UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

“ESTUDIO DE LA DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE

LA ENZIMA METIONINA SULFÓXIDO REDUCTASA DE

Caenorhabditis elegans”

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área especializada de Biotecnología y Bioquímica de proteínas, y memoria para optar al título de

Bioquímica por:

CARLA PAULINA TRIGO ÁLVAREZ

Director de tesis

Dra. Rebeca Aldunate Malgalhes

Santiago 2010

II

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE MAGÍSTER

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas que la tesis de Magíster presentada por la candidata:

CARLA PAULINA TRIGO ÁLVAREZ

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado

de Magister en Bioquímica, área de especialización de Biotecnología y Bioquímica de

proteínas y al título de Bioquímica, en el examen de defensa rendido el día 17 de Marzo

del año 2010.

Director de Tesis

Dra. Rebeca Aladunate M. ------------------------------------------------

Comisión Informante de Tesis

Dra. Inés Contreras -----------------------------------------------

Dra. Ana María Kettlún -----------------------------------------------

Dra. Virginia Fernández -----------------------------------------------

III

LUGAR DE DESARROLLO DE TESIS:

Laboratorio de Nutrición Molecular.

Depto. de Biología Celular y Molecular.

Facultad de Ciencias Biológicas.

Pontificia Universidad Católica de Chile.

Escuela de Biotecnología

Universidad Santo Tomás

FINANCIAMIENTO:

Proyecto Fondecyt nº11060285.

COLABORADORES

Dr. Sergio Lobos

Dra. Alicia Minniti

IV

Este trabajo más que el cierre de un ciclo

es el comienzo de un nuevo paso en mi vida…

…pasa el tiempo y crece de nuevo

se hace grande y otra vez vuela

vuela al vertiginoso impulso del remonte y,

nuevamente, patrón de la bandada,

callejea por la inmensidad azul…

V

AGRADECIMIENTOS

A todos los miembros del Laboratorio de Nutrición molecular por apoyarme con gran

paciencia en mi trabajo estos años partiendo por el Dr. Federico Leighton quien

siempre demostró una especial preocupación por mi, a mis compañeros de laboratorio:

Luis, Pablo, Carlos y Druso. Agradezco a todos ellos que siempre estuvieron

dispuestos a ayudarme.

Agradecimientos a Rebeca Aldunate, directora de este trabajo, quien me recibió, me

entregó herramientas y enseño a enfrentar aquellos obstáculos que la ciencia nos

impone y desarrollar mi temple ante la adversidad, a Alicia Minniti y Dr. Sergio Lobos,

por su colaboración y siempre buena disposición.

Agradezco a mis esforzados padres, quienes siempre han estado apoyándome en

cualquiera sea el proyecto en el que me encamine, han sido y seguirán siendo el pilar

fundamental para no dejarme vencer y constantemente buscar metas más altas sin

importar lo difícil que sea llegar a ellas… Un simple gracias para ellos, se queda corto.

A mis hermanos Omar, Ely y Katy, mis amores y base para mis sueños.

A mi abuelita Irma y especialmente mi tío Rolo, gran apoyo durante estos años, que

mas que un tío un segundo padre para nosotros, sabemos que siempre contamos con

ambos.

A mi tía Rosa por su apoyo desde siempre, a mi abuelita Carmen, y el resto de mi

numerosa familia, sólo recibí buenos deseos y energías de ellos.

Finalmente, a mis variados y reales amigos: Paly, Vivi, Marce, mis hermanos Los

Cóndores, mis amigos de Universidad Gonzalo, Pame, Andrea y Ceci, por ser aquellos

oídos y brazos que alguna vez necesite cuando mi familia estaba lejos.

VI

INDICE GENERAL

INFORME DE APROBACIÓN DE TESIS…………………………………………………….II

INFORMACIÓN DE DESARROLLO DE TESIS………...………………………….……...III

DEDICATORIA………………………………………………………………………………....IV

AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………………….....V

INDICE GENERAL…………………………………………………………………………..…VI

INDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………………IX

INDICE DE TABLAS…………………………………………………………………………...XI

ABREVIATURAS………………………………………………………………………………XII

RESUMEN……………………………………………………………………………………..XIV

SUMMARY……………………………………………………………………………………..XVI

1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………...1

2. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………….…7

3. OBJETIVOS GENERALES Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………….7

4. MATERIALES Y METODOS…………………………………...……………………….…….

4.1 Materiales……………………………………………………………………………….....8

Materiales y reactivos generales…………………………………………………….........8

Enzimas……………………………………………………………………………………...9

Marcadores de peso molecular……………………………………………………..........9

Medios de cultivo celular………………………………………………………….............9

Material biológico………………………………………………………………………....10

Bacterias……………………………………………………………………………...10

Vectores………………………………………………………………………………10

Cepas de Nemátodos………………………………………….………………......10

Líneas celulares……………………………………………………………….........10

Anticuerpos………………………………………………………………………..…11

4.2 Métodos………………………………………………………………………………….12 Cultivo y mantención de células…………………………………...……………..12

Cultivo de líneas celulares………………………………………………………...12

Transfección transiente de líneas celulares……………………………………..12

VII

Transfección transiente de células Hela………………………………………….12

Transfección transiente de células Hek293T…………………………………….12

Bacterias competentes……………………………………………………….........13

Mantención de cepas bacterianas………………………………………………...13

Transformación de cepas bacterianas…………………………………………...14

Evaluación de colonias positivas……………………………………………….....14

Técnicas bioquímicas…………………………………………………………….............14

Extracción de proteínas para western blot y para ensayo de actividad Msr...14

Extracción de proteínas para fraccionamiento subcelular………..……………15

Extracción de proteínas para obtención de ARN…….………………………...15

Extracción de proteínas para ensayo de luciferasa y β-galactosidasa………15

Cuantificación de proteínas en extractos celulares………………………….....15

Electroforésis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)………………....16

Western blot………………………………………………………………………....16

Ensayo de actividad de la Msr………...……………………………………….....17

Ensayo de actividad de la Luciferasa…………….……………………………..17

Ensayo de actividad de la β-galactosidasa……………..……………………….18

Ensayo de actividad de la Succinato Deshidrogenasa…………..………….....18

Inmunofluorescencia……………………………………………………………….18

Microscopia Electrónica de transmisión. Determinación con DAB.…………..19

Inmunodetección para MET………………………………………….……....19

Montaje de células para MET……………………………………….…….....20

Microscopia Electrónica de transmisión. Determinación con Oro……….…...20

Montaje de células para la detección con Oro……………………………..20

Inmunodetección con Oro…………………………………………………....20

Fraccionamiento Subcelular……………………………………………………...21

Técnicas en Biología Molecular……………………………………………………….....21

Purificación de plasmidios recombinantes……………………………………....21

Digestión de plasmidios recombinantes con enzimas de restricción………....21

Electroforésis de ADN en gel de agarosa……………………………………....22

Purificación de fragmentos de ADN……………………………………………...22

VIII

Obtención de fragmentos de ADN por PCR…………………………………...22

Generalidades de la reacción de PCR…………………………………….22

Extracción de ARN total de cultivos celulares………………………………….23

Obtención de ADNc por RT-PCR………………………………………………..23

Incubación con DNasa……………………………………………………....23

Transcripción reversa in vitro………………………………………………..24

Cuantificación de ADN y ARN………………………………………………......24

Ligación de fragmentos de ADN y plasmidios………………………………....24

5. RESULTADOS……………………………………………………………………………..25

Objetivo 1....……………………………………………………………………....25

Objetivo 2…………………………….………………………………………….....35

6. DISCUSION………………………………………………………………………………....56

7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………..60

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………………………..61

IX

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. Determinación de la distribución subcelular de la MSRA-1 por Inmuno

florescencia indirecta.………………………………………………………………..……..26

FIGURA 2. Comparación de la expresión de la MsrA humana y de MSRA-1 de C.

elegans……………………………………………………………………..……………….....27

FIGURA 3. Cuantificación de la actividad reductora específica en extractos

celulares que expresan MSRA-1 de C. elegans..………………………………….…..27

FIGURA 4. Comparación de la actividad de la enzima Succinato

Deshidrogenasa……………………………………………………………………………..28

FIGURA 5. Análisis de la expresión de la enzima MSRA-1.myc en las fracciones

mitocondriales y citosólicas en células Hek293T…………………………………...…30

FIGURA 6. Fotografías obtenidas con microscopia electrónica de transmisión

(MET) de células HEK293T…………….…………………………………….……….…..31

FIGURA 7. Fotografías obtenidas con microscopia electrónica de transmisión

(MET) de células Hela…...…………………..…………………………….………………32

FIGURA 8. Fotografías de microscopia de transmisión que muestra el precipitado

de DAB frente a peroxidasa utilizada para inmuno

detección………………………………………………………………………………………32

FIGURA 9. Inmuno detección de la MSRA-1 asociado a HRP. Fotografías

obtenidas con microscopia electrónica de transmisión (MET)

con.........……………………………………………………………………………………..33

FIGURA 10. La enzima MSRA-1 se localiza en mitocondrias de células.

Fotografías de microscopia electrónica de transmisión (MET) con inmuno

detección asociada a Oro..…………………………………………………………....… 34

FIGURA 11. Resultados del análisis con el programa de alineamiento SIM

…………………………………………………………………………….…………………..36

FIGURA 12 .Resultados del análisis con el programa de alineamiento SIM

…………………………………………………………………………………………….......37

FIGURA 13. Resultados del análisis con el programa de alineamiento SIM

…………………………………………………………………………………..…………….38

FIGURA 14. Resultado de la predicción de estructura secundaria de la MSRA-1

por Lpred3…………………………………………………………………………..………...39

X

FIGURA 15. Diagrama de la estructura de alfa hélice para los primeros 20

aminoácidos de MSRA-1…………………………………………………...………………39

FIGURA 16. Alineamiento de secuencias de las MsrAs de mamíferos: ratón,

humana, rata y bovino……………………………………………...………………….…..40

FIGURA17. Estructura terciaria propuesta para la MSRA-1 a través del programa

RasMOl-theorical model…………………………………………………………………....41

FIGURA 18. Secuencias aminoacídicas de los clones generados para el estudio

de un posible epítope de destinación mitocondrial……………………….…………..42

FIGURA 19. Determinación de la distribución subcelular de la MSRA-1 y de sus

clones de proteínas truncados mediante inmunofluorescencia

indirecta………..…………………………………………………………………………….43

FIGURA 20. Gráfico que muestra el porcentaje de la actividad específica para la

MSRA-1 en los diferentes clones…………………………………………………….......44

FIGURA 21. Análisis de la expresión de la enzima MSRA-1.myc y sus respectivos

clones truncados en las fracciones mitocondrial y citosólica en células Hek293T

transfectadas................................................................................................................45

FIGURA 22. Determinación de los ARNm de los diferentes clones

generados…...……………………………………………………………………………...46

FIGURA 23. Determinación por inmunoflorescencia indirecta de la distribución

subcelular de la MSRA-1 y MSRA-1 Mutante R6G en células HEK 293T

transfectadas……………………………………………………………………………..…..48

FIGURA 24. Detección de los transcritos de la MSRA-1 Mutante R6G por RT-

PCR……………………………………………………………………..……………….……..49

FIGURA 25. Análisis de la expresión de la MSRA-1 Mutante R6G en las fracciones

mitocondrial y citosólica en células Hek293T………………………………………....49

FIGURA 26. Imágenes obtenidas por microscopia de transmisión y confocal, en

Nemátodos microinyectados con pPD95_75promo1934pbc.e::GFP……………….50

FIGURA 27. Curvas de supervivencia de C. elegans a lo largo de un ciclo de

vida……………………………………………………………………………………………..51

FIGURA 28. Screening por PCR de poblaciones de nemátodos transgénicos

microinjectados con pcDNA msrah.Myc (ANM26)……………………………………..52

XI

FIGURA 29. Análisis de los sitios de unión para DAF-16 en el promotor de la

MSRA-1 de C.elegans………………………………..…………………….………..………53

FIGURA 30. Análisis de la regulación de la actividad del promotor de MSRA-1 por

FoxO3A…………………………………………………………………...…………………..55

INDICE DE TABLAS

TABLA 1. Partidores utilizados……………………………………………......................11

TABLA 2. Actividad reductora en metioninas obtenidas en extractos proteicos de

células Hek293T transfectadas con la MSRA-1……………………………………......27

TABLA 3. Resultados de la medición de la actividad específica de los clones de

la MSRA-1………………………………………………….…………………………………44

XII

ABREVIATURAS

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ADN complementario

ADNmt: ADN mitocondrial

AP-1: Proteína activadora 1

Arg: arginina

ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ARNi: ácido ribonucleico interferente

ATP: adenosin trifosfato

BCA: ácido bicinconínico

BrEt. bromuro de etidio

BSA: albúmina de suero bovino

CaM: calmodulina

Cys: cisteína

DAB: 3,3´-diaminobencidina

Dabsyl:4-dimetilaminoazobenceno-4´-sulfonil

DBE: secuencia de reconocimiento para factores de la familia FOXO

DEPC: di-etilpirocarbonato

DMEM: medio Eagle modificado por Dulbecco

DMSO: dimetilsulfóxido

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfatos

DO: densidad óptica

DTT: dititreitol

ECL: realzador de quimioluminiscencia

EDTA: ácido etilen-diamino-tetra-acético

FADH2: flavina adenina dinucleótido reducido

FOXO: factores de transcripción Forkhead clase O

GFP: proteína de fluorescencia verde.

h: horas

HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia

HRP: peroxidasa de horseradish

XIII

IGF-1: factor de crecimiento tipo insulina 1

IPTG: isopropil tiogalactosida

Kb: kilo bases

kDa: kilo Daltons

Met: metionina

MetO: metionina sulfóxido

MsrA: metionina sulfóxido redutasa A

MTT: tetrazolium metiltiazol

NAD: nicotinamida adenina dinucleótido

NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

NL: norleucina

ONPG: o-Nitrofenil β-d-galactopiranosido

PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida

pb: pares de bases

PBS: tampón fosfato salino

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PM: peso molecular

PMS: fenazina metosulfato

PSA: persulfato de amonio

PVDF: polivinilideno difluor

ROS: especies reactivas de oxígeno

RLB: tampón de reportero de lisis

SDH: Succinato deshidrogenasa

SDS: dodecil sulfato de sodio

seg: segundos

SFB: suero fetal bovino

SOD: superóxido dismutasa

STETL: tampón de extracción de ADN con lisosima

TEMED: N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina

TMRE: etil ester tetrametilrodamina

UTR: región no traducida del ARNm

Xgal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosida

XIV

RESUMEN

El daño oxidativo inducido por las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los diferentes

componentes celulares se ha postulado como una de las principales consecuencias del

envejecimiento celular y de enfermedades crónicas asociadas a la edad. Durante el

envejecimiento este daño oxidativo está caracterizado por la oxidación de lípidos, ADN y

proteínas. En las proteínas el blanco principal de las ROS corresponde a aquellos

aminoácidos sulfurados como la Metionina y la Cisteína, existiendo sólo para el caso de

la Metionina un sistema de reparación específico para los isómeros de su forma oxidada;

la enzima Metionina Sulfóxido Reductasa (Msr). Esta enzima es altamente conservada y

se expresa desde las bacterias a los mamíferos. Su función fisiológica se ha relacionado

con la mantención de la actividad de proteínas afectadas por la oxidación de algunas de

sus metioninas. Recientemente en el caso de la Msr del tipo A, ésta ha sido involucrada

en los procesos que determinan la vida media de los organismos. En Caenorhabditis

elegans se determinó su secuencia genómica, su actividad enzimática y su expresión en

los diferentes tejidos de estos organismos, sin embargo, aún se desconoce su

distribución subcelular y su función biológica en los diferentes tejidos.

En este trabajo se propone como hipótesis que la Metionina Sulfóxido Reductasa de C.

elegans (MSRA-1) presenta una distribución mayoritariamente mitocondrial, y su función

enzimática está ligada a la reparación del daño provocado por el estrés oxidativo

generado en este organelo.

