ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS …
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Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS
POR EL HONGO PLEUROTUS OSTREATUS EN UN BIORREACTOR
USANDO RESIDUOS DE FRUTA COMO SUSTRATO
Proyecto de grado
Por
CRISTHIAN CAMILO CHAPARRO HERNÁNDEZ
Presentado a la facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERO QUÍMICO
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogotá D.C
Junio 2019
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Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS
POR EL HONGO PLEUROTUS OSTREATUS EN UN BIORREACTOR
USANDO RESIDUOS DE FRUTA COMO SUSTRATO
Proyecto de grado
Por
CRISTHIAN CAMILO CHAPARRO HERNÁNDEZ
Presentado a la facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERO QUÍMICO
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramirez, PhD.
Co-asesor, Daniel David Duran Aranguren.
Jurado, Felipe Salcedo Galán, PhD.
Director del departamento: Andrés Gonzáles Barrios, PhD.
Departamento de Ingeniería Química
Junio 2019
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RESUMEN
Estudio de la producción de enzimas lignocelulolíticas por el hongo Pleurotus ostreatus
en un biorreactor usando residuos de fruta como sustrato.
Cristhian Camilo Chaparro Hernández.
Universidad de los Andes, Colombia
Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD.
Co- Asesor: Daniel David Duran Aranguren.
La producción de enzimas y demás productos de valor agregado a partir de residuos
agroindustriales ha sido un enfoque central en la industria biotecnológica como una
alternativa para reducir el impacto ambiental y abrir horizontes a mercados más
sostenibles. Los residuos agroindustriales se componen en su mayoría de material
lignocelulósico cuyos componentes (lignina, pectina, celulosa y hemicelulosa) son de
gran importancia para la utilización en diversas aplicaciones. En el presente estudio se
realizó la cuantificación de azúcares reductores y la evaluación de las actividades
enzimáticas de las enzimas lignocelulolíticas: lacasa, exopoligalacturonasa y
exoglucanasa, en cultivo sumergido del hongo ligninolítico Pleurotus ostreatus como
tratamiento biológico para la hidrólisis de celulosa y deslignificación de residuos de
cascara de mango y piña. Se incubaron los cultivos en frascos de vidrio a velocidades de
agitación de 75 y 150 rpm con diferentes proporciones de fruta y se sometieron los
resultados a un diseño factorial completo para posteriormente realizar el escalado a un
biorreactor Batch. Según los resultados del diseño factorial completo, la velocidad de
agitación tiene un efecto significativo en la concentración de azúcares reductores y
actividad de las enzimas estudiadas, mientras que el respectivo análisis de varianza arrojó
que la proporción de fruta Mango/Piña no tiene un efecto significativo en el valor final
de las variables de respuesta. Finalmente, a partir del análisis estadístico se realizó el
cultivo sumergido en el reactor Batch con una velocidad de agitación constante de 150
rpm y una proporción de sustrato Mango/Piña de 75%. La deslignificación de los residuos
de fruta en los cultivos incubados en frasco de vidrio se le atribuye principalmente a la
acción de la lacasa la cual alcanza una actividad enzimática de 1474,49 U/L, seguida por
la acción de la exopoligalacturonasa con una actividad enzimática máxima de 1359,52
U/L y finalmente la acción de la exoglucanasa que reportó una máxima actividad
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enzimática de 508,51 U/L. La actividad enzimática de la exopoligalacturonasa en el
cultivo sumergido del reactor Batch reflejó un incremento del 305,67% con respecto a los
incubados en frasco de vidrio; la actividad de la exoglucanasa obtuvo un incremento de
398,50%, mientras que la actividad de la lacasa obtuvo una disminución de 3404,23%.
Palabras clave: enzimas, residuos agroindustriales, lignocelulosa, biorreactor, actividad
enzimática.
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NOMENCLATURA
DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico
ABTS Ácido 2-.2-azinobis-(3-etilbenzoatiazolin-6-sulfónico)
pH Potencial de Hidrógeno
rpm Revoluciones por minuto
U/L Unidades de actividad enzimática por litro
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN iii
NOMENCLATURA v
TABLA DE CONTENIDO vi
LISTA DE FIGURAS vii
LISTA DE TABLAS viii
OBJETIVOS ix
CAPÍTULOS
I INTRODUCCIÓN 1
II MATERIALES Y MÉTODOS 8
III RESULTADOS Y DISCUSIÓN 11
3.1. Montajes 11
3.1.1. Cuantificación de azúcares reductores 11
3.1.2. Medición de actividad enzimática 13
3.1.2.1. Lacasas 13
3.1.2.2. Exopoligalacturonasa 15
3.1.2.3. Exoglucanasa 17
3.1.3. Efecto de la velocidad de agitación en la concentración de
azúcares reductores y actividades enzimáticas 19
3.1.4. Efecto de los componentes presentes en la biomasa lig-
nocelulolítica de los residuos de fruta en la concentra-
ción de azúcares reductores y actividades enzimáticas 20
3.2. Biorreactor 20
3.2.1. Cuantificación de azúcares reductores 21
3.2.2. Medición de actividad enzimática 22
3.2.2.1. Lacasas 22
3.2.2.2. Exopoligalacturonasa 23
3.2.2.3. Exoglucanasa 24
3.2.3. Factores involucrados y fuentes de error en el proceso de
escalado 25
IV CONCLUSIONES 27
V TRABAJO FUTURO 28
REFERENCIAS 29
ANEXOS 33
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de acción de la enzima lacasa 3
Figura 2. Esquematización de ambos tipos de fermentaciones 5
Figura 3. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 75 rpm 12
Figura 4. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 150 rpm 12
Figura 5. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 75 rpm 14
Figura 6. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 150 rpm 14
Figura 7. Actividad de la exopoligalacturonasa de los montajes a 75 rpm 16
Figura 8. Actividad de la exopoligalacturonasa de los montajes a 150 rpm 16
Figura 9. Actividad enzimática de exoglucanasa de los montajes a 75 rpm 18
Figura 10. Actividad enzimática de exoglucanasa de los montajes a 150 rpm 18
Figura 11. Cuantificación de los azúcares reductores del cultivo del biorreactor 22
Figura 12. Actividad enzimática de lacasas del cultivo del biorreactor 23
Figura 13. Actividad de la exopoligalacturonasa del cultivo del biorreactor 24
Figura 14. Actividad enzimática de exoglucanasa del cultivo del biorreactor 25
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Factores con sus respectivos niveles para el diseño experimental 10
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OBJETIVOS
• Evaluar la producción enzimática de Pleurotus ostreatus en cultivo sumergido y
agitado utilizando residuos de mango y piña como sustrato a diferentes
velocidades de agitación.
• Determinar el potencial de producción enzimática de Pleurotus ostreatus con
fermentación sumergida utilizando un biorreactor Batch.
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CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
En el mercado mundial, la industria agrícola se encuentra en constante crecimiento. Se
estima que para el año 2030 habrá un total de 1645 millones de hectáreas destinadas para
la agricultura, presentando un crecimiento del 3.22% comparado con el año 2007
(Alexandratos & Bruinsma, 2012). Aunque estas hectáreas totales destinadas para dicha
actividad promueven empleo y alimento para toda la población trayendo grandes
beneficios para la economía principalmente de los países dependientes de la agricultura,
no toda la producción agrícola mundial es aprovechada de manera eficiente, de hecho, se
estima que un tercio del alimento producido globalmente para consumo humano es
desperdiciado, lo que equivale a aproximadamente 1.3 billones de toneladas por año
(Ravindran, Hassan, Williams, & Jaiswal, 2018). Aún, si todo el alimento producido
mundialmente fuera aprovechado para consumo humano, es inevitable la obtención de
residuos derivados entre los cuales se encuentran principalmente la cáscara de arroz, la
paja de trigo, la paja de avena, cáscara externa de la piña, entre otros (Nagendran, 2011).
Estos y otros residuos provenientes de la agricultura contienen una gran reserva de
biomasa lignocelulósica que no es aprovechada. Debido a su composición, estos residuos
tienen un gran potencial como materia prima para la producción de biocombustibles y
productos químicos reduciendo los impactos ambientales que provienen actualmente de
estas industrias (Liao, Liu, & Hodge, 2014). En vista de la gran cantidad de residuos
derivados de la agricultura generados alrededor del mundo y a sus características
bioquímicas particulares, han surgido bastantes estudios para transformar estos residuos
en productos de valor agregado. Estos estudios han estado enfocados principalmente en
el bioprocesamiento microbiano cuyos posibles productos derivados se encuentran
enzimas, ácidos orgánicos, colorantes para alimentos, bioetanol, biometano, entre otros
(Panda, Mishra, Kayitesi, & Ray, 2016).
