Estudio de la Interacción entre los Grupos Fosfato del ...

Estudio de la Interacción entre los

Grupos Fosfato del Ácido

Desoxirribonucleico y Fármacos modelo

que poseen Grupos Básicos

Q.F. Liliana Paola Alarcón Ramírez

2017

Estudio de la Interacción entre los

Grupos Fosfato del Ácido

Desoxirribonucleico y Fármacos modelo

que poseen Grupos Básicos

Trabajo de tesis para acceder al grado de

Doctor en Ciencias Químicas de

Liliana Paola Alarcón Ramírez

Director

Prof. Dr. Rubén Hilario Manzo

Comisión Asesora

Prof. Dra. Graciela Panzetta Prof. Dra. Marcela Longhi Prof. Dr. Gustavo Pino

Evaluador externo

Prof. Dra. Ana Lea Cukierman

Dedicado al Único y Soberano

Dios, Jesucristo con todo mi amor

El manuscrito aquí presente representa el trayecto del camino de mi vida

que más ha impactado y trascendido en mí ser, permitiendo la resignificación del

ayer, consolidando el presente a cada paso y afirmando la esperanza de un

futuro mejor; transformando para siempre la visión del mundo, de las sociedades,

de la amistad, de la familia, del amor, de Dios y visualizando el papel de la

Ciencia y de la Investigación en la construcción de un país no solo en cuanto a los

avances productivos, sino también en la formación de nuevas generaciones

apasionadas por el conocimiento y el deseo de ser auténticamente mejores. Es

por eso que deseo expresar mi más profundo agradecimiento:

A mi director de tesis, Prof. Dr. Rubén H. Manzo, a quien admiro y quiero,

gracias por decidir formarme, un maestro;

A los profesores que integran la Comisión Asesora: Prof. Dra. Graciela

Panzetta, Prof. Dra. Marcela Longhi, Prof. Dr. Gustavo Pino, por sus valiosos

aportes y acompañamiento;

A la Prof. Dra. Ana Lea Cukierman por haber aceptado evaluar nuestro

trabajo;

A las instituciones que financiaron la investigación, Conicet, FONCyT,

SECyT;

A la Prof. Dra. María Eugenia Olivera, por su apoyo desinteresado;

Al Prof. Dr. Álvaro Jimenéz k, Prof. Dra. Fabiana Alovero;

A mis compañeros de laboratorio;

Al Prof. Dr. Daniel Allemandi, Prof. Dr. Santiago Palma y mis compañeros de

docencia;

Al personal docente y no docente de los Departamentos de Farmacia,

Orgánica y Fisico-química;

A las chicas y profesoras de Farmacognosia

A Argentina, A Colombia

A los hermanos de la IPUC e IPNJ

A mi familia amada y añorada, a mis amigos del alma, y a quien está

dedicado este trabajo, al Señor Jesús, sin ellos no hubiese sido posible, les debo

todo, no sería lo que soy sin ellos, todo mí amor.

Resumen

El trabajo desarrollado en esta tesis doctoral aborda la caracterización in vitro de la interacción iónica entre los grupos fosfato del Ácido Desoxirribonucleico (ADN), tomado como modelo de ácido nucleico (AN), con las especies protonadas de un grupo seleccionado de fármacos (F) con grupos básicos, a través de la determinación de constantes de afinidad, la reversibilidad de la interacción y el efecto sobre la estructura secundaria de la macromolécula.

Comprendió la caracterización en dispersión acuosa de la sal sódica del ADN de esperma de salmón (comercial (ADN-Na) y de referencia (ADN-NaR)), la forma ácida (HADN) y de los complejos ADN-F con Atenolol (At), lidocaína (Li), timolol (Ti), bencidamina (Be) y propranolol (Pr). F con diferentes propiedades básicas, lipofílicas-hidrofílicas y solubilidad.

El estudio de las constantes de afinidad (Kpi), a través de la determinación de especies en el equilibrio demostró que, una alta proporción de F se encuentra acomplejado con el ADN por condensación iónica [R-FH+], exhibiendo Kpi del orden de 106. A su vez, el acomplejamiento produce una progresiva disminución del potencial electrocinético negativo con el aumento en la proporción del F acomplejante, lo que es consistente con la formación de los [R-FH+].

Los F fueron liberados lentamente desde los sistemas ADN-F en celdas bicompartimentales, mediante una cinética difusional análoga a la informada con otros polielectrolitos (PE) ácidos, demostrando que los complejos se comportan como reservorios de los F, de manera consistente con el alto grado de condensación iónica.

Utilizando dicroísmo circular se observó un comportamiento diferenciado del efecto de la interacción sobre la estructura secundaria del ADN. Esta no se modificó por el acomplejamiento con At, Li y Ti, pero fue significativamente alterada por F más lipofílicos como Be y Pr, revelando modificaciones en la estructura secundaria del ADN de carácter reversible, excepto con el Pr.

La caracterización in vitro de las interacciones ADN-F desarrollada en esta tesis, proporciona una base físico-química con proyecciones en varios campos de interés farmacoterapéutico, tales como la identificación in vivo del efecto de las interacciones descriptas sobre la funcionalidad de los AN, la utilización de ADN como portador de F y la transfección intracelular de AN.

INDICE GENERAL

LISTADO DE SIGLAS Y SÍMBOLOS

LISTADO DE FIGURAS

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN GENERAL Y OJETIVOS 1.1. Marco en el que se desarrolla la tesis……………………………………………… 3

1.2. Objetivo General ……………………………………………………………………….. 3

1.3. Importancia del proyecto …………………………………………………………….. 4

1.4. Objetivos Específicos ………………………………………………………………….. 4

1.5. Fuente de ADN a utilizar en el estudio……………………………………………. 5

1.6. Antecedentes……………………………………………………………………………….. 6

1.7. Ácidos Nucleicos (AN)…………………………………………………………………… 7

1.8. Estructura de los AN……………………………………………………………………… 8

1.8.1. Bases Nitrogenadas…………………………………………………………. 8

1.8.2. Pentosas………………………………………………………………………… 9

1.8.3. Grupo fosfato………………………………………………………………….. 10

1.8.4. Estructura primaria………………………………………………………….. 11

1.8.5. Estructura secundaria………………………………………………………. 12

1.8.6. Otro tipo de organizaciones……………………………………………… 14

1.9. Ubicación de los AN en la estructura intracelular……………………………… 15

1.10. Interacciones ADN y Fármacos (F) que afectan su funcionalidad (unión

a surcos e intercalantes)………………………………………………………………… 16

1.10.1 Tipos de unión………………………………………………………………. 17

1.10.1.1. Unión a los surcos…………………………………………. 17

1.10.1.2. Intercalantes………………………………………………… 18

1.11. Interacción Polielectrolito (PE)-F……………………………………………………. 19

1.11.1. Propiedades de las dispersiones PE-F……………………………… 20

1.11.2. Caracterización de la condensación iónica……………………….. 23

1.11.3. Caracterización de los complejos en estado sólido……………. 24

CAPÍTULO 2: METODOLOGÍA GENERAL

2.1. Materiales…………………………………………………………………………………… 29

2.1.1. ADN……………………………………………………………………………. 29

2.1.2. Obtención del HADN a partir de ADN-Na………………………… 29

2.1.3. Fármacos modelo………………………………………………………….. 30

2.1.4. Reactivos……………………………………………………………………… 30

2.2. Metodología…………………………………………………………………………………. 31

2.2.1. Determinación Espectrofotométrica de ADN…………………….. 31

2.2.2. Determinación de pH…………………………………………………….. 31

2.2.3. Potenciometría Diferencial de Barrido (PDB)…………………….. 32

2.2.4. Determinación de Sodio…………………………………………………. 32

2.2.5. Determinación de conductividad……………………………………… 33

2.2.6. Espectroscopia de correlación fotónica (dynamic light

scanning DLS)……………………………………………………………….

33

2.2.7. Electroforesis en gel………………………………………………………. 33

2.2.8. Dicroísmo circular………………………………………………………….. 34

2.2.9. Preparación de complejos………………………………………………. 35

2.2.10. Determinación de Especies en el Equilibrio y de la constante

de afinidad Kpi………………………………………………………………. 36

2.2.11. Evaluación de la reversibilidad de la interacción Efecto del

agregado de sales neutras sobre los equilibrios de formación

de pares iónicos……………………………………………………………… 36

2.2.12. Estudios de Liberación en celdas bicompartimentales de

difusión………………………………………………………………………… 37

2.2.13. Reversibilidad de los cambios en la estructura del ADN

determinado por DC……………………………………………………… 38

2.2.14. Difracción de rayos X…………………………………………………….. 38

CAPÍTULO 3: MATERIALES SELECCIONADOS Y CARACTERIZACIÓN DE ADN-Na Y HDNA EN DISPERSIÓN ACUOSA

PARTE I………………………………………………………………………………. 41

3.1. Introducción………………………………………………………………………………… 41

3.2. Sumario………………………………………………………………………………………. 42

3.3. Materiales y metodologías…………………………………………………………….. 44

3.4. Resultados y Discusión…………………………………………………………………. 44

3.4.1. Caracterización por Espectroscopia UV……………………………. 44

3.4.2. Caracterización por potenciometría diferencial de barrido

(PDB)…………………………………………………………………………… 46

3.4.3. Determinación potenciométrica de Sodio…………………………. 48

3.4.4. Caracterización de la estructura secundaria por Dicroísmo

Circular (DC)………………………………………………………………… 49

3.4.5. Caracterización de tamaño molecular por electroforesis……. 52

3.4.6. Ensayo de permeación de los polímeros………………………….. 53

3.5. Conclusiones……………………………………………………………………………….. 54

PARTE II…………………………………………………………………………….. 55

3.1. Introducción………………………………………………………………………………… 55

3.2. Set de F Modelo…………………………………………………………………………… 55

3.3. Calidad y origen de los materiales utilizados…………………………………… 58

CAPÍTULO 4 CARACTERIZACIÓN DE LOS SISTEMAS ADN-F

EN DISPERSIÓN

4.1. Introducción…………………………………………………………………………………. 61

4.2. Materiales y Metodologías……………………………………………………………… 62

4.3. Resultados y Discusión………………………………………………………………….. 63

4.3.1. pH de las dispersiones ADN-F…………………………………………. 65

4.3.2. Mediciones de conductividad………………………………………….. 66

4.3.3. Mediciones de potencial electrocinético……………………………. 67

4.3.4. Mediciones de electroforesis…………………………………………… 68

4.3.5. Distribución de especies en las dispersiones ADN-F………….. 69

4.3.5.1. Procesamiento de datos para la determinación de

Especies en el Equilibrio y de la constante de

afinidad (Kpi)………………………………………………… 70

4.3.5.2. Determinaciones analíticas en condiciones de

equilibrio………………………………………………………… 72

4.3.6. Reversibilidad del Sistema: Efecto de la relación de

volúmenes compartimento donor ( d ) y receptor ( r )……….. 76

4.3.7. Reversibilidad del Sistema: Efecto de la adición de otras

especies sobre los equilibrios…………………………………………… 78

4.3.8. Difracción de rayos X de los complejos ADN-F…………………… 80

4.4. Conclusiones………………………………………………………………………………... 82

CAPÍTULO 5 CINÉTICA Y MECANISMO DE LIBERACIÓN DE

LOS F DESDE LOS COMPLEJOS ADN-F

5.1. Introducción…………………………………………………………………………………. 87


5.3. Resultados y Discusión………………………………………………………………….. 92

5.3.1. Liberación en agua………………………………………………………….

5.4. Conclusiones…………………………………………………………………………………. 100

CAPÍTULO 6 EFECTO DE LA INTERACCIÓN PE-F SOBRE LA

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN

6.1. Introducción…………………………………………………………………………………. 103

6.1.1 Aplicaciones del DC en el análisis estructural del ADN……….. 103


6.3. Resultados y Discusión…………………………………………………………………… 106

6.3.1. Efecto de la lipofilicidad de los F sobre la estructura

secundaria…………………………………………………………………….. 106

6.3.2. Reversibilidad de los cambios en la estructura del ADN………. 111

6.3.3. Efecto de la temperatura sobre la estructura secundaria de

los complejos ADN-F………………………………………………………. 113

6.4. Conclusiones………………………………………………………………………………… 114

CONCLUSIONES GENERALES Y PROYECCIONES………………….… 119

BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………. 125

PUBLICACIONES y PRESENTACIONES……………………………………… 145

ANEXO I MANEJO DEL ELECTRODO DE SODIO…………………………………… 149

ANEXO II BASES TEÓRICAS DE DICROÍSMO CIRCULAR…………………….. 155

LISTADO DE SIGLAS Y SÍMBOLOS

AN: Ácidos nucleicos, este término hace referencia tanto al ADN como al ARN.

ADN: Ácido desoxirribonucleico, denominación general que incluye las diferentes

muestras de: ADN-Na, ADN-NaR, HADN y HADNR

ADN-Na : Sal sódica del ácido desoxirribonucleico marca Saporitti

ADN-NaR: Sal sódica del ácido desoxirribonucleico marca Sigma, referencia

ADN-Fx : Complejo iónico Ácido desoxirribonucleico - Fármaco, dónde x representa

el % de neutralización del polímero con el fármaco.

ADN-FH+ : Par iónico

[ADN-FH+ ]: Concentración estequiométrica del par iónico

ARN: Ácido ribonucleico

At: Atenolol

Be: Bencidamina

CD: Compartimento donor

CR: Compartimento receptor

DC: Dicroísmo Circular

ds: doble hélice

F: Fármaco

F : Especie neutra del fármaco básico

[F ]: Concentración estequiométrica de la especie neutra del fármaco

F - : Grupo ionizado del fármaco ácido

FDA US: Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos

FH : Fármaco ácido

FH+: Grupo protonado del fármaco básico

[FH+]: Concentración estequiométrica de la especie protonada del fármaco

HADN: Forma ácida del ácido desoxirribonucleico obtenido a partir de ADN-Na

HADNR: Forma ácida del ácido desoxirribonucleico marca Sigma, referencia

I+D: Investigación y Desarrollo

Kpi: Constante de formación de par iónico

Li: Lidocaína

Log P: Lipofilicidad

M: Molaridad

mV: mili Voltios

N: normalidad

nm: nanómetros

pb: pares de pases

PDB: Potenciometría diferencial de barrido

PE: Polielectrolito

PE-F: Complejo polielectrolíto-Fármaco

–PO4H: Grupo fosfato ácido

–PO4- : Grupo fosfato ionizado

pKa: Constante de disociación ácida

PM: Peso molecular

Pr: Propranolol

QbD: Quality by desing

r.p.m: revoluciones por minute

Rx: Difractometría de Rayos X de polvos

SPF: Sistema portador de F

Ti: Timolol

USP: Farmacopea de Estados Unidos

UV: Ultravioleta

Kesp: Conductividad específica

Kl: Constante de liberación del fármaco

Kpi: Constante de afinidad

Λ: Conductancia Estequiométrica (µS.cm2/M)

Θ: Ángulo de incidencia de rayos X sobre la muestra

Δθ: Ángulo de elepticidad

λ: longitud de onda de máxima absorción

µS.cm-1:Unidad de conductancia, micro Siemmens por centímetro

ζ : Potencial electrocinético

% p/v: Porcentaje peso en volumen

LISTADO DE FIGURAS

Figura Titulo pp

1.1 Estructura química y pKa de las bases nitrogenadas del ADN y ARN … 8

1.2 Formación del Nucleósido Adenosina ……………………………………………. 10

1.3 Formación del Nucleótido Adenosin 5'-monofosfato ……………………….. 10

1.4 Estructura primaria del ADN ………………………………………………………… 12

1.5 Estructuras secundarias del ADN …………………………………………………. 12

1.6 Estructura terciaria y cuaternaria del ADN…………………..…………………. 14

1.7 Estructura química de netropsina (a) y de cisplatino (b)…………………. 18

1.8 Estructura química de daunomicina …………………………………………….. 19

1.9 Potenciales electrocinéticos (ζ) exhibidos por dispersiones acuosas de

PE cargados con F………………………………………………………………………. 21

1.10 Distribución de especies luego de la partición de los hidrogeles (PE-

F50) con un solvente orgánico………………………………………………………. 23

3.1 (a) Espectro de Absorción y (b) relación absorbancia vs

concentración de ADN-Na en agua MQ pH 7,2……….…………………….. 45

3.2 Perfiles de titulación potenciométrica de ADN-NaR (a), HADN (c),

HADNR (e)…………………………………………………………………………………. 47

3.3 Curvas de calibración del NaCl y ADN-Na para la determinación de

Sodio………………………………………………………………………………………….. 48

3.4 Perfil de DC de ADN-NaR, DNA-Na y HADNR en agua Milli-Q, pH

≈7,0. La concentración del PE en las dispersiones acuosas es de 0,05

mg/mL ……………………………………………………………………………….…….. 50

3.5 Perfil de DC de DNA-Na en agua Milli-Q, pH ≈7,0. La concentración

del PE en las dispersiones acuosas varía en el intervalo de 0,005 a

0,049 mg/mL………………………………………………………………………………. 50

3.6 Efecto de la temperatura sobre el perfil DC de ADN-NaR en agua

Milli-Q, pH ≈7,0. La concentración del PE en las dispersiones acuosas

es de 0,05 mg/mL ……………………………………………………………………… 51

3.7 Electroforesis en gel de agarosa de ADN-Na y HADN, corridas en gel

de agarosa al 0,75% y teñidas con SYBR Green I. ……………………….. 52

3.8 Porcentaje de permeación de polímero a través de membrana de

celulosa (12,000 Da), usando como medio receptor agua………………… 53

3.7 Fármacos seleccionados para estudiar los sistemas (PE-Fx)……………… 57

4.1 Variación de la conductividad específica y del pH con la proporción de

At en la dispersión………………………………………………………………………. 66

4.2 Variación del potencial electrocinético en función del agregado de moles % de F para la dispersión ADN-Fx…………………………………………

67

4.3 Electroforesis de gel en agarosa de complejos ADNR -F100 y 150 en gel

de agarosa 0,75%, revelados con Syber Green I……………………………. 68

4.4 Determinación del tiempo de diálisis necesario para alcanzar el

equilibrio en los sistemas ADN-F, utilizando como modelo el complejo

ADN-Pr43 a pH≈ 7,0. Relación de volumen entre el compartimento d

y r : a) 1/40 b) 1/10…………………………………………………………………… 73

4.5 Efecto de la proporcionalidad de F modelo que neutraliza ADN-Na

sobre la Kpi. Comparación del comportamiento entre las dos fuentes

de ADN-Na ensayadas. a) ADN-Na 0,60 % p/v b) ADN-NaR 0,12 %

p/v ……………………………………………………………………………………………. 75

4.6

Distribución de especies en el equilibrio de los sistemas ADN-At37-92 a

pH≈ 7,0 obtenidos por diálisis………………………………………………………. 76

4.7 Efecto del cambio del volumen del compartimiento receptor en el

equilibrio de los sistemas ADN-F introducidos en el compartimento d,

utilizando como modelo el complejo ADN-At37-92 a pH≈ 7,0……………. 77

4.8 Efecto de la adición de concentraciones crecientes de contraiones

inorgánicos (NaCl), sobre la distribución de especies de los sistemas

ADN-F, utilizando como modelo el complejo ADN-At85. Los valores de

pH corresponden al compartimento d en el equilibrio……………………… 79

4.9 a) Difracción de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Li

y Li como F modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ. (b) Difracción

de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Pr y Pr como F

modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ………………………………….. 80

5.1 Perfiles de liberación acumulativa de atenolol en agua. ADN-F50, y F

de referencia en células de Franz en función del (a) tiempo y (b) del

tiempo1/2. ADN-Na se incluyó como blanco………………………… 94

5.2 Perfiles de liberación acumulativa de lidocaína en agua. ADN-F50, y F

de referencia en células de Franz en función del (a) tiempo y (b) del

tiempo1/2. ADN-Na se incluyó como blanco………………………… 95

5.3 Perfiles de liberación acumulativa de propranolol en agua. ADN-F50,

como de F de referencia en células de Franz en función del (a)

tiempo y (b) del tiempo1/2. ADN-Na se incluyó como blanco…………… 96

5.4 Liberación acumulativa de At desde el complejo ADN-Atx (x: 42%,

64 % y 85% y At de referencia equivalente a 100%......................... 98

5.5 Liberación acumulativa de Li desde el complejo ADN-Lix (x: 25%,

42 % y 85% y Li de referencia equivalente a 100%......................... 99

5.6 Liberación acumulativa de Pr desde el complejo ADN-Prx (x: 25%,

42 % y 85% y Pr de referencia equivalente a 100%......................... 99

6.1 Espectro de DC para ARN-A dextrógiro y ADN-A, ADN-B dextrógiro, y

ADN-Z levógiro……………………………………………………………………………. 104

6.2 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Na en agua Milli Q, pH 7,0…………… 107

6.3 Efecto de la temperatura sobre el perfil de DC de una dispersión

acuosa de ADN-NaR (0,04 mg / ml) a pH 7,0………………………………….. 107

6.4 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-At50 ………………………………..………….. 108

6.5 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Li50 …………………………..……………….. 109

6.6 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Ti50 …………………………..……………….. 109

6.7 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Bz50 …………………………..………………. 110

6.8 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Pr50 ……………………………………………. 111

6.9 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Bz50 después de realizar la diálisis

exhaustiva…………………………………………………………………………………. 112

6.10 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Pr50 después de realizar la diálisis

exhaustiva…………………………………………………………………………………. 112

611 Efecto de la temperatura sobre el perfil de DC de una dispersión

acuosa de ADN-Ti50 …………………………………………………………………… 113

612 Efecto de la temperatura sobre el perfil de DC de una dispersión

acuosa de ADN-Pr50 …………………………………………………………………… 114

INTRODUCCIÓN

GENERAL

Capítulo 1

En este capítulo se describen los objetivos del trabajo doctoral y el contexto

en el cual se desarrollan. También la estructura y conformaciones de los AN,

sus propiedades fisicoquímicas e interacciones con F actualmente conocidas.

