estructura 3D carbohidratos · O HO HO HO OH O O OH HO H H H OH OH NOE H1’-H3’ NOE H1’-H3’...
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Metodologías para la determinación estructural de f ármacos y el estudio de fenómenos de reconocimiento molecular
Programa de doctorado en Química Médica
Estructura 3D de carbohidratos
Virus
Bacteria
GlicoproteinaCelula
Reconocimiento molecular y carbohidratos
Hormona
Enzima Anticuerpo
Toxina
Lectina
Orientación entre ellos dada por los
ángulos dihedros f, y (w) alrededor del
enlace glicosílico, distancias de átomos…
Conformaciones del ciclo (sillas)
La conformación de los carbohidratos
bote
semisilla
silla
Bote torcido
semisilla
· ·
Q
φ
θ
equator
pole
O 210º1S3
O270º
1S5
4C11C4
OO
θ = 0º
2SOBote torcido
O
O
OO
O
O
O
O O
O
O
O
φ = 0º
θ = 0ºθ = 90ºθ = 180º
30º
60º
90º
120º
150º
180º210º
240º
270º
300º
330º
OO
O
30º3S1
O 90º5S1
O
330ºOS2
θ = 180º
O
θ = 90º
Efectos anoméricos
O
H
OR. .
O
CH
OR-. .
+
Efecto anomérico
Efecto exo-anomérico. .
R
H1
C2O5
exo-antiexo
RH1
C2O5
no-exo
R
H1
C2O5
O
O
R
C2
O5 O
OR
O
O
R
Efecto exo-anomérico
Análisis conformacional de carbohidratos
Torsiones Glicosídicas φ, y Ψ
OH
OH
OH
OO OHO
HO
OH
OMeOH
φ ψ
-180-120-60 0 60 120180
φ
ψψ ψψ
-180-120-60 0 60 120 180-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
φφφφMapa probabilidad
φφφφ-180
-120
-60
0
60
120
180
ψψ ψψ
-180
-120
-60
0
60
120
180-180-120-60 0 60 120180
φ
ψψ ψψ
-180-120-60 0 60 120180-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
φφφφ120-180-120-60 0 60 180
180120600-60-120-180
Mapa rígido Mapa relajado
Torsión ω del grupo hidroximetilo
HHH
H
H
0.9 10.7 5.0
O
OR
HO
HO
HO H
ωωωωO
OR
HO
HO
HO H
ωωωωO
O
HO
HO
HO H
ωωωω
H6S
6R
6S
H6R
6SH6R
OOO
R
O -H
OO -H
H-
H5,H6R3J
gg (ω ≅−60º) gt (ω ≅ 60º) tg (ω ≅180º)
0.9 10.7 5.0
2.8 3.1 10.7
H5,H6R
H5,H6SJ3
Torsiones de los hidroxilos secundarios
O R
OH
OO
OH
OH
OH
RO
H
H
OO
HO
O
H
O
Oc r
Mecánica y Dinámica Molecular con MM3*
mapa de
16 configuraciones iniciales mapa adiabático
16 mapasrelajados
gtggccgtggcrgtggrcgtggrr
tgggcctgggcrtgggrctgggrr
gtgtccgtgtcrgtgtrcgtgtrr
tggtcctggtcrtggtrctggtrr
6400 estructuras
Constante Dieléctrica: 1, 80
Modelo de disolvente H2O, GB/SA
Simulaciones de MD
mapa de probabilidad6400 estructuras
Rayos-X
Desplazamientos químicos
Pocos cristalizan bien y pocas estructuras se han
resuelto
Se pierde la información dinámica
Técnicas para obtener datos experimentales
RMN
Desplazamientos químicos
Cosntantes de acoplamiento escalar (J)
NOEs
Residual dipolar couplings RDC
Relajación cruzada
Espectros 1D
Experimentos J-resueltos: HSQC
oriented
H1-C1 Gal
ppm (f1)4.004.104.204.304.404.504.604.704.80
H1-C1 Glcββββ
90.0
95.0
100.0
1D - tracest2 coupled HSQC
O
O
O
HO
HO
OHOH
OH
OHOH
OH
13C
t1 coupled CT-CE-HSQC
orientedD2O
D2Oppm (f1)
4.404.504.604.704.80
ppm (f2)4.505.00
90.0
95.0
100.0
ppm (f1)
ppm (f2)4.505.00
ppm (f1)
ppm (f1)5.005.105.205.305.40
Gal 1
Glc 1ββββGlc 1ααααH1-C1 Glcαααα
orientedD2O
1H
13C
1HTolman et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1416-1424
Aproximación basada en pares de spines aislados (ISPA)
Experimentos:
•COSY, TOCSY, HSQC
•NOESY, ROESY
O
HOHO
HO
OH
OO
OHHO
HH H
OH
OH
Distancia fija Depende de φ/ψφ/ψφ/ψφ/ψ
NOE H1’-H4
NOE H1’-H3’=
r-6H1’-H4
r-6H1’-H3’
H1’ H4 H3’
O
HOHO
HO
OH
OO
OHHO
HH H
OH
OH
NOE H1’-H3’ NOE H1’-H3’0 250 500 750 1000 1250 1500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
NO
E(%
)
Aproximación basada en un par de spines aislado (ISPA)
0 250 500 750 1000 1250 1500
mixing time (ms)
f(t)= P0 (1-eP2t) (1-eP1t)
M (0)= P0*P1
M H1’-H4
M H1’-H3’=
r-6H1’-H4
r-6H1’-H3’
εεεε =1
εεεε =80
MM3*
zz
ψ ψ
2'2'--44
-180 -120 -60 0 60 120 180
0
60
120
180
0
60
120
180
φ
180120600-60-120-180
0
60
120
180
0
60
120
180
ψ
0
ψ