En una primera etapa se estudió la distribución subcelular de la MSRA-1 de C. elegans

expresada en cultivo de líneas celulares de mamíferos. Para lo cual se utilizaron técnicas

de inmunofluorescencia indirecta, microscopia fluorescente, fraccionamiento subcelular y

de microcopia electrónica de transmisión (MET). Nuestros resultados indican que la

MSRA-1 presenta una distribución prioritariamente mitocondrial cuando es expresada en

diferentes líneas celulares en cultivo.

En una segunda etapa, se estudió la estructura y secuencia aminoacídica del extremo N-

terminal de esta proteína en busca de una posible señal de destinación mitocondrial,

homóloga a las reportadas en la literatura. Este análisis determinó la existencia de dos

Argininas (R6 y R30) cercanas al N-terminal de la MSRA-, las que presentan similitud en

XV

su posición a las Argininas de relevancia para la distribución subcelular presente en otras

especies. Se generaron dos construcciones génicas donde se eliminaron los fragmentos

del extremo N-terminal de la enzima que contenían estas Argininas (10 aminoácidos).

Sin embargo, los resultados mostraron que los cortes efectuados en la secuencia

afectaron la expresión de la enzima. Posteriormente estudios con una mutante específica

para la Arginina 6, sugieren que esta mutante presenta una pérdida de la destinación

mitocondrial.

Finalmente, se observó in vivo la expresión de la MSRA-1 en C. elegans y su papel

fisiológico, rescatando el fenotipo de la cepa mutante con la expresión de esta enzima.

XVI

SUMMARY

The oxidative damage induced by the reactivate oxygen species (ROS) in different

cellular components has been postulated as one of the main consequences of cellular

aging and of chronic diseases associated with age. During aging oxidative damage is

characterized by the oxidation of lipids, DNA and proteins. In proteins, the main target

of ROS are methionine and cysteine amino acid residues. The oxidation of methiones,

unlike other oxidative modifications, can be reduced by the methionine sulfoxide

reductase system (Msr). MsrA is a well characterized component of this system and is a

conserved enzyme found from bacteria to mammals. Its function has been related to

the maintenance of activity of proteins affected by the oxidation of some methionines,

moreover, lately and specifically the MsrA, has been involved in the processes that

determine the lifespan. Recently, MSRA-1 in Caenorhabditis elegans has been

sequenced and its enzymatic activity has been characterized, however its biological

function and subcellular localization are unknow.

In this work our hypothesis is that the Methionine Sulfoxide Reductase of C. elegans

(MSRA-1) is expressed mainly in mitochondria and its enzymatic function would be the

repair of the oxidative stress damage generated in this organelo.

In the first stage, we studied the subcellular distribution of the MSRA-1 expressed in

different mammalian cell culture lines. For this purpose we used immunofluorescence

hint, fluorescent microscopy, mitochondrial isolation and electronic microcopy of

transmission (EMT). Cell cultures lines were transfected with constructions that express

the MSRA-1 enzyme fused to epitopes as myc or GFP. Our results indicate that MSRA-

1 mainly is distributed in mitochondria when the protein is expressed in Hela and

Hek293T cells.

In the second stage, we analyzed the secondary structure and aminoacid sequence of

the N-terminus of this enzyme. The results of this study show that two arginines (R6

and R30) located the N-terminus of the MSRA-1 are relevant for the mitochondrial

destination. These arginines are conserved in position and relevance for other species.

XVII

Finally, we analyzed in vivo the MSRA-1 expression in C. elegans and his physiological

role, with the rescue of phenotype in mutant strain.

1

INTRODUCCION

Metionina Sulfóxido Reductasas

El envejecimiento celular está caracterizado por un aumento de proteínas modificadas

por la oxidación de residuos específicos de éstas, siendo la Metionina y la Cisteína, los

que más rápidamente se oxidan en condiciones de estrés oxidativo (Moskovitz, 2005).

Bajo condiciones fisiológicas la oxidación de las metioninas libres y unidas a proteína es

causada por una gran variedad de reacciones que llevan a la formación de metionina

sulfóxido, en dos formas epiméricas metionina-S-sulfóxido y metionina-R-sulfóxido,

oxidaciones que pueden llevar a la pérdida de la función de la proteína. Sin embargo,

estas oxidaciones pueden ser revertidas a través de la acción de dos enzimas

reparadoras estereoespecíficas, la Metionina Sulfóxido Reductasa A (MsrA) y Metionina

Sulfóxido Reductasa B (MsrB), respectivamente (Hansel et al., 2005).

La expresión de ambas enzimas ha sido descrita desde bacterias a mamíferos (Delaye et

al., 2007), su importancia radica principalmente en la evidencia que la oxidación de las

metioninas puede resultar en la pérdida de actividad biológica en una amplia variedad de

proteínas y péptidos (Brot et al, 2000). Uno de los sustratos para este sistema de

enzimas reparadoras, con mayor importancia clínica, puede ser el inhibidor de proteinasa

α1, cuya oxidación en la metionina en la posición 358, provocada por el humo del

cigarrillo u otros reactivos in vitro, causa pérdida de su capacidad inhibitoria de la

elastasa, formando parte de la patofisiología del enfisema pulmonar en fumadores (Carp

et al., 1982). Otro ejemplo de su posible papel regulatorio sobre proteínas es la

interacción con la Calmodulina (CaM), ésta proteína une calcio regulando una gran

variedad de eventos celulares como la contracción muscular y la neurotransmisión. La

Calmodulina está constituida inusualmente por un alto porcentaje de metioninas y la

oxidación de sus metioninas tanto en la posición 144 como 145 genera una disminución

en la capacidad de unir calcio, y consecuentemente de activar la Calcio ATPasa (Yin et

al., 2000). Consecuentemente, se ha demostrado que la adición de Msr genera una

recuperación de la actividad de la proteína Calcio ATPasa dependiente de CaM (Sun et

al., 1999).

2

MsrA y su participación en envejecimiento

En diversos organismos eucarióticos desde levadura a mamíferos las evidencias sugieren

que la enzima MsrA tiene una participación determinante de la vida media de estos.

Investigaciones de nuestro laboratorio utilizando al nemátodo Caenorhabditis elegans

muestran que los mutantes nulos de esta enzima acortan su vida media en un 30 %

(Minniti et al., 2009). Así como también, estudios basados en la sobreexpresión de la

proteína MsrA de bovino en el sistema nervioso de Drosophila melanogaster (mosca de la

fruta), muestran que este organismo aumenta su supervivencia en un 70% y con ello un

incremento en la resistencia al estrés oxidativo y una mayor eficiencia metabólica (Ruan

et al., 2002). En levaduras nulas para MsrA se ha observado un acortamiento de la vida

en un 26%, mientras que en aquellas que sobreexpresan la enzima, su vida media

aumenta en un 25% (Koc et al., 2004). El mismo efecto se observa en ratones nulos para

esta enzima, donde la ausencia del gen de la MsrA genera una disminución de un 40 %

en la vida media, y aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo (Moskovitz et al., 2001).

Si bien se desconocen los factores que controlan y regulan la expresión de la MsrA en

mamíferos, en C. elegans se ha visto que ésta está controlada por el factor de

transcripción FOXO3A/DAF-16 (Minniti et al., 2009). FOXO3A es un factor transcripcional

evolutivamente conservado, presente desde invertebrados a mamíferos y cuyo homólogo

en C.elegans es el factor DAF-16. Numerosas evidencias muestran que este factor DAF-

16 controla la longevidad de los organismos (Kenyon et al., 1993, Van der Horst et al.,

2007 y Katic. et al., 2005). En nuestro laboratorio se ha determinado que puede controlar

la expresión de la MSRA-1 (Minniti et al., 2009).

Mitocondria, estrés oxidativo y envejecimiento celular

La cadena respiratoria mitocondrial se encuentra finamente coordinada para transferir

electrones desde NADH o FADH2 a una serie de aceptores de electrones, hasta la

transferencia final al oxígeno que lleva a la producción de agua, sin embargo, estas

reacciones bioquímicas pueden llevar a la producción de especies reactivas de oxígeno

(ROS). Estas ROS son un elemento que podría determinar la supervivencia de los

organismos, siendo la mitocondria tanto el principal generador de estas especies

3

oxidativas como el principal blanco del daño oxidativo de macromoléculas (proteínas,

ADNmt, etc.). Esto ha llevado a numerosas investigaciones a tratar de dilucidar los

mecanismos del estrés oxidativo en el envejecimiento y la participación de las

mitocondrias (Balaban et al., 2005).

Diversas evidencias muestran que el daño o mutación generada al ADN mitocondrial

(ADNmt) producto de su cercanía a la generación de ROS y la carencia de una cubierta

protectora de histonas, pueden llevar a reducir la precisión de la transferencia de

electrones incrementando aun más la producción de ROS y por demás la lesión de

ADNmt (Linnane et al., 1989). Tyynismaa y su grupo el 2005, generó un modelo de

ratones mutantes cuyos resultados implicaron la mutación del ADNmt con los procesos

de envejecimiento. Estos ratones contenían una polimerasa de ADN mitocondrial carente

de la función exonucleasa, lo que generó en ellos un sustancial incremento en los puntos

mutados en el ADNmt en diversos tejidos, observándose en ellos características propias

del envejecimiento a temprana edad (reducción en el peso, reducción de grasa

subcutánea, pérdida de pelo, curvatura de la espina y osteoporosis) así como también

una reducción en la vida media.

Estudios que comparan la estructura y la funcionalidad mitocondrial en C. elegans de

diferentes edades muestran que las mitocondrias senescentes están morfológicamente

alteradas y funcionalmente producen más ROS y menos ATP (Shinenaga et al., 1994).

Así mismo, se ha obsevado que la actividad de los complejos I y II de la cadena

transportadora de electrones y el consumo de oxígeno, decrecen significativamente en

aquellos nemátodos senescentes, alrededor de 14 días de vida, en comparación con

ejemplares jóvenes de 4 días de vida, esto estaría acompañado de cambios estructurales

del organelo (Yasuda et al., 2006).

Los nemátodos de C. elegans han demostrado ser una herramienta importante en la

búsqueda de establecer una probable relación entre la función de la cadena

transportadora de electrones, como generadora de ROS, y el envejecimiento de los

organismos. Estudios de la anulación o la interrupción parcial de la cadena

transportadora, mediante la mutación de isp-1 perteneciente al complejo III mitocondrial

4

genera nemátodos con una vida media extendida y un evidente aumento de resistencia a

agentes inductores de estrés oxidativo (Feng et al., 2001). La utilización de ARN

interferentes (ARNi) para diversos genes que codifican proteínas mitocondriales

pertenecientes a la cadena transportadora como atp-3, nuo-2, isp-1, cco-1 y frh-1,

generan un incremento en la vida media de los nemátodos, retardo en el crecimiento,

desarrollo y maduración de las gónadas (Rea et al., 2007).

Por otro lado, se ha demostrado que también se puede modular el rango de vida por el

aumento en los niveles de componentes antioxidantes, principalmente enzimas

reguladoras del estrés oxidativo generado por ROS, y que reducen estas especies tanto

fuera como dentro de la mitocondria. Así, en mamíferos un incremento de la superóxido

dismutasa (SOD) extiende la vida media de fibroblastos primarios y reduce la velocidad

de acortamiento de los telómeros (Serra et al., 2003). Además, se ha observado en C.

elegans transgénicos que sobreexpresan las enzimas de reparación oxidativa SOD y

catalasa, una resistencia al estrés generado por el peróxido de hidrogeno, aumentando la

supervivencia de éstos nemátodos frente a condiciones de estrés oxidativo agudo

(Larsen, 1993).

En consecuencia, las evidencias planteadas apoyarían la idea de una relación entre los

cambios en el metabolismo mitocondrial, la generación de ROS, y la modulación de la

vida media de los organismos. Esto llevaría a relacionar a aquellas enzimas involucradas

en las vías de regulacion de estrés y la longevidad de los organismos con la funcionalidad

y la constitución estructural de la mitocondria.

Distribución subcelular de la MsrA

Estudios basados en la secuencia aminoacídica y ensayos de destinación subcelular de

la MsrA humana han entregado información sobre la existencia de diferentes isoformas

de esta enzima, las que presentarían distintos patrones de expresión subcelular.

Investigaciones basadas en la expresión de proteínas de fusión de MsrA humana con

green fluorescence protein (GFP) muestran que esta enzima se distribuye tanto en el

citoplasma como en la mitocondria (Hansel et al., 2005), donde la destinación a la

mitocondria estaría determinada por un dominio N-terminal de 23 aminoácidos (Hansel et

5

al., 2002). La localización de MsrA en el citoplasma y en la mitocondria evidencia la

existencia de dos isoformas de MsrA lo que podría ser el resultado de una traducción

diferencial de un único ARNm (Vougier et al., 2003) o que ambas isoformas sean el

producto de dos ARNm diferentes, es decir un procesamiento alternativo. Investigaciones

sugieren que un procesamiento alternativo del gen msrA sería un caso particular de

tejidos como la retina (Lee et al., 2006) o de células nerviosas embrionarias (Kim and

Gladyshev, 2006), apoyado actualmente con el hallazgo de dos promotores distintos para

el mismo gen que generaría indistintamente las isoformas mitocondriales y

citosólicas/nuclear de la MsrA humana, en tejidos de retina de mono (Pascual et al.,

2008).

La enzima Metionina Sulfóxido Reductasa de C. elegans (MSRA-1) fue clonada por Lee y

colaboradores el 2005. Si bien se pudo determinar su actividad enzimática in vitro, sólo

recientemente nuestro laboratorio describió su destinación y expresión en los diferentes

tejidos (Minniti et al., 2009). C.elegans es un nemátodo que vive en suelo, se encuentra

en la mayoría de las regiones templadas del planeta, mide solo 1 mm de largo de adulto

y se presenta en dos sexos, hermafroditas y machos. Este organismo ofrece múltiples

ventajas para los estudios relacionados con longevidad. Pueden ser cultivados en el

laboratorio, su ciclo de vida es corto (entre 2-3 semanas), han sido identificadas y

caracterizadas todos sus genes y células, y se pueden hacer estudios utilizando gran

cantidad de individuos (cada hermafrodita genera 300 individuos). Las vías de regulación

de procesos vitales de estos nemátodos y los vertebrados presentan alto grado de

homología. Toda la información de su genoma completamente secuenciado, se

encuentran en una biblioteca de datos en línea (www.wormbase.com). En el contexto de

este estudio es importante señalar que la MSRA-1 clonada de C.elegans ha sido

caracterizada enzimáticamente, pero la información con respecto a su distribución

subcelular y/o sustratos biológicos aun no han sido dilucidados.

Con estos los antecedentes, este estudio se plantea como hipótesis de trabajo que “la

Metionina Sulfóxido Reductasa de C. elegans (MSRA-1) presenta una distribución

mayoritariamente mitocondrial, y su función enzimática está ligada a la reparación

del daño provocado por estrés oxidativo generado en este organelo”.

6

Para desarrollar esta hipótesis, nosotros nos planteamos dos objetivos

específicos: El primero, analizar la distribución subcelular de la enzima MSRA-1 de

C.elegans y el segundo determinar el epítope de destinación mitocondrial de la

enzima MSRA-1 de C.elegans.

Nuestros resultados sugieren que en un sistema de cultivo celular la enzima MSRA-

1 de C.elegans presenta una distribución principalmente mitocondrial, que la

mutación en la arginina en posición 6 del N-terminal de la MSRA-1 determina la

pérdida de la destinación mitocondrial, lo que sugiere que estaría involucrada en la

destinación de esta enzima al interior de la mitocondria.

7

II.2 HIPOTESIS

La enzima Metionina Sulfóxido Reductasa (MSRA-1) de Caenorhabditis elegans presenta

una distribución subcelular mitocondrial.

II.3 OBJETIVO GENERAL

Estudiar la distribución subcelular de la enzima MSRA-1 de C.elegans y los mecanismos

que la determinan.

II.4 OBJETIVO ESPECÍFICOS.

1-Analizar la distribución subcelular de la enzima MSRA-1 de C.elegans.