Finalmente, se presentan las propiedades de relevancia de las dispersiones

PE-F.

Capítulo 1 UNIVERSIDAD

INTRODUCCIÓN GENERAL NACIONAL DE CÓRDOBA

3

1.1. Marco en el que se desarrolla la tesis

El estudio de la interacción entre polielectrolitos (PE) ácidos y básicos y

fármacos (F) ionizables con grupos básicos y ácidos respectivamente, y sus

aplicaciones farmacéuticas se viene desarrollando desde hace más de una

década en el grupo de investigación. En particular su aplicación como sistemas

portadores de fármacos (SPF) basados en la alta afinidad PE-F para generar

complejos iónicos.

Entre los PE ácidos que han sido utilizados previamente en proyectos de

investigación y desarrollo (I + D) se destacan: PE sintéticos (poli-metacrilatos),

semisintéticos (carboximeticelulosa) y PE naturales (ácido algínico y ácido

hialurónico).

La disponibilidad de una plataforma tecnológica y una razonable

infraestructura, constituyeron las bases para proponer el estudio de la

interacción entre los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (AN) y F modelo con

grupos básicos protonables.

En este marco, se propusieron para el desarrollo de la tesis los objetivos

que se detallan a continuación.

1.2. Objetivo General

Se propuso entonces:

Realizar un estudio amplio de la interacción reversible de los grupos

fosfato del ácido desoxirribonucleico (ADN), como modelo de AN,

con un grupo seleccionado de F con grupos básicos protonables,

desde un enfoque propio de la química supramolecular.

UNIVERSIDAD

Q.Farm. Liliana P. Alarcón NACIONAL DE CÓRDOBA

4

1.3. Importancia del proyecto

La disponibilidad de información sistemática sobre la interacción de F

protonables de utilidad farmacoterapéutica con los grupos ionizados de los AN,

que contemple la afinidad y reversibilidad de la interacción, así como los efectos

sobre la estructura primaria y secundaria de la macromolécula es de

importancia en varios campos del conocimiento sobre las propiedades y

aplicaciones de estas importantes macromoléculas.

Entre ellos podemos reconocer:

- Utilización de ADN comercial como portador de principios activos.

- Situaciones farmacoterapéuticas en las que esta clase de F pueden

interaccionar con los AN.

- Generación de propiedades en los AN que favorezcan su inserción intracelular

mediante el apropiado acomplejamiento.

Estos aspectos serán analizados detalladamente a lo largo del desarrollo

del texto de la tesis.

1.4. Objetivos específicos

Se propusieron los siguientes objetivos:

1. Establecer una batería de ensayos que permita una detallada

caracterización fisicoquímica tanto del ADN, como de los complejos ADN-

F obtenidos en dispersión utilizando un grupo seleccionado de F modelo.

2. Determinar cuantitativamente la afinidad ADN-F, la reversibilidad de la

interacción y la cinética y mecanismo de la liberación del F desde la

macromolécula.



5

3. Evaluar los efectos de la interacción ADN-F sobre propiedades físicas de

relevancia, como el potencial electrocinético, estructura secundaría,

movilidad electroforética, entre otras.

1.5. Fuente de ADN a utilizar en el estudio

Es importante destacar que el uso de ADN se encuentra aprobado en

Europa como materia prima para productos cosméticos según la decisión

2006/257/CE de la comisión de la Comunidad Europea (Comisión Europea,

2006).

La fuente de ADN utilizada en este estudio, es la sal sódica extraída y

purificada de esperma de salmón, de la especie Oncerhynchus keta, conocido

también como ADN de testículo de salmón. En la actualidad esta sustancia es

comercializada con diferentes propósitos, como suplemento nutricional y

materia prima para productos cosméticos.

En esos campos se proclaman como beneficios funcionales: anti-

envejecimiento para cuerpo y cerebro, aumento del rendimiento deportivo y

recuperación y mejoramiento de la salud hepática y de la piel (Martínez O,

1997; Navarro J, 1999; Holen E, 2005); también se le atribuye la capacidad de

absorber rayos UV (Sasaki Y, 2010). Sin embargo, no existe suficiente evidencia

reportada para los usos indicados.

En el campo farmacéutico se han propuesto films de ADN / Colágeno

para el tratamiento de heridas, los que han sido considerados como promisorios

biomateriales para vendajes (Van Den Beucken J, 2006; Shen X, 2008).

Asociaciones ADN / lípidos han presentado interesante actividad antibacteriana

(Tanaka K, 1996; Inoue Y, 2003; Yamada M, 2005), también se reportan

aplicaciones odontológicas para la cicatrización de heridas alrededor de

implantes orales (Fukushima T, 2001; Getts R, 2016).

UNIVERSIDAD


6

1.6. Antecedentes

Cómo se detallará más adelante en este capítulo, en las unidades del

ADN se encuentran grupos fosfato orientados al exterior de la molécula, estos

poseen un hidrógeno ácido que en solución acuosa se disocia comportándose

como un PE.

La disposición de los grupos fosfato ha sido muy utilizada para generar

interacciones electrostáticas con PE y lípidos catiónicos (formando los

denominados lipoplejos) a los efectos de adecuar, por acomplejamiento, las

propiedades de plásmidos y ADN en relación a la denominada terapia génica

(Rolland A, 2003) que involucra la captación de estas entidades por células pro

y eucariotas. En la actualidad se observa una importante dinámica en la

investigación de esta problemática (Tiera M, 2011; Shimanovich U, 2011). Por

otra parte, la unión electrostática de los grupos fosfato ha sido considerada la

principal interacción con moléculas de amplia distribución en el organismo, tales

como las poliaminas: espermina (Feuerstein B,1990; Utsuno K, 2010) y

espermidina (McGregor T, 2002; Hackl E, 2005).

Respecto a la interacción de los AN con moléculas orgánicas endógenas y

exógenas de pesos moleculares por debajo de 1000 g/mol (Um S, 2006;

Wahyuni E, 2010), un intervalo en el que se encuentra una alta proporción de

principios activos usados actualmente en farmacoterapia, muchas

investigaciones se han focalizado en las moléculas que intercalan el ADN, dada

su importancia en la interrupción de las propiedades biológicas del AN (Cheng

X, 2009; Hajian R, 2009; Shah A, 2009; Mizuno Y, 2010; Stepankova J, 2011;

Getts R, 2016).

Sin embargo, se ha prestado menos atención al estudio de F que son

capaces de interaccionar iónicamente con los AN, a pesar que:



7

Una importante fracción de los F utilizados en terapéutica tienen grupos

básicos que se encuentran protonados a pHs fisiológicos, por lo que son

capaces de interactuar como contraiones de los grupos fosfato ionizados

de los AN.

Durante la administración de muchas formas farmacéuticas, tales como

inyecciones intramusculares, gotas oftálmicas y parches transdérmicos,

una concentración apreciable del F está en contacto con las células de

los tejidos involucrados (Banker G, 1996).

1.7. Ácidos Nucleicos (AN)

Se describirán aquí las estructuras y conformaciones de los AN, los sitios

de ionización y las distintas clases de interacciones entre el ADN y F que han

sido informadas en la actualidad.

Los AN son las biomoléculas portadoras de la información genética, con

funciones celulares en la conservación, replicación, y transmisión de esta

información.

Desde el punto de vista químico, los AN son macromoléculas formadas

por polímeros lineales de unidades monoméricas llamadas nucleótidos, unidas

por enlaces éster de fosfato, la secuencia de las unidades no tiene periodicidad

aparente; presentan un alto grado de polimerización, siendo las moléculas más

grandes que se conocen.

Se clasifican en dos tipos de AN, ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y

ácidos ribonucleicos (ARN). Se diferencian básicamente en tres aspectos:

UNIVERSIDAD


8

Citosina (C) Timina (T) Uracilo (U)

1) El azúcar (pentosa) que forma parte de los nucleótidos: desoxirribosa

en el ADN y ribosa en el ARN. 2) Las bases nitrogenadas que contienen:

Adenina, Guanina, Citosina y Timina en el ADN; y Adenina, Guanina, Citosina y

Uracilo en el ARN. 3) La estructura de las cadenas: en el ADN se encuentra

organizada en una cadena doble y en el ARN una cadena sencilla.

Históricamente es de relevancia mencionar el descubrimiento de los AN

en 1869 por Meischer, en su trabajo con leucocitos y espermatozoides de

salmón, que la denominó nucleína por encontrarse en el núcleo. Así como, el

descubrimiento de la estructura tridimensional compleja del ADN en 1953 por

Watson y Crick (Watson J, 1953; Crick F, 1954; Manning G, 1978)

1.8 Estructura de los AN

1.8.1. Bases Nitrogenadas

Purinas

Pirimidínicas

Figura 1.1 Estructura química y pKa de las bases nitrogenadas del

ADN y ARN (Acharya S, 2009).

Adenina (A) Guanina (G)



9

Las bases nitrogenadas contienen la información genética, son

estructuras planas, aromáticas. Establecen interacciones por formación de

puentes de hidrógeno entre bases complementarias de la cadena doble (Crick

F, 1954; Taylor P, 2015), e interacciones hidrofóbicas que ayudan a estructurar

las cadenas mediante el acomodamiento entre bases vecinas de la misma

cadena (Burkard M, 1999; Ohmichi T, 2002).

Los AN tienen varios centros de ionización presentes en las bases (Figura

1.1 (Acharya S, 2009). Cada una de las bases tiene un sitio de protonación o de

desprotonación a pHs ácido o alcalino, respectivamente. Sin embargo, dado que

se comportan como ácidos o bases débiles, tales ionizaciones no son de

relevancia a pHs cercanos a 7,0.

1.8.2. Pentosas

La unión de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los

compuestos llamados nucleósidos (Figura 1.2). Se efectúa a través de un

enlace glicosídico (Blackburn G, 1996; Acharya S, 2009), con configuración beta

(β) entre el carbono 1 de la ribosa o desoxirribosa, y un nitrógeno de la base, el

1 en las pirimidinas, y el 9 en las purinas, con la pérdida de una molécula de

agua.

Para evitar confusiones en la nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos,

los átomos de la pentosa se designan con números seguidos de un apóstrofe

(1',2', 3', 4' y 5'), para distinguirlos de los de las bases, por lo que los enlaces

de los nucleósidos se designan como β (1'-1) en las pirimidinas y β (1'-9) en las

purinas (Blackburn G, 1996; Acharya S, 2009).

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10

Figura 1.2 Formación del Nucleósido Adenosina

1.8.3. Grupo fosfato

Figura 1.3 Formación del Nucleótido Adenosin 5'-monofosfato

Nucleósido (Adenosina)

Nucleótido (Adenosin 5'-monofosfato)

Ion Fosfato

Base nitrogenada (Adenina)

Pentosa (Ribosa)

Nucleósido (Adenosina)

Enlace éster

Enlace N-glucosídico



11

Los nucleótidos (Figura 1.3) son los ésteres fosfóricos de los nucleósidos.

Están formados por la unión de un grupo fosfato al carbono 5' de una pentosa.

A su vez la pentosa lleva unida al carbono 1' una base nitrogenada

Se forman cuando se une un ácido fosfórico a un nucleósido en forma de

ion fosfato (-O-HOPO-O-) mediante un enlace éster con el grupo alcohol -OH

del carbono 5' de la pentosa. Aunque la ribosa tiene tres posiciones en las que

se puede unir el fosfato (2', 3' y 5'), y en la desoxirribosa dos (3' y 5'), los

nucleótidos naturales más abundantes son los que tienen fosfato en la posición

5’. Nucleótidos con fosfato en 3' aparecen en la degradación de los ácidos

nucleicos (Robert H, 2008).

Los grupos de fosfato internucleotídico tienen una pKa de ionización de

1,5; mientras que los fosfatos terminales tienen valores de pKa de 1,5 y 6,5

(Chamberlin S, 2002; Acharya S, 2009). Esto significa que a pH fisiológico los

fosfatos internucleótidos están completamente ionizados.

1.8.4. Estructura primaria

Se trata de la secuencia de desoxirribonucleótidos de una de las hebras.

Estos últimos se unen entre sí mediante el grupo fosfato del segundo

nucleótido, que sirve de puente de unión entre el carbono 5' del primer

nucleótido y el carbono 3' del siguiente nucleótido (Figura 1.4). Es decir, la

secuencia de las unidades de monómeros se ordena 5' 3' (Blackburn G, 1996;

Acharya S, 2009).

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12

Figura 1.4 Estructura primaria del ADN

1.8.5. Estructura secundaría

Watson y Crick (Watson J, 1953; Crick F, 1954; Manning G, 1978)

postularon el modelo que representa dos hebras de ADN dispuestas juntas en

una doble hélice de diámetro constante. Las hebras están enrolladas en torno a

un eje imaginario, que puede girar hacia la derecha (dextrógira) o izquierda

(levógira), según el tipo de ADN, uniéndose a través de puentes de hidrógeno

de manera complementaria y antiparalela (Figura 1.5).

Figura 1.5 Estructuras secundarias del ADN



13

En esta estructura, las bases presentes en una hebra se acoplan con las

bases de la hebra opuesta de manera complementaria y antiparalela a través

de la formación de puentes de hidrógeno (Taylor P, 2015). Esta interacción

determina el acomodamiento en forma de doble hélice (Ohmichi T, 2002). Por

lo tanto, la interacción entre las bases opuestas son las fuerzas predominantes

que estabilizan las estructuras secundarias del ADN. Otro factor que aporta a la

estabilización de la estructura es la orientación del grupo fosfato hacia el

exterior de la hélice que minimizan las fuerzas de repulsión.

El proceso de auto-ensamblaje entre las bases, ocurre así: Adenina (A) y

tiamina (T) forman dos puentes de hidrógeno; y entre guanina (G) y citosina

(C) se forman tres puentes de hidrógeno.

El esqueleto de la estructura espiral del ADN describe dos surcos - mayor

y menor. Los surcos difieren no sólo en tamaño, sino también en polaridad y

características químicas (Nielsen J, 2001). Las bases presentes en cada surco y

la secuencia de unión son específicas. En el surco mayor A-T tiene una

secuencia aceptor-donor-aceptor y G-C tiene una secuencia de aceptor-aceptor-

donor.

Dependiendo del nivel de hidratación del biopolímero y de la naturaleza

de los contraiones presentes, la doble hélice puede encontrarse en diferentes

configuraciones helicoidales: formas A, B o Z (Figura 1.5) (Robert H, 2008).

La forma A se produce en condiciones anhidras (<75% de humedad

relativa) y se encuentra en las esporas bacterianas. Tiene 11 pares de bases

(pb) por giro helicoidal, una elevación helicoidal por pb de 0,26 nm, y un

diámetro de 2,6 nm, las bases nitrogenadas forman un ángulo de 20° con el eje

azúcar – fosfato.

La forma B es la forma más común encontrada en condiciones naturales

y de altos porcentajes de humedad. Tiene 10 pb por giro helicoidal, una

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14

elevación helicoidal por pb de 0,34 nm, y un diámetro de 2,0 nm, las bases

nitrogenadas forman un ángulo de 90° con el eje azúcar-fosfato. Ambas formas

A y B son hélices formadas hacía la derecha.

La forma Z es una hélice formada hacía la izquierda y se cree que sirve

como un interruptor genético, ya que se encuentra acompañado de la unión de

grupos metilo (-CH3). Tiene 12 pb por vuelta helicoidal, una elevación helicoidal

por pb de 0,37 nm y un diámetro de 1,8 nm.

1.8.6. Otro tipo de organizaciones

Figura 1.6 Estructuras terciaria y cuaternaria del ADN



15

La estructura terciaria del ADN se establece cuando la doble hélice es

capaz de enrollarse sobre sí misma, formando una especie de súper-hélice. Esta

disposición se conoce como ADN superenrrollado, y se debe a la acción de

enzimas Topoisomerasas-II, esta estructura da estabilidad y reduce la longitud

de la molécula (Robert H, 2008). En células procariotas está asociado a una

pequeña cantidad de proteínas; en eucariotas el empaquetamiento es más

complejo y compacto comprendiendo desde nucleosoma, collar de perlas y fibra

cromatínica, acompañado por un mayor número de proteínas.

La estructura cuaternaria se conoce como cromosomas, que es la forma

aún más compacta del ADN.

El ADN se encuentra generalmente como doble hélice, pero también

existe en cadena sencilla, en forma circular (Ban C, 1994; Uytterhoeven K,

2002), horquillas (Kopka M, 1985; Feigon J, 1999), tripletes (Bordelon J, 2002)

y cuadruplete (Robert H, 2008).

El ARN funciona generalmente en la forma de cadena sencilla y se

organiza (se pliega a sí mismo) en estructuras secundarias y terciarias (Braña

M, 2001), dependiendo de su tamaño, de la estructura y de las funciones,

existen diferentes tipos, algunos son: ARN mensajero, ARN transferencia, ARN

ribosomal, ARN de interferencia, Micro ARN, ARN interferente pequeño, entre

otros.

1.9. Ubicación de los AN en la estructura intracelular

El Ácido desoxirribonucleico (ADN), es el material genético de todos los

organismos vivos y de la mayoría de los virus. Lleva la información necesaria

para la replicación y para dirigir la síntesis de ARNs y proteínas. Es de

relevancia recordar que, tanto las células eucariotas como procariotas poseen

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16

una membrana plasmática que las separa del medio y poseen ribosomas dónde

se encuentra ubicado el ARN. Sin embargo, en las células eucariotas el ADN es

lineal y se encuentra ubicado en el núcleo, organizado en forma de

cromosomas (el núcleo está rodeado por una membrana). Mientras que las

células procariotas al carecer de dicha membrana contienen el ADN, que es

circular, compactado en una estructura llamada nuceloide en el citoplasma.

1.10. Interacciones ADN y F que afectan su funcionalidad (unión a surcos e intercalantes)

Existen F que pueden actuar directamente sobre los AN interrumpiendo

la replicación y transcripción (Hasanzadeh M, 2016). Es por esto que el blanco

más utilizado en las farmacoterapias contra el cáncer es el ADN, donde se

busca inhibir la rápida replicación de las células cancerosas. También en

muchas enfermedades como la diabetes, el lupus, la enfermedad de Alzheimer,

entre otras, que pueden atribuirse a la sobre o subproducción de proteínas o la

producción de proteínas mutadas, se busca entonces, modular el proceso de

traducción de proteínas (Sisto M, 2014; Bougas A, 2017).

Se han descripto diferentes mecanismos de interacción entre el ADN y

los F, siendo los más relevantes la unión a surcos y la intercalación. Sin

embargo, el resultado en todos los casos es la modificación de la actividad del

biopolímero (Hasanzadeh M, 2016). El efecto del F sobre el ADN está a menudo

relacionado con la geometría de unión. De este modo, la actividad potencial de

un F podría ser evaluada identificando su tipo de unión al ADN.



17

1.10.1 Tipos de unión

Para la mayoría de los F, el tipo de unión que se da con el ADN no

implica formación de enlaces covalentes, por lo tanto, es un proceso de

equilibrio. La constante de unión se puede determinar midiendo la proporción

de las formas libres y unidas del F. Las interacciones están impulsadas por

atracciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y

fuerzas de van der Waals (Shaikh S, 2004).

Se han descripto dos tipos de interacciones no covalentes entre el F y el

ADN: la unión a los surcos y la intercalación. También pueden ocurrir

combinaciones de estos modos y la unión no especıfica.

1.10.1.1. Unión a los Surcos

Los F de unión al surco menor son generalmente delgados y en forma de

media luna, sin grupos laterales que producen impedimento estérico. Algunos

ejemplos de ligandos de unión al surco menor incluyen distamicina,

cromomicina, y netropsina (Figura 1.7, a). Estos F no producen cambios

significativos a la estructura del ADN.

Existen menos F de unión al surco mayor, aunque éste es un modo de

unión muy común para que las proteínas regulen la expresión génica. Ejemplos

de los principales F de unión al surco mayor incluyen alquilantes, mostazas y

cisplatino (Figura 1.7, b).

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18

Figura 1.7. Estructura química de netropsina (a) y de cisplatino (b)

1.10.1.2. Intercalantes

La intercalación ocurre cuando se inserta una estructura aromática plana

entre los pb de Watson-Crick. Lo que genera una separación entre los pb del

ADN y globalmente la hebra se alarga y se desenrolla ligeramente. Los

compuestos con dos o tres anillos fusionados no ocupan completamente el

espacio entre los pb, mientras que cuatro anillos fusionados tienen el tamaño

indicado para intercalarse eficientemente entre las pb (Hasanzadeh M, 2016). El

sitio de unión que prefieren los intercaladores es dónde se encuentra la

secuencia 5 'pirimidina-purina 3' (Braña M, 2001). Ejemplos de intercaladores

incluyen bromuro de etidio, equinomicina, actinomicina, quinacrina y

daunomicina (Figura 1.8). Los intercaladores son F eficaces en la interrupción

de los procesos de replicación, transcripción y reparación del ADN.