-180-120-60 0 60 120 180φ
ψ
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180-120 -60 0 60 120 180
-180-120-60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180
ψ
1’
4
1’3
SYN φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 60º / 0º
1'1'--44 εεεε =80
H2O
zz
ψ
2'2'--44
1'1'--33-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
-180
-120
-60
0
60-180-120 -60 0 120 180φ
-180
-120
-60
0
60
120
180
ψ
-180
-120
-60
0
60
120
180
ψ
-180
-120
-60
0
60
120
180
φ-180-120 -60 0 60 120 180
-180-120 -60 0 60 120 180
φφ120-180-120 -60 0 60 180
-180
-120
-60
0
-180
-120
-60
0ψ
-180
-120
-60
0
60
120
180-180-120 -60 0 60 120 180
ANTI φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 60º / 180º
G-G φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 180º / 0º
2’
4
1'1'--44
Consecuencias de la flexibilidad de oligosacáridos
H H
A BNOE AB = f (r -6
AB )
H H
A B
NOE AB = f ( <r -6AB> )
rAB
A B
H H
Proceso de intercambio Conformación “virtual” de alta energía
RO
OHNH2O
O
R
H2N
OH
OH
HH
H2.7-3.0 A
2.5 A
φ/ψ 0/φ/ψ 0/φ/ψ 0/φ/ψ 0/−−−−60606060
E (Kcal/mol)
Conformación “virtual”
de alta energía
-150-100
-500
50100
150 -180
-120
-60
0
60
120
180
250
300
350
d14=2.3A
d15=2.5A
E (Kcal/mol)
17%
83%
Simulación de NOE: programa NOEPROM
• NOE estacionario, 2D NOESY y 2D ROESY
• Equilibrio conformacional
• Simulación simultánea de toda la red de protones
• Flexibilidad: modelos dinámicos
Características:
DistanciasDistanciasmodelo/smodelo/s
Matriz de Matriz de relajaciónrelajación
Intensidades NOEIntensidades NOE
180120600-60-120-180
O H
O H O H
O
OO
H OH O
O H
O Me
O H
φφφφ ψψψψ1
Gal Glc
Simulación de NOE: programa NOEPROM
φφφφ120-180-120 -60 0 60 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180
-120
-60
0
60
120
180
ψψ ψψ% NOE% NOE
Intensidad NOE ( % )
Gal
OH
OH OH
OO
OH OH O
OH
OMe
OH
Glc
1’2’
3’
4’
5’
6’
4
1
2
3
5
6
1
Comparación con los datos de RMN
Intensidad NOE ( % )Pareja deprotones
EXP.EXP.500MHz500MHz
MM3-1 MM3-80 MM3-H 2O MM3-80MD
MM3-H 2OMD
AM1
H-1’/H-2’ 6.5 6.4 6.6 6.5 6.6 6.7 5.7H-1’/H-3’ 9.1 8.4 7.6 8.0 8.2 7.7 8.0H-1’/H-4’ -2.3 -1.8 -1.7 -1.8 -1.7 -1.8 -1.5H-1’/H-5’ 10.0 10.9 11.2 10.8 10.9 11.0 8.0H-1’/H-3 3.53.5 0.2 1.51.5 0.0 -0.2 1.11.1 9.29.2H-1’/H-4 12.712.7 17.0 15.215.2 17.8 17.8 12.912.9 10.710.7H-1’/H-5 -- -0.1 0.0 -0.1 -0.3 -0.1 1.9H-1’/H-6R 1.0 0.5 0.8 1.3 -0.4 0.3 1.6H-1’/H-6S 1.0 0.2 1.9 -0.2 1.0 2.0 0.5
Resumen de la determinación estructural en disolución con RMN
NOE Desplazamientos(proteinas)Estructura localizada
de ~1.8 a 4.5 Å
HN, Hα y CαCorrelacionados con estructura
secundaria
Restricciones
de distancia
Restricciones de desplazamiento
1 - 3 enlaces
Acoplamientos
1.8 < dOH < 2.0 Å
Enlaces de H
O
HN
2.7 < d < 3.0 Å
Corr. cruzada
ΓΓΓΓIM,IS
csa,d
d
S
I
Residual dipolar couplings (RDC)
Estructuras con largas distancias
Orientación de un fragmento “rigido” En relación al campo magnético
1 - 3 enlaces
Sin límite de distancia entre fragmentos
Estructura localizada Estructura con larga distancia
Restricciones de ángulos
Restricciones de distancia
O2.7 < dON < 3.0 Å
Restricciones de ángulos
2 - 3 enlaces M
En RMN de líquidos se promedia a 0Aunque se observa como NOE
Acoplamientos dipolares ∝∝∝∝ < 3 cos2 θ θ θ θ –1 1 1 1 >>>> / / / / < < < < r 3333 >>>>B
0
θθθθ
Acoplamientos dipolares
En sólidos estáticos causa desdoblamiento
En sólidos con MAS (Magic spinning angle) se promedia a 0
Or
H
C
Alineamiento al azar Cristal líquido
Bo Bo
DMPC DHPC+
Bicela
Acoplamientos residuales dipolares (RDC)
H O
OH
O
H O
O H
Reordenamiento isotrópicoNo RDC
Reorientación anisotrópicaRDC
Típicos medios
Bicelas DMPC : DHPC
Bicelas CHAPSO:DMPC
CPCl : Hexanol : Brine
Fagos de bacterias
Suspensión de V2O5…..…..
H O
OH
O
H O
O H
acoplamiento: J (escalar) desdoblamiento: J + D