993; De La Paz et al., 1996). Los glbulos rojos, aunque estn expues- tos frecuentemente a un estado de estrs oxidativo intracelular, se encuentran bien equipados para manejar esta condicin, a travs de las actividades combinadas de las enzimas superxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y el sistema de defensa dependiente del glutatin, por lo que son capaces de protegerse ellos mismos con- tra los productos derivados del O2 (Sri- vastava y Beutler, 1968; Stern, 1985; Winterbourn y Stern, 1987). Por consi- guiente, el estado oxidativo de los gl- bulos rojos puede ser usado como un n- dice biolgico del dao oxidativo re- tiniano (Prashar et al., 1993; Thornalley et al., 1996).Estudios in vivo e in vitro han demostrado que los eritrocitos de animales adultos pueden proteger otros tejidos contra el dao inducido por las especies reactivas de O2. La accin de la CAT y el sistema de reciclaje del glutatin son considerados el factor cla- ve de este mecanismo protectivo (Hef- fner y Repine, 1989).Papp et al. (1999) rea- lizaron un estudio con 50 pacientes de diferentes edades (6 semanas a 6 aos) que padecan de ROP para determinar el estado del glutatin en los glbulos rojos de dichos pacientes, y observaron una cada del glutatin reducido (GSH) junto con un aumento del glutatin oxidado (GSSG), dando as una alta relacin GSSG/GSH. Ello les permiti sealar que dicha relacin constituye un parmetro confiable de estrs oxi- dativo importante en estos pacientes. Segn Keys y Zimmerman (1999), el GSH protege los cidos grasos poliin- saturados de los segmentos externos de los bastones contra la peroxidacin lipdica.

El glutatin es el an- tioxidante intracelular ms importante; se encuentra presente principalmente en forma reducida (GSH) y a una concen- tracin mucho ms baja en su forma oxidada (GSSG; Srivastava y Beutler,1968). En condiciones normales existe una alta proporcin GSH/GSSG, necesa- ria para una proteccin celular efectiva (Cadenas y Davies, 2000). El agotamien- to del GSH conduce a muerte celular y ha sido documentado en muchas condi- ciones degenerativas; su estado intracelu- lar parece ser un indicador sensible de la salud general de las clulas y de su habilidad para resistir las demandas txi- cas (Parris, 1997).Trabajos recientes (La- chapelle et al., 1999; Dembinska et al.,2001; 2002; Bentez, 2003; Surez,2004) han demostrado que las ratasSprague-Dawley recin nacidas, expues- tas durante los primeros 14 das de vidaa un ambiente hiperxico desarrollananomalas retinianas. A nivel estructural estas anomalas se manifiestan como unadisminucin del grosor de la capa plex-iforme externa (CPE) y del nmero de clulas horizontales (NCH), y a nivelfuncional como una disminucin de laamplitud de la onda b del electroretino- grama (ERG) bajo condiciones escotpi-cas (ausencia de luz) y fotpicas (pre-sencia de luz). Dembinska et al. (2001), demostraron que existe una correlacinentre la duracin de la exposicin al O2 y la disminucin en la amplitud del ERG escotpico, as como en el decreci-miento del grosor de la CPE y el NCH. Dichos autores sealan que la severidad de los daos depende en gran parte delestado de madurez de la retina al mo-mento de comenzar la hiperoxia y de- muestran que el dao es mayor si la hi-peroxia comienza la segunda semana devida de la rata que si transcurre durante la primera semana.Bentez (2003) y Surez(2004), utilizando un modelo experimental muy similar al de Dembinska et al. (2001;2002), encontraron resultados anlogos alos de este grupo en lo que respecta a una disminucin dependiente del O2 en la am- plitud de la onda b del ERG escotpico, el grosor de la CPE y del NCH.Tomando en cuenta que la concentracin de GSH en sangre es un ndice apropiado de toxicidad por O2 en situaciones donde los prematuros son so- metidos a altas concentraciones de este gas, este estudio tuvo como objetivo eva- luar el efecto del estrs oxidativo sobre la ultraestructura retiniana y su relacin a los niveles de GSH en sangre de ratas Sprague-Dawley en desarrollo sometidas a hiperoxia.