(b) (a)



19

Figura 1.8 Estructura química de daunomicina

1.11. Interacción PE-F

Considerando que el principal objetivo planteado consiste en determinar

en qué grado los AN se comportan como polielectrolitos (PE) ácidos, en esta

sección se describen propiedades relevantes de las interacciones PE-F.

Los PE ácidos o básicos en dispersión acuosa reaccionan con moléculas

que posean grupos básicos o ácidos, respectivamente. La reacción ácido base

genera en dispersión acuosa una alta proporción de pares iónicos. Los

equilibrios se representan en las siguientes ecuaciones:

RH + F R- + FH+ [R-FH+] Ec.1

Dónde RH y R- representan el grupo ácido del PE aniónico (los grupos

funcionales pueden ser R-COOH, R-SO3H o -O-HOPO-O-, etc.), que reacciona

con un F básico. F y FH+ representan las especies del F. El resultado de los

equilibrios es la generación del producto de condensación contraiónica

denominado par iónico [R-FH+].

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20

Del mismo modo, un PE básico interacciona con un fármaco ácido (FH )

RR1R2N + FH RR1R2NH+ + F - [ RR1R2NH+F - ] Ec.2

Donde RR1R2N representa el grupo básico del PE catiónico, en el que R1

y R2 pueden ser hidrógenos o grupos alquílicos, FH y F - representan las

especies neutra e ionizada del FH y [RR1R2NH+F - ] es el producto de la

condensación.

1.11.1. Propiedades de las dispersiones PE-F

De manera general, cuando se neutralizan los grupos ácidos (RH) de un

PE ácido con F en un medio acuoso se generan los siguientes equilibrios:

RH R- + H+ Ec.3

F + H+ FH+ Ec.4

R- + FH+ [R-FH+ ] Ec.5

Como producto de la neutralización del PE se genera una alta proporción

de pares iónicos [R-FH+]. Esta condensación contraiónica, se adjudica a un

balance entre la atracción electrostática de un contraion por la cadena del PE y

la pérdida de entropía traslacional del contraion, debido a su localización en la

vecindad de la cadena de la macromolécula (Dobrynin A, 2005).



21

Los PE en dispersión generan cargas positivas o negativas según su

naturaleza básica o ácida. Sus sales inorgánicas exhiben altos potenciales

electrocinéticos (ζ). Del mismo modo, los complejos con contraiones orgánicos

(ej. F modelo) aun cuando mantienen un alto grado de condensación

contraiónica, mantienen esta propiedad.

En nuestro grupo de investigación se han obtenido resultados con

diversos complejos PE-F que han exhibido valores de ζ altos (ver figura 1.9).

Figura 1.9 Potenciales electrocinéticos (ζ) exhibidos por dispersiones

acuosas de PE cargados con F. C: Carbomer; EE: Eudragit E; EL:

Eudragit L. Los subíndices indican el % de F y contraión inorgánico

expresado en moles % que neutraliza los grupos ionizables de cada

PE (Battistini F, 2015).

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22

Como se señaló, las dispersiones obtenidas con un PE ácido producen un

ζ negativo, así como las obtenidas con PE básicos producen un ζ positivo. El

comportamiento observado puede interpretarse con los modelos teóricos de

doble capa eléctrica, en otras palabras, un modelo constituido por dos fases

interpenetradas: fase macromolecular y fase fluida (Martin A, 1993; Jiménez-

Kairuz A, 2004).

El modelo propone que, en condiciones de equilibrio, un PE ácido que

interacciona con un contraión FH+, conforma un microentorno macromolecular

donde la concentración de especies catiónicas (H+ y FH+) es mayor que en el

seno de la solución. Esto ocurre como consecuencia de la atracción

electrostática de las cargas negativas remanentes del PE que están siendo

neutralizadas con FH+ por condensación iónica, en equilibrio con una proporción

de contraiones con mayor grado de libertad, algunos de los cuales poseen

suficiente energía cinética para migrar al seno de la solución. De esta manera,

el microentorno macromolecular tendrá permanentemente cargas iónicas con

capacidad de interactuar con un campo eléctrico.

Como ocurre con contraiones inorgánicos, la interacción ácido-base entre

los PE ácidos y moléculas de F protonable mantienen un alto ζ que contribuye a

la estabilidad física de las dispersiones.

La concentración de OH-, en cambio, es mayor en el seno de la solución

debido a fuerzas de repulsión entre especies cargadas del mismo signo y a los

requerimientos de electroneutralidad en dicho seno: [FH+] + [H+] = [OH-].

Como se mencionó anteriormente, el modelo supone que la concentración de

especies neutras es igual en ambas fases, tanto en el microentorno

macromolecular como en el seno de la solución.

De acuerdo a este modelo, el microentorno se caracteriza por un valor

de pH menor al del seno de la solución y por una alta proporción de FH+ bajo la

forma de pares iónicos.



23

1.11.2. Caracterización de la condensación iónica

Se ha descripto que la interacción ácido-base genera, en dispersión

acuosa, un alto grado de condensación iónica entre el F y el PE (Jiménez-Kairuz

A, 2003; 2004; Ramírez M, 2004; 2009). Para complejos binarios constituidos

por PE ácidos como carbomer y ácido algínico cargados con F básicos, las

constantes de afinidad (Kpi) están en el orden de 103 a 106 (Ramírez M, 2006;

Jiménez-Kairuz A, 2008; Ardusso M, 2010). En la figura 1.10 se observa la

distribución de especies de los diferentes complejos binarios.

Figura 1.10 Distribución de especies luego de la partición de los

hidrogeles (PE-F50) con un solvente orgánico. (C-Li) Carbomer-

Lidocaína; (C-Me) C-Metoclopramida; (C-Pro) C- Procaína; (AA-Li)

Ácido algínico-Li; (EE-Ke) Eudragit E-Ketoprofeno y (EE-Na) EE-

Naproxeno (Battistini F, 2015).

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24

Recientemente se han observado los mismos resultados para el

biopolímero ácido hialurónico (Battistini F, 2013). Para los PE básicos como

Eudragit E100 con F ácidos, se observó un grado de condensación iónica mayor

al 88%, algunos de los F ácidos investigados tienen grupos fosfato como la

dexametasona (Quinteros D, 2012; 2011; Guzmán M, 2012).

La reversibilidad de la condensación iónica se ha estudiado a través del

efecto sobre los equilibrios de la incorporación de concentraciones crecientes de

sales inorgánicas, la extracción de los F por diálisis o partición con solventes y

mediante estudios cinéticos de liberación de los F.

La incorporación de sales inorgánicas produce un desplazamiento parcial

del equilibrio promoviendo una mayor liberación de la molécula del F desde el

entorno del PE. Esta reversibilidad confiere a las dispersiones PE-F propiedades

particulares como portador de F de dimensiones nanométricas. Estas

propiedades son de relevancia en aplicaciones farmacotécnicas y

biofarmacéuticas tales como: aumento de la solubilidad aparente de F poco

solubles (Jiménez-Kairuz A, 2002; 2003; Quinteros D, 2008 ), estabilidad

química (Jiménez-Kairuz A, 2004; Esteban S, 2009), resistencia al ataque

enzimático (Quinteros D, 2011), modulación de la liberación del F desde el PE

en presencia de fluidos biológicos (Jiménez-Kairuz A, 2002; 2003; Quinteros D,

2011), interacción con membranas biológicas (bioadhesividad y promoción de la

permeabilidad de F) (Romero V, 2010).

1.11.3. Caracterización de los complejos en estado sólido

La caracterización de las propiedades farmacotécnicas en estado sólido,

conduce a la obtención de información fundamental en el desarrollo de

formulaciones, debido a la mayor estabilidad de los compuestos en estado

sólido que en dispersión. Por esto, es usual encontrar formas farmacéuticas



25

como polvos para reconstituir antes de su administración (Ansel H, 2011). La

interacción iónica entre el PE y F en estado sólido se ha evidenciado

principalmente mediante espectroscopia FT-IR, análisis térmico y difracción de

rayos X de polvos (Guzmán M, 2012; Ramírez M, 2009). Por difracción de rayos

X se analiza el estado cristalino o amorfo de los complejos PE-F, estos últimos

se obtienen como sólidos amorfos y no muestran las propiedades cristalinas

originales de los F precursores.

Los complejos PE-F en estado sólido pueden obtenerse mediante

diferentes técnicas, como se observa en el esquema 1.1, tales como:

evaporación del solvente, liofilización, coacervación o secado por atomización.

(Jiménez-Kairuz A, 2008; Quinteros D, 2008).

Esquema 1.1 Procedimientos utilizados para la preparación y

obtención de los complejos sólidos PE-F.

PE (Dispersión acuosa o

hidroalcohólica)

F contraión (Solución o dispersión)

Condensación del complejo PE-F

evaporación del solvente

liofilización secado por spray

Producto sólido

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26

METODOLOGÍA

GENERAL

Capítulo 2

En este capítulo se describen los materiales y metodologías utilizadas tanto en la

caracterización del polímero como de los complejos.


METOGOLOGÍA GENERAL NACIONAL DE CÓRDOBA

29

2.1. Materiales

2.1.1. ADN

Como fuente de ADN de referencia (ADN-NaR) se utilizó la sal sódica de

ADN de esperma de salmón, conocido también como ADN de testículo de

salmón. El ADN-NaR es una macromolécula de doble hélice, extraída y

purificada de la especie Oncerhynchus keta. Los siguientes valores son

reportados en la ficha técnica del producto: peso molecular aproximadamente

de 2000 pb (pares de bases), contenido de G-C es de 41,2%, temperatura de

fusión (Tm) 87,5°C. (Tm es la temperatura a la cual el 50% de la molécula se

encuentra como doble hebra). El HADNR es la forma ácida del ADN. Ambas

referencias fueron provistas por Sigma Chemical Co., St Louis, USA.

El ADN de esperma de salmón provisto por Parafarm®, Bs. As. Argentina

(ADN-Na), fue usado para la elaboración de lotes de dispersión de mayor

volumen. Según el informe técnico, el ADN es extraído y purificado de la

especie Oncerhynchus keta. El certificado de análisis indica que el contenido de

fósforo es del 87% y el control higiénico de bacterias aerobias y coliformes

conforme.

2.1.2. Obtención del HADN a partir de ADN-Na

El HADN es la forma ácida obtenida de la muestra provista por

Parafarm®, utilizando una resina de intercambio iónico. Se preparó una

dispersión inicial de una cantidad pesada de aproximadamente 500 mg de ADN-

Na en la mínima cantidad de agua Milli-Q aproximadamente 20 mL, que

presentó un pH inicial de 7,0; se eluyó a través de una columna de vidrio

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30

conteniendo una resina sulfónica de intercambio catiónico (Amberlite IR 120 en

su ciclo de protones (Sigma-Aldrich), R-Ar-SO3H). Luego de la recolección de la

muestra se añadieron sucesivas alícuota de agua Milli-Q a la columna con el fin

de obtener la mayor recuperación del HADN. La dispersión recolectada presentó

un pH de 1,9; posteriormente fue liofilizada (Liofilizador Labbconco®) bajo

vacío de 1 x 10-3 mbar previo congelamiento en freezer.

2.1.3. FÁRMACOS MODELO

Los F seleccionados para obtener los productos ADN-F fueron de grado

farmacéutico. Atenolol (At) y los clorhidratos de lidocaína (Li), propranolol (Pr) y

bencidamina (Bz) y timolol maleato (Ti), fueron provistos por Parafarm®, Bs.

As. Argentina.

2.1.4. REACTIVOS

Los reactivos y solventes utilizados fueron de calidad pro-análisis. Se

preparó una solución al 0,9% P/V de cloruro de sodio (Cicarelli Laboratorios).

Para las electroforesis se utilizó SYBR Green I (SIAL), agarosa,

marcadores de ADN de alto (1kb) y bajo (100 pb) peso molecular provistos por

Sigma Chemical Co., St Louis, USA. Se preparó un buffer de fosfato 10mM

(PBS, 10mM, pH 6,8) acorde a la USP 34-NF 29, 2011. Se utilizó agua Milli-Q

para la realización de todas las determinaciones.



31

2.2. Metodología

2.2.1. Determinación Espectrofotométrica de ADN

Los espectros de absorción fueron determinados en un

Espectrofotómetro Thermo Electron Corporation (Evolution 300), con un

programa Visión proTM Software, en celdas de cuarzo de 1 cm, el barrido fue

realizado en un intervalo de longitud de onda entre 200-400 nm partiendo de

una solución acuosa stock del polímero de concentración de 1,2 mg/mL, se

realizaron diluciones para obtener valores de absorbancia entre 0,2 a 1,0. La

solución stock se prepara sin agitación dejando hidratar el polímero con el 50%

del Agua Milli-Q necesaria para la dispersión. Se determinó el grado de

contaminación proteica a través del índice obtenido de la relación de

absorbancias A260/A280.

2.2.2. Determinación de pH

Las mediciones de pH de las dispersiones acuosas de ADN-Na, HADN y

de la serie de complejos ADN-F, fueron realizadas a temperatura ambiente

utilizando un pH-metro Mettler Toledo Seven Multi equipado con electrodo de

vidrio combinado Ag/AgCl (Mettler Toledo DG 115-SC).

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32

2.2.3. Potenciometría Diferencial de Barrido (PDB)

Las mediciones se realizaron en un titulador manual y en un titulador

automático (Titrando 905 de METROHM) con un pH-metro Mettler Toledo,

Seven Multi con electrodo de vidrio Ag/AgCl DG 115-SC a 25°C. Se utilizaron

soluciones estandarizadas de NaOH 0,0486 N y HCl 0,0500 N como referencia

(R) y titulante, respectivamente.

La curva de referencia (R) se realizó utilizando como muestra 7 mL de

NaOH 0,0486 N. Para la curva problema (P) se elaboró una muestra con 7 mL

de NaOH 0,0486 N y una cantidad pesada de aproximadamente 100 mg de

polímero, se agita suavemente hasta completa dispersión. El volumen de cada

muestra se completó a 50 mL con agua libre de dióxido de carbono. El registro

de pH se tomó en el intervalo de 0 a 20 mL de reactivo titulante, el intervalo de

dosificación fue de 0,2 y 0,1 mL.

El procesamiento de los datos se realizó utilizando el programa Excel.

2.2.4. Determinación de Sodio

Los equivalentes -O-Na+OPO-O- por gramo de polímero fueron

determinados mediante la cuantificación del catión sodio. Para ello se utilizó un

electrodo selectivo de Sodio marca METTLER TOLEDO perfectIONTM comb Na+

(Mettler Toledo, Germany).

Para el uso de este sensor se elaboró un instructivo de uso (POE004 manejo del

electrodo de Sodio), dónde se consignaron las condiciones de medición

estandarizadas. Para el detalle de la técnica ver Anexo 1.



33

2.2.5. Determinación de conductividad

La conductividad de las dispersiones de ADN y de los complejos ADN-Fx

fue medida utilizando un conductímetro Mettler Toledo Seven Multi equipado

con una celda de conductividad (InLab® 741). Los valores de conductividad

medidos (Siemens –S-), fueron multiplicados por la constante de la celda del

electrodo correspondiente (0,101078 cm-1) para obtener la conductividad

específica (Kesp, S/cm). Las muestras fueron termostatizadas a 25°C.

2.2.6. Espectroscopía de dispersión dinámica dela luz (dynamic light

scattering DLS)

Los coeficientes de difusión y potenciales electrocinéticos (ξ) fueron

determinados usando el equipo Delsa Nano C (Beckman Coulter, Osaka, Japón)

equipado con un láser de diodo de 658 nm a un ángulo de dispersión fijado en

165° y un controlador de temperatura. Los valores de ξ se obtuvieron de la

función de autocorrelación provista por el software Delsa Nano 2.20 (Beckman

Coulter. Osaka. Japan) que emplea la ecuación de Smoluchowsky (Lyklema

J,2003). El dato informado corresponde al promedio de tres mediciones de la

muestra. Las mediciones fueron tomadas por duplicado a 25°C a dispersiones

de PE en concentración entre 0,1 a 1,2% P/V solo y acomplejado con

proporciones crecientes de F (ADN-Fx).

2.2.7. Electroforesis en Gel

El peso molecular de las muestras de ADN fue determinado por

electroforesis siguiendo la metodología descripta en Sambrook et al,1989.

UNIVERSIDAD


34

utilizando un equipo Mini-Sub® Cell GT Cell (Bio Rad Life Science China) con

una fuente POWER PAC BASIC 100-120V/220-240V (Bio Rad Life Science

Singapur). Las muestras se sembraron por duplicado en un gel de agarosa al

0,75% de 10cm de longitud. Previamente el gel fue teñido con 2µL SYBR

Green. Se sembró un volumen final de 12 µL de muestra previamente

incorporada a un buffer de carga que está compuesto por azul de bromofenol

(0,25%), xileno ciamol (0,25%), glicerina (80,0%) y agua Milli-Q (19,5%). El

gel fue sumergido en un aparato horizontal con buffer TBE 1x (Tris base 90

mM, ácido bórico 90 mM y EDTA 2mM) y la corrida se desarrolló durante 1,5

horas a 100 Voltios.

2.2.8. Dicroísmo Circular (DC)

Los espectros fueron medidos en un espectropolarímetro Jasco 81, se

mantuvo el compartimento de la celda con un flujo continuo de nitrógeno de

alta pureza. Los parámetros establecidos para el equipo fueron: velocidad de

corrida: 50 nm/ min, número de acumulaciones: 3, tiempo de respuesta: 4 s,

ancho de banda: 2 nm y longitud de onda: 190 - 350 nm. Se utilizaron celdas

de cuarzo de 0,02 cm (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), en las cuáles se

colocaron 0,5 mL de sistema a evaluar, siendo inicialmente agua Milli-Q, luego

el blanco constituido por F y agua Milli-Q y finalmente la muestra. Se realizaron

diluciones, tanto de la muestra original como de los blancos, de manera que la

concentración final fuese de 0,3 mg/mL, utilizando como medio de dilución

agua Milli-Q desgasificada y filtrada. El software permite realizar una corrección

del perfil de la muestra sustrayendo el perfil del blanco correspondiente. Cada

espectro representa el promedio de 3 determinaciones por muestra. Las

determinaciones fueron tomadas a temperatura ambiente.

Antes de proceder con las determinaciones de DC, a las muestras se les

determinó el espectro UV verificando un valor de absorbancia entre 0,8 a 1,0 a



35

la longitud de onda de máxima absorción del ADN (260 nm). El procesamiento

de los datos se realizó utilizando el programa Sigma Plot 11 y fueron

representados como las variaciones en el ángulo de elipticidad (Δε).

Se realizaron determinaciones luego que las muestras fueran sometidas

a un ciclo de temperatura (calentamiento - enfriamiento) controlado por un

baño termostatizado adaptado al equipo que recubre el soporte de la celda, el

control de la temperatura dentro de la muestra se efectuó con la ayuda de un

termómetro digital. El ascenso paulatino de temperatura se llevó hasta un

máximo de 82°C, se sostuvo por 4 minutos, y se dejó enfriar a temperatura

ambiente.

2.2.9. Preparación de Complejos

Se obtuvieron las dispersiones acuosas de los complejos binarios ADN-Fx

y HADN-Fx, mezclando soluciones acuosas de las sales de los F con dispersiones

del polímero previamente hidratado sin agitación durante 24 horas y en

relaciones tales que el polímero, en el sistema, estuviera a una concentración

final de 0,12% P/V para ADN-NaR y 0,6% P/V en el caso de ADN-Na y HADN.

En todos los casos el subíndice “x” corresponde al porcentaje de los grupos

fosfato del PE neutralizados con el F contraión, siendo x = % dentro del

intervalo de 25% a 150%. Las dispersiones se agitaron suavemente durante 1

hora y se almacenaron durante 15 horas a 4-8°C. Antes de utilizarlas para las

determinaciones se dejan temperar al ambiente y se verifica el pH del

complejo, ajustando de ser necesario a valores de pH cercanos a la neutralidad,

adicionando HCl 1N.

Los complejos binarios en estado sólido, se obtuvieron por liofilización de

las dispersiones PE-F bajo vacío de 1 x 10-3 mbar, previo congelamiento en

freezer de -80°C.

UNIVERSIDAD


36

2.2.10. Determinación de Especies en el Equilibrio y de la constante de

afinidad Kpi

Las proporciones de las especies [F ], [FH+] y [R - FH+] de la serie de

complejos ADN-Fx se determinaron mediante el equilibrio de diálisis de las

dispersiones usando tubos de membrana de acetato de celulosa previamente

hidratado en agua Milli-Q durante 30 min (12,000 Da; Sigma, St Louis, MA,

USA). En el tubo de diálisis [compartimento donor ( d )] se incorporan

exactamente 10 mL de las dispersiones acuosas PE-F con una concentración de

PE de 0,12% o 0,6% P/V y distintos porcentajes de neutralización del polímero

con el F. El tubo sellado con clips fue introducido en un vaso de precipitado

sellado con Parafilm® [compartimento receptor ( r )] que contiene 100mL

(1/10) o 400 mL (1/40) de agua Milli-Q desgasificada.