1a. Analizar la expresión de la enzima en condiciones de cultivo de líneas celulares, en

particular determinar su expresión mitocondrial y citosólica.

2-Determinar el epítope de destinación mitocondrial de la enzima MSRA-1 de

C.elegans.

2.a- Analizar los posibles epítopes que determinen la destinación mitocondrial en la

enzima MSRA-1, mediante programas computacionales que utilizan la secuencia

aminoacídica.

2.b- Generar diferentes mutantes de la enzima y evaluar la distribución subcelular de

cada uno de ellos.

8

MATERIALES

Materiales y reactivos generales

De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) se obtuvieron los siguientes reactivos:

3,3´-diaminobencidina (DAB), albúmina de suero de bovino (BSA), dimetilsulfóxido

(DMSO), o-Nitrofenil β-d-Galactopyranosido (ONPG), EDTA, Triton X-100, Tween-20,

glicina, inhibidores de proteasas (Pepstatina A, Leupeptina, Aprotinina ), antibióticos

streptomicina-penicilina, ampicilina y gelatina.

De Merck (Darmstadt, Alemania) se obtuvieron, cloruro de sodio, cloruro de potasio,

hidróxido de sodio, etanol, isopropanol, metanol, paraformaldehído, formaldehído 37%,

ácido clorhídrico, cloruro de magnesio, sulfato de cobre y potasio, acetonitrilo, perhidrol

(H2O2 30%), cloroformo y glutaraldehído.

De Kodak (Rochester, NY, EUA): reactivos de revelado.

De Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, EUA) dATP, dGTP, dTTP, dCTP, Medio LB broth

miller base, Agarosa ultra pura, TRIS ultra pure, el reactivo Lipofectamine 2000TM para la

transfección de líneas celulares, MgCl2 grado PCR.

De Fuji (Japón): películas para revelado de Western.

De Dako (Carpintería, CA, EUA) fluoro mounting medium.

De Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA): tripsina 10X, bromuro de etidio, Optimem I

reduced serum media, X-gal.

De Pierce (Rockford, IL, EUA): El sistema comercial BCA protein assay para medición de

proteínas, el kit revelado quimioluminiscente ECL (Picomolar Enhancer

Chemioluminicenst kit) y el kit de purificación de mitocondrias para células de mamíferos

(Mitochondria Isolation kit for mammalian cells).

De Millipore (Bedford, MA EUA) se obtuvo la membrana de PVDF Immobilon-P para la

transferencia de proteínas.

De W&Z, (Santiago, Chile) se obtuvo: acrilamida, bis-acrilamida, persulfato de Amonio

(APS), TEMED, -mercaptoetanol, dodecil sulfato de sodio, bicarbonato de sodio,

sacarosa, glicina, cloruro de calcio, PBS 10X, TBS 10X, NP-40, fosfato monobásico y

9

dibásico de sodio, EDTA sal sódica agua sin nucleasas (DEPC) y la solución de

Chomczynski-fenol.

De Promega Corp (Madison, WI, EUA) se obtuvo luciferase assay system (sustrato de la

enzima luciferasa ) y Reporter Lysis Tampón (RLB).

De Electron Microscopy science EMT ( Hatfield, PA,USA) se obtuvo el OsO4 y las resinas

EPON y LR-white.

Enzimas

Las enzimas de restricción: BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI y XhoI se obtuvieron de Gibco

BRL-Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA. Las enzimas ADN polimerasa Taq

Platinum y Pfx ADN polimerasa Platinum junto con el tampón para reacción 10x (Tris-HCl

20 mM pH 8,4, KCl 50 mM) y MgCl2 50 mM, la enzima transcriptasa reversa M-MLV, su

tampón de reacción 5x (first strand buffer),el inhibidor de RNasa (rRnasin), el DTT 0,1 M y

los partidores ramdom necesarios para la transcripción reversa in vitro se obtuvieron de

Invitrogen Corp. La ligasa T4 y su solución 10x para realizar la ligación se obtuvo de

Promega Corp (Madison, WI, EUA). La Dnasa Turbo, su tampón 10x y solución

inhibidora se obtuvieron de Ambion, Inc. (USA).

Marcadores de peso molecular

Los marcadores de peso molecular 1 Kb ADN ladder, para determinar tamaño de ADN

doble hebra entre 12 Kb y 500 pb de Gibco BRL (Grand Island NY, EUA) y entre 10 Kb y

500 pb de New England Biolabs (EUA ). El marcador de peso molecular para proteínas,

utilizado para Western Blot fue el Prestained Protein Molecular Weight Marker de

Fermentas (Hanover, MD, EUA) para discernir entre proteínas de 20 a 200 kDa.

Medios de cultivo celular

El medio de cultivo DMEM (Dulbecco Modified Eagle Media con HEPES , L-glutamina y

alta concentración de glucosa) y medio Optimem I reduced serum media para células

eucarióticas que se utilizaron fueron obtenidos de Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA)

así como también el suero fetal de bovino y el agar para cultivo de bacterias en placa.

Como medio base de crecimiento de bacterias se utilizó el LB Lennox broth base de

Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, EUA)

10

Material Biológico

Bacterias

Se utilizaron bacterias competentes de la cepa E.coli DH5α para la transformación con

los plasmidios de interés.

Vectores

Se utilizó el plasmidio pGemT-easy vector (Madison WI, EUA) para clonar Productos de

PCR, con resistencia a ampicilina.

El vector pcDNA 3.1 myc-His de Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, EUA) se utilizó para

sobreexpresar el factor de transcripción FOXO3A, y todos los clones de MSRA-1.

El vector reportero pGL2-Basic (Madison WI, EUA) que contiene el ADNc para luciferasa

de luciérnaga se utilizó para evaluar la actividad de los distintos fragmentos del promotor

de la MsrA.

El vector comercial pSV-β-galactosidase (Madison WI, EUA) se utilizó como control

interno para monitorear la eficiencia de transfección de los cultivos celulares. Este

plasmidio tiene el promotor temprano y enhancer SV40 que dirigen la transcripción del

gen lacZ que codifica para la enzima β-galactosidasa.

El vector pPD95_75, específico para sobreexpresión de proteínas en C. elegans fue

obtenido de la Dra. Rebecca Kohn (Ursinus College, Collegeville, PA)

Cepas de nemátodos

Los nemátodos Caenorhabditis elegans N2 (Wilde-type) y mutantes nulos para la msra-

1(tm1421), asi como también, las cepas transgénicas que expresan la proteína MSRA-1

(ANM07) y la cepa N2 MSRA-1::GFP fueron facilitadas por la Dra. Alicia Minniti (Fac.

Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile).

Líneas celulares

Células N2A (neuronales) fueron donadas por el laboratorio de la Dra. Alejandra Alvarez

(Fac. Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile). Células HepG2 (hepatoma

humano), células Hek293T (embrionarias de riñón humano) y células HeLa (carcinoma

Cervico-uterino) fueron obtenidas de la American Type Cell Collection (ATCC).

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Anticuerpos

Anticuerpo policlonal de conejo anti-MsrA se obtuvo De Upstate Biotechnologies (NY,

EUA). El anticuerpo anti-tubulina hecho en ratón se obtuvo de Sigma Chemical Co. ( St.

Louis, MO, EUA.). El anticuerpo monoclonal anti-c-myc (clone 9E10) se obtuvo de Roche

(Mannheim, Germany) y el anti-myc en suero monoclonal fue facilitado por la Dra.

Marcela Bravo, laboratorio de Inmunología Clínica y Reumatología, PUC.

Los segundos anticuerpos anti-ratón conjugados con el fluoróforo Alexa 546 (rojo) y con

Alexa 488 (verde) se obtuvieron de Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Los segundos

anticuerpos anti-conejo-peroxidasa y anti-ratón-peroxidasa se obtuvieron de KCL

(Gaithersburg, MD, EUA). El anticuerpo anti-ratón-Oro (15 nm conjugated-goat anti

mouse IgG) se obtuvo de Ted Pella Inc. Redding, CA, USA.

Partidores utilizados

Partidor Secuencia Tm (°C)

Msra.ce.Xho3´ 5´AgTCTCGAG AgCATgACAgTTTCTTggATC 3´ 60

Msra.ce.Hind5´ 5´AgTAAgCTTATggCTTATTTggAgCgTgC 3´ 60

Ce.Msra.Hind-10atg 5´AgTAAgCTTATgCAgTgCTTCTggggAgAA 3´ 70

Ce.Msra.Hind-20atg 5´AgTAAgCTTATgAAgCTgAAAggAgTTgTggT 3´ 68

Ce.Msra.Bamh3´ 5´AgTggATCCAgCATgACAgTTTCTTggATC3´ 71

MsrAc.eMut6R.Hind5´ 5´gTgCAAgCTTATggCTTATTTggAgggTgCCTATTTTg 3´ 77

Tabla 1. Partidores diseñados en el laboratorio y luego generados en Invitrogen Custom

primers (Grupo Bios, Chile).

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MÉTODOS

Cultivo de líneas celulares.

Las células Hela, N2, HepG2 y Hek293 se crecieron en monocapas y mantenidas en

placas de 60mm o 100mm de diámetro a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad. Como

medio de crecimiento se utilizó el medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de

bovino, glucosa a una concentración de 4,5 g/L (medio denominado alta glucosa) y con

100U/ml de penicilina y 0,1mg/ml de estreptomicina. Las células fueron crecidas hasta

alcanzar no más de 85% de confluencia, y para su amplificación y siembra fueron lavadas

con PBS e incubadas con tripsina 1X por 5 minutos a 37ºC. Posteriormente las células se

centrifugaron a 650 g por 3 minutos en 1 ml de medio. El número de células sembradas

se hizo acorde al tipo de célula, al experimento y al tamaño de las placas.

Transfección transiente de líneas celulares

a-Transfección transiente de células Hela

Para la transfección de líneas Hela se utilizó el reactivo Lipofectamine 2000 de Invitrogen

Corp (Carlsbad, CA, EUA) según las recomendaciones del fabricante. 48 h antes de la

transfección, las células fueron sembradas en medio DMEM alta glucosa 5% suero

completo, en placas de 24 pocillos con una superficie de 2 cm2, con un cubreobjeto en el

fondo de la placa de igual superficie, a una densidad de 35.000 células/pocillo. Al

momento de la transfección, las células se encontraban al 75% de confluencia y el medio

de cultivo se cambió por DMEM alta glucosa sin antibióticos y sin suero. En cada pocillo

se agregó un total de 0,6 µg de ADN plasmidial. Para un pocillo, se diluyó 1,5 µl del

reactivo Lipofectamine 2000 en 50 µl de Optimem I, se incubó por 5 minutos y luego se

mezcló con el ADN plasmidial previamente diluido en 50 µl. La mezcla cuyo volumen final

fue de 100 µl se dejó incubar por 20 minutos a temperatura ambiente y luego se agregó

sobre las células. Las células y el ADN plasmidial se incubaron por 4 h a 37º C, 5% de

CO2 y 95% de O2. Al cabo de este período se agregó igual volumen de medio DMEM alta

glucosa 5% suero completo y se incubó por toda la noche.

b- Transfección transiente de células HEK293T

Para la transfección transiente de HEK293T, se utilizó un protocolo similar al descrito en

(a). 48 h antes de la transfección, las células fueron sembradas en medio DMEM

13

completo, en placas de 60 cm2 de superficie con una densidad de 1.000.000

células/pocillo, y en placas de 20 cm2 de superficie con una densidad de 400.000

células/pocillo. Al momento de la transfección, las células se encontraban al 90% de

confluencia y el medio de cultivo fue cambiado por DMEM alta glucosa sin antibióticos y

sin suero. Para cada placa se agregó un total de 20 µg de ADN plasmidial y diluyó 40 µl

del reactivo Lipofectamine 2000 en 1,5 ml de Optimem I, mientras que en las placas de

menor superficie se agregó 6 µg y se diluyó 15 µl de Lipofectamine 2000 en 300 µl de

Optimem I, se dejó incubar por 5 minutos y luego se mezcló con el ADN plasmidial

previamente diluído en el mismo volumen de Optimen I. La mezcla se dejó incubar por 20

minutos a temperatura ambiente y luego se agregó sobre las células. Las células y el

ADN plasmidial se incubaron por 4 h a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de O2. Al cabo de este

período el medio se reemplazó por el medio DMEM alta glucosa 10% suero completo y

se incubó por toda la noche.

Bacterias competentes

Se generaron bacterias competentes de la cepa de E.coli DH5α. Para lo cual 3 ml de

cultivo bacteriano fueron crecidos toda la noche en LB sin ampicilina, con una agitación

de 65 g, del cual se tomó 1 ml para inocular 200 ml de LB sin ampicilina. Las bacterias

fueron crecidas hasta una OD 600 de 0.7 luego de lo cual se centrifugaron a 650 g por 7

minutos a 4ºC. El sedimento bacteriano fue resuspendido en 100 ml de CaCl2 75 mM

esteril y frío, y se incubó a 4ºC por 40 min. Posteriormente se centrifugó a 650 g por 10

minutos a 4ºC y el sedimento se resuspendió en 20 ml de CaCl2 75 mM despacio, y se le

agregó glicerol hasta un 14% del volumen final. Las bacterias competentes se alicuotaron

y guardaron a -80ºC hasta su uso.

Mantención de cepas bacterianas

Las cepas bacterianas positivas para el plasmidio de interés fueron mantenidas

congeladas a –80ºC con glicerol al 40% o a 4ºC en placas LB-agar 1,5% (LB= triptona 10

g/l, NaCl 5 g/l y extracto de levadura 5 g/l) conteniendo 100 mg/l de ampicilina. Para

crecer estas bacterias, se inoculó un tubo de 15 ml que contenía 5 ml de LB/ampicilina

con una colonia aislada de las placas o con 20 µl de la reserva congelada en glicerol. El

inóculo se creció toda la noche a 37ºC con agitación a 65 g. La confirmación de la

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identidad del plasmidio se realizó, posterior a su purificación, por el análisis de los

patrones de corte de enzimas de restricción correspondientes al fragmento subclonado o

por secuenciación.

Transformación de cepas bacterianas

Para la transformación de las bacterias DH5α con los diferentes plasmidios de interés, se

descongelaron 100 µl de células competentes en hielo y se mezclaron con la reacción de

ligación y luego se incubaron por 30 minutos en hielo. Posteriormente se dio un pulso de

calor a 42ºC por 45 seg y se dejó reposar en hielo por 2 minutos. A la mezcla de

transformación se le agregó 1 ml de medio de crecimiento LB sin antibióticos y se incubó

por 1 h a 37º C con agitación a 65 g. Finalmente, alícuotas de 50-150 µl de la mezcla se

sembraron en placas de Agar-LB-ampicilina, con X-gal e IPTG para la utilización del

plasmidio pGEM-T, y se incubaron toda la noche a 37ºC.

Evaluación de colonias positivas

La positividad de los clones fue confirmada mediante la selección directa de las colonias,

donde parte de la colonia fue cultivada en 5 ml LB/ampicilina líquido, con agitación por 12

horas. De cada colonia se tomó 1 ml, el cual se centrifugó y se obtuvo el sedimento

bacteriano, que fue resuspendido en 300 µl de solución STETL (sacarosa 8%, Tritón X-

100 al 5%, EDTA 50 mM pH 8, Tris 50 mM pH 8, 1 mg/ml lisozyma) y se aplicó un golpe

de calor a 100ºC por 90 seg. Posteriormente la mezcla se centrifugó a 14.200 g por 20

minutos y el sobrenadante se precipitó con igual volumen de isopropanol por 1 h a -20ºC.

Finalmente se centrifugó a 14.200 g por 5 minutos a 4ºC, se eliminó el sobrenadante y el

sedimento se resuspendió en 50 µl de agua, para posteriormente verificar la positividad

de la colonias mediante el corte con enzimas de restricción o reacción de PCR utilizando

partidores específicos.

Técnicas Bioquímicas

Extracción de proteínas para Western blot y para medición de actividad específica

de la MSRA.