La mayoría de los residuos agroindustriales son ricos en material lignocelulósico, fuente
importante para el desarrollo de productos como los biocombustibles que buscan ser un
reemplazo para los combustibles fósiles (Kantharaj, Boobalan, Sooriamuthu, & Mani,
2017). Con el fin de aprovechar de gran manera la biomasa lignocelulósica, es necesario
recurrir a distintos procesos para lograr la separación de los componentes de estos
residuos. Diversos pretratamientos físicos y químicos se han desarrollado para este fin,
sin embargo, estos conllevan varias desventajas como la generación de biopolímeros de
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baja calidad. Con el fin de superar estos inconvenientes, se ha desarrollado el
pretratamiento biológico a partir de microorganismos el cual ha tenido resultados
eficientes y además cuenta con procesos amigables para el medio ambiente y de bajo
consumo energético (Kumar & Sharma, 2017).
Varios microorganismos incluyendo hongos y bacterias son capaces de degradar celulosa
y otro tipo de fibras naturales que se encuentran en la pared celular de las plantas. Por
este motivo, los hongos contribuyen de manera significativa a la degradación de material
lignocelulósico en la naturaleza produciendo diversos tipos de enzimas lignocelulolíticas
(Dashtban, Schraft, & Qin, 2009). El material lignocelulósico está compuesto
principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina (Malherbe & Cloete, 2002). La
celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal y su contenido se
encuentra en un rango estimado de 35 a 50% del peso seco de la planta (Lynd, Weimer,
van Zyl, & Pretorius, 2002). La celulosa es un polímero compuesto de subunidades de
glucosa unido a partir de enlaces 𝛼-1,4 glucosídicos y usualmente se ordena en estructuras
microcristalinas haciendo que su hidrolisis en condiciones naturales sea muy complicada
(Malherbe & Cloete, 2002). Para la degradación de la celulosa son necesarias 3 tipos de
enzimas: las endoglucanasas que hidrolizan las regiones amorfas de las fibras celulósicas
rompiendo los enlaces glucosídicos; las exoglucanasas que remueven monómeros y
dímeros del final de la cadena de glucosa; y la β-glucosidasa que hidroliza dímeros de
glucosa impidiendo la acumulación de celobiosa, la cual inhibe la acción de las
celobiohidrolasas (Malherbe & Cloete, 2002) (Béguin & Aubert, 1994). Al igual que la
celulosa, la hemicelulosa se compone de subunidades de glucosa unidas a partir de
enlaces 𝛼-1,4 glucosídicos, sin embargo, a diferencia de la celulosa, la hemicelulosa tiene
una configuración ecuatorial y además se compone de más péptidos, por lo que para su
degradación son necesarias más enzimas (Scheller & Ulvskov, 2010). Por otro lado, la
lignina es un polímero aromático que se obtiene de la fenilalanina y contiene diferentes
grupos funcionales hidroxilos, metoxilos, carboxilos y carbonilos lo que confiere su
compleja estructura. Para la degradación de lignina las enzimas más estudiadas son la
lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y la lacasa (Aarti, Valan, &
Agastian, 2015). Además, para la degradación efectiva del material lignocelulósico
también es necesario la acción de las enzimas denominadas pectinasas, encargadas de
degradar pectinas a partir de reacciones de depolimerización y esterificación (Kantharaj
et al., 2017). Las pectinas son una clase de polisacáridos complejos que se encuentran en
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las paredes celulares de las plantas y cuya función es la de servir como agente hidratante
y de construcción para el material celulósico (Thakur, Singh, Handa, & Rao, 1997). A
continuación, se mencionarán a profundidad las enzimas lignocelulolíticas evaluadas en
el presente estudio.
Lacasas EC 1.10.2.3 Las lacasas son un tipo de oxidasas que poseen un centro activo
compuesto por cobre y se encuentran en gran variedad de bacterias, hongos, insectos y
plantas. Los cuatro átomos de cobre que se encuentran generalmente en una molécula de
lacasa se dividen en Tipo 1 (T1), Tipo 2 (T2) y un Tipo 3 binuclear (T3) (Yang et al.,
2017). El centro activo compuesto por cobre es oxidado por oxígeno o un compuesto
aromático generando un intermediario deficiente de un par de electrones. Este
intermediario será nuevamente oxidado por oxígeno o sustratos fenólicos y se completará
el ciclo gracias a cuatro oxidaciones posteriores (Páez, 2012). El ciclo completo se
observa en la Figura 1.
Figura 1. Esquema de acción de la enzima lacasa (Paéz, 2012).
La catálisis de la lacasa puede también darse con la acción de sustratos no fenólicos
gracias a la acción de mediadores. Los mediadores son un grupo de compuestos orgánicos
que tienen la habilidad de ser oxidados por la lacasa formando radicales libres capaces de
oxidar compuestos no fenólicos que la lacasa por sí sola no puede oxidar. El mediador
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sintético más común es el ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS)
(Brijwani, Rigdon, & Vadlani, 2010)
Exopoligalacturonasa (Pectinasa) EC. 3.2.1.67 Las poligalacturonasas son las enzimas
pectinolíticas más abundantes cuya función es la de romper la cadena de ácido
galacturónico en la región lisa de la pectina con la adición de agua (Jayani, Saxena, &
Gupta, 2005).
Exoglucanasa 3.2.1.91 La exoglucanasa es una enzima que hidroliza los enlaces β-1,4
glucosídicos de los extremos de la cadena, produciendo celobiosa como producto
principal. La exoglucanasa crea una especie de túnel de unión con el sustrato, ambos lados
del túnel se forman a partir de cadenas laterales involucradas en una compleja red de
puentes de hidrógeno ricos en aminoácidos que interactúan con los azúcares (Divne et al.,
1994).
Además de los productos de valor agregado que pueden ser generados por la degradación
de la biomasa lignocelulósica, las enzimas lignocelulósicas como tal son de gran utilidad
en distintas aplicaciones. Es por ello, que la producción de enzimas microbianas se está
convirtiendo en parte central de los intereses de la industria biotecnológica a nivel
mundial debido a sus importantes usos en diversos sectores de la industria como la
farmacéutica, energética, alimenticia, entre otros (Singh, Kumar, Mittal, & Mehta, 2016).
El mercado mundial de la industria de producción de enzimas está creciendo a
velocidades gigantescas, en el año 2013 generó ganancias aproximadas de $4.8 billones
de dólares en 2014 y se estimaba que para el año 2018 alcanzara una cifra cercana a los
$7.1 billones de dólares. La utilización de residuos alimenticos para la producción de
enzimas es un futuro promisorio que se ha venido de desarrollando debido a que
proporciona seguridad y viabilidad económica para el desarrollo del proceso y del
producto (Ravindran & Jaiswal, 2016).
Con el objetivo de aprovechar el uso de residuos orgánicos que representan un bajo costo
como materia prima para la producción de enzimas, se han llevado a cabo la amplificación
de técnicas de bioprocesamiento microbiano usadas en laboratorio a gran escala. Esto ha
presentado varios retos a la industria dada la necesidad de crear condiciones ambientales
propicias para el crecimiento del microorganismo y la producción de metabolitos
secundarios (Subramaniyan & Vimala, 2012). Condiciones adversas para su crecimiento
puede resultar en la producción de compuestos no deseados o en el bajo rendimiento del
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microorganismo. El desarrollo de técnicas como la fermentación en estado sólido y la
fermentación sumergida han liderado el nivel de producción industrial de compuestos
bioactivos. Algunos metabolitos secundarios presentan una producción más elevada en
fermentación en estado sólido que en fermentación sumergida y viceversa.
La fermentación en estado sólido se define como la fermentación efectuada en ausencia
o deficiencia de agua. Por otra parte, la fermentación sumergida hace referencia al tipo
de fermentación realizada en presencia de un exceso de agua (Singhania, Sukumaran, &
Patel, 2010). En particular, para la producción de enzimas, la fermentación sumergida es
utilizada en mayor medida debido a que utiliza un medio líquido que contiene disueltos
los nutrientes requeridos por el microorganismo (El-Barry, Abraham, & Cerda, 2015).