Las fases estuvieron en contacto durante 24 horas hasta que alcanzaran

el equilibrio. Durante este tiempo, los sistemas se mantuvieron en el equipo de

agitación termostatizado a 25°C y constante agitación a 32 rpm.

Finalmente, se registró el pH de los compartimentos d y r, y se midió la

concentración del F en el compartimento r mediante espectrofotometría UV a

la longitud de onda de máxima absorción de cada F.

2.2.11. Evaluación de la reversibilidad de la interacción: Efecto del

agregado de sales neutras sobre los equilibrios de formación de pares

iónicos

El efecto de la adición de NaCl se evaluó mediante diálisis. Se prepararon

sistemas de la siguiente composición ADN-At85-NaCly, el subíndice “y”

corresponde al porcentaje de los grupos fosfato del PE neutralizados con el Na+



37

contraión, siendo y= 25%, 50% y 100%. La diálisis se efectuó tal como se

describe en el numeral 2.10 para una relación de volumen 1/40 ( d/r ). Se

seleccionó At como F modelo para este ensayo, debido a que, en estudios

previos, presentó los valores de constantes de afinidad más altos; por lo tanto,

los resultados pueden ser extrapolados a sistemas con menores valores de

afinidad.

2.2.12. Estudios de Liberación en celdas bicompartimentales de

difusión

Los estudios de liberación in vitro de los F desde las dispersiones de los

complejos ADN-Fx, se llevaron a cabo utilizando celdas de difusión

bicompartimentales del tipo Franz (ver figura 5.1), separadas por una

membrana semipermeable de acetato de celulosa (12,000 Da; Sigma. St

Louis.MA. USA) previamente hidratada en agua Milli-Q durante 30 min. El área

efectiva de difusión fue de 1,25 cm2. En el compartimento receptor se colocan

16 mL de medio receptor (agua Milli-Q o solución de NaCl 0,9% P/V)

desgasificado y atemperado a 37°C. En el compartimento donor se introduce

exactamente 1mL de dispersión ADN-Fx o una solución acuosa de F en una

concentración equivalente a la utilizada en el complejo. La concentración se

establece a fines de garantizar las condiciones de sumidero, es decir, que

prevalezca la difusión del F en dirección donor-receptor.

El sistema se mantiene termostatizado a (37,0 ± 0,1) °C y el

compartimiento receptor es sometido a una agitación magnética suave y

constante. Se estableció una frecuencia de muestreo durante 3 horas de la

siguiente manera: 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 y 180 min, extrayendo 0,9 mL del

medio receptor con reposición de medio fresco y atemperado.

UNIVERSIDAD


38

La concentración de F liberado se cuantifica por espectrofotometría UV a

la longitud de onda de máxima absorción de cada F. Los resultados informados

son producto del promedio de tres mediciones independientes entre sí.

2.2.13. Reversibilidad de los cambios en la estructura del ADN

determinado por DC

Los complejos ADN-Pr50 y ADN-Bz50 fueron sometidos a una diálisis

exhaustiva para recuperar el ADN sin F. Para llevar esto a cabo, se colocaron 10

mL del complejo en dispersión en el tubo de diálisis, tal como se describe en el

numeral 2.10 para una relación de volumen 1/40 ( d/r ) por 24 horas, usando

como medio receptor buffer fosfato sódico 10 mM a pH 7,0; el cuál fue

renovado en su totalidad cada 2 horas durante las primeras 8 horas. La

cuantificación de F, que migra al compartimento receptor, se determinó por

espectroscopia UV y las modificaciones estructurales del ADN en el medio

donor, por DC.

2.2.14. Difracción de rayos X

Los patrones de difracción de Rx fueron obtenidos usando un

difractómetro (PANalyical XPert Pro, Países Bajos) provisto con un software

específico para el procesamiento de datos y utilizando una lámpara de Cu (Kα)

(λ=1,5418 Å). Las muestras sólidas se colocaron en un porta-muestra de

aluminio y se estableció un intervalo de barrido entre 5 y 7 en 2θ/θ y una

velocidad de barrido de 0,04 2θ/s. Previo al ensayo las muestras fueron

pulverizadas a polvo fino.

Materiales

seleccionados y

Caracterización de

ADN-Na y HDNA en

dispersión acuosa

Capítulo 3

En este capítulo se describen las materias primas: PARTE I del ADN generalidades,

selección de las metodologías para caracterizar su funcionalidad como PE, resultados

y discusión de los hallazgos. PARTE II descripción de los F seleccionados.

Capítulo 3 MATERIALES GENERALIDADES UNIVERSIDAD CARACTERIZACIÓN ADN Y HADN NACIONAL DE CÓRDOBA

41

PARTE I

3.1. Introducción

Como se señaló previamente en el capítulo 1, el ADN se encuentra

aprobado como materia prima para uso en productos cosméticos según la

decisión 2006/257/CE de la comisión de la Comunidad Europea (Comisión

Europea, 2006).

Para evaluar la pureza y principales características estructurales de los

ADN a utilizar, se desarrolló una serie de ensayos utilizando cuatro muestras: la

sal sódica ADN-NaR y la forma ácida HADNR, obtenidas de Sigma-Aldrich y

denominadas como referencias (R), la sal sódica ADN-Na provista por

Parafarm®, Bs. As. Argentina y la forma ácida HADN obtenida a partir del ADN-

Na.

El objetivo de este capítulo es describir y analizar la caracterización

fisicoquímica de los ADN descriptos anteriormente, para la cual se seleccionaron

técnicas desarrolladas y aplicadas en anteriores estudios con otros PE, así como

la exploración de nuevas técnicas que permitieran reunir la mayor información

posible sobre la identidad, pureza y propiedades específicas de las sustancias

en estudio como se describe en el esquema 3.1.

UNIVERSIDAD Q.Farm. Liliana P. Alarcón NACIONAL DE CÓRDOBA

42

Esquema 3.1 Batería de ensayos establecida para la caracterización de las muestras de ADN. Donde UV: caracterización espectroscópica, PDB: Potenciometría diferencial de barrido, DC: Dicroísmo circular

3.2. Sumario

Mediante la titulación por PDB de las dispersiones acuosas de ADN-Na a

0,60 % P/V y ADN-NaR a 0,12 % P/V se determinó que en ambos casos los

grupos fosfato están salificados. La determinación potenciométrica de Na+

reveló que ADN-Na contiene 3,71 meq/g y ADN-NaR contiene 3,51 meq/g de

grupos fosfato salificados. Ambas muestras exhiben al UV, un máximo de

absorción a 260 nm y un valor del cociente de absorbancias de A260/ A280

cercano a 1,8; indicando un aceptable grado de pureza.

ADN-Na

HADN

UV

Identificación y pureza.

ds o ss

PDB

Grado de salificación

Peso Equivalente

Determinación de Na

Número de equivalentes

DC

Tipo de estructura

conformacional

Electroforesis

Tamaño medido en pb.

Potencial Electrocinético

Carga, estabilidad


43

Por DC se reveló que ambas muestras presentan una estructura

secundaria tipo-B, la cual es característica de la estructura nativa de doble

hélice del ADN. La electroforesis en gel indicó que el ADN-NaR exhibe una banda

correspondiente a una cadena que contiene entre 2000 a 8000 pares de bases

(pb), mientras que el ADN-Na corresponde a un tamaño menor a 100 pb. Las

dispersiones exhibieron potenciales electrocinéticos de -28,0 ± 1,0 para ADN-Na

al 0,60% P/V y -35,9 ± 1,6 para ADN-NaR al 0,12% P/V.

Por último, la permeación a través de una membrana semipermeable de

acetato de celulosa (12,000 Da; Sigma. St Louis.MA. USA) permitió evidenciar la

pureza de las sales sódicas del ADN en cuanto a la ausencia de fragmentos

correspondientes a oligonucleótidos, mientras que las formas ácidas se

encuentran contaminadas con dichos fragmentos que migraron a través de la

membrana.

A continuación, en la tabla 3.1 se resumen los resultados de los

parámetros medidos durante los ensayos de caracterización.

Tabla 3.1 Sumario de información obtenida en la caracterización de

ADN-Na implementando la batería de ensayos definida.

Parámetro Teórico ADN-Na ADN-NaR

λ max 260 260 260

A (50µg/mL) 1,00 1,00 1,08

a (µg/mL)-1 cm-1 0,0200 0,0209 0,0218

Relación de A 260:280

1,80 1,72 1,88

pH --- 7,20 7,25

PM pb --- < 100 2000-8000

ζ (mV)2 --- -28,0 ± 1,0 -35,9 ± 1,6

Equivalentes/g --- 3,71 x10-3 3,51 x10-3

DC Doble hélice, tipo-B


44

3.3. Materiales y metodologías

Las descripciones detalladas de las metodologías utilizadas se informaron

en el capítulo 2. Metodologías generales.

3.4. Resultados y Discusión

3.4.1. Caracterización por Espectroscopia UV

Esta técnica nos permitió obtener, a través de la longitud de onda de

máxima absorción, información sobre la identidad de la muestra. Algunos

autores (Lehninger A, 2008; García JP 2014) han definido el coeficiente de

extinción y la absorbancia que una solución 50µg/mL debe presentar, en caso

de ser un ADN de hélice sencilla o doble. A través del cálculo del cociente de las

absorbancias en 260/280 se obtiene información sobre las condiciones de

pureza, específicamente contaminación con proteínas y otros compuestos

orgánicos.

En la figura 3.1 se observa el perfil del espectro de absorción del ADN-

Na, donde se evidencia un máximo de absorción a una longitud de onda de 260

nm. En la tabla 3.2 se expresan los resultados de los parámetros mencionados

para todas las muestras analizadas, donde se constata que todos los polímeros

exhiben un máximo de absorción a 260 nm, un coeficiente de extinción cercano

a 0,0200 y una absorbancia de 1,00 para una solución de 50µg/mL de

concentración, resultados que corresponden a un ADN de doble hélice. El valor

del cociente de absorbancias de A260/ A280 cercano a 1,80; indica un grado de

pureza aceptable para la muestra de proveedor nacional y un alto grado de

pureza para la referencia certificada.


45

Figura 3.1 (a) Espectro de Absorción y (b) relación absorbancia vs

concentración de ADN-Na en agua Milli-Q pH 7,2.

Tabla 3.2 Parámetros de identificación y pureza en agua Milli-Q a pH

7,2

1. La desviación estándar fue calculada para las mediciones de cada muestra de manera

independiente, por la similaridad entre los valores de los errores se reporta solo uno.

Al realizar el monitoreo de control de estos parámetros del ADN durante

el almacenamiento, se observó que la muestra sufre algún proceso de

degradación, ocasionado probablemente por la continua apertura del envase y

exposición del material al ambiente. Razón por la cual se implementa una

frecuencia de análisis cada 3 meses y se fortalecen las medidas sanitarias en la

manipulación.

Parámetro Teórico ADN-Na HADN ADN-NaR HADNR

σ1

Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2 Lote 1

λ máx. 260 260 260 260 260 260 -----

A (50µg/mL)

1,00 1,04 1,00 1,22 1,08 1,11 ± 0,01

a (µg/mL)-1 cm-1

0,0200 0,0208 0,0209 0,0235 0,0218 0,0219 ± 0,0005

Relación de A 260:280

1,80 1,62 1,72 1,49 1,76 1,88 ± 0,03

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

200 220 240 260 280 300 320

A

λnm

y= 20,8 x - 0,0056 R² = 0,998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,02 0,04 0,06

A

mg/mL

a b


46

Los parámetros del HADN obtenido por resina, revelan que su paso por

esta degrada la molécula hasta oligonucleótidos, por lo tanto, se alejan del

requerimiento de doble hélice y del grado de pureza aceptable.

3.4.2. Caracterización por potenciometría diferencial de

barrido (PDB)

La PDB es útil para caracterizar las propiedades ácido-base de sistemas

que estén constituidos por una molécula ionizable en solución o por una mezcla

de las mismas. Adicionalmente, permite identificar y cuantificar los grupos

ácidos y/o básicos presentes a través de las áreas que describen los perfiles.

Permite dar conclusiones acerca de la pureza iónica de los compuestos.

Las figuras 3.2 a, c y e muestran los perfiles de titulación de las

muestras de ADN-NaR, HADN y HADNR respectivamente, mientras que las

figuras b, d y f muestran cualitativamente el área delimitada por el diferencial

de pH entre la solución de referencia y la muestra de PE en función del

volumen del titulante. El área positiva del perfil de ADN-NaR de los grupos

fosfato (-O-Na+OPO-O) presentes en el PE están en su forma ionizada (-O- -

OPO-O-), es decir que los fosfatos se encuentran salificados, mientras que el

área negativa para los HADN y HADNR indican que los grupos ionizables del PE

se encuentran en su forma ácida (-O-HOPO-O). El resultado de la muestra

HADN confirma la eficiencia de las resinas de intercambio iónico para obtener el

HADN a partir del ADN-Na.

Se debe considerar el aporte a las respectivas áreas del perfil, por parte

de los grupos hidroxilo presentes en las bases guanidina y tiamina, que se

comportan como ácidos débiles (pKa= 9,9 y 9,4, respectivamente), y de los

nitrógenos protonables presentes en adenina y citosina, centros básicos muy

débiles (pKa= 4,2 y 3,51) (Acharya S, 2006).


47

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20

Δp

H

HCl 0,05 N (mL)

f

-2

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20

Δp

H

b

-8

-6

-4

-2

0

0 5 10 15 20Δ

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

pH

a

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

pH

HCl 0,05 N (mL)

e

c

d

Figura 3.2 Perfiles de titulación potenciométrica de ADN-NaR (a), HADN (c),

HADNR (e), la muestra referencia NaOH vs HCl ( ) y (....) NaOH + PE vs HCl y

(b, d y f ) ΔpH = (....) - ( ) vs HCl.


48

3.4.3. Determinación potenciométrica de Sodio

Considerando que todos los grupos fosfato se encuentran como sal

sódica (-O-Na+OPO-O), los equivalentes por gramo de polímero fueron

determinados mediante la cuantificación potenciométrica de sodio. El ADN-Na

presenta 3,71 ± 0,01 meq y el ADN-NaR contiene 3,51 ± 0,01 meq (-O-

Na+OPO-O) por gramo de material sólido (tabla 3.3). Los datos obtenidos

están cercanos al límite inferior del intervalo de peso molecular informado para

una unidad de nucleótido (288,2 – 328,2 para las bases de menor y mayor peso

molecular).

Tabla 3.3 Determinación de los mequivalentes de grupos fosfato por

gramo de material, a través de la determinación de sodio.

Ecuación de la

recta

Error Valor

X´ [M] mg/mL PE Eq.g

NaCl Y= 54,9 X+101,2 ±1,5

ADN-Na Y= 53,0 X+ 89,7 ±1,4 -2,9 1,3 x 10-3 0,35 269,2 (3,71 ± 0,01) x 10-3

ADN-NaR Y= 56,3 X+96,5 ±1,6 -2,8 1,4 x 10-3 0,41 284,9 (3,51 ± 0,01) x 10-3

Figura 3.3 Curvas de calibración del NaCl y ADN-Na para la

determinación de Sodio.

y = 54,9 x + 101,2

R² = 0,998

y = 53,0 x + 89,7 R² = 0,998

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

-5 -4 -3 -2 -1 0

mV

Lg[M]

NaCl

DNA.Na C


49

3.4.4. Caracterización de la estructura secundaria por

Dicroísmo Circular (DC)

Todas las dispersiones acuosas en agua Milli-Q de la figura 3.4, fueron

tomadas bajo las mismas condiciones de concentración y pH ≈ 7,0 Es

importante destacar que los resultados obtenidos con esta técnica sobre la

estructura secundaria son de tipo cualitativo.

Las dispersiones de los polímeros presentaron un perfil de DC

correspondiente a una estructura secundaria de doble hélice tipo-B.

Comportamiento característico de la estructura nativa, dónde las bases se van

uniendo complementariamente girando hacia la derecha, en entornos de alta

humedad relativa.

En la figura 3.4 se observan tres señales corrientemente adjudicadas a la

configuración B, un efecto Cotton positivo en 275 nm, un efecto Cotton

negativo en 240 nm y un punto de cruce con el eje en 258 nm, que coincide

con la longitud de onda de máxima absorción del ADN. Finalmente, en la región

de longitud de onda corta entre 180 y 200 nm aparece una señal positiva.

En la figura 3.5 se puede evidenciar el efecto de la concentración del PE

sobre la intensidad de las señales, estas determinaciones fueron necesarias a

fines de seleccionar la concentración óptima del PE, que permitiera definir con

mayor claridad los efectos Cotton positivo y negativo descriptos en el párrafo

anterior.


50

Figura 3.4. Perfil de DC de ADN-NaR, DNA-Na y HADNR en agua Milli-Q,

pH ≈7,0. La concentración del PE en las dispersiones acuosas es de

0,05

mg/mL.

Figura 3.5. Perfil de DC de DNA-Na en agua Milli-Q, pH ≈7,0. La

concentración del PE en las dispersiones acuosas varía en el intervalo

de 0,005 a 0,049 mg/mL.

nm

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

-2

-1

0

1

2

3

ADN-Na

ADN-NaR

HADNR

nm

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

-2

-1

0

1

2

3 0.005 mg/mL

0.018 mg/mL

0.024 mg/mL

0.037 mg/mL

0.049 mg/mL


51

El efecto de la temperatura sobre la estructura secundaria se observa en

la figura 3.5, se describe una señal positiva en toda la región, comportamiento

que ha sido descripto para el ADN de cadena sencilla (Johnson C, 1996).

La pérdida de la estructura secundaria, ejercida por el calentamiento, no

es reversible en su totalidad luego del enfriamiento, ya que se observa en la

región de longitud de onda < 215 nm de la muestra de ADN enfriada, una

inversión de la señal positiva, comportamiento descripto anteriormente cuando

el ADN sufre una transición polimórfica a la forma Z, esta puede ocurrir en

alguna parte de la estructura o en toda la muestra, donde la formación de la

doble hélice complementaria se conforma girando hacia la izquierda (Walker G,

1980).

Figura 3.6. Efecto de la temperatura sobre el perfil DC de ADN-NaR en

agua Milli-Q, pH ≈7,0. La concentración del PE en las dispersiones

acuosas es de 0,05 mg/mL.

nm

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

-10

-5

0

5

10

15

20

25

25ºC

82ºC

enfriamiento


52

3.4.5. Caracterización de tamaño molecular por

electroforesis

La figura 3.7 muestra el resultado de la electroforesis en gel de agar de

los PE. En la parte superior de la fotografía se ubica el polímero de mayor peso

molecular, en este caso la muestra 4 correspondiente al ADN-NAR exhibe una

banda entre 2000 a 8000 pares de bases (pb). En las zonas inferiores se ubican

los polímeros de menor peso molecular, el ADN-Na, el HADN y el HADNR

exhibieron un tamaño menor a 100 pb.

Figura 3.7 Electroforesis en gel de agarosa de ADN-Na y HADN, corridas en gel de agarosa al 0,75% y teñidas con SYBR Green I.

Línea 1. HADN; Línea 2. ADN-Na; Línea 3. HADNR; Línea 4. ADN-Na

R

1 2 1 2 3 4


53

3.4.6. Ensayo de permeación de los polímeros

La figura 3.8 muestra el resultado de la permeación de los polímeros a

través de la membrana, que será utilizada posteriormente en los ensayos de

determinación de constantes de afinidad y cinética de liberación. Para la

implementación de esas técnicas es requerimiento que el polímero no atraviese

la membrana. Como se observa en la figura, la forma ácida de ADN, tanto de la

referencia como el obtenido por resina, presentan migración al compartimento

receptor de componentes de muy bajo peso molecular. Aunque el peso de

estos polímeros, determinado por electroforesis, es similar al ADN-Na, es

posible que la forma ácida tenga un porcentaje de pequeños fragmentos no

caracterizados. El comportamiento observado sobre la pureza de estas

muestras, determinó que no se utilizarán en la preparación de complejos con

los F seleccionados.

Figura 3.8 Porcentaje de permeación de polímero a través de membrana de celulosa (12,000 Da), usando como medio receptor

agua.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 30 60 90 120 150

% p

erm

ea

ció

n d

e p

oli

me

ro

Tiempo (min)

ADN-NaHADNHADNR


54

3.5. Conclusiones

Se obtuvo información y conocimiento acerca de la pureza y de las

características fisicoquímicas de mayor relevancia de las dispersiones ADN-Na y

ADN-NaR y sus respectivas formas ácidas.

La batería de ensayos propuesta logró la caracterización necesaria para

avanzar en el estudio de la interacción ADN-F.

Se determinaron los grupos ionizables fosfato por gramo del ADN

Se determinó la estructura secundaría del ADN y el efecto parcialmente

irreversible de la temperatura.

Se verificó que el ADN obtenido de proveedor nacional cumple con los

criterios de calidad y pureza, al ser comparado con ADN de referencia de

calidad certificada.