Las células fueron lavadas con el tampón fosfato salino pH 7,4 (NaCl 137 mM, KCl 2,7

mM, Na2HPO4 1,4 mM y KH2PO4 1,4 mM) (PBS), se les agregó tampón de lisis que

contiene Tris- HCl 50 mM (pH 7,4), 0,5% Tritón X-100, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, y los

15

inhibidores de proteasa, Pepstatina A, Aprotinina y Leupeptina a una concentración de 5

µg/ml. Luego mediante el uso de puntas amarillas dobladas se soltaron de la placa y se

traspasaron a tubos Eppendorf. Para eliminar residuos celulares posteriores, el extracto

se homogeneizó con jeringa de tuberculina 20 veces o se sonicaron con 2 pulsos de 0,5

output por 15 seg cada uno.

Extracción de proteínas para fraccionamiento subcelular

Las células fueron lavadas con PBS, se les agregó tripsina 1x e incubó por 5 minutos a

37°C, luego mediante arrastre con 1 ml de PBS se traspasaron a tubos Eppendorf.

Posteriormente se centrifugó a 650 g por 3 min, se descartó el sobrenadante y el pellet

se congeló en PBS a -80°C hasta el momento del fraccionamiento subcelular.

Extracción de proteínas para extracción de ARN

Las células fueron lavadas con PBS, luego se les agregó 1 ml de solución de

Chomczynski-fenol y mediante un rastrillo celular se soltaron de la placa y se traspasaron

a tubos Eppendorf, posteriormente se procedió con la extracción de ARN o se guardaron

a -80°C hasta el momento de continuar la extracción.

Extracción de proteínas para ensayo de actividad Luciferasa y β-galactosidasa.

Para estos ensayos enzimáticos, las células transfectadas fueron lisadas utilizando

Reporter Lysis Tampón (RLB), especialmente diseñado para no interferir en la medición

de ambas enzimas. Para esto, las células fueron lavadas 2 veces con PBS y luego se

agregaron 200 µl de RLB para placas de 20 cm2 o placas de 6 pocillos. Posteriormente

las placas fueron incubadas en hielo con agitación por 10 min, se soltaron las células de

la placa y se traspasaron a tubos Eppendorf. Los extractos celulares fueron guardados a -

80ºC hasta el momento de los ensayos.

Cuantificación de proteínas en extractos celulares

Se utilizó el método del ácido bicinconínico, reactivo que forma un complejo colorimétrico

con Cu1+ formado por la reducción alcalina de Cu2+ en presencia de proteínas. 1 a 5 L

de la muestra, previamente diluidos en PBS a un volumen final de 25 L en pocillos de

0,32 cm2, fueron mezclados con 200 L del reactivo de trabajo provisto por el fabricante.

16

Después de mezclar, la placa de 96 pocillos fue incubada por 30 minutos a 37 °C. Se

cuantificó la absorbancia a 562 nm de cada pocillo en un lector de ELISA Bio-Tek modelo

Synergy HT y se determinó la concentración de proteínas totales sobre la base de una

curva estándar construida con albúmina de suero bovino, en un rango de 2 a 12 g

totales por pocillo.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)

Se utilizó geles de SDS-PAGE para la separación de proteínas totales de los extractos

celulares de los cultivos. El gel consistió en un gel concentrador compuesto por

acrilamida al 5%, Tris-HCl 0.125 M pH 6,8, SDS 0,1%, PSA 0.05% y Temed 0,15% , y un

gel separador de acrilamida al 12,5%, Tris-HCl 0,38 M pH 8,8, SDS 0,1%, PSA 0,05% y

Temed 0,15%. Las proteínas se mezclaron con tampón de muestra Tris-HCl 125 mM pH

6,8, SDS 6%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 10% y azul de bromofenol al 0,07%. Las

muestras se hirvieron por 10 minutos antes de ser cargadas en el gel, el cual se corrió

por 1-2 h en un campo eléctrico de 105V constante.

Western Blot

Transferencia: Las proteínas fraccionadas previamente por SDS-PAGE fueron

transferidas a una membrana de Inmobilon de PVDF, utilizando una cámara de

transferencia Bio-Rad modelo Mini-Protean® III Cell. Previo a la transferencia la

membrana es activada por 1 minutos en metanol 100%. El traspaso se realizó a 4º C por

1 h y a 300 mA constante, en una solución tampón que contenía Tris-HCl 25 mM pH 8,4,

glicina 250 mM, SDS al 0,1% y metanol al 20%. La eficiencia del traspaso se determinó

por el uso de estándares de peso molecular preteñidos.

Revelado de la reacción antígeno-anticuerpo: la membrana que contenía las proteínas

transferidas fue incubada por 2 h a 37°C en tampón de bloqueo TBST-Leche (Tris–HCl

20 mM pH 7,0, NaCl 0,1 M, Tween-20 al 0,05% y 5% de leche descremada) para

bloquear los sitios inespecíficos. Luego se agregó en diluciones adecuadas el primer

anticuerpo específico (anti MsrA diluído 1:2000, anti -c-myc 1:400 o anti tubulina 1:2000)

y se incubó con agitación durante 2 h a 37°C o por toda la noche a 4º C con agitación.

Posteriormente, la membrana se lavó 2 veces con agua, y una vez en TBS, se incubó con

el segundo anticuerpo correspondiente diluido 1:10.000 en el tampón TBST-leche y se

17

incubó por 45 minutos a 37°C con agitación. Luego, la membrana fue lavada 2 veces con

agua, una vez por 5 minutos con TBST y 10 minutos en TBS con agitación. Este segundo

anticuerpo estaba conjugado con peroxidasa y el revelado fue hecho con sustrato

quimioluminicente ECL, aplicando distintos tiempos de exposición de la membrana frente

a las películas, dependiendo de la intensidad de luminiscencia.

Ensayo de medición de actividad específica de la MSRA

La actividad específica de la Metionina Sulfóxido Reductasa se determinó mediante la

detección de la reducción del substrato sintético dabsyl-metionina Sulfóxido (dabsyl-

MetO) a dabsyl-Metionina (dabsyl-Met) producto de la acción de esta enzima, protocolo

modificado de Lee et al.2005. El Dabsyl (4-dimetilaminoazobenzeno-4’sulfonil) obtenido

de Pierce, tiene la capacidad de ser conjugado fácilmente con diversos aminoácidos y es

detectado espectrofotométricamente a 436 nm. La mezcla de reacción 15 mM Hepes

(pH 7,4), 10 mM MgCl2, 30 mM CaCl2, 20 mM dithiothreitol (DTT), 0,7 mM dabsyl

Metionina –D-sulfoxido y 0,1 mM Norleucina dabsilada (NL) (estándar interno) y MsrA en

un volumen final de 100 µL fue incubada a 37°C por 30 minutos y la reacción fue

detenida con la adición de 300 µL de acetonitrilo. Después de centrifugar a 10.460 g por

10 min, 60 µL del sobrenadante fue separado por una columna de fase reversa Kromasil

100-3,5C18 (150x4,6 mm). Para el paso por la columna se utilizó una gradiente (de 20%

a 66,7%) de acetonitrilo en tampón de equilibrio (29 mM tampón acetato de sodio pH

4,5), y el derivado de dabsyl y productos fueron monitoreados con el equipo HPLC Merck,

a un flujo de 1 mL/min, con una absorbancia de 436 nm.

Ensayo de actividad de la Luciferasa

Para cuantificar la expresión del gen reportero de la luciferasa en los cultivos, se utilizó el

sistema comercial de Promega, Luciferase Assay System específico para células de

mamíferos. De acuerdo con las recomendaciones del fabricante, todos los reactivos y los

extractos celulares se encontraban a temperatura ambiente. Se mezclaron 20 µl de los

extractos celulares con 100 µl de la mezcla de reacción y se cuantificó la luminiscencia en

un Luminómetro Berthold modelo Sirius, durante los 30 primeros segundos de incubación

a temperatura ambiente.

18

Ensayo de actividad de la β-galactosidasa

Este ensayo se realizó en placas de 96 pocillos con un área de 0,32 cm2 cada pocillo,

donde se agregaron 45 µl de muestra y 100 µl de reactivo ONPG 4 mg/ml en tampón Z

(tampón fosfato 0,1 M pH 7,4, KCl 10 mM, MgSO4 1 mM), y la mezcla se incubó a 37ºC

entre 30-90 min, evitando que llegue a saturación. La reacción se detuvo agregando 55 µl

de Na2CO3 1 M y se determinó la absorbancia a 405 nm de cada pocillo en un lector de

ELISA Bio-Tek modelo Synergy HT.

Ensayo de actividad de la Succinato deshidrogenasa (SDH)

Este ensayo se realizó en placas de 96 pocillos con un área de 0,32 cm2 cada pocillo,

donde se agregaron 200 µl de muestra y 80 µl de la mezcla de reacción compuesta en

concentración final por KH2PO4 50 mM, MTT 60 µg/ml, PMS 120 µg/ml y succinato 10

mM. La mezcla se incubó a 25°C por 30 minutos y se determinó la absorbancia a 570 nm

de cada pocillo en un lector de ELISA Bio-Tek modelo Synergy HT.

Para el cálculo de las unidades por litro (U/L) se utilizó la ecuación:

∆OD

U/L = min x F.D

ε 570 x 0,9 cm

Donde la ∆OD es la diferencia entre la absorbancia a los 30 minutos y la absorbancia a

tiempo cero, F.D es el factor de dilución, ε570 es el factor de extinción a 570 nm( 17.000 M-

1 cm-1 )y 0,9 cm es la altura del volumen final de la mezcla de reacción.

Inmunofluorescencia

Primeramente se agregó al medio celular el marcador de mitocondrias (Mitotracker red o

green) en una dilución final de 1:10.000, y se incubó por 30 minutos a 37°C.

Posteriormente se lavó con PBS-Ca/Mg (0,1 mM Calcio y 1 mM Magnesio) y las células

se fijaron en paraformaldehído al 4% disuelto en PBS por 1 h a temperatura ambiente.

Luego la solución de fijación fue removida y se realizaron 3 lavados de 5 minutos cada

uno con PBS-Ca/Mg para retirar el paraformaldehído, y a continuación las células se

permeabilizaron con PBS 0.2% Tritón X-100 por 5 minutos y bloqueadas con PBS

19

gelatina 0,2%, 2 veces por 5 minutos. Luego del bloqueo, los cubreobjetos se incubaron

con 40 µl del anticuerpo anti-c-myc (Roche) 1:20 en PBS gelatina 0,2% sobre parafilm y

cámara húmeda por 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC. Al día siguiente,

los cubreobjetos se lavaron con PBS gelatina 0,2% tres veces por 5 minutos a

temperatura ambiente, luego se incubó con el 2º anticuerpo anti-mouse Alexa 488 diluído

1:2000 en PBS gelatina 0,2%, por 45 minutos a temperatura ambiente y oscuridad.

Posteriormente, se realizaron 6 lavados de 5 minutos cada uno con PBS gelatina 0,2% en

oscuridad, y un último lavado con PBS por 5 min. Finalmente las células fueron

guardadas a 4ºC en el medio de montaje fluoro mounting médium hasta ser observadas

con un microscopio Nikon de fluorescencia, a un aumento de lente objetivo de 100X.

Microscopia electrónica de transmisión (M.E.T). Determinación con DAB.

a-Inmunodetección para M.E.T

Las células se lavaron con el PBS-Ca/Mg y luego se fijaron en paraformaldehído al 2%

disuelto en PBS por 1 h a temperatura ambiente. Luego, la solución de fijación fue

removida y se realizaron 3 lavados de 5 minutos cada uno con PBS-Ca/Mg para retirar el

paraformaldehído, a continuación las células se permeabilizaron con PBS 0,1% BSA y

0.2% Tritón X-100 por 5 minutos y luego se bloqueó con PBS 0,1% BSA, 2 veces por 5

minutos. Luego del bloqueo, los cubreobjetos se incubaron con 40 µl del anticuerpo anti-

c-myc (Roche) 1:20 en PBS 0,1% BSA sobre parafilm y cámara húmeda por 2 h a

temperatura ambiente o por toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, los cubreobjetos se

lavaron con PBS 0,1% BSA tres veces por 5 minutos a temperatura ambiente, luego se

incubó con el 2º anticuerpo anti-mouse HRP diluido 1:2000 en PBS 0,1% BSA por 45

minutos a temperatura ambiente y oscuridad. Posteriormente, se realizaron 6 lavados de

5 minutos cada uno con PBS 0,1% BSA, y por último se incubaron con 3,3´-

diaminobencidina (DAB) 1 mg/ml, Tris-HCl 0,1M y 3% H2O2, por toda la noche a

temperatura ambiente.

Para la caracterización morfológica subcelular, a las células en la etapa de la fijación se

les adicionó glutaraldehído al 0,25% disuelto en tampón fosfato pH 7, además de

paraformaldehído al 2%, y fueron pasadas directamente al montaje sin la inmuno

detección.

20

b-Montaje de células para M.E.T.

En primera instancia se lavaron las muestras, ya fijadas, en tampón cacodilato 0,1 M

pH7,2 por 10 minutos a temperatura ambiente, luego se incubó con OsO4 1% acuoso, se

deshidrató con lavados sucesivos de etanol al 50%, 70%, 95% y 100% por 10 minutos

cada uno, y por último dos veces en acetona-etanol 1:1, se incubó en EPON-acetona por

30 minutos a temperatura ambiente, luego se realizó una preinclusión en EPON pura por

1 h, y la inclusión final fue en EPON fresca por 1 h, dejándola polimerizar a 60°C por 24

h. De los bloques generados se obtuvieron cortes semifinos de 1-2 micrones sin teñir, los

que fueron observados en microscopio OlympusCX31, y posteriormente se les realizaron

cortes finos de 80 nm en un ultramicrotomo Sorvall MT-5000. Los cortes finales se

observaron en Microscopio Electrónico de transmisión Philips Tecnai 12A-80KV.

Microscopia electrónica de transmisión (M.E.T). Determinación con Oro.

a-Montaje de células para la detección con Oro.

La células se centrifugaron hasta formar un pellet sin fijación previa, luego se deshidrató

con lavados sucesivos de etanol al 50%, 70%, 95% y 100% por 10 minutos cada uno, se

incubó en resina LR-white 1:1 y posteriormente en resina pura polimerizada a 50 °C. Una

vez polimerizada se realizaron cortes finos en un ultramicrotomo Sorvall MT-5000, los

cuales se montaron en una grilla de Níquel para posteriormente realizar la inmuno

detección con oro.

b-Inmunno detección con Oro.

El corte de células ya montadas en la grilla de Níquel se bloquearon por 30 minutos con

PBS1%BSA (Bovine Serum albumine), luego se incubaron por 10 minutos con PBS

0,05% Tritón X-100, incubó durante la noche a 4°C con anticuerpo primario anti-myc,

contenido en suero de hibridoma. Posteriormente se lavó tres veces con PBS 0,1% BSA

Tritón e incubó con segundo anticuerpo anti mouse asociado a Oro por 2 h a temperatura

ambiente, se lavó tres veces nuevamente con PBS 0,1% BSA , se enjuagó una vez con

agua destilada y procedió a teñir con acetato de uranilo acuoso al 1% y citrato de plomo

(Reynolds,1963) para finalmente observar en Microscopio Electrónico de transmisión

Philips Tecnai 12A-80KV.

21

Fraccionamiento subcelular

Las células congeladas previamente en PBS fueron centrifugadas a 650 g por 3 minutos,

y el pellet fue resuspendido en el primer tampón (A) del sistema comercial de purificación

de mitocondrias para células de mamíferos (Mitochondria Isolation kit for mammalian

cells) de Pierce, basado en separación de fracciones subcelulares por centrifugación

diferencial y homogenización por “dounce”. Así, resuspendidas en el tampón A fueron

sonicadas en el equipo Micro Ultrasonic Cell Disrupter KONTES (Woodstock, CT. USA) 2

veces a 0,5 output por 15 segundos, en hielo. Luego se continuó con el procedimiento

recomendado por el proveedor del sistema comercial.