Este proceso de fermentación presenta el beneficio de homogeneizar el medio de cultivo
y además la posibilidad de controlar parámetros como la temperatura y el pH. Por otro
lado, la fermentación en estado sólido presenta grandes retos y dificultades en procesos
industriales debido al monitoreo y control de las variables; es por ello que se prefiere la
fermentación sumergida a la hora del escalado (El-Barry, Abraham, & Cerda, 2015). En
la Figura 2 se esquematiza ambos tipos de fermentaciones.
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Varios grupos de microorganismos son utilizados frecuentemente en la transformación
de desechos orgánicos con material lignocelulósico utilizando alguno de estos dos tipos
de fermentación, Pleurotus ostreatus es uno de ellos. P. ostreatus es un hongo
basidiomiceto perteneciente a la familia Pleurotaceae (Papaspyridi, Aligiannis, &
Topakas, 2012). P. ostreatus es una especie de crecimiento rápido, además es de gran
importancia en la industria debido a que degrada lignina, uno de los componentes más
abundantes en los residuos agrícolas. Usualmente se realiza una fermentación en medio
sólido para la obtención de enzimas lignocelulósicas a partir de P. ostreatus, esto debido
a que requiere un menor contenido de humedad para crecer comparado con otros
microorganismos (Subramaniyan & Vimala, 2012). Sin embargo, este tipo de
fermentación en P. ostreatus presenta algunos inconvenientes como contaminación
frecuente por la manipulación del sustrato y tiempo relativamente largo en la producción
del inóculo. Es por ello, que la fermentación sumergida es una alternativa para evitar los
problemas mencionados anteriormente debido a que se obtiene el inoculo en cultivo
líquido, permitiendo producir una mayor cantidad de biomasa de mejor calidad en un
periodo de tiempo más corto (Guillén, Márquez, & Sanchez, 1998).
Teniendo en cuenta las consideraciones expuestas anteriormente en cuanto a las
características del hongo y proceso de fermentación sumergida, es posible obtener los
resultados deseados en cuanto a producción de enzimas lignocelulolíticas y tiempo de
fermentación se refiere. El objetivo de este estudio es identificar las variables de
Figura 2. Esquematización de ambos tipos de fermentaciones. Arriba: Fermentación en
estado sólido. Abajo: Fermentación sumergida. (Ravindran & Jaiswal, 2016)
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operación del proceso que maximicen la producción de enzimas por parte del hongo y
con ello escalarlo en un biorreactor batch utilizando el principio de la fermentación
sumergida.
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CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepa. Se utilizó la cepa Pleurotus ostreatus.
Residuos de fruta. Se recolectaron residuos de fruta (mango y piña) como sustrato para la
experimentación. Estos residuos fueron previamente secados y molidos según el
protocolo de la NREL. El tamaño de partícula es de aproximadamente 1 mm.
Crecimiento de la cepa Pleurotus ostreatus en agar de malta. Se sembró la cepa Pleurotus
ostreatus en cajas de petri utilizando agar extracto de malta para facilitar el crecimiento
del hongo. Esto se realizó recolectando un plug por medio de técnica de punción
extrayendo parte del micelio para luego ubicarlo en el agar. Finalmente se lleva a
incubación durante 1 semana y se mantiene a 25ºC permitiendo que el micelio cubra
totalmente la superficie del agar.
Preparación del pre-inóculo. Se extrajeron 15 plugs de micelio del material previamente
incubado y se agregaron en 5 mL de caldo SDY en tubos de ensayo de 10 mL. Finalmente
se lleva a incubación durante 1 semana y se mantiene a 25ºC.
Preparación del inoculo. Para el inoculo es necesario esterilizar el recipiente de 0.5 L
durante dos ciclos. Además, se preparó un buffer citrato pH 5. Una vez todo el material
se esterilizó, se agregaron 170 mL del buffer citrato a cada recipiente con 1,7 g de fruta.
Esto se realizó por duplicado con el fin de mantenerlos en agitación a 150 rpm y 70 rpm
a una temperatura de 25ºC. Se realiza toma de muestras del medio líquido cada 4 días
para la medición de actividad enzimática.
Cuantificación de azúcares reductores. Para la cuantificación de azúcares reductores se
utilizó el método de DNS. Este método es una técnica colorimétrica que consiste en la
reacción de óxido-reducción entre el ácido 3,5-dinitrosalicílico y los azúcares reductores
presentes en la muestra. El poder reductor de los azúcares permite que el ácido 3,5-
dinitrosalicílico se reduzca al ácido 3-amino-5-nitrosalisílico pasando de una coloración
amarilla a una rojiza-marrón (Garriga, Almaraz, & Marchiaro, 2017). Para ello, se agrega
1 mL de extracto enzimático junto a 1 mL de DNS en tubos de ensayo de 10 mL y luego
se coloca en agua en ebullición durante 5 minutos. Posteriormente se deja enfriar hasta
temperatura ambiente y se completa el volumen con 8 mL de agua destilada. Finalmente
se mide la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Para conocer la concentración
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de azúcares reductores a partir de la absorbancia es necesario hacer una curva de
calibración empleando glucosa.
Actividad enzimática de lacasas (E.C.1.10.3.2). Para medir la actividad enzimática de
lacasa se preparó una solución de ABTS 1mM en buffer acetato de sodio con pH 4,5. Se
adicionaron 50 µL de extracto enzimático junto a 950 µL de la solución ABTS-buffer
acetato y se registró la absorbancia por espectrofotometría por 10 minutos registrándola
cada minuto a una longitud de onda de 436 nm. La lectura es comparada frente a un blanco
en donde el extracto enzimático es reemplazado por agua destilada. La actividad se
cuantificó siguiendo la ley Beer-Lambert:
𝑈
𝐿=𝐴𝑉𝑡𝐹𝑑𝑡𝜀𝑉𝑚𝑙
Donde,
𝐴
𝑡= Pendiente obtenida al linealizar los resultados de absorbancia durante los 10 minutos
de reacción.
𝑉𝑡 = Volumen de la celda (1 mL)
𝐹𝑑 = Factor de dilución
𝜀 = Coeficiente de extinción molar a 436 nm (29.3 mM-1cm-1)
𝑉𝑚 = Volumen de la muestra (50 µL)
Actividad de la exopoligalacturonasa. Para cuantificar la actividad de la enzima
exopoligalacturonasa se adiciona 2 mL de una solución pectina al 1% en buffer citrato de
sodio junto a 0,5 mL de extracto enzimático en tubos de ensayo de 25 mL, la mezcla se
llevó a 50ºC durante 30 minutos. Luego, los tubos se enfrían rápidamente para detener la
reacción y se agregan 2,5 mL del reactivo DNS, la solución se lleva a ebullición durante
5 minutos. Posteriormente se agregan 10 mL de agua destilada y se procede a medir
absorbancia por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm (Debing, Peijun,
Stangnitti, Xianzhe, & Li, 2006).
Actividad de la exoglucanasa. Para cuantificar la actividad de la enzima exoglucanasa se
adiciona 2 mL de una solución celulosa cristalina al 1% en buffer citrato de sodio junto a
0,5 mL de extracto enzimático en tubos de ensayo de 25 mL, la mezcla se llevó a 50ºC
durante 60 minutos. Luego, los tubos se enfrían rápidamente para detener la reacción y
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se agregan 2.5 mL del reactivo DNS, la solución se lleva a ebullición durante 5 minutos.
Posteriormente se agregan 10 mL de agua destilada y se procede a medir absorbancia por
espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm (Montoya, 2008).
Diseño experimental. Para este estudio se realizó un diseño factorial completo en donde
se definieron como factores la velocidad de agitación, la proporción de fruta y el tiempo
de incubación. Los niveles para cada factor se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Factores con sus respectivos niveles para el planteamiento del diseño factorial
completo.
Factor Nivel
Velocidad de agitación (rpm) 75 150
Concentración de fruta (%) 25 50 75
Tiempo de incubación (días) 4 8 12 15 20
Se realizaron 3 réplicas para un total de 90 experimentos. Se tomaron como variables de
respuesta la concentración de azúcares reductores y la actividad de cada enzima estudiada
en el presente proyecto.
Preparación del inóculo para el biorreactor. Se extrajeron 8 plugs de micelio del material
fúngico previamente incubado y se agregaron en 50 mL de caldo SDY en matraces
Erlenmeyer de 250 mL. Se incubaron durante 7 días a 25 °C y posteriormente cada uno
se resembraron en matraces Erlenmeyer de 1000 mL con 500 mL del mismo medio para
obtener el inóculo del biorreactor. Los matraces se llevaron nuevamente a incubación
durante 7 días y se mantuvieron en agitación constante a 150 rpm y a una temperatura de
25 °C.
