“ESTUDIO DEL INTERFERÓN TIPO III SOBRE LA INFECCIÓN DEL ...
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“ESTUDIO DEL INTERFERÓN TIPO III SOBRE LA INFECCIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE” M. en C. HELEN KENIA PALMA OCAMPO Presenta D. en C. Gerardo Santos López D. en C. Nora H. Rosas Murrieta BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA Facultad de Ciencias Químicas Centro de Química-Instituto de Ciencias Posgrado en Ciencias Químicas Tesis presentada para obtener el grado de Doctorado en Ciencias Químicas en el área de Bioquímica y Biología Molecular Abril 2016 Directores de tesis
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“ESTUDIO DEL INTERFERÓN TIPO III SOBRE LA
INFECCIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE”
M. en C. HELEN KENIA PALMA OCAMPO
Presenta
D. en C. Gerardo Santos López D. en C. Nora H. Rosas Murrieta
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE PUEBLA
Facultad de Ciencias Químicas
Centro de Química-Instituto de Ciencias
Posgrado en Ciencias Químicas
Tesis presentada para obtener el grado de
Doctorado en Ciencias Químicas en el área de
Bioquímica y Biología Molecular
Abril 2016
Directores de tesis
i
El trabajo experimental de esta tesis se llevó a cabo en el laboratorio de Virología
Médica del Centro de Investigación Biomédica de Oriente del Instituto Mexicano
del Seguro Social (CIBIOR-IMSS) y en el Centro de Química del Instituto de
Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (ICUAP).
Esta tesis recibió financiamiento por el Fondo de Investigación en Salud-IMSS
(IMSS/FIS/PROT/G11/975); Fondos para la infraestructura científica-IMSS
(CTFIS/1ORD/12/2011) y Redes temáticas de colaboración académica SEP-BUAP-
CA-147(2012-2014).
Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) el apoyo
brindado mediante la beca número 209395 para cursar el programa de
Doctorado en Ciencias Químicas en la Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla, con fecha de 1 de enero de 2010 al 31 de diciembre de 2014.
Se agradece al Instituto Mexicano del Seguro Social el apoyo brindado como
becario de investigación en el Centro de Investigación Biomédica de Oriente, con
el número de matrícula 98222353, durante el 1 de marzo de 2010 al 1 de marzo
de 2015
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. AGRADECIMIENTOS
Primeramente, agradezco a la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla por abrirme las
puertas para poder estudiar este programa de doctorado y al Instituto mexicano del Seguro Social,
por permitirme realizar el trabajo experimental.
Agradezco a mis asesores de tesis: la Dra. Nora H. Rosas Murrieta y el Dr. Gerardo Santos
López, por el apoyo, la confianza y oportunidad brindada para la realización de este trabajo.
Gracias al Dr. Gerardo, por sus conocimientos, orientación, su manera de trabajar, su
persistencia, paciencia (mucha paciencia) y motivación, que han sido fundamentales para mi
formación. Gracias por las ocurrencias que hicieron llevaderos estos años. Por ser mi amigo y
siempre apoyarme.
A los revisores de tesis: Dr. Julio, Dra. Vero, Dra. Paulina, Dra. Lourdes, Dra. Irma, Dr. Alberto
y a la Dra. Vicky, por su tiempo y dedicación, por compartir conmigo su conocimiento y hacerme ver
los errores cometidos. Gracias. Especialmente al Dr. Julio Reyes, por las largas charlas, su entusiasmo
en mi trabajo, por compartir su experiencia conmigo, por todo su apoyo y la amistad brindada a mi
persona.
Gracias a mis amigos del laboratorio, que vivieron a mi lado cada logro y sufrimiento y que
siempre estuvieron para apoyarme, enseñarme y sobre todo por compartir conmigo todas esas
chocoaventuras vividas durante este tiempo: Carolina, Alejandra, Juan Carlos, José Luis, Citlalli, Luis
y Tony.
Agradezco a casi todo el personal del CIBIOR y demás estudiantes, por su disposición y su
ayuda cuando se necesitó. Gracias a la Dra. Lilián por su apoyo y amistad.
Finalmente, a quienes se llevan mi entero agradecimiento, porque sin su apoyo,
comprensión, sus palabras de aliento y amor no hubiese logrado alcanzar este objetivo:
a mi familia. Gracias a mis padres por su apoyo incondicional en cada día de mi vida, y
sobre todo gracias a mi esposo y a mis hijos, porque fueron ellos quienes vivieron
conmigo toda esta travesía. Gracias DY por comprender que mamá tenía que ir al lab.
Gracias mis amores (Ygo, Yggy, YH), ustedes hicieron posible este doctorado. ¡Los amo!
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iv
v
Congresos, simposios y foros académicos donde el trabajo fue presentado
1. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda, Vallejo Ruiz Verónica,
Reyes Leyva Julio y Santos López Gerardo. Estudio del interferón tipo III en la
infección por el virus del dengue. XXIX Congreso Nacional de Bioquímica del 11 al
17 de noviembre de 2012. Oaxaca, Oaxaca, México.
2. Palma Ocampo Helen Kenia. Efecto del interferón tipo III en la infección por el virus
del dengue. XVII Simposio Interno del Posgrado en Ciencias Químicas. 10 al 12 de
octubre de 2012. Puebla, Puebla, México.
3. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda, Vallejo Ruiz Verónica,
Reyes Leyva Julio y Santos López Gerardo. El interferón tipo III inhibe la replicación
del virus del dengue en células epiteliales. XX Foro Sur de Investigación en Salud.
IMSS. 12 al 14 de junio de 2013. Huasca de Ocampo, Hidalgo, México.
4. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda, Vallejo Ruiz Verónica,
Reyes Leyva Julio and Santos López Gerardo. Activation of type III interferon inhibits
dengue virus replication in an epithelial cells model. 5th European Congress of
Virology. Lyon Congress Center. 11-14 de septiembre de 2013. Lyon, Francia.
5. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda, Vallejo Ruiz Verónica,
Reyes Leyva Julio and Santos López Gerardo. Activation of type III interferon inhibits
dengue virus replication in an epithelial cells model. Virologie. Vol. 17. John Libbey
Eurotext. September 2013.
6. Santos López Gerardo, Palma Ocampo Helen Kenia, Vallejo Ruiz Verónica, Reyes
Leyva Julio Rosas y Rosas Murrieta Nora Hilda. Estudio de la respuesta del
interferón tipo III en células infectadas por el virus del dengue. Obtención del tercer
lugar modalidad cartel. Unidad de Congresos del Centro Médico Nacional Siglo XXI.
2 al 4 de octubre de 2013. Ciudad de México. México.
7. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda y Santos López Gerardo. El
interferón tipo III inhibe la replicación del virus del dengue en un modelo epitelial
vi
humano. XVIII Simposio Interno del Posgrado en Ciencias Químicas. 23 al 25 de
octubre de 2013. Puebla, Puebla, México.
8. Palma Ocampo Helen Kenia, Rosas Murrieta Nora Hilda, Vallejo Ruiz Verónica,
Reyes Leyva Julio and Santos López Gerardo. El interferón tipo III inhibe la
replicación del virus del dengue. XXII Foro Nacional de Salud de Investigación
Científica. IMSS. 5 al 8 de noviembre de 2013. Oaxtepec, Morelos, México.
9. Helen K. Palma-Ocampo, Juan C. flores-Alonso, Verónica Vallejo-Ruiz, Julio Reyes-
Leyva, Lilián Flores-Mendoza, Irma Herrera-Camacho, Nora H Rosas-Murrieta and
Gerardo Santos-López. Interferon lambda inhibits dengue virus replication in
epitelial cells. Virology Journal. 12:150. 2015
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RESUMEN
En las enfermedades virales, la infección es controlada en la célula por el interferón tipo I (IFN-
α), sin embargo, el virus del dengue (DENV) tiene la capacidad de inhibir esta respuesta. El
interferón tipo III, también conocido como interferón lambda (IFN-λ), es una vía
complementaria a la respuesta antiviral por IFN-α. Este trabajo analiza la respuesta antiviral
mediada por el IFN-λ contra la infección del virus del dengue serotipo 2.