Técnicas de Biología Molecular

Purificación de plasmidios recombinantes

Las bacterias de la cepa DH5α que contenían los plasmidios de interés fueron crecidas

en medio líquido LB, ampicilina (100 µg/ml), a 37º C y bajo agitación de 65 g durante la

noche. Para la purificación de plasmidios a pequeña escala (5 ml de cultivo bacterial), el

procedimiento utilizado fue el recomendado por el proveedor del sistema comercial

“Axygen Plasmid MiniPrep Kit”, basado en el método de la lisis alcalina. Este método

permitió preparar entre 5 a 18 g de plasmidio, el que fue analizado con enzimas de

restricción o por su directa secuenciación.

Para la purificación a mediana escala (80 ml de cultivo bacterial), el procedimiento

utilizado fue el recomendado por el proveedor del sistema comercial “Plasmid MidiPrep

kit” de Qiagen, también basado en el método de la lisis alcalina mencionado

anteriormente. Con este método se obtuvo alrededor de 250 g de plasmidio libre de

ARN y cuya pureza permitió su utilización en la transfección de cultivos de líneas

celulares, para lo que se tuvo especial cuidado de resuspenderlos en agua estéril.

Digestión de los plasmidios recombinantes con enzimas de restricción

Para las digestiones, se incubó el ADN (0,2 a 1,0 g) con 1-10 unidades de enzima de

restricción en un volumen final de 25-50 l durante 2 h a 37º C y en presencia de la

solución de reacción recomendada por el fabricante de la enzima. Los fragmentos de

ADN obtenidos fueron separados por electroforesis en geles de agarosa.

22

Electroforesis de ADN en geles de agarosa

Los fragmentos de ADN o plasmidios recombinantes fueron separados mediante

electroforesis en geles horizontales de agarosa entre 0,8 a 1,5% (p/v) dependiendo del

tamaño del ADN. Los geles de agarosa se realizaron en tampón TBE 1x (Tris-HCl 89 mM;

ácido bórico 89 mM; EDTA 2 mM; pH 8,8) y se agregó bromuro de etidio (BrEt) a una

concentración final de 0,3 g/ml. Las muestras se cargaron al gel en amortiguador de

carga, donde ¼ de su volumen corresponde a glicerol 20% v/v; sarcosil 0,1% p/v; azul de

bromofenol 0,1% p/v; EDTA 25 mM. Como tampón de corrida se utilizó TBE 1x.

Normalmente se aplicó un campo eléctrico de 80V por 1 a 1,5 h. Finalmente, se

visualizaron los fragmentos de ADN en un transiluminador UV y se fotografío utilizando

una cámara digital Cannon de 5,0 megapixeles.

Purificación de fragmentos de ADN

Para purificar fragmentos de ADN desde geles preparativos de agarosa, se utilizó el

sistema comercial Rapid gel extraction system de Axygen, para lo cual se siguieron las

recomendaciones del fabricante.

Obtención de fragmentos de ADN por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

Generalidades de la reacción de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está basada en repetidas reacciones de

polimerización de una determinada zona de un ADN. Esta reacción es catalizada por la

ADN polimerasa Taq de la bacteria termofílica Thermus aquaticus (en esta tesis se utilizó

la variante denominada Platinum que posee un anticuerpo adherido a la enzima, la cual

se activa después de someterla a 95ºC por 5 min), mediante el uso de dos

oligonucleótidos como partidores específicos, que son complementarios a un templado

cualquiera de ADN, y que permiten el inicio de la reacción de polimerización.

Las reacciones se realizaron en un termociclador de Perkin Elmer (GeneAmp PCR

System, modelo 2400), en un volumen final de 25 l y los componentes de la mezcla de

reacción fueron los siguientes: templado de ADN, amortiguador de la ADN polimerasa

Taq 1x (Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM); dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 0,2 mM cada

uno, MgCl2 1,5 mM, partidores 1,5 µM cada uno y 2,5 unidades de ADN polimerasa taq.

Los ciclos de PCR utilizados para la obtención de cada fragmento variaron dependiendo

23

del Tm de cada partidor (temperatura óptima estimada para la hibridación del partidor con

el ADN) y del largo del fragmento deseado.

Las secuencias y las Tm de los partidores utilizados en esta tesis se describen en la tabla

I. La estimación de la Tm de los partidores se realizó mediante la siguiente ecuación:

Método "GC": para partidores con más de 13 nucleótidos.

Después de cada reacción, los productos se mantuvieron a 4ºC hasta que fueron

verificados mediante electroforesis en gel de agarosa para comprobar su

correspondencia de tamaño.

Extracción de ARN

Se agregó a células en cultivo 1 mL de solución Chomczyski-fenol, se arrastraron y

congelaron a -80°C. Posterior a su descongelación se les agregó 200 µl de cloroformo,

se agitó e incubó por 10 minutos en hielo. Luego fueron centrifugadas a 12.200 g por 15

minutos a 4°C, la fase acuosa se trasladó a un tubo Eppendorf limpio y se le agregó igual

volumen de isopropanol para precipitar a -80°C por 2 h. Posteriormente se centrifugó a

12.200 g por 15 minutos y el pellet fue lavado dos veces con etanol 70% (en agua con

DEPC) y centrifugado a 12.200 g por 15 minutos, luego fue secado por 10 minutos a

temperatura ambiente y resuspendido en aproximadamente 45 µl de H2O (con DEPC).

RT-PCR

Tratamiento con DNAasa

Las muestras de ARN fueron tratadas con DNasa Turbo (Ambion) para eliminar las

trazas de ADN plasmidial residual que pudiese quedar, para ello se les agregó 5 µl del

tampón 5x específico del sistema comercial y 1 µl de la enzima correspondiente a 2U en

un volumen final de 50 µl, y fueron incubadas por 30 minutos a 37°C, luego se detuvo la

reacción agregando 5 µl del tampón de inactivación y se incubó a 65°C por 10 minutos. A

continuación se procedió con la transcripción reversa in vitro o se congelaron a -80°C

hasta retomar el procedimiento.

24

Transcripción reversa in vitro

Para 10 µl de muestra con aproximadamente 1 µg de ARN se incubó primero con 1 µl de

los partidores ramdom y 1 µl de dNTP´s (10 mM) a 65°C por 5 minutos, luego se agregó 4

µl de tampón 5x, 2 µl de DTT y 1 µl de RnasaOUT (inhibidor de RNasa) y se incubó 2

minutos a 37°C, finalmente se agregó 1 µl de la enzima transcriptasa reversa M-MLV

(Invitrogen) e incubó 10 minutos a 25 °C y posteriormente por 50 minutos a 37°C. Para

inactivar la reacción se llevó la mezcla a 70°C por 15 minutos y las muestras con el

ADNc obtenido fueron utilizadas para la amplificación de ADN con partidores específicos,

por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Cuantificación de ADN y ARN

Se cuantificó el ADN y ARN a través de la medición de la absorbancia a 260nm, donde

los ácidos nucleicos tienen su máxima absorción, con el equipo Bioftometro Eppendorf

(Eppendorf AG, Hamburg), que entregó complementariamente además las longitudes de

280 nm y 230 nm, y las razones entre ellas. La concentración en µg/ml se midió en una

solución de 2 µl de la muestra de ADN o ARN en un volumen final de 50 µl de H2O.

Ligación de fragmentos de ADN y plasmidios

La ligación entre el producto de PCR purificado y el plasmidio pGemT-Easy, se realizó

mezclando cada uno en una relación molar aproximada de 3:1, utilizando la ADN ligasa

T4 y el tampón de reacción, ambos obtenidos de Promega, siguiendo las indicaciones

del fabricante. La reacción se realizó en un volumen final de 10 l con 50 a 100 ng de

plasmidio, tampón de ligación 1X y 3 unidades de ADN ligasa T4. La reacción se

incubó a 16º C por toda la noche y luego la mezcla de ligación completa se utilizó para

la transformación de E. coli DH5α competentes.

Se procedió de la misma manera para la ligación a los vectores pGL2-Basic, pcDNA 3.1 y

pcDNA3.1 Myc-His, previa digestión de estos vectores y de los fragmentos ya

secuenciados que se encontraban en los vectores de clonamiento con enzimas de

restricción exclusivas, que permitieron la hibridación entre los vectores y los fragmentos.

25

RESULTADOS

OBJETIVO ESPECIFICO 1

Analizar la distribución subcelular de la enzima MSRA-1 de C.elegans.

1a. Análizar la expresión de la enzima MSRA-1 en condiciones de cultivo celular, en

particular determinar su expresión mitocondrial y citosólica.

La secuencia génica que codifica para la enzima Metionina Sulfóxido reductasa A en C.

elegans (msra-1) fue descrita por Lee et al., 2005. La región codificante corresponde a

621 pares de bases, la cual se amplificó por RT-PCR y posteriormente se clonó en el

vector de expresión pcDNA3.1mycA(+) (pcDNAmsrA620c.e.myc). Este plasmidio se

utilizó para transfectar transientemente células de la línea celular de mamíferos Hela

(ATCC). La expresión de la enzima en estas células fue evaluada por medio de

inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos anti-myc como anticuerpo primario,

y anti-mouse Alexa488 (Molecular Probes) como secundario. Como muestra la Figura 1

la distribución subcelular de esta proteína se localiza particularmente en las mitocondrias

ya que colocaliza con el patrón mostrado por el marcador mitocondrial Mitotracker red

(Molecular Probes), (Figura.1 A, D , G).

La expresión de la MSRA-1 se evaluó por Western blot, con los correspondientes

extractos celulares de los cultivos celulares (Hek293T) transfectadas, se ocupó el mismo

anticuerpo anti-c-myc como primario y un secundario anti mouse HRP. La Figura 2

muestra la expresión de la proteína con un peso esperado de acuerdo a la secuencia

génica y al epitope myc, similar a la proteína MsrA humana usada como control de la

expresión.

Se midió la actividad reductora específica de la enzima MSRA-1 mediante el ensayo de

reducción de Dabsyl-metionina oxidada (Dabsyl-MetSO) medido por HPLC de fase

reversa, método por el cual se obtuvo un 73% mas de actividad sobre la basal. Así se

pudo corroborar la sobreexpresión de MSRA-1 en células Hek293T transfectadas

transientemente y con ello que nuestra proteína perteneciente C.elegans es funcional

(Figura 3 Tabla 2).

D E

G

F

H I

A B C

D E F

G H I

Figura 1. Determinación de la distribución subcelular de la MSRA-

1 por Inmuno florescencia indirecta. Células Hela transfectadas con

pcDNA msra620c.e.myc La detección de la MSRA-1 fue realizada con

anticuerpos anti-c-myc (Roche) y anticuerpos secundarios anti mouse

Alexa 488 (Molecular Probe). En los paneles verticales se encuentran

las fotografías obtenidas por microscopia de fluorescencia de células

transfectadas con pcDNAmsra620c.e.myc (paneles A, D y G), luego los

controles negativos transfectadas con el vector vacío (paneles B,E y H)

y células no tranfectadas (paneles C,F e I). En orden descendente se

puede observar la tinción obtenida con el anticuerpo anti-c-myc (verde),

en segundo lugar la tinción mitocondrial (rojo) y por último de color

amarillo los lugares donde ambas tinciones colocalizan .

A B C

D E F

G H I

26

KDa

~34

~26

Figura 2. Comparación de la expresión

de la MsrA humana y de la MSRA-1 de

C. elegans. Western blot utilizando

anticuerpos contra el epítope Myc. Carril 1

extracto de células Hek293T transfectadas

con pcDNA.msrah.myc (MsrAh.myc), y

carril 2 células Hek293T transfectadas con

pcDNA msra620c.e.myc (MSRA-1.myc).

En cada carril se cargaron 160 µg de

proteína de los respectivos extractos

celulares.

Contr

ol (ve

ctor

vaci

o)

MSRA-1

C.e

.

0

50

100

150

200

*

Act

ivid

ad

esp

ecíf

ica

(%

del

co

ntr

ol)

(nM

Met

/ug

pro

teín

as/

min

)

Extracto celulares de cultivos

Transfectados

Promedio de Actividad específica ( nM met/µg de

proteínas/min)

Promedio de porcentajes de actividad respecto a células sin

transfectar

MSRA-1 C.e. 2,285 173% Control (Vector vacio) 1,452 100%

MsrAh purificada(control+) 212,564

Tabla 2 . Muestra la actividad reductora específica de la MSRA-1 obtenida en

extractos proteicos de Hek293T transfectadas con MSRA-1c.e.

1 2

MsrAh-myc MSRA-1-myc

Figura 3. Cuantificación de la

actividad reductora específica en

extractos celulares que expresan

MSRA-1 de C. elegans. Se

utilizaron 10 µg de proteína totales

obtenidas en cada uno de los

extractos celulares. Detalles del

ensayo de actividad de la MSRA-1

ver la sección de Materiales y

Métodos. n=3, p=0,0123

27

28

Una vez obtenida la expresión del clon de MSRA-1, se prosiguió con la estandarización

de la técnica de fraccionamiento subcelular para la obtención de un extracto proteico

mitocondrial con la mínima contaminación citosólica. Posteriormente se realizó un análisis

comparativo, a través de Western blot, de la expresión de MSRA-1 en las fracciones

mitocondrial y citosólica.

Con el fin de obtener una mayor lisis celular y la liberación de las mitocondrias, se

introdujo una variación a la técnica de separación mitocondrial indicada por la guía del kit

Pierce (Isolation Mitocondrial Kit), en el proceso de lisis se agregó la sonicación de 2

pulsos de 15 segundos ( 0,5 output ) a las muestras celulares resuspendidas en el primer

tampón (A). Así mediante la observación de una gota de las células bajo microscopio

después de lisarlas (datos no mostrados), junto a la posterior medición de actividad de la

Succinato Deshidrogena (SDH) una vez obtenidas las fracciones, tanto de las células

Hek293T con sonicación como de aquellas que no eran sonicadas, se pudo concluir que

se obtuvo una mejor lisis celular y mayor pureza de la fracción mitocondrial en aquellas

que fueron sonicadas (Figura.4).

Cito

sólic

a

Mito

condri

al

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

Con sonicación

Sin sonicación

Act

ivid

ad

SD

H/u

g p

rote

ína

s

Figura 4. Comparación de la

actividad de la enzima

Succinato Deshidrogenasa.

En los extractos proteicos de

las fracciones citosólica y

mitocondrial, de células

Hek293T con sonicación y sin

sonicación, n=1.

29

Con el objeto de analizar cuantitativamente la expresión de la MSRA-1 en mitocondrias,

se procedió a la ejecución de un fraccionamiento subcelular en células transfectadas con

pcDNA.msra620c.e.myc. La Figura 5A muestra la expresión de la MSRA-1 las fracciones

subcelulares mitocondrial y citosólica. La cuantificación de la presencia de esta enzima se

realizó mediante la medición de la densitometria de las bandas y su tamaño a través del

programa Quantity One. La Figura 5B muestra que el 80% de la expresión de la MSRA-1

corresponde a la presente en la fracción mitocondrial. Para determinar la pureza de las

fracciones se utilizaron dos indicadores; la actividad SDH (que mayoritariamente se

destina a las mitocondrias) (Figura 5C) y la detección de tubulina (presente sólo en la

fracción citosólica) por medio de anticuerpo anti tubulina monoclonal, en el caso del

Western blot (Figura 5A).

Mediante microscopia electrónica de transmisión se analizó tanto la morfología subcelular

de aquellas células que sobreexpresaban MSRA-1, como la inmuno detección de MSRA-

1 a través de la utilización de los anticuerpos anti-c-myc y anti mouse-HRP (horse rabbit

peroxidase), este último como anticuerpo secundario. Para lo que se utilizó la reacción de

diaminobencidina (DAB) con la peroxidasa unida al anticuerpo secundario, lo que generó

un precipitado oscuro (Figura 8) , también observable bajo microscopio electrónico.

La morfología mitocondrial de aquellas células Hek293T transfectadas con

pcDNA3.1msra-1.myc, es diferente a aquellas transfectadas con el vector vacío y no

transfectadas, pues mostraron en apariencia una mayor densidad óptica (Figura 6C y D),

misma característica observable en células transfectadas con pcDNA3.1 msrahuman.myc

(Figura 6E), lo que se observa de igual forma en otro tipo celular como las células de

cultivo Hela (Figura 7).