Preparación del medio de cultivo para el biorreactor. Se preparó 1 L de buffer citrato pH
5 y se mezcló junto a 10 g de fruta. El medio de cultivo se esterilizó junto al biorreactor
antes de empezar la fermentación.
Biorreactor. Se utilizó un Biorreactor New Brunswick BioFlo®/CelliGen® 115 de 7,5 L
para el montaje junto a una turbina Rushton de 6,4 cm de diámetro. El cultivo se mantuvo
a una temperatura de 26 °C, agitación constante de 150 rpm y aireación de 0.65 vvm. Se
realiza toma de muestras del medio líquido cada 24 horas para la medición de actividad
enzimática.
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CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Montajes
3.1.1 Cuantificación de azúcares reductores
En la Figura 3 se muestra el comportamiento obtenido para la concentración de azúcares
reductores durante 20 días de cultivo a una velocidad de agitación de 75 rpm y las distintas
proporciones de concentración de fruta. Las concentraciones de azúcares en los montajes
permanecen casi constantes con un leve incremento en el día 8 de incubación y su
posterior disminución hasta el día 20 para alcanzar aproximadamente las mismas
concentraciones que en el día 4. Este comportamiento no difiere de gran manera para las
concentraciones de azucares reductores de los montajes cultivados a 150 rpm como se
observa en la Figura 4. La concentración máxima de azúcares reductores para los cultivos
incubados a 75 rpm fue de 13,58 g/L con una proporción de fruta de 50% mango, mientras
que para los cultivos incubados a una velocidad de agitación de 150 rpm la concentración
máxima fue de 14,53 g/L con una proporción de fruta de 50%. Cabe resaltar que, para los
cultivos incubados a ambas velocidades de agitación, la concentración máxima de
azúcares reductores no difiere de gran manera con las otras proporciones de fruta.
Este comportamiento en la concentración de azúcares es consistente con el encontrado
por el estudio de Hidalgo, Narváez, Pedroza, & Velásquez (2012) quienes reportaron que
la concentración de azúcares reductores llegó a un pico en el primer día de incubación y
luego empezó a decrecer gradualmente hasta el día 7. Aunque el comportamiento es
similar, los días de incubación donde se presenta la máxima concentración cambia, esto
debido a que el sustrato que se utilizó en dicho estudio para la liberación de azúcares
reductores es distinto al utilizado en este ensayo.
Despúes de 8 días de incubación, el hongo probablemente empezó a consumir azúcares
simples y por tanto la concentración empezó a disminuir gradualmente a través del tiempo
(Hidalgo et al., 2012).
12
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Figura 3. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 75 rpm. Los
valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
Figura 4. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 150 rpm. Los
valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Conce
ntr
acón (
g/L
)
Días25 % Mango 50 % Mango 75 % Mango
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L
)
Días
25 % Mango 50 % Mango 75 % Mango
13
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Se realizó un diseño factorial completo con el cual se concluye con un nivel de
significancia del 5% que la velocidad de agitación (p-value = 0,034) y tiempo de
incubación (p-value = 0,000) tiene un efecto significativo en la concentración de azúcares
reductores, mientras que la concentración de fruta (p-value = 0,526) no tiene un efecto
significativo sobre la concentración de azúcares reductores. Adicionalmente, se construyó
una gráfica de efectos principales en donde se observa que la tasa media de concentración
de azúcares reductores es mayor en el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación
de 75 rpm. Por otra parte, la proporción de fruta no afecta de manera significativa la
concentración media de azúcares reductores como se logra corroborar en esta gráfica y
en el análisis de varianza mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica
de efectos principales se encuentra en el Anexo 2.1.
3.1.2 Medición de actividad enzimática
3.1.2.1 Lacasas
En las Figuras 5 y 6 se presenta la curva de comportamiento de la actividad enzimática
de lacasas para las velocidades de agitación de 75 y 150 rpm respectivamente. La
actividad enzimática en los cultivos con una velocidad de 75 rpm alcanzó un pico en el
día 10 de incubación para todas las proporciones de frutas y luego los niveles de actividad
fueron disminuyendo gradualmente. Por otro lado, para los cultivos incubados a una
velocidad de 150 rpm, la actividad máxima de lacasas encontró un pico en el día 12 de
incubación para todas las proporciones de frutas exceptuando los cultivos que crecieron
en una proporción de 25% mango como sustrato, la cual alcanzó un pico en el día 15 de
incubación, de igual manera los niveles de actividad disminuyeron gradualmente. Este
comportamiento concuerda con los estudios realizados por Sekme, Ataci, & Arisan
(2013) y Rodrigues et al. (2012) en donde se demostró que la actividad enzimática de
lacasas incrementa hasta alcanzar un pico y luego disminuye hasta un valor similar a la
inicial. Esto se debe posiblemente a la rápida diminución de contenido de lignina una vez
se alcanza la actividad enzimática máxima de lacasas (Leatham, 1985). Para una
velocidad de 75 rpm la actividad máxima fue de 1212,20 U/L con una proporción de fruta
de 25% mango, mientras que para una velocidad de agitación de 150 rpm la actividad
máxima fue de 1474,49 U/L con una proporción de fruta de 50% mango.
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Figura 5. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 75 rpm. Los valores se
tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
Figura 6. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 150 rpm. Los valores se
tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
437,06
1212,20
684,35598,32 562,00
395,13
1085,53
929,47
705,10
364,00
458,25
839,54
479,00562,00 518,34
0
500
1000
1500
2000
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
95,84
996,58
1350,46
1463,65
1303,09
369,49
1317,94
1474,49
1090,26
930,46
149,18
614,95
1131,46
943,68
834,50
0
500
1000
1500
2000
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
15
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A partir del diseño factorial realizado se concluye con un nivel de significancia del 5%
que la velocidad de agitación (p-value = 0,012) y tiempo de incubación (p-value = 0,001)
tiene un efecto significativo en la actividad enzimática de lacasas, mientras que la
concentración de fruta (p-value = 0,188) no tiene un efecto significativo sobre dicha
actividad. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos principales en donde se
observa que la tasa media de actividad enzimática de lacasas es mayor entre los días 8 y
12 de incubación y a una velocidad de agitación de 150 rpm. La proporción de fruta por
otra parte no afecta de manera significativa la tasa media de actividad enzimática como
se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis de varianza mencionado anteriormente.
El análisis de varianza y la gráfica de efectos principales se encuentran en el Anexo 2.2.
3.1.2.2 Exopoligalacturonasa
La actividad enzimática de exopoligalacturonasa se midió con la ayuda del reactivo DNS
y se estimó a partir de la curva de calibración realizada con glucosa, dicha curva se
encuentra en el Anexo 1. A partir de los datos obtenidos se lograron construir los perfiles
de actividad para los cultivos incubados a 75 y 150 rpm. En la Figura 7 se observa el
perfil de actividad enzimática de exopoligalacturonasa para los cultivos incubados a 75
rpm donde alcanza un pico en el día 8 y posteriormente decrece de manera gradual. De
manera similar, los cultivos incubados a 150 rpm presentan su actividad máxima en el 8
día de incubación como se aprecia en la Figura 8, con un posterior decrecimiento en la
actividad enzimática. Para los cultivos incubados con una velocidad de agitación de 75
rpm la actividad máxima de exopoligalacturonasa fue de 1359,52 U/L en el día 8 de
incubación con una proporción de fruta de 75% de mango, mientras que para los cultivos
incubados a 150 rpm la actividad máxima de la enzima resulto ser de 1012,87 U/L con
una proporción de fruta de 50% de mango.
En el estudio realizado por Adeleke, Odunfa, Olanbiwonninu, & Owoseni (2012) donde
evaluaron la producción enzimática de la poligalacturonasa de Penicillum atrovenetum,
Apergillus flavus y Aspergillus oryzae usando cáscara de naranja como sustrato, se
presentó un comportamiento similar al obtenido en este ensayo donde la actividad
enzimática de todas las cepas alcanzan un pico en el día 5 de incubación y posteriormente
decrece de manera gradual hasta el día 15.
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Figura 7. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa de los montajes a 75 rpm.
Los valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error
representan la desviación estándar.
Figura 8. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa de los montajes a 150 rpm.
Los valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error
representan la desviación estándar.