La diferencia entre el peso molecular de ADN-Na y ADN-NaR, produce

dispersiones de diferente aspecto y viscosidad, lo que lleva a utilizarlas

en diferente porcentaje P/V en los complejos.

Se evidenció que la forma ácida del ADN no es conveniente para la

elaboración de complejos con F.

La frecuencia de reanálisis establecida permitió detectar detrimento de la

calidad de la materia prima y tomar los correctivos pertinentes.


55

PARTE II

3.1. Introducción

El criterio utilizado para seleccionar un grupo de F modelo consideró, por

una parte, utilizar F que hayan sido estudiados previamente como contraiones

de PE ácidos. Por otra parte, se consideró incorporar F con diferente basicidad y

que exhibieran diferentes propiedades hidrofílicas-lipofílicas.

Adicionalmente, se estimó que ambas especies, F y FH+, tuvieran el

mismo espectro de absorción.

3.2. Set de F Modelo

Todos los F seleccionados como modelo tienen grupos básicos en su

estructura constituidos por aminas alifáticas (Figura 3.7). La tabla 3.1 contiene

las principales propiedades físicas y químicas del conjunto de F.

Estos F, como se mencionó antes, han sido utilizados con otros PE como

el Carbomer, el Ácido Algínico, la Carboximetilcelulosa, el Ácido Hialurónico, el

Eudragit®S y Eudragit®L, lo que permite comparar los resultados.


56

Atenolol Lidocaína

Timolol Propranolol


57

Bencidamina

Figura 3.7. Fármacos seleccionados para estudiar los sistemas (PE-Fx)

Tabla 3.1: Fármacos básicos seleccionados con sus valores de pKa, PM

Log PC y solubilidad de sus bases libres.

F PMa

g/mol Tipo de

Amina pKa

Log PC

o/wb Solubilidad (mg/mL)

Atenolol (At) 266,34 Secundaria 9,54 0,22 13,30

Propranolol (Pr) 295,81 Secundaria 9,53 3,48 7,09 x 10-2

Timolol (Ti) 316,42 Secundaria 9,53 2,12 2,74c

Lidocaina (Li) 234,34 Terciaria 7,95 2,44 4,10c

Bencidamina (Bz) 345,90 Terciaria 9,27 3,71c 5,11 x 10-2

a) PM: Peso molecular del F. b) Log PC o/w: log del coeficiente de partición en

octanol / agua. Todos los datos fueron tomados de Avdeef A. Absorption and

Drug Development (2003), excepto aquellos marcados con “c ” los cuáles fueron

tomados de PubChem.


58

3.3. Calidad y origen de los materiales utilizados

Los siguientes materiales fueron utilizados en el desarrollo de esta tesis

doctoral:

ADN de esperma de salmón (DNA-NaR) de Sigma Chemical Co., St Louis,

EE.UU. y ADN de esperma de salmón (ADN-Na) de Parafarm®, Bs. As,

Argentina. Atenolol y los clorhidratos de lidocaína, propranolol y bencidamina y

la sal de maleato de timolol, todos de calidad farmacéutica, Parafarm®, Bs. As,

Argentina. Se utilizaron Sigma SYBR Green I (SIAL), agarosa BioReagent, para

biología molecular, 1KB DNA Ladder y PCR 100 bp Low Ladder. Se preparó una

solución salina tamponada con fosfato 10 mM (pH 6,8 PBS), de acuerdo con la

USP 34-NF 29, 2011. Todos los demás reactivos químicos fueron de calidad

analítica y se utilizó agua Milli-Q en los experimentos.

En este capítulo se describen la caracterización de las propiedades

físicas de las dispersiones ADN-F. Así como un estudio preliminar de la

obtención de estos complejos en estado sólido y su posterior

redispersión.

Caracterización de

los Sistemas ADN-F

en dispersión

Capítulo 4


61

4.1. Introducción

El objetivo de este capítulo es describir los resultados obtenidos en la

preparación de los diferentes complejos y la posterior caracterización de

algunas propiedades físicas de las dispersiones ADN-F, vinculadas a la

estabilidad de estos sistemas.

Con este propósito se realizaron diversas determinaciones dirigidas a

caracterizar tales propiedades, entre ellas determinaciones de pH,

conductividad, potencial electrocinético y comportamiento electroforético.

Además, se caracterizó la capacidad del ADN para formar pares iónicos

[R- FH+] con un set de F modelo. El grado de afinidad se determinó midiendo la

proporción de F unido al PE y las proporciones de especies libres bajo la forma

F y FH+ en situaciones de equilibrio utilizando diálisis.

De manera complementaria, dada la complejidad del ADN, se realizó un

estudio preliminar y exploratorio de la obtención de complejos en estado sólido

por liofilización, y su caracterización en cuanto a la pérdida de cristalinidad de

los F al interaccionar con el PE, utilizando la difracción de rayos x.

Este estudio, que aporta al entendimiento a escala molecular del sistema

PE-F, está vinculado con los resultados que se discutirán en capítulos

posteriores, sobre la cinética de liberación de los F y el efecto de la interacción

sobre la estructura secundaria del AN.


CARACTERIZACIÓN SISTEMAS ADN-F NACIONAL DE CÓRDOBA

62

En lo que respecta al ADN, los grupos fosfato presentes en los

nucleótidos, poseen un hidrógeno ácido (pKa 1,5 Acharya S, 2006) que se

disocia en un amplio intervalo de valores de pH de interés fisiológico y le

confieren las propiedades de los PE aniónicos. Considerando entonces, que los

equilibrios iónicos constituirían la principal interacción entre los grupos fosfato

del ADN y las especies protonadas FH+, la ecuación 1 puede ser reemplazada

por:

R-Na +FH+A- R- + FH++ Na+ + A- [R- FH+] + Na+ + A-

Ec.6

Donde R- representa un grupo fosfato ionizado de la sal sódica del ADN

y A- representa el anión de las sales de los F.

4.2. Materiales y Metodologías

Para desarrollar estas determinaciones se utilizaron las dispersiones de

ADN-Na y ADN-NaR y soluciones de F descriptos en el capítulo 3. Se utilizó

agua Milli-Q para la realización de los ensayos.

La metodología para la preparación de complejos ADN-Fx (X= 25, 42 y

85 moles %), tanto de la dispersión al 0,60 % P/V del ADN-Na, como al 0,12%

P/V del ADN-NaR y el ajuste de pH de los sistemas, y su posterior obtención en

estado sólido, se describe en el numeral 2.2.9 del capítulo 2. Se preparó el

complejo ADN-At(85)-NaCl(z), conforme al numeral 2.2.11.


63

Los estudios de pH, conductividad, potencial ζ, electroforesis y

finalmente, los patrones de difracción de Rx fueron obtenidos tal y como se

describió en los numerales 2.2.2., 2.2.5. - 2.2.7. y 2.2.14. del capítulo 2.

Finalmente, los estudios de afinidad se llevaron a cabo utilizando bolsas

de diálisis de la manera como se describió en el numeral 2.2.10. del capítulo 2.

4.3. Resultados y Discusión

En general, la reacción de las dispersiones acuosas de ADN-Na al 0,60 %

P/V con proporciones crecientes de los F básicos modelo [atenolol (At),

lidocaína (Li), propranolol (Pr), timolol (Ti) y bencidamina (Bz)] generaron

dispersiones homogéneas ligeramente viscosas, transparentes sin la presencia

de sedimentos, excepto cuando reaccionaron con una alta proporción de F de

mayor lipofilicidad como el Pr y Bz, como se detalla en la tabla 4.1. Los

sistemas con presencia de precipitado no fueron utilizados para las posteriores

determinaciones.

Resultados similares fueron obtenidos con ADN-NaR al 0,12% P/V.

Aunque en este caso se usó una concentración más baja de PE debido a la

viscosidad producida por el alto peso molecular de la macromolécula. Sin

embargo, en ambos casos, un incremento de la concentración de los complejos,

también produce un incremento en la viscosidad de las dispersiones generando

hidrogeles traslucidos.

Por inspección visual se determinó que los sistemas son físicamente

estables durante el almacenamiento a 2-8°C durante 20 días.



64

Tabla 4.1. Descripción del aspecto físico de las dispersiones ADN-F.

Complejo % F Aspecto

ADN -At

ADNR – At 25-100 Dispersión traslucida incolora

ADN -Li

ADNR – Li 25-100 Dispersión traslucida incolora

ADN -Pr

ADNR – Pr 25-100

Dispersiones traslucidas incoloras hasta el 75% de F.

> 75% Dispersiones opacas, lechosas con presencia

de precipitado

ADN -Ti

ADNR – Ti 25-100 Dispersión traslucida incolora

ADN -Bz

ADNR – Bz 25-100

Dispersión traslucida incolora hasta el 50% de F, >

50% presencia de opacidad hasta precipitados

Es de destacar, que estos sistemas pueden contener concentraciones

importantes de F. Por ejemplo, en las dispersiones de ADN-Prx, ADN-Bzx, ADN-

Lix y ADN-Tix, se vehiculizan concentraciones de F superiores a la solubilidad en

agua de sus formas neutras como se informa en la tabla 4.2.

Tabla 4.2. Comparación entre la solubilidad del F y la concentración de

F en la dispersión.

F

ADN-Fx

(%)

Concentración de

F vehiculizado en la dispersión

[mg/mL]

pH

Solubilidad

acuosa de F (mg/mL)

[ADN-F]b / Soc F

Propranolol (Pr) 40 2,46 6,66 7,09 x 10-2 34,70

Timolol (Ti) 85 7,19 6,67 2,74a 4,45 Lidocaína (Li) 85 4,80 5,95 4,10a 1,20

Bencidamina(Bz) 40 2,87 4,73 5,11 x 10-2 56,16

Los datos de solubilidad fueron tomados de Avdeef A, (2003) excepto los marcados con “a ” tomados de PubChem (2016). b: Concentración de F vehiculizado en la dispersión [mg/mL]. c:

Solubilidad acuosa del F (mg/mL).


65

4.3.1. pH de las dispersiones ADN-F

El pH de las dispersiones al 0,60% P/V del ADN-Na y al 0,12% P/V del

ADN-NaR es de 7,2. La progresiva incorporación de los F en forma de sales

(clorhidrato y maleato) produce una disminución del pH como se informa en la

tabla 4.3 (a) y (b). El At que se incorpora como base libre genera valores de pH

entre 10,0 y 11,0 por lo que el sistema se lleva a neutralidad mediante el

agregado de HCl 1M.

Tabla 4.3. Valores de pH ± 0,05 de dispersiones ADN-F (a), ADNR-F

(b). F en proporciones crecientes expresadas como moles %

a) Proporción de F

%

ADN-F

Pr Me Li

25 7,17 7,06 7,01

50 7,03 6,47 6,75

75 6,97 6,24 6,62

100 6,89 6,07 6,58

b) Proporción de F

%

ADNR-F

Pr Be Li Ti

50 6,66 6,67 6,59 5,41

100 6,33 6,21 6,19 4,93

Los valores de pH de las dispersiones son directamente dependientes de

la basicidad (pKa) y porcentaje de F incorporado y de su contraión, así como

también de la concentración de polímero disperso en cada caso. El Ti está

salificado con el ácido dicarboxílico maleico cuya solución acuosa exhibe un



66

valor de pH entre 3,8 y 4,3 (USP 34-NF 29, 2011) y, en consecuencia, origina

dispersiones más ácidas.

4.3.2. Mediciones de conductividad

La figura 4.1 ilustra un aumento progresivo de la conductividad con el

agregado de proporciones crecientes de At a las dispersiones de ADN-Na. Este

comportamiento es consistente con la formación de pares iónicos de acuerdo

con la Ec. 6, y la consecuente liberación de Na+ desde el ADN, que junto al Cl-

proveniente del At, incrementan la conductividad gracias a su alta movilidad

electroforética.

Figura 4.1 Variación de la conductividad específica ( ) y del pH ( )

con la proporción de At en la dispersión.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

0

500

1000

1500

2000

2500

0 25 50 75 100 125 150

σ (

µS

/cm

)

% Proporción de F

pH


67

4.3.3. Mediciones de potencial electrocinético

En la figura 4.2 se representa el efecto de la adición progresiva de F

sobre el ζ del ADN-Na. Tanto el ADN-NaR al 0,12% como el ADN-Na al 0,60%,

exhiben ζ altos y negativos, -36 mV y -28 mV, respectivamente. Se observa que

la adición de F cambia progresivamente el ζ inicial, llevándolo a valores menos

negativos. Esta disminución se asocia con la condensación de la especie FH+

con el ADN, en el que el microentorno del polianión está rodeado de moléculas

del FH+ que neutralizan parcialmente sus cargas eléctricas.

Figura 4.2 Variación del potencial electrocinético en función del

agregado de moles % de F para la dispersión ADN-Fx.

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 25 50 75 100

ζ (m

V)

% Incorporación de F

At Li

Pr Me



68

4.3.4. Mediciones de electroforesis

Para este ensayo se adicionaron al ADN-NaR proporciones de F

equivalentes al 100% y 150% de los grupos fosfato a fin de mantener una alta

proporción de condensación contraiónica.

Se observa en la Figura 4.3 la electroforesis en gel de agarosa de ADN-

NaR y los complejos de ADNR–At(100 y 150). Las líneas 2 y 3, representan el ADN

cuando interacciona con el At, la movilidad del PE se ve disminuida y la

intensidad de la banda no se modifica al incrementar el agregado de F.

Figura 4.3 Electroforesis de

gel en agarosa de complejos

ADNR-F 100 y 150 en gel de

agarosa 0,75%, revelados

con Syber Green I. Línea 1,

ADNR; Línea 2 ADNR-At (100);

Línea 3 ADNR-At (150).

1 2 1 2 3 6 7 8 911


69

4.3.5. Distribución de especies en las dispersiones ADN-F

Con el propósito de caracterizar los equilibrios involucrados en la

interacción ADN-F y el grado de condensación iónica de los F con los PE, se

determinó la distribución de las especies en el equilibrio (F, FH+ y [R- FH+]),

utilizando la técnica de diálisis. La metodología utilizada se puso a punto

previamente (Battistini F, 2014), en respuesta a las limitantes presentadas por

la técnica de partición con solventes orgánicos de la especie neutra del F que

interacciona con el ADN. Entre ellas la imposibilidad de analizar F de baja

lipofilicidad.

Esquema 4.1 Representación de las especies y equilibrios establecidos en los sistemas ADN-F en condiciones de diálisis.

La técnica de determinación de especies en el equilibrio mediante diálisis de las

dispersiones PE-F es un sistema agua/agua, en este caso el efecto de

separación se consigue con el uso de una membrana semipermeable, que

impide la difusión del ADN desde el compartimiento donor por su tamaño



70

molecular, superior al tamaño del poro de la membrana como se muestra en la

figura 3.7. Los equilibrios que se establecen en este sistema están

representados en el esquema 4.1

4.3.5.1. Procesamiento de datos para la determinación de

Especies en el Equilibrio y de la constante de afinidad (Kpi)

Una vez alcanzado el equilibrio se determinaron las especies que

migraron al compartimento r, mediante:

a) La determinación molar del F por espectrofotometría UV. Dado que el

grupo básico es alifático en todos los F analizados, ambas especies F

y FH+ son analíticamente indistinguibles por lo que se determina FT =

FH+r + Fr

b) La determinación de [H+] en ambos compartimentos

c) Dado que F es la única especie capaz de difundir libremente entre los

compartimentos, se considera que su concentración en el equilibrio es

la misma en el compartimento d y r.

Es importante destacar que las mediciones espectrofotométricas se

realizan solamente en el compartimento r, en el que todas las especies están en

solución y no hay macromoléculas que puedan dispersar la radiación UV.

Sobre estas bases, conociendo la [F ] y la [H+] en el compartimento d ,

es posible determinar [FH+] a través de las ecuaciones descriptas a

continuación, y por defecto la fracción [FH+ ] que está formando parte del par

iónico. De acuerdo como lo describe la ecuación 6, en el equilibrio se cuenta

con la presencia de iones Na+ y A-, provenientes de la sal del PE y del F,

respectivamente. Estos iones por su tamaño molecular difunden libremente por

los compartimentos d y r.


71

Dado que, la masa de Fr en mg fue restada de la masa inicial F0 para

obtener la masa del compartimento donor Fd, (F0 – Fr = Fd ), de la relación

([ F ]r /[ F ]d ) dada por la diálisis, se puede calcular la distribución de especies

de acuerdo a las siguientes ecuaciones:

[F]𝑟

[F]𝑑=

[𝐹𝐻+]𝑟 + [𝐹]𝑟

[𝐹]𝑑 + [𝐹𝐻+]𝑑 + [R− 𝐹𝐻+]𝑑

Ec.7

𝐾𝑎 =[𝐹][𝐻+]

[𝐹𝐻+]

Ec.8

La constante de afinidad de la condensación iónica (Kpi) fue calculada

siguiendo las siguientes ecuaciones (Ardusso M, 2010):

𝐾𝑝𝑖 =[R− 𝐹𝐻+] [𝐻+]

[RH] 𝐾𝑎 [𝐹𝐻+]

Ec.9

El término [RH] fue calculado de la ecuación 10.

[RH] = [RH]𝑡 - [R− 𝐹𝐻+] - [R− ]

= [RH]𝑡 - [R− 𝐹𝐻+] - [ 𝐹𝐻+] Ec.10



72

Dadas las condiciones experimentales dónde la sumatoria de las especies

negativas [R− ] más [𝑂𝐻−] y [𝐶𝑙−] es igual a la sumatoria de las especies

positivas [𝐹𝐻+] más [𝐻+] y [𝑁𝑎+], y considerando que [ 𝐶𝑙−] =

[𝑁𝑎+], [R− ] ≫ [𝑂𝐻−] y [𝐹𝐻+] ≫ [𝐻+], entonces [R− ] se aproxima a [𝐹𝐻+].

De esta manera, la técnica conserva los principios fisicoquímicos de la

extracción por solventes, adicional de superar las limitantes anteriormente

mencionadas, abriendo el abanico para el análisis de una gran variedad de F

con diferentes propiedades fisicoquímicas, cuenta con la principal ventaja de

prescindir del uso de solventes orgánicos. Se obtienen resultados reproducibles

y confiables

4.3.5.2. Determinaciones analíticas en condiciones de equilibrio

La evaluación de la concentración de F en el compartimento r en función

del tiempo, permitió definir el tiempo en que el sistema alcanza el equilibrio. El

cual se define como la obtención de los mismos valores de concentración de F

en dos lecturas consecutivas, en un período no menor a 2 horas. De este modo

se estableció que en 24 horas el sistema alcanza el equilibrio.

El tiempo definido para alcanzar el equilibrio fue determinado por el

seguimiento de la diálisis durante 48 horas a 25°C del sistema ADN-Pr50. Como

puede observarse en la figura 4.4 a), para la relación de volúmenes 1/40 entre

los compartimentos d y r. En la figura 4.4 b) para la relación de volúmenes 1/10

entre compartimento d y r, en el intervalo de tiempo trascurrido entre las 24 y

36 horas se mantiene constante la concentración de F en el compartimento r ,

al igual que la distribución de especies. Conforme a los resultados, se define 24

horas como el tiempo en el cuál se alcanza el equilibrio para los sistemas ADN-

Fx.


73

Figura 4.4 Determinación del tiempo de diálisis necesario para alcanzar el

equilibrio en los sistemas ADN-F, utilizando como modelo el complejo ADN-

Pr43 a pH≈ 7,0. Relación de volumen entre el compartimento d y r : a) 1/40

b) 1/10

En la tabla 4.4 se presenta la proporción inicial de F en el sistema ADN-Fx

(antes del equilibrio), la fracción molar del [F] en el equilibrio expresada como

porcentaje de grupos fosfato neutralizados, la distribución de las especies en el

equilibrio y la constante de afinidad (Kpi) para una serie de experimentos, en el

que los datos obtenidos se procesaron de acuerdo con las ecuaciones, que se

describieron previamente.

a

b

0

20

40

60

80

100

12 24 36

Dis

trib

uci

ón d

e E

speci

es

(% )

tiempo Horas

[ ADN- FH+]

[ F ]

[ FH+]

0

20

40

60

80

100

12 24

Dis

trib

uci

ón d

e E

speci

es

(%)

tiempo Horas

[ FH+]

[ F ]

[ ADN- FH+]



74

Tabla 4.4. Distribución de especies en el equilibrio y log Kpi obtenido por diálisis de complejos ADN-Fx a 25 °C.