La inmuno detección asociada a DAB generó un precipitado de predominancia

mitocondrial lo que es observable en la Figura 9 (flechas negras), que también se logró

con la inmuno detección asociada a oro (Figura10), sugiriendo que la MSRA-1 tiene una

ubicación preponderante en este compartimiento subcelular, y aparentemente en la

matriz mitocondrial.

Mit

MSR

A-1

.Myc

c.e

Cit

MSR

A-1

.Myc

c.e

Mit

Hek

293T

(co

ntr

ol-

)

Cit

Hek

293T

(co

ntr

ol-

)

Msr

Ah

.Myc

(co

ntr

ol+

)

Mito

condria

l

Cito

sólic

a

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

**

De

ns

ito

me

tria

(ra

zó

n)

mito

cond

rial

cito

sólic

o

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

Ac

tiv

ida

d S

DH

(uM

ole

s/m

in *

LT

)B C

A

Figura 5. Análisis de la expresión de la enzima MSRA-1.myc en las fracciones

mitocondriales y citosólicas en células Hek293T. A) Western blot realizado con

anticuerpos primarios anti-c-myc (Roche) y anti tubulina monoclonal, por separado, mas

anticuerpo secundario anti mouse HRP. Se utilizó como control negativo fracciones

obtenidas de células Hek293T sin transfectar y como control positivo extracto de células

transfectadas con MsrA humana fusionada al epítope myc. En cada carril se cargaron 10

µg de extracto de proteínas para cada fracción. B) Gráfico que muestra el análisis de

densitometría realizada a las bandas obtenidas del Western blot, con un n=3, p=0,0031. C)

Cuantificación de la actividad de la SDH obtenida en las fracciones mitocondrial y

citosólica (mayores detalles del ensayo en seccion Materiales y Métodos) n=3.

30

A

B

D

C

E

Figura 6. Fotografías obtenidas con microscopia electrónica de

transmisión (MET) de células Hek293T. A) Células Hek293T sin

transfectar. B) Hek293T transfectadas con el vector pcDNA3.1.MYC vacío.

C) Hek293T transfectadas con MSRA-1. D) Hek293T transfectadas con la

mitad de la concentración de cDNA de MSRA-1. E) Hek293T transfectadas

con MsrA humana. Paneles de la izquierda: Menor aumento, muestra célula

completa. Paneles a la derecha: ampliaciones de las imágenes, detalle de

mitocondrias.

31

A

B

A

C

B

D

Figura 7. Fotografías obtenidas con microscopia electrónica de transmisión

(MET) de células Hela. A) Células Hela sin transfectar. B) células transfectadas

con MSRA-1.

Figura 8. Fotografías obtenidas con microscopia de transmisión, que

muestra el precipitado de DAB frente a peroxidasa utilizada para inmuno

detección de la MSRA-1. A) células Hek293T sin transfectar. B) células

transfectas con pcDNA.msrah.myc. C y D) células transfectadas con

pcDNA.msra-1.myc. Magnitud 100X.

32

A B

C D

Figura 9. Inmunodetección de la MSRA-1 asociada a HRP obtenida con

microscopia electrónica de transmisión (MET). La metodología de tratamiento

para células Hek293T transfectadas con MSRA-1 fue la inmuno detección indirecta

de epítope Myc, ocupando como anticuerpo secundario anti mouse-HRP y detección

por reacción con DAB. A) escala de 5.0 µm B) escala de 2.3 µm C) escala de 1.4

µm D) escala de 1.7 µm con diferente mezcla de fijación. Flechas negras: indican

precipitado DAB. Flechas blancas: indican mitocondrias.

33

A

B

D

C

E

F

H

G

Figura 10. La enzima MSRA-1 se localiza en las mitocondrias de las células.

Fotografías obtenidas mediante microscopia electrónica de transmisión (MET) con

inmuno detección asociada a Oro. La metodología de tratamiento para células

Hek293T transfectadas con MSRA-1 fue la inmuno detección indirecta del epítope

Myc, ocupando como anticuerpo secundario anti mouse-Au (oro). A-D) Control

negativo de células HEK293T transfectadas sin incubación con el primer anticuerpo. E-

H) Células Hek293T transfectadas e incubadas con anticuerpos anti-myc monoclonal

(suero de hibridoma) como primario y anti mouse-Au como secundario. 34

35

OBJETIVO ESPECÍFICO 2

Determinar el epítope de destinación mitocondrial de la enzima MSRA-1 de

C.elegans.

2.a-Análizar la secuencia aminoacídica de la MSRA-1 y modelamiento molecular.

2.a.1-Análisis estructura primaria:

Con el fin de determinar la existencia de epítopes de destinación subcelular según la

estructura primaria de la MSRA-1, se introdujo la secuencia aminoacídica en diferentes

programas de predicción de destinación mitocondrial y a otros compartimientos celulares

por unión a la membrana, entre ellos el MitoProt II (Claros and Vincens, 1996), MitPRED

(Kumar et al., 2006) y PreDotar (Small et al., 2004). Los resultados obtenidos de los

análisis indicaron una baja probabilidad de destinación a algún compartimiento subcelular

específico. Para complementar esta información, se decidió alinear la secuencia de ADN

completa de MSRA-1 (de C.elegans) con las secuencias de distintas especies de MsrA,

de conocida destinación mitocondrial y así analizar sus similitudes.

2.a.1.1-Alineamiento de la secuencia de la MSRA-1 con la MsrA humana.

La MsrA humana tiene una conocida distribución mitocondrial, donde un epítope de 23

aminoácidos perteneciente a su N terminal determinan su destinación a este organelo.

Estos aminoácidos serían dispensables para la actividad de la enzima (Hansel et al.,

2002). Se alineó la secuencia de 207 aminoácidos de la MSRA-1 con los 235

aminoácidos de la MsrA humana, y de igual forma con sólo el epítope de 23 aminoácidos

a través del programa SIM (Evaluate the significance of this protein sequence similarity

score using PRSS at EMBnet-CH). Obteniéndose un 36,3% de similitud entre las dos

secuencias completas (Figura 11A). Con la comparación entre los epítopes N terminal de

las MsrAs humana y de C.elegans se obtuvo similitud en 2 secuencias cortas

pertenecientes a los N terminales de ambas enzimas (Figura 11B). Entre ellas llama la

atención dos argininas, una en posición 6 (R6) y otra en posición 30 (R30), cuyas símiles

serían R7 y R22 en la MsrA humana, para las cuales estudios previos indican que, al ser

mutadas cada una por separado, generan una pérdida de destinación mitocondrial de

36

manera similar a la provocada por la extracción del epítope por completo (Hansel et al.,

2002). Estas argininas son conservadas igualmente en otras especies que poseen al

menos una isoforma mitocondrial, tales como las MsrA de rata y ratón (Kim H et al.,

2005).

Esta región de la MSRA-1, presenta la secuencia GCFWG en estrecha cercanía a estas

argininas, la cual se postula como posible sitio catalítico, basado en la secuencia de

consenso QCFWG determinada como tal para Metioninas Sulfóxidos Reductasas de

otras especies. Por lo cual y debido a su extrema cercanía al N-terminal de la enzima, la

mutación de esta zona podría interferir en los estudios que apunten a determinar un

epítope en esta zona.

MsrAhuman, 66 QMAVFGMGCFWGAERKFWVLKGVYSTQVGFAGGYT SNPTYKEVCSEKTGHAEVVRVVYQP

MSRA-1 5 ER AYFGLQCFWG- ESAWAKLKGVVVTRVGYAGGKQPNPTYKNI---------KDHT E I T E I T DP

* ** **** * ** ** * ** *** ***** * * *

MsrAhuman, 126 EHMSFEELLKVFWENHDPTQGMRQGNDHGTQYRSAIYPTSAKQMEAALSSKENYQKVLSE

MSRA-1 60 KVI EYSKLTNFFWKHHNPAERRKK------------ QYQSAILYVNDDQK KVA----EETLKVAKDK

* ** * * ** *** * * *

MsrAhuman, 186 HGFGPITTDIREGQTFYYAEDYHQQY

MSRA-1 111 H---GDIETYIEPLDKFYQAEDYHQKY

* * * * * ** ****** *

MsrAhumanN 7 RA 20 VPRMG MSRA-1 6 RA 28 VTRVG

* * * * *

Figura 11. Resultados del análisis de la secuencia de la MSRA-1 y MsrA humana

con el programa de alineamiento SIM. A) Secuencia 1: MsrA humana, (235 residuos).

Secuencia 2: MSRA-1, (207 residuos). 36.3% de identidad en 146 residuos B) Secuencia

1: srAhumanaNH2.23aminoácidos (28 residuos). Secuencia 2: MSRA-1, (207 residuos)

60.0% de identidad en 5 residuos overlap 100.0% identidad en 2 residuos overlap; Score:

9.0; Gap frequency: 0.0%.

A

B

37

2.a.1.2- Alineamiento de la MSRA-1 con la MsrA de ratón y de rata:

Asimismo trabajamos con el péptido señal de 20 residuos del N-terminal de la MsrA de

ratón (Kim H et al., 2005), el cual pertenece a un grupo de péptidos predichos como

señales de destinación mitocondrial en las enzimas de bovino, rata y humano (Figura

16).

La señal de ratón fue alineada con la secuencia completa de C.elegans, encontrando

coincidencias similares a la humana, es decir, existe alta similitud en las secuencias

cortas cercanas al N terminal, se conservan las Argininas tanto en la MsrA de ratón

como en la de rata y la humana, que en el caso de esta última son claves en su

disposición mitocondrial (Figura 12A). En el caso comparativo con su homóloga en rata

existe un 37,7% de similitud (Figura 12B), siendo un poco más alta que con la humana.

Figura 12. Resultados del análisis con el programa de alineamineto entre las

secuencias de MSRA-1 y MsrA de rata y ratón. A) Secuencia 1: MSRA-1, (207

residuos). Secuencia 2: N-term MsrA ratón (20 residuos). B) Secuencia 1: MSRA-1

(207 residuos). Secuecia 2: Msra. Rata (233 residuos)

2.a.1.3-Alineamiento con MsrA de Arabidopsis thaliana :

Otro resultado llamativo es la similitud encontrada con el N-terminal de 54 aminoácidos

perteneciente a la MsrA de Arabidopsis thaliana, involucrado en el destino a la región

100.0% identidad en 2 residuos

MSRA-1 6 RA Nmsra ratón 7 RA

** 66.7% identidad in 3 residuos

MSRA-1 28 VTR

Nmsra ratón 18 VRR

* *

37.7% identidad en 146 residuos

MSRA-1 5 ERAYFGL QCFWG- ESAWAKLKGVVVTRVGYAGGKQPNPTYKNI--------KDHTE I TE I T FDP

Msra.rata 64 QMAVFGMGCFWGAERKFWL LKGVY STQVGFAGGYTRNPTYKEVCSEKTGHAEVVRVVYRP

* ** **** * **** * ** *** ***** * * *

MSRA-1 60 KVIEYSKLTNFFWKHHNPAERRKK-------------QYQ SAI LYVNDDQKKVA------- EET LKV--AK

Msra.rata 124 EHVSFEELLKVFWENHDPTQGMRQGNDCGTQYRSAVYP T SAVQMEAALKSKEEYQKVLSK

* ** * * ** ** * * ** ** *

MSRA-1 109 DKHGDIETYIE P LDKFYQAEDYHQKY

Msra.rata 184 HGFG P ITTDIREGQVFYYAEDYHQQY

* * * * ** ****** *

A B

38

plastidial de este organismo. Esta secuencia es rica en Serinas, el cual incluye los

aminoácidos QCFWG, predichos como principales participantes de la actividad catalítica

de estas enzimas, y que en el caso de la MSRA-1 sería la secuencia GCFWG, la que

está particularmente mucho más cercana al N terminal. Por lo tanto, la inclusión del sitio

catalítico dentro del epítope plastidial en A. thaliana podría llevarnos a no descartar que

el N-terminal de MSRA-1 tenga la clave en su destinación mitocondrial (Figura 13).

MSRA-1 7 AYFGLQCFWG

MsrAar 38 AQFGAGCFWG

* ** * * * *

Figura 13. Resultados del análisis con el programa de alineamiento SIM.

Secuencia 1: MSRA-1 (207 residuos). Secuencia 2: MsrA Arabidopsis thaliana (50

residuos). 70.0% de identidad en 10 residuos sobrepuestos.

2.a.2-Análisis de la estructura secundaria del N-terminal de la MSRA-1:

El análisis sobre la relación entre los epítopes de destinación mitocondrial en diversas

especies, generó una lista de aquellos parámetros que debían cumplir las secuencias

proteicas. Entre estos podemos destacar un alto porcentaje de Argininas, Leucinas y

Serinas (R, L y S) y una gran probabilidad de conformar estructura secundaria alfa hélice

(o un alto momento helical) con alta hidrofobicidad (Heijne et al., 1986).

Al introducir la secuencia completa de la MSRA-1 en el programa de predicción de

estructura secundaria Lpred3, los resultados muestran una alta probabilidad de formar

una alfa hélice en los primeros 20 aminoácidos del N-terminal (Figura 14), que son los de

nuestro interés. Esto dejaría expuestos para un mismo lado un conjunto de aminoácidos

no polares como L, W, A y F (Figura 15), que podrían colaborar en un posible anclaje y/o

entrada a la membrana mitocondrial.

39

MAYLERAYFGLQCFWGESAWAKLKGVVVTRVGYAGGKQPNPTYKNIKDHTEITEITFDPKVIEYSKLTNFFWK

----HEHHHH------HHHHH----EEEEEEEEE---------------EEEEEEEE------HHHHHHHHHH HHNPAERRKKQYQSAILYVNDDQKKVAEETLKVAKDKHGDIETYIEPLDKFYQAEDYHQKYWFRQKKILFDEL H-----------EEEEEE--HHHHHHHHHHHHHHHH----EEEEEE--------HHHHHHHHH---------- SLLDTQVAEGELATKLNAYCAGFQDFHDLERLAKEYGLKDSFVNKVKDYALSGGDPRNCHA

----------- HHHHHHHHH------HHHHHHHH-----HHHHHHHHHHHH----------

Figura 14. Resultado de la predicción de estructura secundaria de la MSRA-1 por

Lpred3.H: hélice alfa y E: lámina beta. Letras en rojo: Argininas en estudio. Letras en

celeste: aminoácidos involucrados en actividad catalítica. Flechas: propuesta de corte del

N terminal.

Asimismo, considerando además la alta similitud existente entre la MSRA-1 y las enzimas

reductasas de algunos mamíferos como el humano y la rata, nos lleva a pensar que el

Figura 15. Diagrama de la

estructura de alfa hélice para

los primeros 20 aminoácidos de

MSRA-1, obtenido por el

programa helical Wheel alpha

rotational for trnasm, escala

selecionanda kPROT. Círculos

rojos: aminoácidos no polares.

Circulo negro: Arginina en

posición 6.

40

epítope de destinación podría estar muy relacionado con lo observado en estas especies,

es decir, encontrarse en la región N terminal, donde se predice la presencia de un alfa

hélice y en base a sus aminoácidos no polares interactuar con la membrana de la

mitocondria para así poder ingresar a ésta.

Un aspecto que podría interferir con lo anteriormente propuesto es la cercanía del

predicho sitio catalítico dentro de la MSRA-1, que en las otras especies se encuentra

lejos del N-terminal (Figura 16). Sin embargo, no está comprobado que en C.elegans la

secuencia QCFWG sea el sitio catalítico, a pesar de su semejanza con la secuencia de

consenso GCFWG.

Figura 16. Alineamiento de secuencias de MsrAs de mamíferos: de ratón, humana,

de rata y bovina. Se muestra la estructura secundaria basada en la secuencia MsrA

bovina. De rojo: el sitio activo más Cys 218 y Cys227. En verde. Los péptidos señales

para mitocondria predichos para cada especie. Información y esquema obtenido de Kim

H et al., 2005.