411,92
1160,43
704,91
536,34
382,64
658,30
1209,73
713,07611,68
395,16
816,13
1359,52
632,14656,84
475,19
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
404,55
782,71
493,41
361,62
363,97
972,861012,87
484,92
355,25360,04
730,51 726,15
576,47
384,87
376,49
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
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A partir del diseño factorial realizado se concluye con un nivel de significancia del 5%
que la velocidad de agitación (p-value = 0,000) y tiempo de incubación (p-value = 0,000)
tiene un efecto significativo en la actividad de exopoligalacturonasa, mientras que la
concentración de fruta (p-value = 0,019) no tiene un efecto significativo sobre la
concentración de dicha enzima. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos
principales en donde se observa que la tasa media de actividad de exopoligalacturonasa
es mayor en el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación de 75 rpm. Por otra
parte, la proporción de fruta no afecta de manera significativa la actividad enzimática
media de exopoligalacturonasa como se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis
de varianza mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica de efectos
principales se encuentran en el Anexo 2.3.
3.1.2.3 Exoglucanasa
La actividad enzimática de exoglucanasa al igual que la de exopoligalacturonasa se midió
con la ayuda del reactivo DNS y se estimó con la respectiva curva de calibración. En la
Figura 9 se observa el perfil de actividad enzimática de exoglucanasa para los cultivos
incubados a 75 rpm donde alcanza un pico en el día 8 y posteriormente decrece de manera
gradual. De manera similar, los cultivos incubados a 150 rpm presentan su concentración
máxima en el 8 día de incubación como se aprecia en la Figura 10, con un posterior
decrecimiento en la actividad enzimática. Para los cultivos incubados con una velocidad
de agitación de 75 rpm la actividad máxima de exoglucanasa fue de 4,19 g/L en el día 8
de incubación con una proporción de fruta de 75% de mango, mientras que para los
cultivos incubados a 150 rpm la actividad máxima de la enzima resulto ser de 5,50 g/L
con una proporción de fruta de 75% de mango. Este comportamiento resulto muy similar
al perfil de actividad para la enzima exopoligalacturonasa
En el estudio realizado por Khalil, Hoque, Basunia, Alam, & Khan (2011), la actividad
de exoglucanasa alcanza su valor máximo en el día 10 y luego los niveles disminuyen de
manera gradual hasta alcanzar valores iguales o cercanos a 0 en el día 14. En un estudio
similar realizado por Goyal & Soni (2011) donde evaluaban la actividad enzimática de la
exoglucanasa utilizando como microorganismo Pleurotus florida y como sustrato CMC,
encontraron que esta enzima alcanza su máxima actividad en el día 10 de incubación y
luego disminuye. Por tanto, los resultados obtenidos en este ensayo concuerdan con los
reportados en la literatura en donde la actividad enzimática de exoglucanasa va
18
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aumentando de manera progresiva hasta alcanzar un pico y luego decrece de manera
gradual.
Figura 9. Actividad enzimática de la exoglucanasa de los montajes a 75 rpm. Los
valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
Figura 10. Actividad enzimática de la exoglucanasa de los montajes a 150 rpm. Los
valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la
desviación estándar.
317,97
376,82
294,27284,49
214,90
305,51
386,72
316,91 310,54
163,82
323,06
387,50
277,84
310,48
240,89
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
277,56
432,66
208,98 195,23189,53
266,44
430,76
206,35 207,86 203,22
247,10
508,51
240,73217,03 214,85
0
100
200
300
400
500
600
4 8 12 15 20
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25 % Mango
50 % Mango
75 % Mango
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A partir del diseño factorial realizado se concluye con un nivel de significancia del 5%
que la velocidad de agitación (p-value = 0,017) y tiempo de incubación (p-value = 0,000)
tiene un efecto significativo en la actividad enzimática de exoglucanasa, mientras que la
concentración de fruta (p-value = 0,371) no tiene un efecto significativo sobre la actividad
de dicha enzima. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos principales en
donde se observa que la tasa media de actividad enzimática de exoglucanasa es mayor en
el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación de 75 rpm. Por otra parte, la
proporción de fruta no afecta de manera significativa la concentración media de
exoglucanasa como se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis de varianza
mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica de efectos principales se
encuentra representada en el Anexo 2.4.
3.1.3 Efecto de la velocidad de agitación en la concentración de azúcares
reductores y actividades enzimáticas
En el presente estudio, fue posible corroborar que efectivamente la velocidad de agitación
tiene un efecto significativo en todas las variables de respuesta evaluadas. Esto debido a
que todos los p-value fueron menores al nivel de significancia (𝛼=0,05). Mussato,
Dragone, Fernandes, Milagres, & Roberto (2008) indican en su estudio que la velocidad
de agitación tiene un efecto negativo en el rendimiento de glucosa y la conversión de
celulosa, es decir, ambas variables de respuesta aumentan al disminuir la velocidad de
agitación. Cabe resaltar que en este estudio se evaluaron tres velocidades de agitación:
100, 150 y 200 rpm. Por tanto, no es posible realizar una comparación amplia dado que
el estudio no incluyó en su análisis la velocidad de agitación de 75 rpm. En este estudio
se utilizó residuo de grano cervecero. Este comportamiento también se presentó en otros
estudios donde se utilizaron sustratos diferentes. Por ejemplo, Mukataka, Tada, &
Takahashi (1983) utilizando como sustrato Avicel y pulpa de papel evidenciaron que
velocidades muy altas de agitación (>200 rpm) disminuían la hidrólisis enzimática de la
celulosa, mientras que velocidades moderadas (100-200 rpm) promovían una buena tasa
de hidrolisis y conversión. Sin embargo, estos resultados pueden no ser consistentes
dependiendo del microorganismo que se esté utilizando. En el estudio realizado por
Vamanu et al. (2011) donde utilizó Pleurotus ostreatus, encontró que a una velocidad de
150 rpm se obtuvo mayor cantidad de biomasa, lo que repercute en una mayor capacidad
del hongo para producir enzimas lignocelulolíticas, en dicho estudio se evaluaron
velocidades de agitación de 0, 50, 100, 150, 200 y 250 rpm. Los resultados arrojados en
20
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el presente estudio son consistentes con los encontrados en la literatura ya que al utilizar
una velocidad de 150 rpm 3 de las 4 variables de respuesta logran alcanzar un valor medio
mayor comparado con la velocidad de agitación de 75 rpm como se observan en las
gráficas de efectos principales que se encuentran en Anexos.
3.1.4 Efecto de los componentes presentes en la biomasa lignocelulósica
de los residuos de fruta en la concentración de azúcares reductores
y actividades enzimáticas
A partir del análisis de varianza arrojado por el diseño factorial completo realizado, fue
posible corroborar que la proporción de fruta mango/piña no tiene un efecto significativo
en las variables de respuesta analizadas. Esto debido a que todos los p-value arrojados
por dicho análisis resultaron ser mayores al nivel de significancia (𝛼=0,05). Para tener
una visión global del efecto que tiene el sustrato específico utilizado en cada una de las
proporciones evaluadas, es necesario relacionar el contenido de los componentes que
tienen los residuos de fruta con los resultados de actividades enzimáticas encontrados. De
acuerdo con el estudio realizado por Jahid, Gupta, & Kumar (2018) el contenido de
celulosa, hemicelulosa y lignina en la cascara de mango es de 38,4; 13,9 y 27,9%
respectivamente; mientras que el contenido de estos tres componentes en la cáscara de
piña se reparten de la siguiente manera: celulosa (22,4%), hemicelulosa (11,1%) y lignina
(6,5%). El bajo contenido de lignina presente en la cáscara de piña facilita el acceso a
azúcares fermentables y por consecuente genera un medio rico en glucosa. En el estudio
realizado por Dúran, Cruz, Gonzáles, & Sierra (2018) se evidencia que al utilizar residuos
de cáscara de piña como sustrato, decrece la actividad enzimática de lacasas, esto debido
a la inhibición de la enzima causada por la alta concentración de glucosa en el medio (Ire
& Ahuekwe, 2016). Los resultados arrojados en el presente estudio son consistentes con
los encontrados en la literatura ya que el valor medio de actividad enzimática de lacasas
es mayor a una proporción de mango/piña del 25%, es decir, con un contenido menor de
lignina. Esto se corrobora con la gráfica de efectos principales para la actividad
enzimática de lacasas que se presenta en la Figura A.2.2.1 encontrada en Anexos.