Para estudiar la respuesta a IFN-λ durante la infección, se utilizó la línea celular C33-A,
en donde se demostró permisividad a la infección por DENV-2. El efecto de IFN-λ sobre la
replicación viral fue determinado en esta línea celular y en paralelo la expresión de genes
estimulados por interferón (ISGs) y los supresores de la señalización de citocinas (SOCS), los
cuales fueron medidos por PCR en tiempo real. Encontramos que IFN-λ inhibe la replicación de
DENV-2 de manera dosis dependiente in vitro, lo cual se ve asociado a la inducción de ISGs, ya
que la reducción del título viral corresponde al incremento de los niveles de ARNm de MXA,
OAS1 e IFN-λ1. La máxima inhibición ocurrió en su máximo pico de expresión. El aumento de
los reguladores negativos, SOCS1 y SOCS3, durante la infección de DENV-2 se vio asociada a la
disminución de la expresión de IFN-λ1. La infección y el tratamiento con IFN-λ1, inducen una
mayor expresión de receptor IL-28RA en membrana. Los resultados en la línea celular Vero,
muestran que el IFN-λ es capaz de inhibir la replicación del virus del dengue en ausencia
de IFN-α. La concentración de IFN-λ en sueros de paciente con fiebre por dengue fue
determinada por ELISA, encontrando un incremento en el IFN-λ serológico en pacientes con
fiebre comparado con a los donadores sanos y pacientes con dengue hemorrágico.
Los resultados de este trabajo sugieren que el IFN-λ es un buen candidato como
inhibidor de la replicación durante una infección con DENV. Los mecanismos moleculares y
celulares entre la infección por DENV e IFN-λ necesitan ser estudiados a más detalle, lo cual
podría proporcionar estrategias para el tratamiento de esta enfermedad. Además, estamos
reportando un nuevo modelo epitelial para el estudio de la infección por DENV in vitro.
viii
ABSTRACT
In viral diseases, infection is controlled in the cell by the type I interferon(IFN-α),
however, dengue virus (DENV) has the ability to inhibit this response. Type III interferon, also
known as lambda interferon (IFN-λ), is a complement to the antiviral response by IFN-α. This
paper analyzes the antiviral response mediated by IFN-λ against infection with dengue virus
serotype 2.
The C33-A cell line, where it showed permissiveness to infection with DENV-2 was used
to study the response to IFN-λ during infection. The effect of IFN-λ on viral replication was
determined in this cell line and in parallel the expression of interferon-stimulated genes (ISGs)
and suppressor of cytokine signaling (SOCS), which were measured by real-time PCR. We found
that IFN-λ inhibits replication of DENV-2 in a dose-dependent manner, which is associated with
the induction of ISGs, since the reduction in title corresponds to the increase of mRNA levels
of MXA, OAS1 and IFN-λ1. The maximum inhibition occurred at its maximum peak of
expression. Increased negative regulators, SOCS1 and SOCS3, during infection of DENV-2 was
associated with decreased expression of IFN-λ1. Infection and treatment with IFN-λ1, inducing
increased expression of IL-28RA receptor in membrane. Results in Vero cell line, show that IFN-
λ is able to inhibit replication of dengue virus in the absence of IFN-α. The concentration of
IFN-λ in sera from patients with dengue fever was determined by ELISA, finding an increase in
IFN-λ in patients with dengue fever compared to healthy donors and patients with dengue
hemorrhagic fever.
The results of this study suggest that the IFN-λ is a good candidate as an inhibitor of
replication during infection with DENV. The molecular and cellular mechanisms between DENV
infection and IFN-λ need to be studied further, which could provide strategies for the
treatment of this disease. In addition, we are reporting a new epithelial model for the study of
DENV infection in vitro
ix
CONTENIDO RESUMEN ................................................................................................................................................ vii
ABSTRACT ............................................................................................................................................... viii
ABREVIATURAS ........................................................................................................................................ xii
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1
Transmisión del virus del dengue ......................................................................................................... 1
Virus del dengue ................................................................................................................................... 2
Ciclo viral .............................................................................................................................................. 5
Epidemiología ..................................................................................................................................... 10
Cuadro clínico ..................................................................................................................................... 11
Inmunopatogénesis del dengue ......................................................................................................... 13
2. ANTECEDENTES ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 14
Participación de la respuesta inmunitaria en la infección por el virus del dengue. .......................... 14
La vía de activación del interferón: Vía Jak/STATs ............................................................................. 15
Regulación de la expresión de interferón .......................................................................................... 18
Evasión de la respuesta antiviral ........................................................................................................ 18
Vía del Interferón tipo III .................................................................................................................... 20
Tratamiento y vacuna contra el dengue ............................................................................................ 24
3. JUSTIFICACIÓN................................................................................................................................ 26
4. HIPÓTESIS ....................................................................................................................................... 26
5. OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 27
Objetivo general ................................................................................................................................. 27
Objetivos específicos .......................................................................................................................... 27
6. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................................. 28
Líneas celulares .................................................................................................................................. 28
Replicación viral ................................................................................................................................. 29
Titulación viral por placas líticas ........................................................................................................ 30
Infecciones virales .............................................................................................................................. 31
Protocolos de estimulación celular .................................................................................................... 32
Microscopía de fluorescencia............................................................................................................. 34
Inmunoelectrotransferencia .............................................................................................................. 34
Preparación de extractos celulares ................................................................................................ 35
x
Determinación de la concentración de proteínas .......................................................................... 35
Electroforesis .................................................................................................................................. 35
Electrotransferencia ....................................................................................................................... 36
Inmunorevelado ............................................................................................................................. 36
Densitometría..................................................................................................................................... 36
RT-PCR en punto final ........................................................................................................................ 37
PCR en tiempo real ............................................................................................................................. 38
Cuantificación de IFN-λ en suero de pacientes mediante ensayos de inmunoabsorción (ELISA) ..... 39
Curva estándar y controles ............................................................................................................ 40
Preparación de la placa .................................................................................................................. 40
Procedimiento del ensayo .............................................................................................................. 40
Muestras sanguíneas de pacientes con dengue ................................................................................ 40
Análisis estadístico ............................................................................................................................. 41
7. RESULTADOS .................................................................................................................................. 44
Replicación de virus del dengue ......................................................................................................... 44
Titulación de los sobrenadantes de cultivos infectados .................................................................... 44
Ensayos de permisividad a la infección en células C33-A .................................................................. 46
Expresión de los transcritos de IFN-tipo III (IFN-λ1, λ2 y λ3) en células C33-A .................................. 47
Producción de IFN-λ en células C33-A infectadas .............................................................................. 48
Expresión del receptor IL28R1 en células C33-A ................................................................................ 50
Determinación de la IC50 de IFN-α, IFN-λ1 e IFN-λ2 en la infección con DENV .................................. 52
Cinéticas de replicación viral .............................................................................................................. 54
Ensayo dosis-respuesta con aumento en tiempo de tratamiento con interferón ............................. 56
Inhibición de la replicación de DENV por IFN-λ1 en células Vero determinado por IC50 ................... 58
Cuantificación relativa del nivel de transcripción de los genes IFN-λ1, SOCS1, SOCS3, OAS1, MXA e
IFN-β durante el proceso de infección y tratamiento con IFN-λ1 ...................................................... 64
Ensayo control de inducción .......................................................................................................... 64
Cinética de expresión de ISGs durante el proceso de infección ........................................................ 65
Incremento de IFN-III en pacientes con dengue ................................................................................ 71
8. DISCUSIÓN ...................................................................................................................................... 74
Modelo de señalización por interferón tipo III en la infección por el virus del dengue .................... 79
9. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 84
10. PERSPECTIVAS ............................................................................................................................ 85
xi
11. ANEXOS ...................................................................................................................................... 86
Confirmación del virus del dengue y serotipo que se utilizó ............................................................. 87
Construcción del plásmido pJET1.2/Blunt DENV2 ............................................................................. 87
Validación de la PCR en tiempo real .................................................................................................. 89
12. REFERENCIAS .............................................................................................................................. 92
13. PRESENTACIÓN Y PUBLICACIÓN DE RESULTADOS ................................................................... 102
14. ESTANCIA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................................. 102
xii
ABREVIATURAS
ADE Potencialización mediada por anticuerpos (Antibody-Dependent
Enhancement)
DENV Virus del dengue
DH Dengue hemorrágico
FD Fiebre por dengue
GAS Sitio de señalización activado por interferón gamma
VHB Virus de hepatitis B
VHC Virus de hepatitis C
H Hora (s)
Hpi Horas post infección
Hpt Horas post tratamiento
IFN Interferón
IFNAR Receptor de interferón tipo I
IRF Factor de respuesta a IFN
ISG Genes estimulados por interferón
ISRE Elemento de respuesta estimulados por interferón
MOI Multiplicidad de infección
MXA Proteína Mx de unión a GTP inducible por interferón (MX1)
Ng nanogramos
Nm nanómetros
NS Proteína no estructural
OAS Oligoadenilatosintetasa
OMS Organización Mundial de la Salud
RE Retículo endoplasmático
xiii
STAT Transductor de señal y activador de la transcripción (del inglés “signal
transducer and activator of transcription”)
SCD Síndrome de choque por dengue
SOCS Supresor de la señalización de citocinas
TLR Receptor tipo Toll
TNF Factor de necrosis tumoral
UFP Unidad formadora de placas
UI Unidades Internacionales
1
1. INTRODUCCIÓN
El dengue representa un problema de salud pública en diferentes zonas de clima húmedo
tropical. Aproximadamente el 40% de la población mundial está en riesgo y más de 120 países
son considerados endémicos para la enfermedad y han sufrido brotes de dengue o de fiebre
hemorrágica por dengue (Figura 1).La incidencia anual de la enfermedad alcanza hasta 50
millones de casos por año, de los cuales 500 mil personas son hospitalizadas y mueren cerca
de 20 mil [1].