Materiales y Mtodos

Para este estudio se uti- lizaron ratas Sprague-Dawley procedentes del Bioterio del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas (IVIC).

Induccin de la retinopata causada por hiperoxia

Las ratas recin nacidas fueron colocadas en incubadoras. Desde el da de su nacimiento, las ratas fueron expuestas diariamente a hiperoxia (801% O2) con tres interrupciones de 30 min al da, con 21% O2, segn el proto- colo sugerido por Lachapelle et al. (1999). El nivel de O2 en la incubadora fue mantenido a 80 1% utilizando un analizador de O2 (7820 O2 Monitoring System) el cual fue conectado a la incu- badora y calibrado diariamente.Los ejemplares tratados fueron sometidos a diferentes regmenes de hiperoxia, desde el da de su naci- miento al da 6, 9, 12 y 14 de vida, es decir, en los das 0-6, 0-9, 0-12 y 0-14. Despus de cada uno de estos perodos de hiperoxigenacin, algunas ratas fueron sacrificadas para la realizacin de los anlisis bioqumicos y otras se mantuvie- ron en un ambiente normxico (21% O2) hasta los 30 das de edad, para el estudio histolgico. Para evitar las complicacio- nes pulmonares que con frecuencia son reportadas en las ratas adultas expuestas a la hiperoxia (Lachapelle et al., 1999), las madres fueron alternadas cada da con las madres de los individuos controles. De esta manera, estos controles, los cua- les estaban en un ambiente normxico, reciban madres de las ratas expuestas al O2.

Determinacin de la concentracin de glutatin reducido (GSH)

Se estudiaron cinco ani- males por cada rgimen de hiperoxia. La determinacin de la concentracin de GSH fue llevada a cabo de acuerdo a la tcnica de Beutler et al. (1963), para lo cual se prepararon 2 soluciones:a) Solucin precipitante:1,67g de cido metafosfrico glacial (mezcla de HPO3 y NaPO3); 0,2g de EDTA y 30g de NaCl en 100ml de agua destilada.b) Reactivo DTNB: 5,5' dithiobis (2-cido nitrobenzoico) al 0,4% en buffer fosfato, pH 7,5.Se mezclaron 0,2ml de sangre con 1,8ml de agua destilada, se adicion 3ml de solucin precipitante, se dej en reposo por un tiempo de 5min y se filtr. Posteriormente a 2ml del filtra-

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Figura 1. Concentracin de GSH en gl- bulos rojos de ratas controles y sometidas a diferentes perodos de hiperoxia post- natal. ***: diferencias altamente significa-tivas (P0,05). Por el contrario, las ratas sometidas a hiperoxia de 0-14 das presentaron valores superiores al con- trol. El anlisis de varianza aplicado a es-precipitante diluida (2 a 3 partes de aguadestilada) y 1ml del reactivo DTNB. La densidad ptica fue medida a 412nm enun espectrofotmetro. La estandarizacindel mtodo se realiz con glutatin(GSH; Sigma).

Histologa de la retina y la coroides

Para los estudios histol- gicos se utilizaron cuatro animales por cada rgimen de hiperoxia. Inmediata- mente despus del sacrificio, por inhala- cin de gases de cloroformo, se coloc un punto de sutura en la parte nasal del ojo. El ojo fue enucleado y fijado com- pleto durante 1h en glutaraldehido 3%, en tampn fosfato 0,1mol a pH 7,4. Luego se hizo una incisin a nivel de la ora serrata y la retina, an inmersa en glutaraldehdo y pegada a la coroides, fue seccionada, seleccionndose para este es- tudio el sector central. Las muestras de retina fueron embebidas en Epn de acuerdo a la tcnica reportada por Rojas et al. (1997). Para el anlisis ultraestruc- tural, se hicieron cortes finos de 70nm que fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo.

concentracin de GSH en glbulos rojosde ratas controles y sometidas a diferen- tes perodos de hiperoxia post-natal, semuestran en la Figura 1. La concentra-cin de GSH en las ratas sometidas de 0-6 y de 0-9 das de hiperoxia fue visible- mente inferior a la del control. El anlisisde varianza aplicado a estos resultados mostr diferencias altamente significati-vas (P