3.2 Biorreactor
A partir del diseño factorial completo realizado, se construyeron gráficas de optimización
con el fin de determinar los niveles que en interacción maximizan los valores de las
variables de respuesta. Estas gráficas se pueden visualizar en la Figura A.2.5.
21
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Al observar con detenimiento las gráficas de optimización, es posible concluir que con el
diseño factorial realizado la concentración de azúcares reductores es máxima al utilizar
una velocidad de agitación de 150 rpm y una concentración de fruta de 75% mango. La
actividad de lacasas se maximiza al utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y una
concentración de fruta como sustrato de 50% mango. En cuanto a la concentración de
exopoligalacturonasa, esta se maximiza al utilizar una velocidad de agitación de 75 rpm
y una concentración de fruta de 75% mango. Finalmente, la concentración de
exoglucanasa es máxima al utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y 75% mango.
A partir de estos resultados, se decidió utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y
una concentración de fruta de 75% mango. Esto se debe a que a esta velocidad de
agitación se maximiza el valor de 3 de las 4 variables de respuesta como se destacó
anteriormente. En cuanto a la concentración de fruta, esta también permite la
maximización de 3 de las 4 variables de respuesta. No obstante, como se vio reflejado en
los análisis de varianza, la concentración de fruta no es muy significativa en el valor que
toma las variables de respuesta. Por este motivo se considera más importante la elección
de la velocidad de agitación.
3.2.1 Cuantificación de azúcares reductores
En la Figura 11 se observa el perfil de concentración de azúcares reductores en el
biorreactor batch. Se puede apreciar un aumento progresivo de la concentración de
azúcares reductores hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una concentración
máxima de 33,42 g/L. Se obtuvo un aumento del 130% en la concentración de azúcares
reductores con respecto a la mayor concentración encontrada en los montajes. Esto se
debe a la gran disponibilidad de glucosa que existe en el medio debido a la acción de las
enzimas que descomponen el material lignocelulósico en monosacáridos y disacáridos los
cuales varios de ellos actúan como azúcares reductores aumentando su concentración
(Asif et al., 2011).
22
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Figura 11. Cuantificación de los azúcares reductores del cultivo del biorreactor.
3.2.2 Medición de actividad enzimática
3.2.2.1 Lacasas
En la Figura 12 se observa el perfil de actividad enzimática de lacasas el cual no es
constante llegando a un máximo local en el día 2, presentando posteriormente una
disminución hasta el día 5 y aumentando nuevamente de manera gradual hasta llegar al
máximo global en el día 8 de fermentación.
Además, la actividad de lacasas presentó un valor muchísimo más bajo en comparación
con los montajes donde se presentaban valores con 2 órdenes de magnitud mayores. Esto
puede deberse a que, al exceder la concentración de glucosa como fuente de carbono, esta
causa un efecto inhibitorio en la actividad enzimática de lacasas disminuyendo su
producción (Sekme et al., 2013). La celulosa disponible de las cáscaras de fruta que se
agregaron como sustrato pudieron actuar como activador de la producción de lacasas
durante los primeros dos días (Ire & Ahuekwe, 2016). No obstante, debido al exceso de
sustrato añadido al biorreactor (10 g), la celulosa posiblemente se empezó a degradar a
una tasa muy alta permitiendo el fácil acceso a grandes cantidades de glucosa que como
se mencionó anteriormente, actúa como inhibidor para la producción de lacasa evitando
una gran actividad enzimática de esta.
18,09 17,43
24,84 28,14
26,94
33,42
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Conce
ntr
acón (
g/L
)
Días
23
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Adiconalmente, el estrés hidrodinámico por parte de la agitación y la aireación parece
tener un efecto negativo en la producción de lacasas. En el estudio realizado por Hess et
al. (2002) se obtuvo una menor actividad de lacasas en el biorreactor comparado con los
montajes realizado en los matraces. Esto se debe probablemente al daño del micelio
causado por la alta tasa de cizalla que ocurre en mayor medida cerca al eje de la turbina.
Sin embargo, no hay suficientes reportes en literatura para concluir en el efecto directo
que tienen sobre la producción de lacasas en biorreactores. En el estudio realizado por
Valencia, Gómez, Galindo, & Serrano (2014) se evidencia que la disminución en la
producción de lacasas en el biorreactor se debe a la producción de proteasas por parte de
Pleurotus ostreatus y no tanto por el estrés hidrodinámico generado por la agitación y
aireación.
Figura 12. Actividad enzimática de lacasas del cultivo del biorreactor.
3.2.2.2 Exopoligalacturonasa
En la Figura 13 se observa el perfil de concentración de exopoligalacturonasa presentando
un comportamiento creciente hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una
actividad máxima de 5515,20 U/L. Se obtuvo un aumento del 305,67% en la actividad
enzimática de exopoligalacturonasa con respecto a la mayor concentración encontrada en
los montajes. Este gran aumento se debe probablemente a la gran cantidad de glucosa y
pectina presente en el medio debido a la gran cantidad de fruta que se agregó (10 g)
además de la concentración de glucosa que ya se estaba presente en el inóculo. En un
19,45
28,53
1,302,59
14,27
37,61
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1 2 5 6 7 8
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
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Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
estudio realizado por Abbasi, Mortazavipoor, & Setudeh (2011), se evidenció que la
actividad enzimática de exopoligalacturonasa aumenta de manera significativa cuando se
utiliza glucosa y pectina como medio de cultivo.
Figura 13. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa del cultivo del biorreactor.
3.2.2.3 Exoglucanasa
En la Figura 14 se observa el perfil de actividad enzimática de exoglucanasa presentando
un comportamiento creciente hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una
actividad máxima de 2534,93 U/L.
972,52734,09
2682,48
3515,49
4827,39
5515,20
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
1 2 5 6 7 8
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
25
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Figura 14. Actividad enzimática de la exoglucanasa de del cultivo del biorreactor.
Se obtuvo un aumento del 398,5% en la actividad enzimática de exoglucanasa con
respecto a la mayor concentración encontrada en los montajes. Este aumento que se
obtuvo con respecto a los cultivos incubados en frascos de vidrios se debe posiblemente
al alto contenido de celulosa presente en los residuos de fruta (mango y piña) utilizados
como medio de cultivo para la fermentación (Dúran, Cruz, Gonzáles, & Sierra, 2018).
3.2.3 Factores involucrados y fuentes de error en el proceso de escalado
Este estudio implica la apertura para investigaciones posteriores en cuanto a la producción
de enzimas lignocelulolíticas por parte del hongo Pleutotus ostreatus con residuos de
fruta como sustrato a escala de biorreactor ya que es la primera vez que se realiza en el
Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los Andes. Es por ello, que es
necesario hablar con más detalle de los factores implicados en el proceso y posibles
fuentes de error que hicieron parte de este. Para la fermentación en el biorreactor se
esperaba utilizar una aireación de 1 vvm basada en la literatura (Guillén, Márquez, &
Sanchez, 1998). Sin embargo, en el laboratorio la aireación máxima posible era de 2,5
L/min que con 3,8 L de volumen de trabajo utilizado para la fermentación equivale a 0,65
vvm. En el estudio realizado por Valencia et al. (2014) la agitación y aireación tiene un
efecto negativo en la producción enzimática, afectando la actividad de producción de
lacasa a altas velocidades de agitación y tasas de aireación. En su investigación
encontraron que la producción de lacasas mejoraba al nivel de aireación y agitación más
1539,60
1707,28
1486,78
1826,49
2300,01
2534,93
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 5 6 7 8
Act
ivid
ad (
U/L
)
Días
26
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bajo; 0,94 kW/m3 s y 0.1 vvm respectivamente. Sin embargo, en el estudio realizado por
Fenice, Sermanni, Federici, & D'Annibale (2003) se encontró que la actividad enzimática
incrementaba al utilizar una aireación entre 0,5 y 1 vvm, mientras que aireaciones altas
(1,5 vvm) disminuían la producción enzimática de manera drástica, en este estudio se
utilizó una velocidad de agitación de 500 rpm. Al observar los resultados de ambos
estudios, es posible determinar que utilizar una aireación alta afecta de gran manera la
producción enzimática. No obstante, en el estudio de Valencia et al. (2014) se encontró
que la aireación óptima es 5 veces menor que en el estudio reportado por Fenice et al.