Las características clínicas y de laboratorio en pacientes con fiebre por dengue (FD)
incluyen fiebre, cefalea, dolor retroorbitario, mialgia, artralgia, náuseas, vómitos, dolor
abdominal, neutropenia, trombocitopenia y hepatomegalia [2, 3]. Cuando se presenta fiebre
hemorrágica los pacientes manifiestan alteraciones de la circulación sanguínea tales como
petequias-equimosis, hematomas, epistaxis, hematuria, trombocitopenia, tiempos de
coagulación prolongados y pueden presentar hemorragia [3]. En el síndrome de choque, que
es la forma más severa de la enfermedad, existen manifestaciones de fuga plasmática,
(taquicardia, vasoconstricción periférica, acumulación de líquidos con síndrome de
insuficiencia respiratoria aguda, derrame pleural, hemoconcentración), hemorragia grave y
afección orgánica grave, que puede llevar a la muerte del paciente [4].
Transmisión del virus del dengue
El principal vector que transmite el dengue es el mosquito Aedes aegypti, que se encuentra
principalmente en las zona intertropical, sin embargo, otro mosquito transmisor de la infección
es el Aedes albopictus, este mosquito posee una mayor termotolerancia a descensos de la
temperatura ambiental [5]. La transmisión del virus del dengue al humano inicia con una
picadura en la piel durante la alimentación del mosquito [6]. Después de la infección el virus
se encuentra en un periodo de incubación, en el que circula en la sangre periférica e infecta
diversos tipos de células. Posteriormente, si un nuevo mosquito pica a la persona enferma
2
durante el estado febril, éste puede infectarse y subsecuentemente transmitir el virus a otra
persona, manteniendo el ciclo de transmisión [2].
Virus del dengue
El virus del dengue (DENV) es un virus lítico que presenta cuatro serotipos (1, 2, 3 y 4), todos
ellos causantes de enfermedad. El virus del dengue pertenece al género Flavivirus dentro de
la familia Flaviviridae [5-7]. El virión maduro mide aproximadamente 50 nm de diámetro. Su
genoma está constituido por una molécula de ARN de cadena sencilla, de polaridad positiva
(ARN+) de alrededor de 11,000 nucleótidos, protegido en una cápside proteica con forma
icosaédrica, que a su vez está cubierta por una envoltura (Figura 2A). En esta membrana
existen dos proteínas importantes para el proceso de infección; la proteína de membrana (M)
y la de la envoltura (E) [8, 9].
Figura 1. Epidemiología del dengue. El dengue es una enfermedad viral transmitida por el mosquito hembra de las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus. La enfermedad está presente en unos 120 países del mundo, en el trópico y el subtrópico, pudiendo así afectar la salud de más de 2500 millones de personas [1].
3
Los genomas de los cuatro serotipos del virus comparten una similitud de cerca de 70%
[5]. Cada genoma codifica para una poliproteína de aproximadamente 3,400 aminoácidos, que
mediante un procesamiento postraduccional se generan 10 proteínas virales: tres proteínas
estructurales y 7 no estructurales (NS) en el siguiente orden: NH2-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-
NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH (Figura 2B) [10]. El extremo amino de pre membrana (prM),
envoltura (E), NS1 y NS4B es procesado por la peptidasa señal del hospedero (señalasa)
localizada en el lumen del retículo endoplásmico, mientras que el procesamiento de la mayoría
Figura 2. A) Estructura del virón de dengue. Se muestra el virión conformado por las proteínas estructurales, cápside (C), membrana (prM, M) y envoltura (E). B) Poliproteína viral y su topología en membrana. Representación esquemática de la topología de las proteínas y su escisión por proteasas del hospedero (flechas rojas y azules) o virales (fechas negras). El genoma del virus, de 11 kb, es traducido en una sola poliproteína que atraviesa la membrana del retículo endoplásmico en diferentes posiciones y procesada postraduccionalmente por una combinación de proteasas celulares (señalasa, furina) y virales. Las flechas muestran los lugares de escisión por las proteasas NS3/2B (negro), furina (cian) y señalasa (rojo). C) Estructura de la proteína prM. El péptido pr se muestra en color cian, DI en rojo, DII en amarillo, DIII en azul y el asa de fusión en verde [11].
4
de las proteínas no estructurales, así como del extremo C-terminal de la proteína C (C, core), s
llevada a cabo en el citoplasma de las células infectadas por la proteasa viral NS2B-3 [11, 12].
La escisión de la secuencia C-terminal de NS1 es llevada a cabo por una proteasa
desconocida presente en el retículo endoplásmico [13], mientras que la proteasa furina,
localizada en el aparato de Golgi, media la escisión de prM a M en la maduración del virión
[14].
Algunas proteínas NS están asociadas con mecanismos virales de evasión de la
respuesta inmunitaria [7, 15] como es el caso de NS2A, NS4A, NS4B y NS5 que inhiben la
estimulación del gen para IFN-β por interferencia con la función del factor de transcripción
STAT1 [16]
La estructura de los virus del dengue se ha determinado mediante microscopía
crioelectrónica y mapas de densidad electrónica de las estructuras proteicas conocidas [17]
con lo cual se ha logrado establecer la conformación de la proteína de la envoltura (E),
estudiada por sus propiedades antigénicas como un posible blanco de vacunas experimentales
y se ha encontrado que el grado y la posición de los glicanos (N-glicosilación) pueden afectar
sus propiedades antigénicas. Entre los Flavivirus, los residuos 67 y 153 se encuentran
conservados, siendo la glicosilación del residuo 153 única para DENV [17, 18]. La glicoproteína
de la envoltura (E) además de ser un sitio antigénico, constituye el sitio de unión del virus a la
célula blanco y participa en la fusión del virión con la membrana endosomal a pH ácido. La
proteína E, se compone de un ectodominio (soluble), una región principal (tallo) y un dominio
transmembranal. El ectodominio presenta tres dominios (DI, DII y DIII) que son principalmente
hojas β con un asa de fusión en el extremo distal de DII. El péptido pr está posicionado sobre
esta asa de fusión (Figura 2C). La proteína E puede cambiar a diferentes estados oligoméricos:
aparece como trímeros de heterodímeros prM-E en partículas inmaduras, como dímero en
virus maduro y como trímero cuando se fusiona a la célula hospedero [10].