1: Relación de volumen entre el compartimento donor (d ) y receptor ( r ). 2: F cargado al ADN en las dispersiones (PE-Fx) colocadas en d antes de la extracción por

diálisis, expresada en mg/mL. La concentración en P/V del ADN-Na y ADN-NaR es 0,60% y

0,12%, respectivamente. 3: Porcentajes (moles %) de F acomplejado con el PE remanente en d luego de la diálisis 4: Valores de pH en r y d después de la diálisis 5: Distribución de especies expresadas como % total de F remanente en d después de la diálisis 6: Logaritmo de la constante de afinidad (Kpi) de la formación del par iónico

Vd/Vr

1. Complejo

F2 Concentración

[mg/mL]

Fx3

[mol

%]

pH4 Distribución de Especies5 (%) Log

Kpi6 r d [R-FH+] FH+ F

1/40

ADN-AtX

2,20 9,38 6,37 6,21 83,98 16,01 1,0 x 10-2 5,86

3,33 18,34 6,77 6,31 83,28 16,70 1,0 x 10-2 5,79

4,49 29,30 6,27 6,44 96,70 3,30 2,8 x 10-3 6,49

6,60 28,99 6,17 6,19 91,49 8,51 4,0 x 10-3 6,30

ADN-PrX

1,25 11,25 6,75 5,66 76,06 23,94 3,5 x 10-3 6,06

2,45 20,71 6,71 5,73 74,47 25,53 4,3 x 10-3 6,00

3,72 24,51 6,64 5,72 69,78 30,21 5,1 x 10-3 5,92

4,90 26,19 6,49 5,94 82,65 17,35 4,8 x 10-3 6,03

ADN-LiX

2,24 9,42 6,17 5,91 85,01 14,75 0,230 4,51

3,39 12,65 6,06 5,91 86,44 13,34 0,225 4,58

4,48 20,59 6,14 5,81 84,94 14,87 0,191 4,66

ADN -At85 4,48 28,79 6,27 6,44 96,70 3,30 2,8 x 10-3 6,49

ADN -At85-NaCl25 4,48 22,67 6,26 6,18 91,19 8,81 4,1 x 10-3 6,26

ADN -At85-NaCl50 4,48 14,08 6,19 6,29 89,98 10,01 6,3 x 10-3 6,04

ADN -At85-NaCl75 4,48 5,42 6,19 6,05 78,07 21,92 6,8 x 10-3 5,84

ADN -At85-NaCl100 4,48 13,32 6,20 5,99 49,35 50,63 1,8 x 10-2 5,37

1/10

ADN -AtX

2,20 36,53 6,36 6,43 98,67 1,33 1,1 x 10-3 6,95

3,33 59,44 6,42 6,41 99,27 0,73 6,0 x 10-4 7,42

4,49 75,37 6,37 6,44 98,80 1,20 9,6 x 10-4 7,40

5,52 92,46 6,27 7,00 97,22 2,77 8,7 x 10-3 6,98

ADNR-AtX 1,29 40,77 6,24 6,71 93,19 6,80 1,1 x 10-2 6,66

1,57 41,95 6,34 6,63 86,60 13,39 1,8 x 10-2 6,43

ADNR- PrX

0,71 30,77 6,25 6,28 88,45 11,54 6,8 x 10-3 6,63

1,45 43,60 6,55 6,25 63,24 36,74 2,1 x 10-2 6,09

2,10 55,13 6,38 6,26 68,25 31,74 1,8 x 10-2 6,28

ADNR- LiX 1,44 30,74 6,30 6,13 53,04 45,73 1,211 4,40

2,13 50,93 6,12 6,07 70,29 29,03 0,699 4,93


75

Como se puede observar en esta tabla, una alta fracción de F que

permanece en el compartimiento d cuando se alcanza el equilibrio, está

involucrada en la condensación iónica con el ADN.

Los F modelo exhiben altas afinidades con el ADN, expresadas como Kpi,

que son del orden de 106.

Los experimentos en una relación de volumen de 1/40 evidencian que At

y Pr exhiben Kpi similares, y a su vez mayores que la presentada por Li, que es

un F de menor basicidad (con un pKa inferior). Este comportamiento también

se observó anteriormente con otros PE ácidos (Ardusso M, 2010).

Adicionalmente, para los experimentos con una relación de volumen de

1/10, cuando el sistema ADN-Atx se carga con una mayor proporción de At, la

Kpi aumenta de manera proporcional con la carga. Finalmente, tanto los

resultados de la tabla 4.4 y la figura 4.5 muestran que el ADN-NaR de alto peso

molecular exhibió un comportamiento similar al observado con el ADN-Na.

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

5 10 15 20 25 30

Log K

pi

Proporción de F (%) en el equilibrio

Prop

Lid

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

25 35 45 55 65

Log K

pi

Proporción de F (%) en el equilibrio

Prop

Lid

b a

Figura 4.5 Efecto de la proporcionalidad de F modelo que neutraliza ADN-

Na sobre la Kpi. Comparación del comportamiento entre las dos fuentes

de ADN-Na ensayadas. a) ADN-Na 0,60 % P/V b) ADN-NaR 0,12 % P/V



76

4.3.6. Reversibilidad del Sistema: Efecto de la relación de

volúmenes compartimento donor (d) y receptor (r).

La figura 4.6 es otra representación gráfica de los resultados de la

distribución de especies luego de alcanzar el equilibrio de los sistemas ADN-Atx,

estos resultados corroboran lo expresado de la tabla 4.4, respecto a la alta

proporción del F que está comprometido en la formación del par iónico con el

ADN.

Cuando la relación de volúmenes entre compartimento r y d es 1/10, la

cantidad remanente después del equilibrio de atenolol en el compartimento r

del sistema ADN-At105 es de 92%, la cual está distribuida de la siguiente

manera:

[ At ] = 0,01 %, [AtH+] = 2,77 % y [ADN-AtH+] = 97,22 %. Esta

tendencia se repite en todos los resultados.

0

20

40

60

80

100

37 59 75 92

% D

istr

ibuci

ón d

e E

speci

es

Proporción de F (%)

Figura 4.6 Distribución de especies en el equilibrio de los sistemas ADN-

At37-92 a pH≈ 7,0; obtenidos por diálisis.

[ ADN-FH+]

[ FH+]

[ F ]


77

La reversibilidad de la interacción se puede observar en la figura 4.7, al

incrementar la relación de volúmenes a 1/40 disminuye la cantidad de F

remanente en el compartimento d cuando se alcanza el equilibrio, con

pendientes de 0,856 para la relación 1/10 y 0,451 para 1/40. El

comportamiento observado aquí se representa en el esquema 4.1, que

considera los equilibrios que se establecen en los dos compartimentos

separados por una membrana semipermeable como se describió anteriormente,

donde las especies que migran libremente son las del F en su forma neutra F, y

las especies catiónicas FH+ y Na+ acompañadas de sus contraiones A-.

b

Figura 4.7 Efecto del cambio del volumen del compartimiento receptor en el

equilibrio de los sistemas ADN-F introducidos en el compartimento d,

utilizando como modelo el complejo ADN-At37-92 a pH≈ 7,0.

y = 0,86 x + 1,85 R² = 0,994

y = 0,45 x - 10,04 R² = 0,997

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 25 50 75 100 125

Pro

porc

ión d

e F

(%

) desp

ués

del

equili

brio

Proporción inicial de F (%)

10/100 10/400



78

A medida que F migra al compartimento r, FH+ se disocia en agua y

como consecuencia de esta disminución de [FH+], esta especie se regenera a

partir de ADN-AtH+ actuando este par iónico como un reservorio de F, hasta

que, una vez saturado el compartimento r se alcanza el equilibrio químico.

Explicando el mecanismo de mayor migración de F al aumentar el volumen del

compartimento r.

4.3.7. Reversibilidad del Sistema: Efecto de la adición de

otras especies sobre los equilibrios.

El modelo de equilibrios propuesto, permite suponer que el agregado de

iones al sistema debería generar desplazamientos de especies como

consecuencia de intercambios iónicos y reagrupamiento de cargas. No obstante,

como se describió anteriormente en la ecuación 6, el sistema originalmente

cuenta con la presencia del ion Na+ proveniente del ADN-Na y del ion Cl-

proveniente de las sales de los F modelo, especies que también alcanzan un

equilibrio entre el compartimento d y r. bajo estas condiciones se determinaron

constantes de afinidad del orden de 106, evidenciando la fuerte atracción

electrostática entre el ADN y F.

R-Na +FH+A- R- + FH++ Na+ + A- [R- FH+] + Na+ + A-

Ec.6

Para un sistema sin interferencia original de iones Na+ y Cl- , el reagrupamiento

de cargas se describe en la ecuación 11 y 12.

[R- FH+] + NaCl- R- Na+ + FH++ Cl- Ec.11

FH+ F + H+ Ec.12


79

De este modo, para evaluar la reversibilidad de la interacción PE-F, se

usó como estrategia la adición de proporciones crecientes de NaCl al sistema

ADN-F que ya contiene Na+ y Cl-. Al aumentar la concentración del ion Na+ se

genera un desplazamiento de una cierta proporción de FH+. Sin embargo, como

puede observarse en la figura 4.8 y en la tabla 4.4, el efecto sobre la Kpi es

limitado, lo que evidencia la mayor afinidad de FH+ sobre Na+.

Figura 4.8 Efecto de la adición de concentraciones crecientes de

contraiones inorgánicos (NaCl), sobre la distribución de especies de los

sistemas ADN-F, utilizando como modelo el complejo ADN-At85. Los valores

de pH corresponden al compartimento d en el equilibrio.

5,8

5,9

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 25 50 75 100

Lo

g K

pi

Proporción de NaCl adicionado (%)

NaCl

pH

pH



80

Patron de difracción de Rayos X

2

0 20 40 60 80 100

ADN-Na

ADN-Li50

Li

4.3.8. Difracción de rayos X de los complejos ADN-F

Se obtuvieron por liofilización complejos sólidos de color blanco, que se

almacenaron en envases de vidrio ámbar y protegidos de la humedad.

El ADN, como la mayoría de los polímeros, presenta un patrón de

difracción nulo, correspondiente a un sólido amorfo, que se caracteriza por

presentar una banda dispersa de baja intensidad a lo largo de todo el espectro

de 2θ / θ. En cambio, los F cristalinos producen un espectro de rayos X

característico, presentando picos intensos a determinados valores de 2θ / θ.

(a)

Figura 4.9 (a) Difracción de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Li y Li como F modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ.


81

Patron de difracción de Rayos X

2

0 20 40 60 80 100

ADN-Na

ADN-Pr50

Pr

(b)

Figura 4.9 (b) Difracción de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Pr y Pr como F modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ.

En las figuras 4.9 (a) y (b) se muestran los patrones de rayos X

característicos para los F seleccionados como modelo de molécula contraión (Li

y Pr respectivamente), del polímero y de los complejos iónicos. Como puede

observarse, el ADN-Na, presenta un diagrama de difracción nulo, una banda

dispersa de baja intensidad semejante a otros PE estudiados. En contraste los F

presentan un difractograma de sólido cristalino.

En los difractogramas de los complejos obtenidos por liofilización,

desaparecen las señales del F cristalino completamente al 40% de

neutralización, asemejándose al de sólido amorfo.



82

Respecto al comportamiento de los complejos PE-F, obtenidos por

interacción iónica entre un F cristalino con un PE. Estos dan origen a un

material amorfo, con ausencia de F libre, que se adjudica a la alta condensación

iónica del F con el PE. (Jiménez-Kairuz A, 2004; Ramírez M, 2006; Quinteros D,

2008; Esteban S, 2009).

Finalmente, se procedió a la redispersión de los complejos sólidos en la

misma proporción de agua Milli-Q inicial, observándose las mismas

características visuales de las dispersiones originales, sin presencia de

precipitados o turbidez. La determinación de la recuperación de las demás

propiedades fisicoquímicas se procederá en etapas posteriores a ser evaluadas.

4.4. Conclusiones

La reacción entre dispersiones acuosas de ADN-Na o ADN-NaR y

diferentes proporciones de las sales de los F utilizados, generan

complejos estables que permiten vehiculizar concentraciones de F

superiores a la solubilidad de sus formas no protonadas.

Los resultados que se reportan en este capítulo son consistentes con la

interpretación basada en la ecuación 6.

La incorporación al ADN de proporciones crecientes de los F genera una

progresiva disminución del pH, lo que es consistente con la alta acidez

de los grupos fosfato (pKa≈1) y la basicidad de las aminas alifáticas (pKa

= 7,95 - 9,53), genera también un aumento de conductividad debido a la

liberación de los contraiones Na+ y Cl- de alta movilidad electroforética.


83

En todos los casos produce una progresiva disminución del alto potencial

electrocinético negativo de ADN-Na, que es consistente con la formación

de pares iónicos [R- FH+]. A su vez, disminuye la movilidad

electroforética de las macromoléculas, lo que puede interpretarse por la

disminución de las cargas netas y aumento del peso molecular.

La técnica definida para la determinación cuantitativa de la afinidad ADN-

F resultó ser idónea para el sistema estudiado, debido a que como se

informó mediante la figura 3.7, la membrana de 12,000 D es efectiva

para evitar el pasaje de la sal sódica del ADN. Además, la técnica

permite conservar la integridad del biopolímero, como no sucedería con

el uso de solventes orgánicos.

El análisis de la determinación cuantitativa de la afinidad, evidenció que

una alta proporción de los F ensayados se encuentra unida a los grupos

fosfato de los ADN en forma reversible exhibiendo constantes de afinidad

(Kpi) en el intervalo 104 – 107.

Las Kpi para los F con mayor basicidad (At, Pr) exhiben valores más altos

que los F con menor basicidad (Li).

El sistema es sensible a la adición de sales neutras que disminuyen

progresivamente el valor de las Kpi, pero pone en evidencia que la

afinidad de las especies protonadas FH+ es mucho mayor que la de los

cationes Na+.



84

Los resultados pueden interpretarse mediante la ecuación 6, lo que pone

de manifiesto que el ADN se comporta en forma análoga a otros PE

ácidos estudiados previamente. La tabla 4.5 presenta datos comparativos

de las Kpi de F con mayor (At, Pr, Me) y menor basicidad (Li), como

acomplejantes de PE lineales con grupos ácidos de diferente fuerza (ADN

pKa≈1.0, HA pKa≈2 y EL, ES pKa≈6)

Del análisis comparativo con otros PE, se observa que los valores de Kpi

para el ADN son similares al HA, estos son mayores que los obtenidos

con los Eudragit® ( EL, ES), y a su vez, EL y ES tienen Kpi similares.

Tabla 4.5. Comparativo de la distribución de especies en el equilibrio y log Kpi de complejos PE-Fx

Donde EL: Eudragit L; ES: Eudragit S; AH: Ácido Hialurónico; Me:

Metoclopramida

Complejo

Fx

[mol %] Distribución de Especies (%)

Log Kpi [R-FH+] FH+ F

EL-Li 25 86,80 12,40 0,80 3,45

50 76,24 33,31 1,45 3,23

ES-Li 25 88,60 8,60 2,80 3,02

50 82,86 13,64 3,49 3,02

EL-Me 50 49,74 50,22 0,04 4,55

ES-Me 50 68,50 31,41 0,09 4,59

AH-Li 25 56,07 42,99 0,94 4,25

50 62,23 36,99 0,77 4,36

AH-Pr 25 60,63 39,64 0,02 5,89

100 78,56 21,42 0,02 6,14

ADNR-AtX 29,30 96,70 3,30 0,003 6,49

40,77 93,19 6,80 0,011 6,66

ADNR- PrX 30,77 88,45 11,54 0,01 6,63

55,13 68,25 31,74 0,02 6,28

ADNR- LiX 30,74 53,04 45,73 1,21 4,40

50,93 70,29 29,03 0,69 4,93

En este capítulo se estudia la cinética y el mecanismo de liberación in vitro de F

modelos desde los complejos iónicos ADN-F, y los factores que pueden

contribuir a modificar la liberación, entendiendo el proceso molecular y

fisicoquímico que se da lugar, y a partir de esta base predecir el comportamiento

que los sistemas tendrán in vivo.

Cinética y

mecanismo de

liberación de los F

desde los complejos

ADN-F

Capítulo 5


87

5.1. Introducción

Los estudios de la liberación de los F desde los complejos PE-F

generalmente se desarrollan en celdas bicompartimentales de tipo Franz. Esta

metodología fue introducida en la década de los 70´s (Franz T, 1978) y

posteriormente optimizada (Shah V, 1999) y fue denominada método de celdas

de difusión vertical por la Food and Drug Administration (FDA), que lo describe

como un método simple, confiable y reproducible para el monitoreo de la

liberación de principios activos desde cremas, ungüentos e hidrogeles (USP 34-

NF 29, 2011; FDA, 1997). La Federación Farmacéutica Internacional publicó

una guía de recomendaciones para la realización de ensayos in vitro para

nuevas formas farmacéuticas donde también las incluye (Brown C, 2011). En el

campo de la investigación, es el método más común referenciado en

publicaciones científicas para la evaluación de la liberación de F desde sistemas

nanoparticulados (Budhian A, 2008; Nerella A, 2014) e hidrogeles (Jiménez-

Kairuz A, 2004).

El dispositivo se representa en el esquema 5.2, compuesto por dos

compartimentos, separados por una membrana sintética semipermeable, el

compartimento donor es el receptáculo dónde se coloca el sistema a ser

analizado, mientras que el compartimento receptor contiene el medio en el que

se desea analizar el sistema. Dentro de las consideraciones para aplicar el

método se destacan, que el tamaño de poro de la membrana debe impedir el

paso de las macromoléculas como los PE y el aseguramiento de las condiciones

sink, es decir, condiciones alejadas de la saturación del F en el medio de

difusión durante todo el ensayo (USP 34-NF 29, 2011; FDA, 1997).

Para realizar una aproximación a los mecanismos involucrados en el

proceso de liberación del F desde el sistema portador se requiere analizar los

perfiles de cinética de liberación a través de modelos matemáticos.

Capítulo 5 CINÉTICA Y MECANISMO DE LIBERACIÓN UNIVERSIDAD DE LOS F DESDE LOS COMPLEJOS ADN-F NACIONAL DE CÓRDOBA

88

En la actualidad, no existe un modelo que considere todos los procesos

físicos y químicos que puedan ocurrir en los diferentes sistemas, pero se logran

interesantes correlaciones con la experimentación in vivo (Franz T, 1978; Batool

H, 2013).

El modelo más sencillo fue propuesto por T. Higuchi (Higuchi T, 1963;

Hasan E, 2003), en este modelo la fracción de F liberado es proporcional a la

raíz cuadrada del tiempo, como se describe en la ecuación 1.

Q = k √t Ec 1

Donde Q es la cantidad (o proporción) de F liberado a tiempo t, k es la

constante de velocidad de liberación. Los valores de k son expresados en

unidades mg.h-1/2 u h-1/2.

Se interpreta que, si se satisface esta correlación, el mecanismo que

gobierna la liberación del F es la difusión, como se ha descripto para numerosos

sistemas matriciales, transdermales, entre otros (Jiménez-Kairuz A, 2003; 2004)

Otro modelo, denominado Korsmeyer-Pepas (Korsmeyer R, 1983; Ritger

P, 1987), fue introducido más recientemente para el análisis de perfiles de

liberación de sistemas matriciales, utilizando la siguiente ecuación:

Mt /M∞ = k t n Ec 2

Donde Mt es la cantidad de F en el compartimento receptor en el tiempo

t; M∞, la cantidad inicial de F en el compartimento donor; Mt /M∞ es la fracción

(0,1 – 0,7) de F liberado a cada tiempo t; k es la constante de velocidad de

liberación y n es el exponente difusional cuyo valor se relaciona al mecanismo

de liberación. El modelo determina que el análisis de los datos se efectúa entre

el 10 y 70% de liberación del F.


89

Un valor de n aproximadamente 0,5 en los sistemas matriciales se

atribuye a un mecanismo de liberación controlado por la difusión del F,

mientras que un valor de n próximo a 1, es atribuido a la erosión o relajación

de las cadenas del polímero. Los valores intermedios sugieren que ambos

procesos (difusión y erosión) regulan la velocidad de liberación (Ranga K, 1998;

Talukdar M, 1995; Lotfipour F, 2004).

Originariamente los modelos cinéticos fueron propuestos para el análisis

de sistemas matriciales, en la actualidad se ha aplicado exitosamente a

sistemas dispersos (Jiménez-Kairuz A, 2003; 2004; Ramírez M, 2006; Ardusso

M, 2010).

En el caso de sistemas compuestos por complejos PE-F, el entendimiento

del proceso cinético requiere un análisis molecular semejante al realizado en el

capítulo 4 en la determinación de las constantes de afinidad.

Se ha propuesto un modelo que contempla la difusión del F desde el

entorno del PE como se esquematiza en el esquema 5.1 para un sistema

constituido exclusivamente por un PE ácido neutralizado con el F básico

(Jiménez-Kairuz A, 2003; 2004; Battistini F, 2013):

De acuerdo con este modelo, cuando el medio receptor es agua, la

difusión del F desde el complejo la desarrolla esencialmente la especie

neutra F que puede difundir libremente al seno de la solución.

Se observó que la velocidad de difusión del F depende de la proporción

de pares iónicos presentes en el sistema. De manera que el equilibrio de

disociación de los pares iónicos en el entorno del complejo PE-F gobierna

la cinética.

Cuando se utiliza una solución salina neutra en el medio receptor (NaCl),

la difusión de los iones Cl- y Na+ al compartimento donor proporciona los

contraiones para que difunda significativamente la especie FH+

acompañando a F con el consecuente aumento de la velocidad de

liberación.


90

En ambas condiciones, la disociación del par iónico es la etapa limitante en

la cinética de liberación, de esta manera, el sistema PE-F se comporta como un

reservorio de F capaz de liberarlo de una manera lenta al medio (Vilches A,

2002; Jiménez-Kairuz A, 2003; 2004; Ramírez M, 2006; Ardusso M, 2010).