(2003), cabe resaltar que la velocidad de agitación utilizada en ambos estudios fue
distinta, por lo que posiblemente la interacción de estos dos factores es relevante a la hora
de evaluar la producción enzimática. En cuanto a las fuentes de error que imposibilitaron
la obtención de resultados más exactos, se encuentra el método de calentamiento utilizado
para mantener el cultivo a 25°C el cual se basaba en una manta térmica que gracias a las
grandes temperaturas que alcanzaba, una parte del material residual de las frutas quedaba
pegada en las paredes del recipiente impidiendo el aprovechamiento total del medio de
cultivo.
27
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CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES
Se evaluaron las actividades enzimáticas de lacasa, exopoligalacturonasa y exoglucanasa
para la hidrólisis de celulosa y la deslignificación del material orgánico presente en los
residuos de fruta y se cuantificó la concentración de azúcares reductores. Se encontró un
efecto significativo de la velocidad de agitación en la actividad enzimática de los
biocatalizadores evaluados y en la concentración de azúcares, esto debido a las
propiedades del hongo Pleurotus ostreatus. La deslignificación de los residuos orgánicos
se le atribuye en su mayoría a la acción de la lacasa dada su mayor actividad comparada
con las demás enzimas. Sin embargo, en el cultivo sumergido del biorreactor Batch la
actividad de la lacasa sufre un decrecimiento radical dada la inhibición de la enzima por
saturación de glucosa. El potencial de producción de enzimas lignocelulolíticas en un
biorreactor Batch es promisorio debido al gran incremento en actividad de exoglucanasa
y exopoligalacturonasa que se evidenció en este proyecto, en cuanto a la lacasa es
necesario tener en cuenta la cantidad de glucosa presente en el medio para evitar
inhibición e incrementar su producción.
28
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CAPÍTULO V
TRABAJO FUTURO
Para seguir con la línea de investigación enfocada en el escalamiento del proceso de
producción de enzimas lignocelulolíticas es necesario en primera instancia realizar una
búsqueda rigurosa en literatura para lograr encontrar el valor óptimo de las variables que
permiten una producción enzimática máxima y así evitar hacer varios experimentos que
limitan el tiempo y uso de equipos y reactivos. En cuanto al biorreactor, sería necesario
estudiar el efecto que tienen distintos tipos de impeller en la producción de enzimas
lignocelulolíticas y así realizar un mejor proceso de escalado. Además, sería
recomendable agregar Cobre y Cadmio al medio de cultivo en el momento de realizar la
fermentación ya que activa la enzima lacasa permitiendo una mayor deslignificación del
material orgánico por parte del hongo Pleurotus ostreatus (Baldrian & Gabriel, 2002).
29
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REFERENCIAS
Aarti, C., Valan, M., & Agastian, P. (2015). Lignin degradation: A microbial approach. South
Indian Journal of Biological Sciences, 1(3), 119-127.
Abbasi, H., Mortazavipoor, S. R., & Setudeh, M. (2011). Polygalacturonase (PG) Production by
Fungal Strains Using Agro-Industrial Bioproduct in Solid State Fermentation. Chemical
Engineering Research Bulletin, 1-5.
Adeleke, A. J., Odunfa, S. A., Olanbiwonninu, A., & Owoseni, M. C. (2012). Production of
Cellulase and Pectinase from Orange Peels by Fungi. Nature and Science, 10(5), 107-
112.
Alexandratos, N., & Bruinsma, J. (2012). World agriculture towards 2030/2050. Agricultural
Development Economics Division.
Asif, H., Akram, M., Saeed, T., Khan, I., Akhtar, N., Rehman, R., . . . Shaheen, G. (2011).
Carbohydrates. International Research Journal of Biochemistry and Bioinformatics,
1(1), 1-5.
Baldrian, P., & Gabriel, J. (2002). Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus
ostreatus. FEMS Microbiology Letters, 69-74.
Béguin, P., & Aubert, J.-P. (1994). The biological degradation of cellulose . FEMS Microbiology
Reviews , 25-58.
Brijwani, K., Rigdon, A., & Vadlani, P. (2010). Fungal Laccases: Production, Function, and. SAGE-
Hindawi Access to Research.
Dashtban, M., Schraft, H., & Qin, W. (2009). Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residues;
Opportunities & Perspectives. International Journal of Biological Sciences, 5(6), 578-
595.
Debing, J., Peijun, L., Stangnitti, F., Xianzhe, X., & Li, L. (2006). Pectinase production by solid
fermentation from Aspergillus niger by a new prescription experiment. Ecotoxicology
and Environmental Safety, 244-250.
Divne, C., Stahlberg, J., Reinikainen, T., Ruohonen, L., Petterson, G., Knowles, J., . . . Jones, A.
(1994). The Three-Dimensional Crystal Structure of the Catalytic Core of
Cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science, 265, 524-528.
Dúran, D., Cruz, L., Gonzáles, L., & Sierra, R. (2018). USE OF TROPICAL FRUIT WASTE FOR THE
PRODUCTION OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYMES AND FUNGAL BIOMASS.
El-Barry, M., Abraham, J., & Cerda, A. (2015). From Wastes to High Value Added Products:
Novel Aspects of SFF in the Production of Enzymes. Critical Reviews in Enviromental
Science and Technology, 1999-2042.
Fenice, M., Sermanni, G. G., Federici, F., & D'Annibale, A. (2003). Submerged and solid-state
production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill waste-based
media. Journal of Biotechnology , 77-85.
Garriga, M., Almaraz, M., & Marchiaro, A. (2017). Determination of reducing sugars in extracts
of Undaria pinnatifida (harvey) algae by UV-visible spectrophotometry (DNS method).
Actas de Ingeniería, 3, 173-179.
30
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Goyal, M., & Soni, G. (2011). Production and characterization of cellulolytic enzymes by
Pleurotus florida. Mycosphere, 2(3), 249-254.
Guillén, G., Márquez, F., & Sanchez, J. (1998). Producción de biomasa y enzimas ligninolíticas
por Pleurotus ostreatus en cultivo sumergido. Revista Iberoamericana Micología, 302-
306.
Hess, J., Leitner, C., Galhaup, C., Kulbe, K., Hintorstoisser, B., Steinwender, M., & Haltrich, D.
(2002). Enhanced Formation of Extracellular Laccase Activity by the White-Rot Fungus
Trametes multicolor. Applied Biochemistry and Biotechnology, 229-241.
Hidalgo, B., Narváez, P., Pedroza, A., & Velásquez, M. (2012). Degradation of Chrysanthemum
(Dendranthema grandiflora) Wastes by Pleurotus ostreatus for the Production of
Reducing Sugars. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 1103-1112.
Ire, F., & Ahuekwe, E. (2016). Production of Fungal Laccase Using Orange Peelings as Substrate
by Submerged Static Fermentation. British Microbiology Research Journal, 15(5), 1-19.
Jahid, M., Gupta, A., & Kumar, D. (2018). Production of Bioethanol from Fruit Wastes (Banana,
Papaya, Pineapple and Mango Peels) Under Milder Conditions. Journal of
Bioprocessing and Biotechniques, 8(3).
Jayani, R., Saxena, S., & Gupta, R. (2005). Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process
Biochemistry, 2931-2944.
Kantharaj, P., Boobalan, B., Sooriamuthu, S., & Mani, R. (2017). Lignocellulose Degrading
Enzymes from Fungi and Their Industrial Applications. International Journal of Current
Research and Review, 9(21), 1-12.
Khalil, I., Hoque, M., Basunia, M., Alam, N., & Khan, A. (2011). Production of cellulase by
Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju in solid state fermentation of
lignocellulosic biomass. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 333-341.
Kumar, A. K., & Sharma, S. (2017). Recent updates on different methods of pretreatment of
lignocellulosic feedstocks: a review. Bioresour Bioprocess, 4(1).
Leatham, G. (1985). Extracellular Enzymes Produced by the Cultivated Mushroom Lentinus
edodes during Degradation of a Lignocellulosic Medium. Applied and Environmental
Microbiology, 859-867.
Liao, W., Liu, Y., & Hodge, D. (2014). Integrated Farm-Based Biorefinery. Lansing, Michigan,
USA.
Lynd, L., Weimer, P., van Zyl, W., & Pretorius, I. (2002). Microbial Cellulose Utilization:
Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(3),
505-577.
Malherbe, S., & Cloete, T. (2002). Lignocellulose biodegradation: Fundamentals and
applications. Re/Views in Environmental Science & Bio/Technology , 105-114.