5
El uso de la crio-microscopía electrónica a pH neutro ha permitido conocer que los
viriones tienen un diámetro de 600 Å donde la proteína E se encuentra dispuesta formando
dímeros con la prM, uniéndose entre ellas y formando espigas de heterotrímeros con 60
unidades organizadas para formar una cápside de simetría icosahédrica. En un virión inmaduro
existen heterodímeros de prM-E mientras que en un virión maduro existen 90 dímeros de
proteínas E y 180 proteínas M en la envoltura [10, 17]. La transformación de un virión
inmaduro a partículas maduras requiere de un rearreglo de las proteínas E y M [19]. La
glicoproteína prM consiste de 166 aminoácidos, es procesada por la proteasa celular furina en
el residuo 91 del extremo N-terminal “pr” durante la maduración (residuos 92-130), y la región
transmembranal del extremo C-terminal de M (péptido 131-166). El péptido pr protege a los
viriones inmaduros contra la fusión prematura con la membrana del hospedero [20, 21].
Ciclo viral
La entrada del virus del dengue a la célula blanco ocurre a través de dos mecanismos; en el
primero, la partícula viral utiliza como receptores múltiples proteínas transmembranales de
las células blanco, que tienen alta afinidad por la glicoproteína E, tales como los receptores de
alta afinidad a laminina, proteínas AXL y claudina 1 [22]. Estos receptores celulares pueden ser
compartidos por los diferentes serotipos del virus [23]. El segundo mecanismo descrito se
denomina mecanismo de amplificación de la infección viral dependiente de anticuerpos (ADE,
antibody-dependent enhancement) [24]. Para que se lleve a cabo la infección se necesita de
una o algunas moléculas que funcionen como receptores para el virus del dengue; entre las
que destacan, la proteína DC-SIGN, localizada en células dendríticas [25]. Se ha demostrado
que DC-SIGN es un receptor que facilita la captura y la endocitosis del virus del dengue [6]
(Figura 3).
Otros posibles receptores descritos incluyen las glicoproteínas de 45 kDa en células
C6/36, de 74 kDa en células Vero, de 43 kDa en línea de células endoteliales, así como las
proteína de choque térmico hsp70 y hsp90 de macrófagos humanos [26, 27], el CD14 y el
6
receptor de manosa [22]. También se ha sugerido la lectina tipo C humana CLEC5A como
receptor para DENV en macrófagos[28].
El establecimiento de la infección requiere de la entrada del virus del dengue a la célula,
vía de endocitosis mediada por receptor, seguido de la liberación de la nucleocápside, debido
a la fusión de la membrana viral la membrana endosomal, aunque hay reportes que mencionan
la entrada directa por fusión a la membrana plasmática [29-31] (Figura 4).
[32]
Los flavivirus contienen la más eficiente y rápida maquinaria de fusión de membrana
de todos los virus envueltos [33]. La proteína E de DENV media la entrada a la célula a través
Figura 3. Posibles receptores de entrada para el virus del dengue. Componentes de la superficie celular involucrados en el reconocimiento, adsorción, unión e internalización del virus: GAGs, receptor de manosa, DC-SIGN, HSP90/HSP70 y TIM/TAM, así como los receptores Fcϒ de
macrófagos, los cuales participan en la internalización del inmunocomplejo de DENV maduro o inmaduro, resultando en el fenómeno ADE. Se muestran los residuos de la proteína E responsables en la unión al receptor [24].
7
de funciones duales de la unión al receptor y fusión de membrana. Durante el ensamble y
maduración, E se asocia con prM, en un complejo heterodimérico que protege la proteólisis
de prM y la reorientación de la proteína E como homodímero. La fusión ocurre entre la
membrana viral y la membrana intracelular siguiendo un cambio conformacional que permite
a E la formación de 3 homotrímeros, un proceso disparado por el pH ácido del endosoma. El
proceso de fusión es promovido a través del péptido pr durante la fase inicial de la entrada
[34].
Figura 4. Ciclo de replicación viral. El virus del dengue infecta la célula hospedera vía endocitosis mediada por receptor, y siguiendo la acidificación de la vesícula y cambios conformacionales en las proteínas virales prM/M y E, el ARN viral es descubierto y liberado al citosol. El ARN viral migra al retículo endoplásmico donde ocurre su traducción, replicación y ensamble. Los viriones empaquetados son transportados al Golgi, donde son escindidos por procesos proteolíticos, lo que resulta en la maduración del virus. Posteriormente son exportados mediante el sistema secretor de la célula hospedera [28].
8
El pH bajo en el endosoma induce la trimerización de la proteína E y la exposición del
péptido pr que se encuentra oculto en la partícula viral madura. El péptido pr interactúa con
la membrana endosomal e inicia el efecto de fusión de la membrana viral con la membrana
endosomal. La presencia de colesterol en la membrana blanco facilita el proceso de fusión,
aunque no es indispensable [28]. Después de la internalización y la fusión de membranas, la
nucleocápside viral, es liberada en el citoplasma con lo cual se libera el genoma viral [35]
(Figura 4).
El genoma viral puede ser traducido en asociación con membranas derivadas del
retículo endoplásmico, esta localización asegura su replicación, traducción y
empaquetamiento de una manera eficiente. Durante la traducción, se produce una sola
proteína que es procesada co y postraduccionalmente por proteasas virales y del hospedero
para obtener las 3 proteínas estructurales y las 7 no estructurales de manera individual [19].
La replicación viral ocurre en estrecha asociación con membranas del retículo
endoplásmico. La mayoría de las proteínas virales no estructurales maduras intervienen en la
replicación del virus [36]. El paso inicial involucra la síntesis de novo de una cadena negativa
intermediaria usando la cadena positiva del genoma como molde. El resultado es una doble
cadena de ARN (ARNdc) intermediario. La forma replicativa, subsecuentemente sirve como
molde o intermediario replicativo para la síntesis de la cadena positiva, que es el ARN
genómico. Después, la síntesis de ARN es asimétrica y semi conservativa, lo cual resulta en la
producción predominante de cadena positiva contra la cadena negativa de ARN [37].
La infección con DENV induce alteraciones en la membranas intracelulares formando
paquetes de vesículas en el citosol o estructuras de membrana lisa, donde se acumula el
complejo de replicación viral y la inducción de la estructura de la membrana pueden servir a
manera de plataforma para el anclaje del complejo de replicación viral [38, 39].
Las regiones C-terminales de la proteína C, prM y E contienen aminoácidos hidrófobos
que sirven como secuencias señal para la inserción del resto de la proteína en la membrana
9
del retículo endoplásmico rugoso. Mientras que las proteínas no estructurales como la NS1
son cortadas por una proteasa viral; la NS2B y su cofactor la NS3 son cortadas por una
peptidasa señal del retículo endoplásmico rugoso [40].
En el extremo C-terminal de la proteína NS3 se encuentran tres actividades enzimáticas,
ARN trifosfatasa, nucleósido trifosfatasa y helicasa. NS3 forma un complejo con NS5 y ayuda
en la replicación viral a través del desenrollamiento del ARN y la desfosforilación previa a su
emparejamiento con el extremo 5’. Las proteínas NS restantes son liberadas por la serín
proteasa viral NS3 que requiere de NS2B como cofactor para la actividad catalítica [36]. Sin
embargo, las modificaciones postraduccionales de las proteínas NS4A-NS4B son mediadas por
la peptidasa señal de la célula hospedera[41].