41

2.a.3-Análisis estructura terciaria:

Utilizando la estructura terciaria generada por el programa RasMOl-theorical model,

pudimos visualizar la posición de las argininas R6 y R30 de la MSRA-1 (Figura 17). Este

modelo muestra que estas argininas se ubican superficialmente y se enfrentan a manera

de pinzas (Flecha en Figura 17), lo que apoya la idea que podrían estar involucradas en

la interacción con alguna proteína o con la misma membrana mitocondrial para la

destinación hacia su interior.

De acuerdo con los datos obtenidos por el análisis de la secuencia de la MSRA-1, se

generaron dos clones que dan origen a dos proteínas truncadas, construidas a partir de la

Arg30

Arg6

Figura 17. Estructura terciaria propuesta para la MSRA-1 a través del programa

RasMOl-theorical model (swiss-model server An Automated Comparative Protein

Modelling Server) basado en la similitud con la secuencia cristalizada de la MsrA de

E.coli (porcentaje de identidad de un 36,486%). En rojo: Arginina en posición 30. En

verde: Arginina en posición 6. Flecha: apunta sector de posible interacción con otras

proteinas.

42

enzima completa (620msra-1: RA1019). El primero, una proteína carente de los primeros

10 aminoácidos (-10Nmsra-1: RA1036) en el cual se elimina la primera Arginina de

interés (R6), y el segundo, que codifica para una proteína carente de los primeros 20

aminoácidos (-20Nmsra-1: RA1039) que retira la R6 y el propuesto sitio catalítico

QCFWG (Figura18).

620msra-1 Maylerayfglqcfwgesawaklkgvvvtrvgyaggkqpnptyknikdhteiteitfdpkvieyskltnffwkhhnpaerrkkqyqsailyv 92

-10Nmsra-1 Mqcfwgesawaklkgvvvtrvgyaggkqpnptyknikdhteiteitfdpkvieyskltnffwkhhnpaerrkkqyqsailyv 82

-20Nmsra-1 Mklkgvvvtrvgyaggkqpnptyknikdhteiteitfdpkvieyskltnffwkhhnpaerrkkqyqsailyv 72

620msra-1 nddqkkvaeetlkvakdkhgdietyiepldkfyqaedyhqkywfrqkkilfdelslldtqvaegelatklnaycagfqdfhdlerlakeyglkds 187

-10Nmsra-1 nddqkkvaeetlkvakdkhgdietyiepldkfyqaedyhqkywfrqkkilfdelslldtqvaegelatklnaycagfqdfhdlerlakeyglkds 177

-20Nmsra-1 nddqkkvaeetlkvakdkhgdietyiepldkfyqaedyhqkywfrqkkilfdelslldtqvaegelatklnaycagfqdfhdlerlakeyglkds 167

620msra-1 fvnkvkdyalsggdprncha 207

-10Nmsra-1fvnkvkdyalsggdprncha 197

-20Nmsra-1fvnkvkdyalsggdprncha 187

Figura 18. Secuencias aminoacídicas de los clones generados para el estudio de

un posible epítope de destinación mitocondrial. En gris: primeros 10 aminoácidos

retirados en el clon-10Nmsra-1.En negrita: siguientes 10 aminoácidos retirados en el

clon -20Nmsra-1. Enmarcados: secuencia consenso de sitio catalítico. Asteriscos:

Argininas 6 y 30 en estudio.

Se mandó a secuenciar cada clon para asegurar la fidelidad de la secuencia génica, y así

evitar tener mutaciones indeseadas.

Con los dos clones se repitió el procedimiento realizado en el primer objetivo, es decir, la

realización de una inmunofluorescencia indirecta y el marcaje de las mitocondrias, para la

detección de su disposición subcelular, además de medir la actividad específica reductora

en los extractos de células transfectadas con los respectivos clones.

La expresión del clon 620msra-1 se mostró mayoritariamente en el compartimento

mitocondrial, sin embargo no obtuvimos una expresión clara para los otros dos clones,

* *

A B C D E

F G H I J

K L M N O

Figura 19. Determinación de la distribución subcelular de la MSRA-1 y de sus

clones de proteínas truncados mediante inmunofluorescencia indirecta.

A,F,K). Células Hela transfectadas con el vector que codifica para la expresión de

la MSRA-1completa (620msra-1), B,G,L) Células transfectadas con el vector que

codifica para MSRA-1 carente de los primeros 10 aminoácidos de su N-terminal

(-10N msra-1), C,H,M) Células transfectadas con el vector que codifica para

MSRA-1 truncada carente de los primeros 20 aminoácidos de su N-terminal (-20N

msra-1). D,I,N) Células transfectadas con el vector vacío. E,J,O) Células sin

transfectar. Identificación de la MSRA- 1 mediante anticuerpo primario anti-c-

MYC (Roche) y secundario anti mouse Alexa546(en rojo). Como marcador de

mitocondrias se utilizó Mitotracker green Invitrogen ( en verde) y en amarillo se

muestra la sobreposición de ambas imágenes.

43

Muestras transfectadas con

Promedio de Actividad MSRA-1

( nM met/µg de proteínas/min)

Porcentajes de

actividad respecto a

células sin transfectar

620msra-1 2,285 173%

-10Nmsra-1 0,931 91%

-20nmsra-1 0,436 86%

células sin Transfectar 1,452 100%

MsrAh purificada(control+) 212,564

Tabla 3. Resultados de la medición de la actividad específica de los clones de la

MSRA-1 a través del ensayo con Dabsyl-MetSO y la medición por HPLC fase reversa.

620

msr

a-1

-10N

msr

a-1

-20N

msr

a-1

Hek

293T

0

50

100

150

200

*

Po

rcen

taje

s d

e A

ctiv

ida

d e

spec

ífic

a

(nM

Met

/ug

pro

teín

as/

min

)

Figura 20. Gráfico que muestra el porcentaje de la actividad específica para la

MSRA-1 en los diferentes clones. n=3, p=0,0123

44

620

msr

a-1

-10N

msr

a-1

-20N

msr

a-1

contr

ol Hek

293t

0.000

0.005

0.010

0.015mitocondrial

citosólica

Act

ivid

ad

SD

H/u

g p

rote

ína

s

α-c-Myc

α-tubulina

Mit

MS

RA

-1.M

yc

Cit M

SR

A-1

. M

yc

Mit

-10N

.Myc

Cit -

10N

.Myc

Mit

-20 N

.M

yc

Cit -

20 N

.Myc

Mit

Hek293T

Cit H

ek293T

Msra

h.M

yc

contr

ol+

A

B

Figura 21. Análisis de la expresión de la enzima MSRA-1.myc y sus

respectivos clones truncados en las fracciones mitocondrial y

citosólica en células Hek293T .A) Gráfico con actividad SDH para

cada uno de las fracciones subcelulares obtenido por 30 µg de proteína.

B) Western blot para 10 µg de extracto de proteínas tanto de la fracción

mitocondrial como citosólica obtenidos de células Hek293T

transfectadas con los clones 620msra-1(MSRA-1.Myc),-10Nmsra-1(-

10N.Myc) y -20Nmsra-1(-20N.Myc). Se utilizó anticuerpo primario

anti-c-myc Roche y anticuerpo secundario anti mouse HRP (primera

línea) y para la detección de tubulina se utilizó anticuerpo primario anti

tubulina monoclonal y secundario anti mouse HRP(segunda línea).

45

46

-10Nmsra-1 ni -20Nmsra-1 (Figura 19), la cual se asemejaba a controles sin

sobreexpresión de la MSRA-1. Esto se confirmó por los resultados obtenidos en la

medición de actividad específica para Metionina Sulfóxido Reductasa A, que mostró una

actividad significativamente mayor en aproximadamente un 70% (Tabla 3), en aquellas

células Hek293T transfectadas con 620msra-1 con respecto a la actividad encontrada en

extractos celulares sin transfectar (Figura 20). Al igual que en la inmunofluorescencia los

resultados obtenidos aquí tampoco nos comprobaron la presencia de los clones -

10Nmsra-1 ni -20Nmsra-1, pues la actividad específica de los extractos transfectados con

estos últimos fue similar al basal en aquellas no transfectadas. Sin embargo, es posible

que su transcripción y traducción se llevase a cabo, pero los cortes hechos en la proteína

podrían estar influyendo en su capacidad de reducir Metioninas, por la cercanía del

propuesto sitio catalítico, por lo ello, se realizó la detección por inmunoblot (Western blot)

contra la cola MYC que poseen estos clones, aplicado a los extractos obtenidos por

fraccionamiento subcelular de las mismas células transfectadas.

Los resultados obtenidos en el inmunoblot contra la cola de detección MYC para cada

clon, muestran que no es posible detectar la expresión proteica de los clones de la

MSRA-1 truncada tanto con 10 aminoácidos de su N-terminal como con 20 aminoácidos,

a diferencia de lo obtenido con el clon perteneciente al ADNc completo (620msra-1), el

cual vuelve a mostrar una expresión en ambas fracciones pero con predominancia en la

mitocondrial (Figura 21B). Sin embargo, al realizar un RT-PCR a cada una de las

muestras podemos observar en la figura 22 que existe expresión de ARNm de cada clon,

Figura 22. Determinación de los transcritos de la

MSRA-1 Truncados. A) RT-PCR con partidores

específicos de cada clon en muestras de ADNc

obtenido de Hek293T transfectadas con cada clon.

B) RT-PCR con partidores específicos de GADPH

en cada muestra con ADNc, como control positivo.

C) Control negativo realizado con muestras de

ARN total obtenido de células Hek293t

transfectadas con cada clon, sometidas a PCR con

partidores específicos, previo a RT (reverse

transcription).

Msr

a-1

Msr

a-1

-10

N

Msr

a-1

-20

N

Sin

tra

nsf

ecta

r

Agu

a

A

B

C

47

por lo que si bien existe transcripción, posterior a ésta se ve afectada la expresión

proteica de estos clones.

En resumen, los resultados muestran que la extracción de 10 o más aminoácidos de la

región N-terminal de la MSRA-1 estaría afectando la mantención de la integridad de esta

proteína, debiéndose tal vez a la eliminación de uno o varios aminoácidos involucrados

en alguna señal de inhibición de degradación proteica incluidos en la sección escindida, o

por lo mismo, la generación de alteración en la conformación terciaria de la proteínas

truncadas, lo que podría llevar a su degradación.

Considerando estos últimos resultados, nos propusimos realizar una mutación puntual de

una de las argininas de esta región. Se sabe que la presencia de argininas es clave en la

señal de destinación mitocondrial (Hansel et al., 2002), mas los datos obtenidos en el

análisis de la secuencia aminoacídica nos llevó a elegir la arginina en posición 6 para ser

mutada por Glicina (R6G) y repetir los ensayos anteriores, esperando no afectar en esta

ocasión la expresión y/o mantención de la proteína.

La inmunofluorescencia indirecta realizada a células transfectadas con el clon mutante

R6G de la enzima mostró una pérdida de la destinación mitocondrial (Figura 23A),

teniendo como control de la correcta expresión trancripcional y traduccional de la MSRA-

1 Mut R6G, el RT-PCR (Figura 24) y el inmunoblot (Figura 23B) realizados a un extracto

de células transfectadas con el mutante. En este último pudimos observar la aparición de

dos bandas a un peso superior a 34 KDa, aproximadamente (Figuras 23-25).

Para corroborar lo observado por inmunofluorescencia y en el inmunoblot, se realizó el

fraccionamiento subcelular de células Hek293T transfectadas con el clon mutante, y el

análisis de densidad de sus bandas en las fracciones respectivas. Como control de la

pureza de las fracciones se midió la actividad SDH. En el fraccionamiento subcelular se

obtuvo sólo las bandas de mayor peso, observadas también en el extracto total (Figura

25A). Estos resultados apoyan lo observado en la inmunofluorescencia, es decir se

obtuvo un aumento en la expresión en la fracción citosólica más que en la mitocondrial.

Figura 23. Determinación por inmunoflorescencia

indirecta de la distribución subcelular de la MSRA-1 y

la MSRA-1 Mutante R6G en células Hela transfectadas

A) Inmunofluorescencia Indirecta. Células Hela

transfectadas con el clon cDNA msra-1 de 620 pb (620msra-

1), clon mutante en arginina 6 (msra-1.mut r6g).

Identificación mediante anticuerpo primario anti-c- MYC

(Roche) y secundario anti mouse Alexa488 (en verde).

Como marcador de mitocondrias se utilizó Mitotracker red

Invitrogen (en rojo) y en amarillo se muestra el merge de

ambas imagenes. B) Inmuno blot anti-c-myc que demuestra

la expresión de la MSRA-1 mutante en las respectivas

células transfectadas.

KDa

~34

~26

B

A

Anti Myc

MT red

Merge

620 msra-1 msra-1.mutr6g pcDNA3.1myc

sin transfectarA B C D

E F G H

I J K L

48

Msra

-1 M

ut.

R6G

Sin

tra

nsfe

cta

r

Agua

Figura 24. Detección de los transcritos de la MSRA-1

Mutante R6G por RT-PCR. RT-PCR realizado con

partidores específicos para la MSRA-1 Mut R6G en

Hek293T transfectadas con pcDNA.msra-1.mutr6g.myc

y células sin transfectar. B) RT-PCR con partidores

específicos de GADPH en cada muestra con ADNc,

como control positivo. C) Control negativo realizado con

muestras de ARN total obtenido de células Hek293T

transfectadas.

mito

condria

l

cito

solic

a

0.0

0.5

1.0

1.5

De

ns

ito

me

tria

(ra

zó

n)

mito

condria

l

cito

solic

a

0.0018

0.0019

0.0020

0.0021

Act

ivid

ad S

DH

/ug

pro

teín

as

Figura 25. Análisis de la expresión de la

MSRA-1 Mutante R6G en las

fracciones mitocondrial y citosólica en

células Hek293T A) Western blot

realizado con anticuerpos primarios anti-

c-myc (Roche) y anti tubulina

monoclonal, por separado, mas anticuerpo

secundario anti mouse HRP. Se cargaron

10 µg de extracto de proteínas para cada

fracción. B) Gráfico que muestra

densitometría realizada a bandas obtenidas

del Western blot, con un n=1. C)

Graficación de actividad SDH obtenida en

las fracciones mitocondrial y citosólica,

por µg de proteínas n=1.

A B

C

α-c-Myc

α-tubulina

KDa

~34

~26

Mit

MSR

A-1

Mu

tR

6G

. Myc

Cit

MSR

A-1

Mu

tR

6G

.Myc

MSR

A-1

Mu

tR

6G

.Myc

to

tal

A

B

C

49

Figura 26. Imágenes obtenidas por microscopia de transmisión (A-C) y confocal (D,F).

Nemátodos microinyectados con pPD95_75msra-1::GFP. A) neuronas de la cabeza. B)

neuronas del cordón ventral, C) Cordón ventral, D) cabeza E) neuronas de la cola inserto

detalle de una de las neuronas de la cola. Imagen obtenida con la autorización de Minniti et

al., 2009.

B C

D

A

F

50

51

-Evaluación in vivo de la localización subcelular de la MSRA-1 en C. elegans.

Evidencias publicadas por nuestro laboratorio muestran que la MSRA-1 se expresa

principalmente en los tejidos de intestino, músculo y neuronas (Minniti et al., 2009).

La Figura 26 muestra la localización en neuronas de la proteína de fusión MSRA-1::GFP,

donde se observa un detalle de la distribución subcelular celular (Figura 26E). Se hace

notar que esta enzima no se localiza en el núcleo. Sin embargo, la microscopía de

transmisión no es suficientemente resolutiva para permitir identificar la destinación a la

mitocondria, como se ha descrito para la enzima humana (Hansel et al., 2005).

-Análisis funcional de la enzima MSRA-1 in vivo

La figura 27 muestra las curvas de sobrevivencia de las cepas silvestres y mutantes de la

MSRA-1, donde se puede ver que la ausencia de la enzima determina una disminución

de la vida media de un 30 % (comparación de línea negra y línea continua gris). Al

incorporarse en esta cepa mutante el gen completo de la msra-1 incluyendo su promotor

endógeno (pGEM promo1403bp::msra-1) es posible rescatar el fenotipo del mutante

(cepa rescatada ANM13), recuperando la vida media similar al nemátodo silvestre (Figura

27).