Esquema 5.1 Modelo que representa la distribución de todas las

especies en equilibrio en sistema PE ácido- F básico (Jiménez-Kairuz

A, 2004)


91

El objetivo de este capítulo es estudiar la cinética y el mecanismo de

liberación in vitro de los F modelos desde los complejos iónicos ADN-F y los

factores que pueden contribuir a modificar la liberación, entendiendo el proceso

molecular y fisicoquímico que se da lugar, y a partir de esta base predecir el

comportamiento que los sistemas tendrán in vivo.

Es importante destacar que en todos los casos al complejo ADN-F lo

acompañan los contraiones provenientes de la macromolécula (Na+) y de la sal

del F (generalmente Cl-). En consecuencia, aun cuando el sistema de liberación

utiliza agua en el compartimento receptor, las especies con capacidad de

difundir libremente son F y FH+ acompañado del contraión Cl- u otro

correspondiente a la sal utilizada.


Se utilizó el ADN-Na y ADN-NaR, se seleccionaron At, Li y Pr como F

modelos para realizar el estudio de liberación. La selección consideró abarcar

diferentes propiedades fisicoquímicas de los F, en cuanto a su hidrofilicidad y

basicidad descriptas previamente en el capítulo 3.

La metodología para la preparación de complejos ADN-Fx (X= 25, 42 y 85

moles %), tanto de la dispersión al 0,60% P/V del ADN-Na, como al 0,12% P/V

del ADN-NaR y el ajuste de pH de los sistemas, se describe en el numeral 2.2.9.

del capítulo 2.

Finalmente, los estudios de cinética de liberación in vitro de los F desde

las dispersiones de los complejos ADN-Fx, se llevaron a cabo utilizando celdas

de difusión bicompartimentales del tipo Franz (ver esquema 5.2), separadas por

una membrana semipermeable de acetato de celulosa (12,000 Da; Sigma. St

Louis.MA. USA), de la manera que se describió en el numeral 2.2.12. del

capítulo 2.


92

Esquema 5.2 Celdas bicompartimentales del tipo Franz utilizada para

evaluar la cinética de liberación de los complejos ADN-F.

5.3. Resultados y discusión

5.3.1 Liberación en agua

Como se señaló en el capítulo 3, la eficacia de la membrana frente a la

difusión de la macromolécula se evaluó y controló colocando como muestra

ADN-Na en el compartimento donor y monitoreando la absorbancia en el

compartimento receptor a 260 nm, durante el ensayo no se observó migración

del PE al compartimento receptor, como se puede observar en las figuras 5.1,

5.2 y 5.3 a), dónde el perfil del ADN-Na se superpone al eje de las “x”.

Los perfiles de liberación de los F modelo desde el complejo ADN-F, en

comparación con el perfil de difusión de la solución de referencia del F (no

acomplejado) pueden observarse en las figuras 5.1, 5.2 y 5.3 a), donde se

grafica la proporción en % de F liberado en función del tiempo. La liberación

del F desde los complejos hacía el agua ocurre en forma lenta.


93

En esas condiciones, la interacción reversible ADN-Fx genera una difusión

de la especie libre del F ( F ) hacia el compartimento receptor, acompañado de

la especie FH+ con su contraión correspondiente. La velocidad de difusión de

las especies libres anteriormente mencionadas, fue considerablemente más

lenta que la del F colocado en una concentración equivalente en el

compartimiento donor del sistema como referencia.

Esta capacidad para modular la liberación es consistente con el alto

grado de condensación contraiónica observado anteriormente. De hecho, como

se describe en la ecuación 6, tanto la especie F sin carga y la especie catiónica

FH+ junto con A- son capaces de difundir libremente y liberarse, mientras que

[R- FH+] se mantiene como un reservorio del F. En línea con estas

observaciones, las velocidades de liberación del F siguieron la correlación

clásica de Higuchi, tiempo1/2 (Visakh P, 2014) como se puede ver en las figuras

5.1, 5.2 y 5.3 b), donde se grafica la cantidad en % de F liberado en función

del tiempo1/2. Los valores de k, para las diferentes dispersiones, se informan en

la Tabla 5.1.

Se puede ver que la constante de liberación de Li desde el complejo

(4,33) es mayor que las obtenidas para los complejos de At (2,64) y Pr (1,85),

comportamiento esperado por la menor Kpi determinada para la lidocaína

Tabla 5.1 Constante de la cinética de liberación en agua: Pendiente de la ecuación de Higuchi (Ec 1), % F liberado en función de la raíz cuadrada del tiempo para F y sistemas ADN-F50.

Sistema k de

liberación ((%).h-1/2)

Δ k y-

intercepto r2

At 8,8 ± 0,2

6,1 -13,6 1,000

ADN-At 2,6 ± 0,1 -1,8 0,989 Li 7,1 ± 0,1

2,8 -10,5 0,999

ADN-Li 4,3 ± 0,2 -8,1 0,993 Pr 7,4 ± 0,3

5,6 -11,8 0,996

ADN-Pr 1,8 ± 0,1 -3,1 0,992


94

Figura 5.1. Perfiles de liberación acumulativa de atenolol en agua.

ADN-F50 ( ) y F de referencia ( ) en células de Franz en función del

(a) tiempo y (b) del tiempo1/2. ADN-Na ( ) se incluyó como blanco.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120 150 180

% A

t l

iber

ad

o

tiempo (min)

a

y = 8,8 x - 13,6

R² = 1,000

y = 2,6 x - 1,8

R² = 0,989

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

% A

t L

iber

ad

o

tiempo1/2 (min1/2)

b


95

Figura 5.2. Perfiles de liberación acumulativa de lidocaína en agua.



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120 150 180

%

Li

Lib

era

do

tiempo (min)

a

y = 4,3 x - 8,1

R² = 0,993

y = 7,1 x - 10,5

R² = 0,998

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

% L

i L

iber

ad

o

tiempo1/2 (min1/2)

b


96

Figura 5.3 Perfiles de liberación acumulativa de propranolol en agua.



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120

% P

r L

iber

ad

o

tiempo (min)

a

y = 1,8 x - 3,1

R² = 0,992

y = 7,4 x - 11,8

R² = 0,996

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

% P

r L

iber

ad

o

tiempo1/2 (min1/2)

b


97

Por otra parte, cuando se mantiene la concentración de ADN-Na

constante, y se incrementa gradualmente la proporción de F incorporado, se

observa un aumento proporcional de la velocidad de liberación del F, como se

muestra en las Figuras 5.4, 5.5 y 5.6. y en la tabla 5.2. Es decir, que los

sistemas se comportaron como portadores que liberan lentamente el F, tal

como se observa con otros sistemas PE-F similares conteniendo At, Li y Pr

(Jiménez-Kairuz A, 2003; Ardusso M, 2010).

Los resultados presentados anteriormente apoyan la hipótesis de que la

principal interacción entre el ADN y los F con grupos básicos protonables ocurre

a través de los grupos fosfato del ADN, lo que conlleva a una alta proporción de

condensación contraiónica, como se describe en la ecuación 6 y se explica en el

capítulo 4. La alta acidez de los grupos fosfato dio como resultado altas

constantes de afinidad (Kpi), incluso en la presencia de sales. A modo

comparativo, Kpi menores se han reportado para PE con grupos carboxílicos de

menor acidez (Ardusso M, 2010).

Tabla 5.2 Datos cinéticos de % F liberado en agua en función de la raíz cuadrada del tiempo para F y sistemas ADN-F50.

Complejo

Fx

[mol

%]

mg de F liberado al compartimento d

T5 T15 T30 T60 T120 T180

ADN-At

42 0,15 ± 0,06 0,198± 0,003 0,32 ± 0,02 0,49 ± 0,01 0,71 ± 0,04 0,82 ± 0,06

64 0,17 ± 0,08 0,26 ± 0,03 0,45 ± 0,04 0,75 ± 0,07 1,16 ± 0,09 1,38 ± 0,11

85 0,22 ± 0,05 0,45 ± 0,06 0,80 ± 0,08 1,3 ± 0,1 1,90 ± 0,12 2,19 ± 0,12

ADN-Li

25 0,24 ± 0,14 0,21 ± 0,04 0,28 ± 0,08 0,43 ± 0,03 0,63 ± 0,04 0,73 ± 0,07

42 0,14 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,31 ± 0,01 0,56 ± 0,05 0,9 ± 0,1 1,12 ± 0,15

85 0,32 ± 0,04 0,43 ± 0,07 0,79 ± 0,09 1,30 ± 0,12 1,93 ± 0,23 2,21 ± 0,21

ADN-Pr

25 0,023 ± 0,001 0,05 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,15 ± 0,02 0,17 ± 0,02

42 0,037 ± 0,001 0,092 ± 0,002 0,17 ±0,01 0,28 ± 0,02 0,42 ± 0,04 0,52 ± 0,05

85 0,09 ± 0,01 0,22 ± 0,02 0,38 ± 0,04 0,7 ± 0,1 1,09 ± 0,16 1,36 ± 0,12


98

Figura 5.4 Liberación acumulativa de At desde el complejo ADN-Atx

(x: 42% ( ), 64 % ( ) y 85% ( ) y At referencia ( ) equivalente a

100%.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 30 60 90 120 150 180 210

mg

A

t l

ibe

rad

o

Tiempo (min)

42% 64% 85% At


99

Figura 5.5 Liberación acumulativa de Li desde el complejo ADN-Lix

(x: 25% ( ), 42 % ( ) y 85% ( ) y Li referencia ( ) equivalente

a 100%.

Figura 5.6 Liberación acumulativa de Pr desde el complejo ADN-Prx

(x: 25% ( ), 42 % ( ) y 85% ( ) y Pr referencia ( ) equivalente a

100%.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 30 60 90 120 150 180

mg L

i lib

era

da

Tiempo (min)

25% 42% 85% Li

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 30 60 90 120 150 180 210

mg

Pr

Lib

era

do

Tiempo (min)

25% 42% 85% Pr


100

5.3. Conclusiones

La liberación de los F desde los complejos respondió en todos los casos a

una cinética interpretada como difusional.

El incremento en la proporción de F en los complejos produjo un

concomitante aumento en la velocidad de liberación.

En línea con la reversibilidad de la interacción ADN-F, la cinética de

liberación del F observada en los sistemas evaluados es consistente con

la determinada en otros PE-F modelo desarrollados previamente

(Jiménez-Kairuz A, 2002; 2003;), no se observaron diferencias

significativas en el comportamiento de la cinética de liberación de los

complejos con los diferentes F evaluados.

Efecto de la

interacción PE-F

sobre la estructura

secundaria del ADN

Capítulo 6

En este capítulo se describen los fundamentos de la técnica dicroísmo circular

y su aplicación al análisis estructural del ADN. Así como la caracterización de

la estructura secundaria del ADN-Na de Salmón y el efecto que produce la

interacción con los F sobre la estructura de la macromolécula y su

reversibilidad.


103

6.1. Introducción

En los capítulos anteriores se ha determinado que la interacción ADN-F

exhibe un alto grado de condensación iónica, con constantes de afinidad del

orden de 106 y que, en concordancia a esta interacción reversible, el F es

liberado lentamente de estos complejos, respondiendo a una cinética de tipo

difusional. El comportamiento observado fue interpretado en términos de la

interacción electrostática entre los grupos fosfato del ADN y las especies

protonadas de los F modelo.

En ese orden de ideas, el objetivo de este capítulo es la caracterización

de la estructura secundaría del ADN-Na y el efecto que produce la interacción

con F sobre la estructura de la macromolécula y su reversibilidad.

A tales fines se utilizó el dicroísmo circular (DC). Las bases físicas y

químicas de esta técnica, se describen en el anexo 2.

6.1.1. Aplicaciones del DC en el análisis estructural del ADN

La señal en el perfil de DC en el ADN se debe a un efecto inducido por el

azúcar que posee un centro quiral, sobre las bases purínicas que son simétricas

y por lo tanto ópticamente inactivas. Los grupos fosfatos tienen transiciones

electrónicas a altos niveles de energía a longitudes de onda inferiores a los 170

nm, el azúcar presenta bajos niveles de intensidad de absorción electrónica

alrededor de 190 nm, longitudes donde la técnica es poco sensible; por lo

tanto se centra el análisis en la región de 300 nm donde se observa una señal

de gran intensidad debida a la transición π-π* generada por la nube electrónica

del sistema aromático de las bases purínicas, y otra de menor intensidad

debida a la transición n-π* generada por electrones no enlazantes (Johnson C,

1996; Xi Z, 2005; Zsila F, 2015).

Capítulo 6 EFECTO DE LA INTERACCIÓN PE-F SOBRE UNIVERSIDAD LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN NACIONAL DE CÓRDOBA

104

Figura 6.1 Espectro de DC para ARN-A dextrógiro y ADN-A, ADN-B

dextrógiro, y ADN-Z levógiro (Bloomfield V. A. et al. 2000).

Los perfiles de DC de las diferentes formas que pueden tener los AN se

muestran en la figura 6.1; de manera general, la intensidad de las señales es

baja debido a que el DC ocurre como un efecto secundario inducido por el

azúcar asimétrico. La intensidad de la señal toma valores mayores en función

del aumento de complejidad del sistema, desde el acomodamiento de las bases

formando una hélice, hasta la complementariedad entre las cadenas generando

la doble hélice o estructura secundaria helicoidal, siendo esta una estructura

asimétrica (Johnson C, 1996).


105

Por lo anteriormente expuesto acerca de las interacciones electrónicas

entre las bases, la técnica de DC es altamente sensible a los cambios en la

estructura secundaria helicoidal de los AN y su orientación, ya que la formación

de la doble hélice depende: del solvente en que se dispersa, el número de pb

por giro y finalmente, la inclinación y distancia de las bases con respecto al eje

central (Johnson C, 1996).

Las configuraciones que adopta el ADN tienen las siguientes

características espectrales:

Forma B: Un efecto Cotton positivo centrado cerca de 275 nm, un

efecto Cotton negativo centrado cerca de 240 nm y un punto de cruce con el

eje entre las dos bandas mencionadas alrededor de 258 nm, que coincide con

la longitud de onda de máxima absorción. En la región de longitud de onda

corta, es decir entre 180 y 200 nm, el efecto Cotton positivo cambia de manera

significativa en función del porcentaje de los enlaces G-C y de la pérdida de la

estructura secundaria, esta intensidad puede disminuir a ¼ de su señal inicial

cuando solo el 50% de las hebras se encuentran apareadas entre sí, es decir,

cuando ocurre su fusión (Tm) (Tanaka K, 1996; Kankia B, 2001; Sousa F, 2007).

Forma A: Un efecto Cotton positivo centrado alrededor de 260nm, Un

efecto Cotton negativo en 210 nm, y otro fuertemente intenso positivo en 190

nm (Johnson C, 1996).

Forma Z: Un efecto Cotton negativo en 190 nm indica que la doble

hélice fue formada hacía la izquierda. (Walker G, 1980).


Se utilizaron el ADN-Na y ADN-NaR y los F descriptos descripto en el

capítulo 3. Se utilizó agua Milli-Q para la realización de los ensayos.


106

La metodología para la preparación de complejos ADN-Fx (X= 25, 42 y

85 moles %), tanto de la dispersión al 0,60% P/V del ADN-Na, como al 0,12%

P/V del ADN-NaR y el ajuste de pH de los sistemas, se describe en el numeral

2.9 del capítulo 2.

Finalmente, los estudios de la estructura secundaria tanto del ADN como

de las dispersiones de los complejos ADN-Fx, se llevaron a cabo en un

espectropolarímetro Jasco 81, de la manera que se describió en los numerales

2.8 y 2.13 del capítulo 2

6.3 Resultados y Discusión

6.3.1 Efecto de la lipofilicidad de los F sobre la estructura

secundaria

Se puede observar en la Figura 6.2 que ambas muestras de ADN-Na

exhibieron espectros de DC característicos de una estructura secundaria de

doble hélice tipo-B (Johnson C, 1996; Zsila F, 2015). En la figura 6.3 se

demostró que el efecto de la temperatura conlleva a la formación de una

cadena sencilla, caracterizada por la desaparición del efecto Cotton negativo en

240 nm, la ausencia del punto de cruce con el eje cercano a 258 nm, y la

desaparición del efecto Cotton positivo en la región corta del espectro, es decir,

a longitudes < 200 nm (Walker G, 1980). El enfriamiento de la muestra

evidencia que la estructura en la mayor parte del perfil recupera su estructura

de doble hélice.


107

Figura 6.2 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Na en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

Figura 6.3 Efecto de la temperatura sobre el perfil de DC de una

dispersión acuosa de ADN-NaR (0,04 mg / mL) a pH ≈7,0.

nm

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

-2

-1

0

1

2

3

ADN-Na

ADN-NaR

nm

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

-10

-5

0

5

10

15

20

25

25ºC

82ºC

Enfriamiento


108

Los complejos de ADN-F50 con los F modelo exhibieron diferentes perfiles

de DC. Los complejos con F de menor lipofilicidad como el atenolol (At),

lidocaína (Li) y timolol (Ti), mostraron señales características del ADN nativo

como se observa en las figuras 6.4, 6.5 y 6.6, lo que sugiere que el ADN en el

complejo mantiene la forma de doble cadena tipo-B.

Figura 6.4 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-At50 en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

nm

220 240 260 280 300 320

-20

-10

0

10

20

30

ADN-NaR

ADNR-At50


109

Figura 6.5 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Li50 en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

Figura 6.6 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Ti50 en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

nm

220 240 260 280 300 320

-30

-20

-10

0

10

20

30

ADN-NaR

ADNR

-Li50

nm

220 240 260 280 300 320

-30

-20

-10

0

10

20

30

ADN-NaR

ADNR

-Ti50


110

Por otra parte, los perfiles de los complejos con F de mayor lipofilicidad

propranolol (Pr) y bencidamina (Bz) sugirieron que el ADN en el complejo no

mantiene la estructura secundaria de tipo-B, como se muestra en las figuras 6.7

y 6.8.

En ambos casos, se observó una reducción significativa del efecto Cotton

negativo con un desplazamiento hacia el rojo de la longitud de onda de máxima

absorción. Además, el complejo de Pr desarrolló un efecto Cotton positivo

alrededor de los 280 nm más intenso, mientras que la Bz produjo una

disminución del efecto mencionado. Este comportamiento se ha observado

anteriormente como indicativo de un grado de deshidratación del ADN (Johnson

C, 1996; Xi Z, 2005; Sousa F, 2007)

Figura 6.7 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Bz50 en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

nm

240 260 280 300 320

-20

-10

0

10

20

ADN-NaR

ADNR

-Bz50


111

Figura 6.8 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Pr50 en agua Milli-Q, pH


mg/mL.

6.3.2 Reversibilidad de los cambios en la estructura del ADN

Las dispersiones de los complejos de Pr y Bz se sometieron a una diálisis

exhaustiva en un buffer a pH = 7,0. El ADN recuperado de la dispersión del

complejo con Bz exhibe un perfil DC similar al de la forma nativa, pero el del

complejo con Pr no volvió completamente al perfil original, figuras 6.9 y 6.10. El

Pr recuperado en el medio receptor determinado por espectrometría de UV,

sólo representa el 88,2% de la cantidad original. Este hallazgo sugiere una

contribución de otras interacciones de tipo no iónico. Por lo tanto, los cambios

observados en la estructura secundaria de ADN, como consecuencia de la

interacción con la muestra de F de mayor lipofilicidad ensayados, parecen ser

de naturaleza reversible excepto con Pr.

nm

200 220 240 260 280 300 320

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

ADN-NaR

ADNR

-Pr50


112

Figura 6.9 Perfil de DC de ADN-Na R y ADN-Bz50 en agua Milli-Q, pH

≈7,0; después de realizar la diálisis exhaustiva.

Figura 6.10 Perfil de DC de ADN-NaR y ADN-Pr50 en agua Milli-Q, pH

≈7,0; después de realizar la diálisis exhaustiva

nm

200 220 240 260 280 300 320 340

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

ADN-NaR 24 hs

ADNR-Pr 24 hs

nm

200 220 240 260 280 300 320 340

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

ADN-NaR 24 hs

ADNR

-Bz 24hs


113

6.3.3 Efecto de la temperatura sobre la estructura

secundaria de los complejos ADN-F.

En todos los casos el efecto de la temperatura sobre los complejos ADN-

Fx generó cambios en la intensidad de las señales, que volvieron a su estado

original. Se eligen el Ti y Pr como modelos para representar los resultados,

como se puede ver en la figura 6.11 y 6.12, el cambio de las señales entre

temperatura ambiente y temperatura de calentamiento del ADN en presencia

de F, mantiene las señales características de una estructura secundaría

helicoidal, no evidencia una apertura de la doble hélice, como ocurrió con el

ADN sin presencia del F (figura 6.3), sugiriendo de esta manera el aporte del F

a la estabilidad de la doble hélice.

nm

220 240 260 280 300 320

-30

-20

-10

0

10

20

30

ADN-Na T 25°C

ADN-Ti T 25°C

ADN-Ti T 78°C

ADN-Ti Enfriamiento


dispersión acuosa de ADN-Ti50 a pH ≈7,0.

λ nm


114


dispersión acuosa de ADN-Pr50 a pH ≈7,0.

6.4. Conclusiones

Se evidenció que las sales de ADN presentan una estructura secundaria

nativa tipo-B, que es susceptible al efecto de la temperatura.