La glicoproteína NS1 es esencial en la viabilidad viral. Esta proteína presenta dos sitios
conservados de N-glicosilación y 12 invariables residuos de cisteína [42]. NS1 está insertada en
el lumen del retículo endoplásmico y es procesada postraduccionalmente en el amino terminal
de la proteína, por la acción de una señalasa celular. La proteína NS2 es liberada del extremo
carboxilo terminal por una proteasa del retículo endoplásmico de la célula hospedera [43]. La
dimerización de la proteína es un pre requisito para su exporte por la vía secretora hacia la
membrana plasmática, donde se mantiene como único residente viral en la célula infectada.
La proteína NS1 es secretada como una proteína soluble y puede estar presente en forma
hexamérica, mostrando propiedades anfipáticas y comportándose como una proteína de
membrana cuando se disocia en dímeros [42]. El papel de NS1 en la replicación del virus es
desconocido pero se cree que facilita la infección viral y la patogénesis del DENV [44, 45].
Las pequeñas proteínas hidrófobas NS2A, NS4A y NS4B están menos caracterizadas, su
naturaleza hidrofóbica las asocia a la correcta localización de las proteínas virales y del ARN
viral durante la replicación y ensamblaje del virión, se cree que la formación de las estructuras
de la membrana citoplásmica inducida por DENV se deben a la disposición de la proteína NS4A
[39].
10
La proteína NS5 de alrededor de 103 kDa tiene tres grandes dominios funcionales, el
N-terminal de S-adenosil metionina metiltransferasa, las secuencias de localización nuclear y
la actividad de la ARN polimerasa viral dependiente de ARN (RdRp) en su dominio C-terminal.
La metiltransferasa abarca los residuos del aminoácido 1 al 239 y es responsable de las
metilaciones en el N-7 de la guanina y en el O-2’ de la ribosa necesarias para el arreglo del
genoma del DENV. La estructura del cap del ARN viral es reconocida por factores celulares
permitiendo el transporte de proteínas al núcleo. El dominio de la polimerasa RdRp de NS5
(residuos 273 a 900) es responsable de la síntesis de nuevos genomas de ARN viral [39].
Una vez armadas las nuevas partículas virales, la proteína prM es madurada a proteína
M en la red trans del Golgi por la proteasa celular furina [46]. No se sabe el papel que funge
la prM durante el ensamblaje viral, pero se le ha asociado con la protección de la
reorganización y la fusión anticipada de las proteínas E, puede ocurrir por la disminución de
pH durante el paso por la red trans del Golgi antes de ser liberadas al medio extracelular [17,
47, 48]. El proceso de ensamblaje del virus se inicia en el lumen del retículo endoplásmico [49]
con la asociación del ARN+ a las proteínas de la cápside para luego ser envueltas en una bicapa
lipídica [7] (Figura 4). La maduración de la partícula viral continúa en vesículas intracelulares,
con la unión de las proteínas prM y E. Por último, las vesículas transportadoras se fusionan con
la membrana plasmática de la célula hospedera, liberando los viriones maduros al espacio
extracelular [7].
Epidemiología
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), el dengue es una de las enfermedades
tropicales más importantes del siglo XXI. La emergencia del dengue en los últimos años del
siglo XX fue debida al alto crecimiento poblacional, la urbanización, los medios modernos de
transporte y la pérdida de la eficacia para controlar al mosquito vector, Aedes aegypti [50]. Las
agencias internacionales de salud pública han invertido poco en el control del dengue mientras
la enfermedad se esparce rápidamente en el mundo con una alta ocurrencia de epidemias
cada 2-5 años. Mientras que el dengue severo en sus dos cuadros clínicos, el dengue
11
hemorrágico y choque por dengue, se imponen como problema de salud pública, social y
económica comparado con otras enfermedades infecciosas importantes [51]. En países
industrializados el dengue había sido percibido como poco importante y recibía poca atención,
fondos para la investigación y control. Sin embargo, la presencia de algunos casos en estos
países, debido al cambio climático y expansión de las grandes urbes, han modificado esta
percepción de la enfermedad. El papel que juega el cambio climático en la propagación de
mosquitos, la circulación de diferentes serotipos del virus y su interacción de selección en la
prevalencia de un serotipo sobre otro, provoca el incremento dramático en la transmisión del
virus del dengue y la emergencia de casos severos de la enfermedad [51, 52].
Los cuatros serotipos del virus del dengue pueden encontrarse en todo el mundo, más
de 100 países son endémicos para esta enfermedad principalmente en las regiones
intertropicales. La OMS estima una incidencia anual de 100 millones de infecciones,
aproximadamente 500,000 casos son por dengue severo, y de ellos se produce alrededor de
12,000 muertes. Tan solo en los últimos años la incidencia se ha incrementado hasta 30 veces
con brotes significativos en 6 regiones de la OMS [53].
En el continente americano el dengue es la infección reemergente más importante. En
México los cuatro serotipos se consideran endémicos. Periódicamente se muestran
incrementos relativos en mortalidad por dengue severo y un marcado incremento en la
incidencia de casos en todo el territorio mexicano [54].
Cuadro clínico
La infección por cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue, puede manifestarse
con un cuadro clínico similar, que en la mayoría de los casos puede ser asintomático o puede
resultar en un amplio espectro de síntomas [55]. Los cuales van desde un cuadro clínico similar
al del resfriado (dengue sin señales de alarma o fiebre por dengue) hasta la forma más severa
de la enfermedad (dengue severo o dengue hemorrágico) que se caracteriza por
12
coagulopatías, incremento de la permeabilidad y la fragilidad vascular, lo cual puede progresar
a un cuadro hipovolémico (síndrome de choque por dengue) [56].
Por este diverso cuadro clínico de la enfermedad, la OMS proporcionó en el año 2009
una nueva clasificación en la que incluyen dos grupos: el dengue (sin signos de alarma) y el
dengue severo (con signos de alarma), en este último quedan agrupados las anteriores
categorías de dengue hemorrágico (DH) y síndrome de choque por dengue (SCD), esto con el
fin de disminuir falsos negativos en el diagnóstico entre DH y SCD [1].
La presentación clínica clásica de la infección por dengue es una enfermedad aguda que
dura alrededor de 4-7 días y se caracteriza por fiebre, escalofríos, erupciones eritematosas,
dolor de cabeza, dolor retro orbital severo y mialgias. En algunos casos puede presentarse
leucopenia, trombocitopenia y concentraciones elevadas de transaminasas. Estos síntomas y
signos se resuelven sin complicaciones en la mayoría de los casos [2, 57]. Sin embargo, algunas
hemorragias distintivas, erupciones cutáneas en extremidades, vómito severo, escape de
plasma y sangrados espontáneos pueden aparecer al final o en el transcurso de la enfermedad,
convirtiéndose en dengue severo. La fuga plasmática por permeabilidad vascular aumentada
resulta en una disminución del volumen de plasma en circulación, hemoconcentración, efusión
pleural y peritoneal y puede poner en riesgo la vida del paciente [50]. El síndrome de choque
por dengue es fatal, con una tasa de mortalidad alta mayor al 20%, pero que puede ser menor
al 1% en lugares con suficientes recursos y experiencia clínica. Los signos de alarma para el
síndrome de choque por dengue incluyen un rápido decremento del hematocrito, dolor
abdominal intenso, vómito persistente, choque profundo con presión arterial o pulso
indetectables [57, 58].
El diagnóstico clínico de dengue hemorrágico se basa en 4 principales manifestaciones
1) fiebre sostenida por 2 a 7 días, 2) tendencia a la hemorragia, prueba del torniquete positiva,
petequias o epistaxis, 3) trombocitopenia (<100 x 109/L) y 4) evidencia de fuga plasmática,
manifestada por hemoconcentración y derrame pleural [59].