Figura 27. Curvas de supervivencia de C. elegans a lo largo de un ciclo de vida.

Línea continua negra cepa silvestre, línea continua gris cepa msra-1 mutante y línea

C

A B C

52

discontinua negra cepa transgénica mutante rescatada que expresa MSRA-1. (Figura

modificada de Minniti et al., 2009).

Con el objetivo de evaluar si la sola expresión mitocondrial de la enzima MsrA podía

rescatar su función biológica in vivo, se intentó generar un transgénico que

sobreexpresara la MsrA humana, esperando que este nemátodo mutante para la MSRA-1

pudiera recuperar el fenotipo silvestre. La MsrA humana, como enzima homóloga es de

conocida destinación mitocondrial, como lo apoyan resultados previos obtenidos en

nuestro laboratorio. El vector generado fue pcDNA3.1 msrah.myc y la forma de

determinar la eficacia de la generación de los transgénicos fue mediante la realización de

la reacción en cadena de polimerasa (PCR= polymerase chain reaction) con partidores

específicos del gen msrah, y posterior detección de expresión proteica a través de

inmunoblot con extractos proteicos obtenidos de las diferentes cepas de nemátodos

transgénicos.

Si bien mediante PCR se pudo corroborar la existencia del ADNc de la MSRA humana en

las 4 cepas transgénicas de C. elegans, denominadas AMN26 (Figura 28), no se pudo

detectar la presencia de la enzima por medio de inmuno blot utilizando anticuerpos anti

MsrA humana ni contra el epitope MYC. Tampoco fue posible detectar la actividad

específica de MsrA por HPLC en estos gusanos. Una posible explicación a este resultado

es que el plasmidio pcDNA3.1 Myc no está diseñado para la expresión de genes en esta

especie, por lo que puede ser necesario la inclusión de vectores específicos C.elegans.

Figura 28. Screening por PCR de

poblaciones de nemátodos

transgénicos microinjectados con

pcDNA msrah.Myc (ANM26). Primer carril

muestra ladder de DNA de 500pb Gibco;

del carril 2 al 5 diferentes cepas

transgénicas 1 al 4, y carril 6 control de

agua.

1 2 3 4 5

6

Species Potential sequences

for FoxO3a (daf16)

Frequency of each

nucleotide in consensus

sequence of FoxO3a *

Frequency of each nucleotide

in consensus sequence of

Daf16 *

C. elegans TTGTTTTC (-1324)

* * * *

* * *

T 95,5%

T 90,9%

T 9,1%

C 86,4%

T 92%

T 4%

C 16%

TTGTTTAC (-71)

* * * *

* * * * *

T 95,5%

T 90,9%

A 90,9%

C 86,4%

T 92%

G 96%

T 96%

A 88%

C 84%

Human CTTTTGTT (-920)

* * * *

* * * * *

C 86%

T 9,1%

T 90,9%

T 95,5%

C 84%

T 4%

T 96%

G 96%

T 92%

Mouse GTAAACA (-2503)

* * *

* * * *

G 86,4%

T 90,9%

A 90,9%

G 84%

T 88%

A 96%

C 96%

ATATTTAC (-2450)

* * * * *

* * * * *

A 0%

A 0%

T 90,9%

A 90,9%

C 86,4%

A 4%

A 4%

T 96%

A 88%

C 84%

GTAAACAA (-468)

* * * *

* * * * *

G 86,4%

T 90,9%

A90,9%

A 95,5%

G84%

T 88%

A 96%

C 96%

A 92%

Figura 29. Esquema y tabla con el análisis de los sitios de unión para DAF-16 en

las secuencias promotoras de la MSRA-1 de C.elegans. A) Sitios de unión para

DAF16 o FOXO3a en el promotor de la MSRA-1 de C.elegans (1934pb), humano

(2017pb) y de ratón (2503pb). B) Tabla: Secuencias de potenciales sitios de unión

para DAF-16 y FOXO3a en los promotores de C.elegans, humano y de ratón, con

información de la frecuencia de cada nucleótido con respecto a su posición dentro de

la secuencia consenso de Daf16 * o FoxO3a* (los porcentajes igual a 100% no son

mostrados), datos para la construcción de la tabla obtenidos de Furuyama et al, 2000.

53

54

-Regulación de la expresión de la enzima MSRA-1

Con el objeto de evaluar la existencia de una relación entre la expresión de la MSRA-1 y

su determinación en la destinación subcelular, se analizó la regulación de la expresión de

la MSRA-1 a través de la activación de su promotor. Para esto el laboratorio contaba con

diferentes fragmentos del promotor de msra-1 de 326 y 1934 pares de bases de la región

5´UTR (Figura 29 y 30) clonados en el plasmidio pGL2basic, que contiene el gen

reportero de la enzima luciferasa. Estos vectores fueron co-transfectados junto a un

vector de expresión con el gen de FOXO3a (pcDNA3.1.foxo3a.myc) en células Hek293T

y posteriormente se midió la actividad luciferasa en células en la presencia o ausencia del

factor transcripcional (Figura30A). Nuestro grupo publicó recientemente que la expresión

de la MSRA-1 está modulada por el factor transcripcional FOXO3A y que todos los genes

que codifican para esta enzima contienen una o mas secuencias de reconocimiento para

este factor (secuencias DBE). La Figura 29 analiza comparativamente estos sitios de

unión en las diferentes regiones 5´UTR de los genes que codifican para la MSRA de

ratón, humana y de nemátodos. Del análisis de la figura 29 se puede decidir que

C.elegans contiene una caja DBE consenso, tanto para DAF-16 o FOXO3A en la posición

-71. En células Hek293T co-transfectadas con los diferentes plasmidios y FOXO3A se

pudo observar que la presencia de FOXO3a aumenta de manera similar la actividad del

promotor de msra-1 en ambas regiones promotoras (Figura 30A). Con sólo la caja DBE

más cercana al punto de inicio de la transcripción (-71) se obtiene una actividad similar a

la obtenida con las dos cajas (-1324 y -71). En paralelo se corroboró, mediante el ensayo

de inmunofluorescencia indirecta, la expresión y activación del factor FOXO3a en estas

células a través de la observación de su traslocación al núcleo (Figura 30C).

Figura 30. Análisis de la regulación de la actividad del promotor de la MSRA-1

por FoxO3A. A) Gráfico de actividad Luciferasa/ actividad β-galactosidasa para los

vectores pGL2 con los fragmentos del promotor de la msra-1, de 326pb y 1934pb.B)

Esquema que muestra los fragmentos del promotor de la msra-1 y las secuencias DBE.

C) Inmunofluorescencia indirecta en células Hela. Anticuerpo primario anti-c-myc

(Roche) y anticuerpo secundario anti mouse Alexa546 (Molecular probe). A la

izquierda células transfectadas con pcDNA.myc, y a la derecha células transfectadas

con pcDNAfoxo3A.myc.

C

pmsra1934pb pmsra326pb0

1

2

3

promotor

promotor con FoxO3A

Luciferase activity/B-gal activity(ratio of each control)

A

B

55

56

DISCUSIÓN

Los resultados de esta tesis muestran que la enzima MSRA-1 de C. elegans se distribuye

principalmente en la mitocondria. Esto fue observado utilizando un sistema in vitro de

expresión de esta enzima en células en cultivo. Estos resultados adquieren relevancia en

el contexto de la relación entre la función de la mitocondria como generadora de ROS y el

envejecimiento de los organismos (Balaban et al., 2005). Por otro lado, numerosas

evidencias apoyan la participación de esta enzima en las vías determinantes de la vida

media de diversos organismos, como levaduras (Koc et al., 2004), Drosopphila

melanogaster (Ruan et al., 2002), ratón (Moskovitz et al., 2001) y Caenorhabditis elegans

(Minniti et al., 2009).

La distribución mitocondrial de la MSRA-1 de C. elegans fue observada en líneas de

cultivo celular de origen humano como son las líneas Hek293T y Hela. Se analizó la

expresión y distribución subcelular en células que expresaban diferentes construcciones

de esta enzima, a través de ensayos de microscopía tanto de inmuno fluorescencia

indirecta como de microscopía electrónica de transmisión (M.E.T) con inmnodetección

con oro. Es de particular relevancia la observación por M.E.T que permite tener una

mayor resolución estructural que otras microscopías. Los resultados sugieren que la

MSRA-1 presentaría una ubicación específica en la matriz mitocondrial. Se observa

también en este estudio que sólo la sobreexpresión de esta enzima determina cambios

en la morfología mitocondrial, con aumento de la densidad de las mitocondrias tanto en el

espacio intermembrana como en la matriz dependiendo del tipo celular en que se

observe. La especificación de su ubicación dentro de este organelo está en desarrollo a

través de la colocalización con el marcaje de una enzima propia de la membrana interna

de la mitocondria (Citocromo Oxidasa), la cual debería aparecer en lugares distintos a los

que se encuentra muestra enzima de interés dentro del organelo. Por otro lado, mediante

el fraccionamiento subcelular se pudo definir y cuantificar que la expresión de la MSRA-1

en este compartimiento subcelular es aproximadamente un 80% mayor en mitocondrias

que lo encontrado en el citosol.

57

Estos resultados nos reducen el campo de posibles sustratos específicos de la MSRA-1

que puedan cumplir un papel clave en la regulación de la vida media y procesos de

envejecimiento en las especies. La MSRA-1 podría estar manteniendo un ciclo de

oxido/reducción de metioninas específicas que con el tiempo sufriría una desregulación,

provocando la activación de procesos relacionados con el envejecimiento y

consecuentemente muerte celular, lo que se suma a su conocida función de mantención

de los niveles de estrés oxidativo (Delaye et al., 2007).

El hallazgo sobre la ubicación subcelular de la MSRA-1 muestra que podrían existir al

menos dos isoformas de esta enzima, al igual como se ha demostrado en su homóloga

humana (Hansel et al., 2005). Considerando la alta similitud y conservación que hay entre

las enzimas MsrA de diversas especies, este estudio se centró en el N terminal de la

proteína, en específico sitios y aminoácidos para los que se tiene certeza en la MsrA

humana tienen un papel fundamental en la derivación a la mitocondria.

Determinación de epítope de destinación mitocondrial.

Para la identificación de un epítope que estuviese destinando la MSRA-1 a la

mitocondria, se realizó en una primera instancia estudios computacionales y

comparativos con la secuencia aminoacídica de esta enzima, desde su estructura

primaria a su estructura terciaria. La estructura primaria de la MSRA-1 fue analizada

utilizando programas computacionales que predicen la destinación subcelular ( PreDotar,

Mit PRED, MitoProd II) donde se obtuvo una baja probabilidad de algún tipo de inserción

a membrana o destinación especifica a algún organelo, en particular a la mitocondria. Sin

embargo, para C.elegans es escasa la información disponible con respecto a epítopes de

destinación mitocondrial. Los programas utilizados principalmente ocupan las bases de

mamíferos y otros organismos conocidos hasta ahora, donde es mas común encontrar la

señalización y epítopes de consenso en el N terminal. En cambio, en los nemátodos no

existe un consenso al respecto , de hecho podemos encontrar epítopes tanto

pertenecientes al C-terminal, a la secuencia media o al N-terminal de las proteínas.

Ejemplo de un epítope en C.elegans que escapa a la norma es el de la proteína HCF

(Host cell factor), involucrada en la proliferación celular, cuyo epítope corresponde a 23

58

aminoácidos de su extremo C-terminal y que genera la compartimentalización en el

núcleo o mitocondria (Izeta et al., 2003).

Debido a lo anterior, se decidió hacer estudios de alineamiento con aquellas enzimas

homólogas cuya similitud es alta, y que poseen al menos una isoforma mitocondrial,

como la MsrA humana, de ratón y rata. Con la MsrA humana existe una similitud de un

36,3 % y con la de rata un 37,7%. Además se alineó con los conocidos epítopes

mitocondriales de cada uno de estos homólogos, es decir, se alineó con los de 23

aminoácidos perteneciente al N terminal de la enzima humana (Hansel et al, 2002) y 20

aminoácidos predichos como péptido señal de la MsrA de ratón (Kim. et al, 2005), el cual

pertenece a un grupo de péptidos predichos como señales de destinación mitocondrial

en las enzimas de bovino, rata y humano.

Este estudio muestra la participación de los 20 aminoácidos pertenecientes al N-terminal

de la MSRA-1 en determinar la traslocación de esta proteína al interior de la mitocondria.

Específicamente se vió el papel de la arginina en posición 6 (R6). Esta arginina muestra

un alto grado de conservación entre las enzimas de mamíferos y, por sobre todo, al

parecer sería clave en la destinación de la MSRA a la mitocondria. Además los estudios

en la estructura secundaria con el programa Lpred3 y estructura terciaria de la MSRA-1

con el programa RasMOl-theorical model, entregaron datos de una alta probabilidad de

formar una alfa hélice para los primeros 20 aminoácidos. Esta característica según la

literatura es de aquellos epítopes que destinan conocidas proteínas a este compartimento

subcelular (Heijne, 1986). Ésta alfa hélice constituida por los 20 aminoácidos de nuestro

interés, deja expuestos para un mismo lado un conjunto de aminoácidos no polares

como L, W, A y F, que podrían colaborar en un posible anclaje y/o entrada a la membrana

mitocondrial, quedando al menos la primera arginina (R6) expuesta hacia el otro extremo

de la hélice, lo que es observable en la estructura terciaria , donde además junto a la

Arginina 22 quedan en una posición superficial y dispuestas en forma de abrazadera o

pinza. Esto apoya la idea que podrían estar involucradas en la interacción con receptores

o con la misma membrana mitocondrial para la destinación hacia su interior, debido a la

naturaleza básica de estos aminoácidos.

59

Para corroborar esto, se generaron 2 clones de la MSRA-1 truncados, sin 10 y 20

aminoácidos del N-terminal, respectivamente. Al primero se eliminó la arginina en

posición 6 y el segundo, se le eliminó esta misma arginina más el posible centro

catalítico. Sin embargo, la escisión de estos aminoácidos generó una aparente

inestabilidad que llevó a la pérdida de estos clones como proteína, basado en que en las

células transfectadas se pudo observar la expresión mRNA del respectivo clon y no así

en los inmunoblot o ensayos de determinación de actividad reductora específica.

Para descartar las posibilidades de que la eliminación de un fragmento de la proteína

llevase a la degradación de ésta, se generó un tercer clon que específicamente fue

mutado en la arginina en posición 6, la que fue reemplazada por una glicina. Los

resultados obtenidos en la inmuno fluorescencia indirecta realizada a células

transfectadas con este clon mutante sugieren una pérdida de la destinación mitocondrial,

lo mismo indicaron los resultados del fraccionamiento subcelular, donde se observa que

esta proteína mutada presenta una mayor expresión citoplasmática. Estos datos sugieren

fuertemente que la arginina propuesta (R6) está involucrada en la determinación del

compartimiento subcelular para la MSRA-1, sin embargo, aún queda por determinar el

epítope completo para su destinación a la mitocondria.

Finalmente, todas las pruebas fueron realizadas con la MSRA-1 perteneciente a

C.elegans en células de líneas de cultivo humanas, por lo tanto, queda por dilucidar si

este sistema es similar in vivo. Por nuestra parte, al intentar la identificación de su

distribución subcelular a través de inmunofluorescencia indirecta in vivo, mediante la

utilización de TMRE como marcador mitocondrial, no fue posible observar con claridad

estructuras subcelulares. En el futuro quedaría por utilizar otras técnicas más resolutivas

como la microscopía electrónica.

60

CONCLUSIONES

-Se demostró que en células en cultivo la MSRA-1 se localiza mayoritariamente en la

mitocondria.

-La mutación de la Arginina en posición 6 del N-terminal de la MSRA-1 determina la

pérdida de la destinación mitocondrial, lo que sugiere que estaría involucrada en la

destinación de esta enzima al interior de la mitocondria.

-La eliminación de los primeros 10 aminoácidos de la MSRA-1 genera la pérdida de la

expresión proteíca.

61

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