Montoya, S. (2008). Actividad enzimática, degradación de residuos sólidos orgánicos y
generación de biomasa útil de macromiceto grifola frondosa. Universidad Nacional de
Colombia. Sede Manizales.
31
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Mukataka, S., Tada, M., & Takahashi, J. (1983). Effects of agitationon enzymatic hydrolysis of
cellulose in a stirred tank reactor. Journal of Fermentation Technology, 615-621.
Mussato, S., Dragone, G., Fernandes, M., Milagres, A., & Roberto, I. (2008). The effect of
agitation speed, enzyme loading and substrate concentration on enzymatic hydrolysis
of cellulose from brewer’s spent grain. Cellosa, 711-721.
Nagendran, R. (2011). Agricultural Waste and Pollution. Chennai, India.
Páez, M. (2012). Determinación de la actividad enzimática de lacasas y lignina peroxidasa de
hongos degradadores de colorantes seleccionados para el tratamiento de aguas
residuales de la industria textil. Sangolquí.
Panda, S., Mishra, S., Kayitesi, E., & Ray, R. (2016). Microbial-processing of fruit and vegetable
wastes for production of vital enzymes and organic acids: Biotechnology and scopes.
Environmental Research, 161-172.
Papaspyridi, L.-M., Aligiannis, N., & Topakas, E. (2012). Submerged Fermentation of the Edible
Mushroom Pleurotus ostreatus in a Batch Tank Biorreactor as a Promising Alternative
for the Effective Production of Bioactive Metabolites. Molecules, 17, 2714-2724.
Ravindran, R., & Jaiswal, A. (2016). Microbial Enzyme Production Using Lignocellulosic Food
Industry Wastes as Feedstock: A Review. Bioengineering (Basel), 3(4).
Ravindran, R., Hassan, S., Williams, G., & Jaiswal, A. (2018). A Review on Bioconversion of Agro-
Industrial Wastes to Industrially Important Enzymes. Bioengineering, 5(4), 1-20.
Rodrigues, J., Dias, M., Albino, S., Pereira, D., de Cássia Soares, M., & Megumi, M. (2012).
Lignocellulolytic Enzyme Production of Pleurotus ostreatus Growth in Agroindustrial
Wastes. Brazilian Journal of Microbiology, 1508-1515.
Scheller, H. V., & Ulvskov, P. (2010). Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol., 263-289.
Sekme, S., Ataci, N., & Arisan, I. (2013). Studies on Laccase Activity in the Filamentous Fungus
Trichoderma reesei. IUFS Journal of Biology, 72(2), 37-42.
Singh, R., Kumar, M., Mittal, A., & Mehta, P. (2016). Microbial enzymes: industrial progress in
21st century. 3 Biotech, 6(2).
Singhania, R., Sukumaran, R., & Patel, A. (2010). Advancement and comparative profiles in the
production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial
cellulases. Enzyme and Microbial Technology , 541-549.
Subramaniyan, R., & Vimala, R. (2012). Solid State and Submerged Fermentation for the
Production of Bioactive Substances: A Comparative Study. International Journal of
Science and Nature, 3(3), 480-486.
Thakur, B., Singh, R., Handa, A., & Rao, M. (1997). Chemistry and uses of pectin — A review.
Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37(1), 47-73.
Valencia, R., Gómez, C., Galindo, E., & Serrano, L. (2014). Toward an understanding of the
effects of agitation and aeration on growth and laccases production by Pleurotus
ostreatus. Journal of Biotechnology, 67-73.
32
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Vamanu, E., Ene, M., Vamanu, A., Pelinescu, D., Sarbu, I., Nita, S., & Barcari, V. (2011).
Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Extracts from Pleurotus ostreatus
M2191 and PQMZ91109. Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 381-
388.
Yang, J., Li, W., Ng, T. B., Deng, X., Lin, J., & Ye, X. (2017). Laccases: Production, Expression
Regulation, and Applications in Pharmaceutical Biodegradation. Frontiers in
Microbiology.
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ANEXOS
Anexo 1: Curva de calibración de DNS
Figura A.1.1. Curva de calibración usando glucosa.
Anexo 2: Pruebas estadísticas
A.2.1 Análisis de varianza para concentración de azúcares reductores
Fuente GL
Modelo 29
Lineal 7
Velocidad de agitación (rpm) 1
Concentración de fruta (%) 2
Tiempo de incubación (días) 4
Interacciones de 2 términos 14
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 2
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 4
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Interacciones de 3 términos 8
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Error 60
y = 1,6552x - 0,0778
R² = 0,9915
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Abso
rban
cia
Concentración (g/L)
34
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Total 89
Fuente
Valor
F
Modelo 3,18
Lineal 10,79
Velocidad de agitación (rpm) 4,72
Concentración de fruta (%) 0,65
Tiempo de incubación (días) 17,38
Interacciones de 2 términos 0,59
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,33
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 1,04
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,43
Interacciones de 3 términos 1,04
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
1,04
Error
Total
Fuente
Valor
p
Modelo 0,000
Lineal 0,000
Velocidad de agitación (rpm) 0,034
Concentración de fruta (%) 0,526
Tiempo de incubación (días) 0,000
Interacciones de 2 términos 0,862
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,721
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 0,392
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,899
Interacciones de 3 términos 0,420
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,420
Error
Total
35
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Figura A.2.1.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de azúcares
reductores.
A.2.2 Análisis de varianza para actividad enzimática de lacasas
Fuente GL
Modelo 29
Lineal 7
Velocidad de agitación (rpm) 1
Concentración de fruta (%) 2
Tiempo de incubación (días) 4
Interacciones de 2 términos 14
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 2
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 4
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Interacciones de 3 términos 8
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Error 60
Total 89
Fuente
Valor
F
Modelo 1,68
Lineal 4,61
36
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Velocidad de agitación (rpm) 6,67
Concentración de fruta (%) 1,72
Tiempo de incubación (días) 5,55
Interacciones de 2 términos 1,03
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,30
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 2,64
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,40
Interacciones de 3 términos 0,24
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,24
Error
Total
Fuente
Valor
p
Modelo 0,046
Lineal 0,000
Velocidad de agitación (rpm) 0,012
Concentración de fruta (%) 0,188
Tiempo de incubación (días) 0,001
Interacciones de 2 términos 0,440
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,745
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 0,042
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,914
Interacciones de 3 términos 0,981
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,981
Error
Total
37
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Figura A.2.2.1. Gráfica de efectos principales para la actividad enzimática de lacasas
A.2.3 Análisis de varianza para concentración de exopoligalacturonasa
Fuente GL
Modelo 29
Lineal 7
Velocidad de agitación (rpm) 1
Concentración de fruta (%) 2
Tiempo de incubación (días) 4
Interacciones de 2 términos 14
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 2
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 4
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Interacciones de 3 términos 8
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Error 60
Total 89
Fuente
Valor
p
Modelo 0,000
Lineal 0,000
Velocidad de agitación (rpm) 0,000
38
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Concentración de fruta (%) 0,019
Tiempo de incubación (días) 0,000
Interacciones de 2 términos 0,013
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,244
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 0,009
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,090
Interacciones de 3 términos 0,773
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,773
Error
Total
Figura A.2.3.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de
exopoligalacturonasa.
A.2.4 Análisis de varianza para concentración de exoglucanasa
Fuente GL
Modelo 29
Lineal 7
Velocidad de agitación (rpm) 1
Concentración de fruta (%) 2
Tiempo de incubación (días) 4
39
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Interacciones de 2 términos 14
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 2
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 4
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Interacciones de 3 términos 8
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8
Error 60
Total 89
Fuente
Valor
F
Modelo 5,11
Lineal 17,15
Velocidad de agitación (rpm) 6,01
Concentración de fruta (%) 1,01
Tiempo de incubación (días) 28,01
Interacciones de 2 términos 1,76
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,03
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 5,62
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,26
Interacciones de 3 términos 0,45
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,45
Error
Total
Fuente
Valor
p
Modelo 0,000
Lineal 0,000
Velocidad de agitación (rpm) 0,017
Concentración de fruta (%) 0,371
Tiempo de incubación (días) 0,000
Interacciones de 2 términos 0,067
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,966
Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 0,001
Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,977
Interacciones de 3 términos 0,886
40
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación
(días)
0,886
Error
Total
Figura A.2.4.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de exoglucanasa.
41
Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández
Figura A.2.5. Gráficas de optimización para maximizar las variables de respuesta. De
arriba a abajo: azúcares reductores, lacasas, exopoligalacturonasa y exoglucanasa.