13
El diagnóstico por laboratorio se realiza mediante el aislamiento del virus por cultivo,
PCR de muestra clínica como suero en fase febril temprana o por pruebas serológicas, como el
incremento en la prueba de inhibición de la hemaglutinación en suero de pacientes en etapa
aguda o convaleciente o a través de la prueba positiva a IgM/IgG específicas para dengue en
ensayos de inmunoabsorción (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) [60].
Inmunopatogénesis del dengue
La infección por uno de los serotipos de dengue resulta en la inmunidad específica para ese
serotipo, puede presentarse una respuesta de protección cruzada a otros serotipos sólo en los
primeros meses después de una infección [61]. Se piensa que la protección serotipo específica
es realizada por anticuerpos neutralizantes contra DENV y por células T de memoria [62].
Fundamental a cualquier discusión sobre la patogénesis de dengue es su asociación con
infecciones secundarias con un serotipo heterólogo con la producción de dengue severo [63]
aunque algunas veces la infección secundaria no causa dengue severo. El modelo de la
potenciación mediada por anticuerpos (antibody-dependent enhanced [ADE]) postula que
algunos anticuerpos específicos contra DENV de una infección previa pueden tener reacción
cruzada con otro serotipo sin neutralizar el virus y utilizando el receptor Fc de
monocitos/macrófagos incrementan el ingreso de partículas virales a las células blanco [64,
65]. La hipótesis del ADE postula que, anticuerpos no neutralizantes son en parte responsables
del aumento del riesgo de tener dengue severo en infecciones secundarias [66]. Esto propone
que el incremento en la infección de cepas de dengue que no son susceptibles a protección
inmune cruzada es potenciada o estimulada por el estado inmune preexistente en el
hospedero.
La inmunopatogénesis de DENV puede involucrar tanto anticuerpos en circulación de
infecciones previas como la respuesta por células T y B y el efecto de citocinas tanto en células
infectadas como en células inmunes, hepatocitos y células endoteliales. El modelo del “pecado
original antigénico” involucra la respuesta a células T, que refiere a la tendencia de utilizar la
14
memoria inmunitaria basada en una infección anterior cuando se encuentra una segunda
infección con otro serotipo diferente al de la primera infección. Esto deja al sistema
inmunitario “atrapado” por la primera respuesta que ha dado a cada antígeno, e incapaz de
montar respuestas eficaces durante las posteriores infecciones [67]. Sin embargo, sean o no
resultado del “pecado original antigénico”, las citocinas juegan un papel directo en la
inmunopatogénesis de DENV, específicamente por su efecto pro inflamatorio en células del
endotelio vascular. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), la citocina primaria implicada en
la patogénesis de dengue severo (DH/SCD), actúa de manera local para activar macrófagos,
pero su liberación sistémica puede ser responsable del aumento de la permeabilidad vascular
vista en DH/SCD [68]. Las proteínas de DENV pueden inducir la producción de TNF-α, así como
la proteína NS1 puede unirse a STAT3 e inducir la producción de TNF-α e IL-6, involucradas en
la inducción de fiebre y la producción de proteínas de fase aguda por el hígado. Además de la
producción de TNF-α se han implicado otras citocinas en la DH/SCD, las más comunes son IL-
6, IL-8 e IL-10. IL-10 es un inmunoregulador con un efecto pleiotrópico involucrado en el
proceso regular la respuesta inflamatoria limitando la producción de citocinas
proinflamatorias (IL-6, IL-12, IL-18 y TNF-α) y quimiocinas (IL-8) [69-71].
2. ANTECEDENTES ESPECÍFICOS
Participación de la respuesta inmunitaria en la infección por el virus del
dengue.
Un componente clave de la respuesta antiviral humana es la vía del interferón (IFN), que actúa
para inhibir la replicación del virus y para estimular la activación de células efectoras antivirales
[72]. La producción de IFN se inicia tras la detección inicial del virus por los receptores de
reconocimiento de patrones de patógenos, tales como receptores RIG-1 y los receptores tipo
“Toll” (TLR) TLR3, TLR7/8 y TLR9, los cuales reconocen patrones moleculares asociados a
patógenos como ARN de doble cadena y ARN de cadena sencilla con fosfato en 5´. Tanto MDA5
como RIG-1 activan la señalización de IFN-β mediante la activación de IPS-1 (activador del
15
promotor de IFN-β) en la membrana mitocondrial y activa al factor 3 asociado a TNF (TRAF3)
activando la cinasa de unión a TANK (TBK1) y a la cinasa inhibidora de NF-κβ (IKKα). TBK1 e
IKKα fosforilan los factores reguladores de la transcripción de interferón (IRF), el IRF3 y el IRF7,
los cuales se unen a promotores de genes que presenten elementos en respuesta a interferón
(ISRE), lo que resulta en la expresión del gen de interferón y en la de varios genes estimulados
por interferón (ISGs). El IFN se une a su receptor, que se encuentra en la misma célula o en
otras células y estimula la activación de la vía de señalización del interferón [72, 73] (Figura 5).
La vía de activación del interferón: Vía Jak/STATs
El receptor de interferón de tipo I (IFNAR) es un heterodímero compuesto por dos cadenas
(IFNAR1 e IFNAR2) [72, 73]. La unión de IFN estimula la heterodimerización del receptor y esto
desencadena la activación de las cinasas Janus Tyk2 y JAK1, que están en contacto con el
dominio citoplasmático de IFNAR [74-76]. Los residuos de tirosina fosforilados de IFNAR actúan
como sitio de acoplamiento para la unión de STAT2 [77], que a su vez es fosforilada por las
cinasas del receptor en el residuo Y-690 [78]. STAT2 activa y recluta a STAT1 [79-81], que
posteriormente es fosforilada en el residuo Y-701 [82]. La fosforilación de STAT1 permite tanto
su homodimerización como una heterodimerización con STAT2 u otras proteínas STATs (Figura
5). El heterodímero STAT1/STAT2 requiere de la unión de una tercera proteína, el IRF9, para
formar el factor trimérico de transcripción, ISGF3 [83-85]. ISGF3 se transporta al núcleo y se
une a secuencias ISREs (5’-TTCNNTTT-3’) [86], que se encuentran dentro de las regiones
promotoras río arriba de genes estimulados por IFN; además STAT1 puede estimular a los ISRE
a través de la interacción con el motivo TTT de la secuencia 5’-AGTTTCNNTTTCNC/T-3’
conservada de los promotores de ISGs tipo I/III [87].
La unión del factor de transcripción ISGF3 a promotores de genes en respuesta a
interferón tiene como resultado, la activación de éstos y el aumento de la expresión de más
de 100 proteínas diferentes que contribuyen a crear un estado antiviral en la célula [88-90].
16
Entre las principales proteínas efectoras de esta vía están las proteínas ISG15 (proteína
estimulada por interferón de 15kDa), la GTPasa MXA (resistencia a mixovirus-1), la proteín
cinasa R (PKR), y la ribonucleasa L (RNasaL) y la familia de la 2,5-oligoadenilato sintetasa (OAS)
[87].