Se observa un efecto diferenciado de los F sobre la estructura secundaria

del ADN-Na, según sus propiedades lipofílicas.

Los complejos ADN-F con F de menor lipofilicidad (At, Li y Ti), conservan

la estructura secundaria nativa tipo-B original del ADN-Na.

nm

220 240 260 280 300 320 340

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

ADN-Pr T25°C

ADN-Pr T 78°C

ADN-Pr Enfriamiento

ADN-Na T25°C


115

Los complejos ADN-F con F de mayor lipofilicidad (Pr y Bz), no

mantienen la estructura secundaria nativa tipo-B original del ADN-Na.

Los cambios generados a la estructura secundaria por la Bz son

reversibles.

Los cambios generados a la estructura secundaria por el Pr no son de

naturaleza reversible, lo que sugiere la posible contribución de otras

interacciones de tipo no iónico en el complejo ADN-Pr.

El efecto de la temperatura sobre la estructura de los complejos es de

naturaleza reversible, lo que sugiere un aporte a la estabilidad de la

estructura por parte del F.


116

Conclusiones

Generales y

Proyecciones


119

Conclusiones Generales y Proyecciones

La caracterización in vitro de las interacciones ADN-F desarrollada en

esta tesis, proporciona una base físicoquímica con proyecciones en varios

campos de interés farmacoterapéutico.

El esquema 7.1 representa las principales interacciones observadas

entre el grupo de F utilizado y el ADN modelo.

Esquema 7.1. Caracterización de las interacciones iónicas ADN-F

El conjunto de ensayos realizado sobre la interacción ADN-F puso de

manifiesto el comportamiento de los F utilizados con el AN modelo.

UNIVERSIDAD

CONCLUSIONES GENERALES Y PROYECCIONES NACIONAL DE CÓRDOBA

120

Por una parte, se observó un comportamiento de tipo general que comprende

la interacción electrostática inespecífica análoga a la que ocurre con otros PE

ácidos de menor complejidad que los AN. Los resultados obtenidos sobre los

equilibrios involucrados en la interacción ADN-F fueron satisfactoriamente

interpretados mediante la ecuación 6 del capitulo 4 y la cinética de liberación

difusional de los F fue consistente con el modelo propuesto para los PE ácidos.

1. Por otra parte, se observó un comportamiento diferenciado del efecto de

la interacción sobre la estructura secundaria del ADN, que en una

primera aproximación se clasificó en función de las propiedades

hidrofílicas- lipofílicas de los F estudiados.

En función de las altas constantes de afinidad ADN-F observadas, es

razonable pensar que, como resultado de la administración farmacoterapéutica

de F básicos con alta permeabilidad sobre las membranas celulares, en la

secuencia farmacocinética que se desarrolla, los AN (ADN y ARN), emplazados

en citoplasma y núcleo, constituyan un significativo blanco intracelular (ver

introducción página 14).

En consecuencia, si las interacciones con esta clase de F pueden afectar

la funcionalidad de los AN es una cuestión que surge como una de las

proyecciones de los resultados presentados. Más aún, teniendo en cuenta los

avances actuales en los campos de la genética y la epigenética (Narayanan et

al., 2017; Wong et al., 2017; Xiao P, 2017).

Basados en lo anterior, en una primera instancia los resultados

descriptos permitirían focalizar el estudio del potencial impacto de la interacción

ADN-F en sistemas in vivo utilizando aquellos F que afectan la conformación y


121

Interacción ADN-F Sobre la conformación

No

afecta Afecta

Efecto

reversible

Efecto no reversible en su totalidad

particularmente en los que evidencian que no ocurre su completa reversibilidad

como es el caso del propranolol (Esquema 7.2).

Esquema 7.2 Comportamiento diferenciado de la interacción ADN-F

sobre la estructura secundaria del ADN

Por otra parte, el comportamiento de la interacción ADN-F descripto en

el inciso 1 y los resultados sobre la obtención de los complejos en estado sólido

y su posterior redispersión, podrían contribuir al uso de ADN como portador de

F para el diseño de formulaciones de liberación modificada; por lo que el

estudio de las propiedades de relevancia biofarmacéutica y farmacotécnica de

estos sistemas constituyen otra proyección de los resultados presentados.

UNIVERSIDAD

CONCLUSIONES GENERALES Y PROYECCIONES NACIONAL DE CÓRDOBA

122

Finalmente, el estudio de la transfección de AN es un área de gran

interés. Los vectores no virales que se utilizan en la actualidad para el

direccionamiento de genes al interior celular, como los plásmidos y la

introducción de RNA de bajo peso molecular (miRNA, siRNA), requieren ser

vehiculizados en liposomas y polímeros lipídicos catiónicos capaces de modificar

la carga superficial negativa de los AN. Dado que los complejos ADN-F

presentan una reducción de la carga superficial, es de interés explorar su

potencial utilidad en el campo de la transfección intracelular de ADN y ARN,

generando una alternativa local, segura y asequible en comparación a los

polímeros utilizados actualmente.

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142

PUBLICACIONES y

PRESENTACIONES

UNIVERSIDAD

PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES NACIONAL DE CÓRDOBA

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Participación en reuniones científicas

“Interaction between nucleic acids and drugs having protonable basic

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conformational changes.” RICIFA Cuarta Reunión Internacional de Ciencias

Farmacéuticas Rosario, Argentina Facultad de Ciencias Químicas UNC Oct 2016

“Efectos sobre la estructura secundaria del ADN generado por el

acomplejamiento de los grupos fosfato con fármacos ionizables. Estudio por

dicroísmo circular y espectroscopia de correlación fotónica.” COIFFA III

Congreso Sudamericana de Biofarmacia y Farmacocinética. Córdoba, Argentina

Facultad de Ciencias Químicas UNC. Nov. 2015

“Study of the formation of ion pairs between the phosphate groups of

deoxyribonucleic acid (DNA) and ionizable drugs therapeutically useful”. RICIFA

Tercera Reunión Internacional de Ciencias Farmacéuticas Córdoba, Argentina

Facultad de Ciencias Químicas UNC. Sep 2014

ANEXO I

MANEJO DEL ELECTRODO DE SODIO

Anexo I UNIVERSIDAD

MANEJO DEL ELECTRODO DE SODIO NACIONAL DE CÓRDOBA

149

1. OBJETIVO: Establecer el procedimiento a seguir para la operación del electrodo selectivo

de Sodio marca METTLER TOLEDO perfectIONTM comb Na+.

2. ALCANCE: Este instructivo aplica a todas las mediciones de actividad de Sodio y

concentración de Sodio en sistemas acuosos. Ver Anexo 1

3. RESPONSABLES:

3.1. DE REALIZARLO: Tesistas de Doctorado y de Posdoctorado, practicantes del laboratorio.

3.2. DE VERIFICARLO: Profesores Encargados del Laboratorio

4. FRECUENCIA: Cada vez que se realice una medición.

5. PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

5.1. No se recomienda la calibración por debajo de 1 x 10-4 M, ya que las repuestas pueden

mostrar cierta curvatura.

5.2. La temperatura de todas las muestras a medir no debe tener entre ellas una diferencia

mayor a los 2°C.

5.3. Ver Anexo 2

6. SIMBOLOS Y/O ABREVIATURAS:

6.1. O: Operador del equipo

6.2. PEL: Profesor encargado del Laboratorio

6.3. ISE: Ion Selective Electrode: Electrodo de Ion Selectivo

6.4. ISAS: Ionic Strehgth Adjuster Solution: Solución de ajuste de la fuerza iónica.

7. CALCULO

7.1 Un punto de Calibración

Cu = Cs * 10ΔE/S, dónde Cu = concentración desconocida, Cs= Concentración de la solución

estándar, ΔE= diferencia de potencial muestra y estándar, S = Pendiente de la recta de

calibración.

8. DIAGRAMA DE FLUJO:

8.1. FLUJOGRAMA DE ACTIVIDADES:


150

INICIO

Determinación de Concentración de Na Verificación de material de vidrio limpio

1. Etapa A: Preparación de ISAS Pesar 200 g NH4 Cl disolver en un matraz con 500 mL de agua destilada, adicionar 50 mL de NH3 concentrado y completar a 1L con agua destilada. 2. Etapa B: Preparación de la solución estándar Hacer diluciones: 1 x 10

-1, 1 x 10

-2, 1 x 10

-

3, 1 x 10

-4 NaCl en agua destilada,

previamente secar el NaCl a 105°C por 2h y dejar enfriar en desecador. Adicionar por cada 100 mL de solución, 2 mL de ISAS. 3. Etapa C: Preparar muestras a valorar de igual manera que la Etapa B

Tomar correctivos posibles.

Revisar posibles causas de desviación Anexo 2

FINAL

NO

¿La pendiente es la esperada: 59.16 ± 2-8%

mV/pH?

SI

Preparación de las soluciones estándar (SS) de calibración y

muestras

Conectar el electrodo al módulo de pH (izq) y ubicar el módulo de

unidades en mV

Sumergir el electrodo en las SS de < a >

concentración. Tomar el potencial.

Aceptar la calibración

Solicitar asesoría al proveedor, si ha extendido el tiempo de vida útil, gestionar compra

Realizar las determinaciones de

las muestras problema.

Lavar y acondicionar el electrodo.

Agite suavemente y lave el

electrodo con agua destilada

entre cada muestra.

Verificar información con el PEL

Anexo I UNIVERSIDAD

MANEJO DEL ELECTRODO DE SODIO NACIONAL DE CÓRDOBA

151

NORMA(S) COMPLEMENTARIA(S):

10.1 . Serie de Informes Técnicos de la OMS 823. Informe 32. Anexo 1 Prácticas adecuadas de

fabricación de productos farmacéuticos. Capítulo 13 y 14. Ginebra 1992

9. FORMATOS ANEXOS:

Número Anexo

Código Nombre Responsable del

Archivo Localización

Tipo de Archivo

1

Ficha técnica de mettler toledo

perfectionTM comb Na+.

Director de Subsidio LAB 212 Físico

Magnético

2 Precauciones y

Recomendaciones Director de Subsidio LAB 212

Físico

Magnético

ELABORADO POR REVISADO POR REVISIÓN ESTRUCTURAL POR

APROBADO POR

LILIANA ALARCÓN MARIA EUGENIA OLIVERA ALVARO KAIRUZ DANIEL ALLEMANDI Tesista Doctorado Profesor Encargado Profesor Encargado Director de unitefa

FIRMA:_________________

FECHA: FABIANA ALOVERO Profesor Encargado FIRMA: FECHA:

FIRMA:_________________

FIRMA:________________

FIRMA:________________

FECHA: FECHA: FECHA:


152

ANEXO II

BASES TEÓRICAS DE DICROÍSMO

CIRCULAR

Anexo II UNIVERSIDAD

BASES TEÓRICAS DICROÍSMO CIRCULAR NACIONAL DE CÓRDOBA

155

2.1 Actividad óptica

EL DC es una técnica espectropolarimétrica basada en dos fenómenos, la

rotación óptica y la elipticidad, que son dos formas de manifestación de una

misma propiedad física que presentan algunas sustancias: la actividad óptica.

En términos generales se dice que la actividad óptica es un

fenómeno físico por el que una sustancia hace rotar el plano de polarización de

un haz de luz plano-polarizada que la atraviesa.

La luz es una onda electromagnética consistente en un campo

eléctrico (E) y un campo magnético (B) oscilantes. Ambos son perpendiculares

entre si y perpendiculares a la dirección de propagación. El plano que contiene

el vector E se conoce como plano de polarización.

Luz (ondas) Linealmente-Polarizada

Si el vector del campo eléctrico oscila a lo largo de una línea recta, la luz

(ondas) se denomina plano-polarizada o linealmente polarizada. La luz

puede polarizarse en planos diferentes, en la figura 1 se muestra una onda

linealmente-polarizada en un plano horizontal vista a lo largo de la dirección de

propagación y frontalmente. En la figura 2 se observa una onda linealmente-

polarizada en un plano vertical.


156

Figura 1. Luz linealmente-polarizada en plano horizontal.

Figura 2. Luz linealmente-polarizada en plano vertical.

Superposición de Ondas Linealmente-Polarizadas con igual Fase

Cuando se superponen dos ondas electromagnéticas linealmente-

polarizadas en dos planos perpendiculares sus campos eléctricos se suman

vectorialmente. Las propiedades de la onda electromagnética resultante

dependen de las intensidades y diferencia de las ondas componentes.



157

En la figura 3 puede verse la superposición de dos ondas que tienen la

misma amplitud y longitud de onda, que están polarizadas en dos planos

perpendiculares y oscilan con la misma fase. Estar en fase significa que las dos

ondas alcanzan sus máximos (picos) y el cruce por el punto cero en el mismo

momento a lo lardo de su propagación. Las ondas componentes se visualizan

en rojo y verde, y la onda resultante en azul.

Como se puede observar, el resultado de esta superposición es otra onda

linealmente-polarizada, su plano de polarización forma un ángulo de 45° con

los planos de polarización de las ondas componentes.

Figura 3. Superposición de dos ondas linealmente-polarizadas que

tienen la misma amplitud y longitud de onda y oscilan con la misma

fase.

Superposición de Ondas Linealmente-Polarizadas fuera de Fase

Cuando dos ondas linealmente-polarizadas (en dos planos

perpendiculares) se superponen estando fuera de fase, la onda que resulta de


158

dicha superposición no es una onda linealmente-polarizada o plano-polarizada.

En la figura 4 se presenta la superposición de dos ondas que tienen la

misma amplitud y longitud de onda, están polarizadas en dos planos

perpendiculares, pero tienen una diferencia de fase de 90°. Una diferencia de

fase de 90° significa que cuando una onda está en su máximo respecto a la

línea de propagación, la otra atraviesa el punto cero. Las ondas componentes

se visualizan en color rojo y verde y la resultante en color azul.


tienen la misma amplitud y longitud de onda y oscilan con una

diferencia de fase de 90°.

El resultado de esta superposición es una onda electromagnética

especial. En todos los puntos a lo largo de la línea de propagación, el vector

campo eléctrico rota en círculo y su longitud se mantiene constante. Dicha onda

se denomina luz (onda) circularmente-polarizada. Como se observa en la

figura 4, la onda se propaga describiendo una espiral en lugar de describir una

curva sinusoidal como la observada en la figura 3 (azul).



159

Si las ondas que se superponen tienen una diferencia de fase de -90°

(desplazadas una respecto a la otra en ¾ de longitud de onda) la onda

resultante también será circularmente-polarizada, figura 5.

Una diferencia de fase de 90° genera una onda de luz circularmente-

polarizada que gira en sentido horario y una diferencia de -90° una onda que

gira en sentido anti horario. Debido a ello es necesario distinguirlas y se les

denomina luz circularmente-polarizada derecha y luz circularmente-

polarizada izquierda.


tienen la misma amplitud y longitud de onda y oscilan con una

diferencia de fase de -90°.

Superposición de Ondas Circularmente-Polarizadas

Anteriormente se describió lo que ocurre cuando se superponen dos ondas

linealmente-polarizadas. Dos ondas circularmente-polarizadas también pueden

encontrarse y superponerse, la onda resultante es aquella que se obtiene a

partir de la suma vectorial del campo eléctrico de las ondas componentes.


160

Cuando se superpone una onda de luz circularmente-polarizada derecha

con una circularmente-polarizada izquierda (ambas con igual amplitud y

longitud de onda) la onda resultante es una onda linealmente-polarizada,

figura 6.

Una conclusión importante que se extrae de esto es: la luz linealmente-

polarizada puede obtenerse por superposición de una onda circularmente-

polarizada derecha y una circularmente-polarizada izquierda cuyas amplitudes

sean idénticas.

Figura 6. Superposición de dos ondas circularmente-polarizadas que

tienen la misma amplitud y longitud de onda.

Interacción de la Luz con la Materia

Cuando la luz interacciona con la materia sus propiedades cambian,

intensidad (amplitud), polarización, velocidad, longitud. Los dos fenómenos más

importantes que se producen como consecuencia de la interacción son la

absorción y disminución de su velocidad.



161

Luz Linealmente-Polarizada en un Medio Absorbente

En la figura 7 se observa lo que ocurre cuando una onda lienalmente-

polarizada ingresa a un medio que absorbe luz y no refracta (índice de

refracción n=1). Cuando la onda sale del material el vector campo eléctrico

oscila de la misma manera que cuando ingresó, pero su amplitud es menor que

la inicial.

Figura 7. Interacción de luz linealmente-polarizada con un material

que absorbe (n=1).

Lo mismo ocurre cuando luz circularmente-polarizada interacciona con un

medio absorbente. Cuando el vector campo eléctrico abandona el medio rota

igual que antes de entrar, pero su longitud es menor figura 8.

Figura 8. Interacción de luz circularmente-polarizada con un material

que absorbe (n=1).


162

Luz Circularmente-Polarizada en un Medio que Produce Dicroísmo

Circular

Algunas moléculas poseen una propiedad particular: absorben luz

circularmente-polarizada derecha en diferente magnitud que luz circularmente-

polarizada izquierda. Este fenómeno se denomina Dicroísmo Circular (DC). Se

observa por ejemplo en compuestos quirales, compuestos que presentan algún

tipo de asimetría (como los atropoisómeros o el ADN) o bien puede ser inducido

por ejemplo por un solvente quiral o un receptor quiral.

Como se demostró anteriormente la luz linealmente-polarizada puede

obtenerse por superposición de ondas circularmente-polarizadas derecha e

izquierda.

Si la luz linealmente-polarizada atraviesa un medio que presenta DC sus

propiedades van a cambiar porque el medio absorbe las dos componentes

circularmente-polarizadas en diferente extensión. En la figura 8.9 se muestra lo

que ocurre cuando una onda de luz linealmente-polarizada (el plano de

polarización mostrado es vertical) atraviesa un medio que no absorbe la

componente circular izquierda (roja) y absorbe la componente circular derecha

(verde).

Debido a que la componente izquierda (roja) no es absorbida, atraviesa

el medio sin cambios. La intensidad de la componente derecha (verde)

disminuye respecto al valor inicial debido a la absorción. La superposición de las

dos componentes a lo largo de la línea de propagación no es más una onda

linealmente-polarizada. El vector campo eléctrico resultante (azul) no oscila más

a lo largo de una recta si no que rota describiendo una elipse. Esta onda se

denomina luz elípticamente-polarizada.



163

Figura 8. Interacción de luz linealmente-polarizada con un material

que absorbe (n=1) y presenta dicroísmo circular.

El DC hace que la luz linealmente-polarizada se transforme en luz

elípticamente-polarizada.

Un parámetro que se define en este tipo de polarización es la

Elipticidad (θ), que es igual al arco de la tangente de la relación entre los

semiejes de la elipse siendo b, el semieje menor y a el mayor, figura 9 y

ecuación 1.

θ = arctg 𝐛

𝐚 ΔA Ecuación 1


164

Figura 9. Representación gráfica de la elipticidad (θ) y rotación (α) de

la luz linealmente-polarizada, al emerger de un medio ópticamente

activo, en la región de las longitudes de onda de una banda de

absorción.

Cuando un material absorbe luz circularmente-polarizada derecha en

diferente magnitud que la luz circularmente-polarizada izquierda los coeficientes

de extinción derecho (ƐR) e izquierdo (ƐL) serán diferentes, lo que conduce a:

ΔƐ = ƐL-ƐR que representa al fenómeno de dicroísmo circular. En los

espectropolarímetros se registran cambios de absorbancia en función de la

longitud de onda, ecuación 2.

El cambio de absorbancia (ΔA) puede expresarse como elipticidad empleando la

ecuación 3.



165

𝚫Ɛ = 𝐈

𝐜𝐥 ΔA Ecuación 2

θ = 33 ΔA Ecuación 3

Los valores de elipticidad y de rotación óptica dependen de la longitud de

onda de la radiación que interacciona con la materia. Cuando se grafica la

elipticidad (θ) en función de la longitud de onda se obtiene un espectro de DC;

si se grafica el ángulo con el que se desvía el plano de la luz linealmente-

polarizada (α) en función de la longitud de onda se obtiene una curva de

dispersión rotatoria óptica (DRO); El primer fenómeno es de tipo absortibo en

tanto que el segundo es dispersivo.

A los siguientes efectos: DC y elipticidad se los conoce como efecto

Cotton.

Para un compuesto que presenta actividad óptica pero que no contiene

ningún cromóforo, esto es, no absorbe luz a la longitud de onda empleada en la

determinación, la rotación óptica decrece en valor absoluto cuando aumenta la

longitud de onda. De esta manera se obtienen las curvas plano-positivas o

plano-negativas. Una curva plana es positiva si la rotación óptica aumenta al

disminuir la longitud de onda. En el caso contrario es negativa.

Si una sustancia además de ser ópticamente activa presenta absorción

en la zona de longitudes de onda empleada, se obtiene curvas con efecto

Cotton.

En conclusión, para obtener espectros de DC un compuesto debe

presentar la característica de ser quiral y poseer un cromóforo que presente

transiciones electrónicas cuyas energías se encuentren en el intervalo de 190

nm a 800 nm, que es la zona accesible a los espectropolarímetros

convencionales.


166

Estudio de la Interacción entre los Grupos Fosfato del ...

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Transcript of Estudio de la Interacción entre los Grupos Fosfato del ...