17
Figura 5. Vía de transducción de señales del interferón tipo I y tipo III. Los ácidos nucleicos son reconocidos por TLRs transmembranales, sensores de ADN citoplásmicos y helicasa de ARN, permitiendo la activación de cinasas. Estas cinasas promueven la activación de otros factores de transcripción como NF-κB, IRF-3 e IRF-7 y su subsecuente transporte al núcleo donde estimulan la transcripción del gen de IFN. La expresión de los genes IFN-λ1 e IFN-β principalmente depende de IRF-3 y NF-κB. La expresión de IFN-λ2 e IFN-λ3, como IFN-α, depende más de la accesibilidad de IRF-7. El IFN-α utiliza un receptor dimérico compuesto por IFNAR1 e IFNAR2. El IFN-λ señaliza a través de un receptor diferente, compuesto por IL28R1 e IL10RB. Aunque se unen a su receptor específico, el IFN-α e IFN-λ inducen la misma vía de señalización, Jak/STAT: la fosforilación y activación del receptor asociados a Jak1 y Tyk2, permitiendo la fosforilación de los factores de transcripción STAT1 y STAT2. Las formas fosforiladas de STAT1 y STAT2 se asocian con IRF-9 para formar un complejo heterotrimérico denominado ISGF3 (factor 3 ISG), que se transporta al núcleo donde se une a secuencias que presentan elementos en respuesta a estímulos por interferón, presentes en los promotores de ISGs que sobreregulan su transcripción. Algunos productos ISGs participan por sí mismos en la señalización de vías que permiten incrementar la producción de IFN y su respuesta lo cual crea un círculo de retroalimentación positiva (y negativa). Dada la similitud de la vía del IFN-α e IFN-λ, se espera que IFN-λ influya en la producción y la respuesta a IFN-α/β, y viceversa [101].
18
Regulación de la expresión de interferón
La activación de la respuesta inmune innata mediada por interferón resulta en la inducción de
un programa proinflamatorio contra la infección de patógenos. Sin embargo, una respuesta
inflamatoria puede ser perjudicial para la célula, por lo que se encuentra controlada para evitar
efectos imunopatológicos. El control de la vía Jak/STAT está dado por la internalización y
degradación del receptor, mediante reguladores negativos activos, que incluyen a la tirosín
fosfatasas (SHP-1, fosfatasa 1-SHP), proteína inhibidora de STAT activada (PIAS) y los
supresores de la señalización de citocinas (SOCS).
La inducción de las proteínas SOCS se produce de una manera dependiente de STAT y
por tanto representan un mecanismo de inhibición por retroalimentación clásico en el que las
señales de citocina inducen la expresión de proteínas que amortiguan sus propias cascadas de
señalización [91] (Figura 6). La familia SOCS contiene ocho miembros (CIS y SOCS1 a SOCS7) y
estas proteínas utilizan dos mecanismos diferentes para regular de manera negativa las
señales de citocina. Por un lado, las proteínas SOCS interactúan con las JAK y dirigen estas
proteínas para la degradación por la vía ubicuitina-proteasoma [91]. De manera alternativa,
pueden actuar con los sitios de unión del dominio SH2 que se encuentran dentro de los bucles
de activación de los dominios de la JAK cinasa y bloquean de tal modo el acceso de las JAK a
sus sustratos. Las vías JAK-STAT también pueden ser reguladas por otros mecanismos como,
por ejemplo, el antagonismo de la actividad de JAK mediada por la proteína tirosinfosfatasa
[91, 92] (Figura 6).
Evasión de la respuesta antiviral
Las células infectadas con DENV han demostrado no responder de manera eficiente al
tratamiento con IFNα/β, indicando que la infección puede evitar la señalización por IFNα/β
[16, 93, 94].
19
Figura 6. Papel regulador de las proteínas SOCS. A) Supresión de las vías del receptor tipo Toll (TLR) y la interleucina 1 (IL-1) por los supresores de señalización de citosinas 1 (SOCS1) y SOCS3. La activación de TLR4 por lipopolisacárido, transmite a través de la proteína adaptadora del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88), proteína tipo MyD88 (MAL), la proteína con dominio TIR (Toll/receptor IL-1) inducible por IFN-β (TRIF) y la proteína relacionada a TRIF (TRAM). El factor nuclear кB (NF- кB) y la cinasas activadas por mitógenos (MAPKs) son activados por el factor de necrosis tumoral (TNF) asociado al factor 6 (TRAF6), transformando al factor de crecimiento β (TGF-β) activado por la cinasa 1 (TAK1) a través de MyD88 y MAL; mientras el IRF3 es activado por TRIF y TRAM. IFN-α o IFN-λ son rápidamente inducidos a través de la vía TRIF-IRF3 y activan la vía de señalización JAK-STAT1. La vía de señalización JAK2-STAT5 es activada por lipopolisacárido e IL-6. SOCS1 inhibe estas vías JAK-STATs. La interacción de MAL fosforilada con SOCS1, resulta en la poliubicuitinación de MAL y su subsecuente degradación. IL-1 activa TRAF6 y TAK1 a través de MyD88. SOCS3 inhibe la transcripción dependiente de NF-кB por la asociación entre TRAF6 y TAK1. B) Regulación de la señalización de TLR por SOCS3. SOCS3 es inducido por la señalización de TLR y suprime a STAT3 activada a través del receptor de IL-6, pero no por IL-10, debido a que SOCS3 no se une al IL-10R [85].
20
La señalización a través de IFNAR es mediada por la vía de señalización STAT1/STAT2 y es un
importante componente de la respuesta celular innata para responder a infecciones virales.
DENV ha desarrollado varios mecanismos para interferir con esta vía de señalización mediante
la inhibición de la fosforilación de STAT1, así como la degradación de STAT2. Las proteínas
NS2A, NS4A y NS4B se asocian con membranas celulares y se ha demostrado que inhiben la
fosforilación de STAT1 y su transporte nuclear [93]. La expresión de estas tres proteínas no
estructurales aumenta la replicación de virus sensibles a interferón en presencia de IFN-α/β
exógeno [93], por ejemplo, durante la infección por el virus de West Nile, el ARN subgenómico
se ha implicado en la evasión de la respuesta por IFN-α/β. Cuando el virus de West Nile es
deficiente en ARN subgenómico, es menos virulento comparado con el virus silvestre, este
fenotipo es rescatado cuando el virus mutante se replica en condiciones deficientes de IFN
[95], lo que sugiere que el ARN subgenómico juega un papel de modulación de la respuesta de
IFN-α/β durante la infección del flavivirus. DENV inhibe la señalización de IFN-α/β disparando
la degradación de STAT2, mediante la ubicuitinación y degradación vía proteasoma mediada
por su proteína NS5 [16].
Vía del Interferón tipo III
Se han identificado tres clases de interferón, designados como tipo I, tipo II y tipo III los cuales
son clasificados de acuerdo con el receptor específico a través del cual desencadenan su
señalización [96, 97]. El grupo de interferones de tipo I se componen de IFN-α, -β, -ω, -ε, y -κ,
los cuales señalizan a través del complejo receptor de IFN-α (IFNAR) [97]. El interferón tipo II
consiste en un solo tipo de molécula, el IFN-γ, es importante tanto para la inmunidad innata
como para la adquirida, ya que esta citocina juega un papel importante en la activación de
células NK (asesinas naturales) y los macrófagos [98].
21
En el año 2003, se describió un tercer tipo de interferón denominado interferón tipo III
o interferón lambda (λ, IFN-λ). Este interferón se descubrió mediante el uso de métodos de
bioinformática por dos grupos independientes [99, 100]. Se encontró que se asemejan al IFN-
α por ser inducidos por infecciones virales, estimulando la expresión de una gran cantidad de
genes que también son estimulados por los interferones α/β (ISGs), y que tienen actividad
antiviral en cultivo celular [99, 100]. En los seres humanos, el interferón tipo III o IFN-λ,
comprende un grupo de cuatro proteínas que han sido nombradas IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-λ3 e
IFN-λ4, codificadas por cuatro diferentes genes presentes en el cromosoma 19 [99, 101]. Estas
proteínas también son llamadas interleucinas (IL) 29, IL-28A e IL-28B para el caso de IFN-λ1,
IFN-λ2, IFN-λ3, respectivamente [100] y pertenecen a la súper familia de IL-10 [99].
Existe una alta homología entre los genes de IFN-λ, particularmente, el gen para IFN-λ3
es casi idéntico al de IFN-λ2, sus promotores son muy similares y comparten elementos
comunes con el promotor de IFN-λ1, sugiriendo que los 3 genes son regulados de manera
similar [102]. El IFN-λ4 es expresado por una pequeña fracción de la población, como
consecuencia del desplazamiento en el marco de lectura ocurrido en la secuencia codificadora
río arriba del gen ifn-λ3, presentando una identidad del 29% con IFN-λ3. Las actividades
biológicas de las citocinas se llevan a cabo a través de su vínculo con los receptores específicos,
que inducen actividades intracelulares a través de vías de transducción de señales. Los
interferones de tipo I (IFN-α/β) utilizan como receptor el complejo formado por IFNAR que
consiste en las subunidades IFNAR1 y 2, localizado de manera ubicua en la membrana de las
células [103]. Los interferones tipo III (IFN-λ) utilizan un receptor diferente, se trata del
receptor IL-28RA, compuesto por la cadena de IL-10R2, que se comparte con la IL-10 y otros
miembros de la súper familia IL-10 [96], y la cadena específica de IFN-λ, la subunidad IFN-λR1
[99, 100] (Figura 5). Este receptor pertenece a la familia de receptores de citocinas tipo II y
contiene un dominio de fibronectina tipo III [104]. Cuando el IFN-λ se une a la cadena IFN-λR1,
el complejo binario induce un rápido cambio conformacional que facilita el reclutamiento de
la segunda cadena IL-10R2 al complejo [105]. Una vez ensamblado, el complejo ternario las
tirosín cinasas Janus acopladas al receptor, Jak1 (subunidad IFN-λR1) y Tyk2 (subunidad IL-
22
10R2), median una transfosforilación en las cadenas del receptor, resultando en la fosforilación
de tres residuos del lado intracelular de la subunidad de IFN-λR1 (Tyr343, Tyr406 y Tyr517), lo
cual provee el sitio de acoplamiento y fosforilación de las proteínas STAT [99, 106]. La
señalización tanto por el receptor de IFN-α/β como del IFN-λ lleva a la formación del complejo
ISGF3 para la activación de promotores de ISGs [100, 107] en consecuencia las actividades
inducidas por IFN-α o IFN-λ son similares [106] (Figura 5).
En el gen que codifica para IL-28RA existen sitios de unión a NFκB, SF-1, WT1, p53, AP-
2, c-Jun, LyF-1 y STAT1 en diferente combinación a la encontrada en los promotores de los IFN-
λ, lo que indica que los IFN-λ y su receptor son regulados por diferentes mecanismos [108]. La
identificación de sitios de unión de STAT1 en el promotor de IL-28RA, propone que la activación
de IL-28RA regula su propia expresión, representando un mecanismo específico para amplificar
los efectos de los IFN-λ [109].
Se ha demostrado que muchos tipos celulares tienen la capacidad de expresar IFN-λ in
vitro, después de una infección viral, pero las células dendríticas plasmocitoides y
convencionales [110] expresan mayor cantidad en comparación a otros tipos celulares. Los
macrófagos, que expresan una gran cantidad de IFNα/β durante las infecciones, no son buenas
productoras de IFN-λ [111], y esto se debe a la distribución limitada del receptor IL-28RA. En
contraste con las similitudes funcionales entre los tipos de IFN-α e IFN-λ, la expresión del
receptor difiere entre estas dos familias. Considerando que el receptor IFNAR se expresa en
cualquier tipo celular, el IL-28RA sólo se expresa en algunos tipos celulares, hay ciertos tipos
celulares que no expresan el receptor y por consiguiente no responden a esta citocina. Se ha
visto que las células epiteliales, queratinocitos y células dendríticas son las que presentan
mayor expresión de IFN-λ [99, 100, 109]. Siendo que la respuesta celular al IFN-λ se limita a
una estrecha gama de tipos de células o tejidos [109, 111], podría ser mejor tolerado por el
organismo, porque sólo ciertos tejidos responderían a la administración exógena de la citocina,
evitando o disminuyendo los efectos colaterales observados con la administración de
interferones de tipo I cuyo receptor IFNAR se expresa de manera ubicua en los diferentes tipos
celulares.
23
Los interferones tipo III (IFN-λ) inducen actividad antiviral directa de manera muy
similar a los de tipo I, sin embrago la función inmunomoduladora de esta nueva clase de
citocinas no está bien establecida. Dada la naturaleza de los genes de IFN-λ de ser inducibles
por virus y el patrón redundante de expresión de IFN-α e IFN-λ, es probable que se induzcan
por un mecanismo común [102]. Los factores IRF 3 y 7 son factores de transcripción que
inducen la expresión de IFN-α. Los promotores de genes de IFN-λ comparten similitudes con
promotores de los genes de IFN-α [112, 113]. La unión de IRF3 e IRF7 al promotor de IFN-λ1
permite su inducción y la activación de IRF7 induce la producción de IFN-λ2 e IFN-λ3 [102, 113].
En los promotores de IFN-λ también existen sitios de unión a NFκB, Ap-1, SF-1, WT1, p53 y
varios sitios de unión a IRFs [108].
Diferentes estudios señalan que el IFN-λ tiene actividad antiviral en cultivo celular
contra varios virus [99, 100]. Reportando que el IFN-λ recombinante inhibe la replicación del
virus de herpes simple [114], del virus de la vacuna [115], del virus de influenza A [116], del
virus de la encefalomiocarditis y del virus de la estomatitis vesicular . También se ha
demostrado que el IFN-λ inhibe la replicación del virus de la hepatitis B y C [99, 100, 114].
Consistente con su actividad antiviral, IFN-λ induce la expresión de diversos biomarcadores de
la respuesta antiviral, incluyendo PKR, OAS, MX, ISG15, IFIT1, IFIT2, entre otros. Por otro lado,
se ha mostrado que la inducción de SOCS3, podría regular de manera negativa la señalización
por IFN-λ [117]. Además de su actividad antiviral y antiproliferativa, el IFN-λ ejerce efectos
inmunomoduladores que se superponen al IFN-α en la respuesta innata y adaptativa del
sistema inmunológico. Estas actividades incluyen el aumento de células NK y de células T
citotóxicas, la promoción de la respuesta Th1 [118], la sobreexpresión de moléculas MHC de
clase I en células tumorales para promover la presentación de antígenos [99, 100] y la
activación de la apoptosis [119], además de sobreregular la expresión de MHC clase I en las
células, facilitando el reconocimiento de antígenos y potencializando su destrucción. El IFN-λ
ha mostrado disminuir la producción de citocinas tipo Th2 (IL-4, IL-5, Il-13, IL-14, Il-15),
potencializar la respuesta Th1, incrementar las células T reguladoras y aumentar las células T
CD8. Las acciones inmunomoduladoras del IFN-λ son específicas del tipo celular, lo cual
24
depende de la distribución de su receptor, la naturaleza de la transducción de señales, y los
genes activados [120, 121]. Los IFN-λ son capaces de llevar a cabo su señalización a través de
las moléculas STAT1, STAT2, STAT3, STAT4 y STAT5. Algunos estudios muestran que el IFN-α
induce la expresión de genes del IFN-λ y que éste último puede inhibir la replicación del virus
de hepatitis C a través de transducción de señales y la regulación de genes estimulados por
interferón de una manera distinta a interferón tipo I [122, 123]. Se ha demostrado que ambas
citocinas inhiben la replicación del virus de hepatitis C, sin embargo, la cinética de activación
de las proteínas STATs y el potencial de los genes efectores inducidos difieren. Los ISGs
estimulados por IFN-α aumentan rápidamente dentro de los primeros 15 minutos después de
la unión a su receptor, pero comienzan a disminuir después de 12 h, mientras que los activados
por IFN-λ aumentan de manera gradual y se mantienen de forma prolongada después del
estímulo. Con el tiempo, la expresión de la mayoría de los genes inducidos por IFN-λ siguen
aumentando por 24 h, mientras que la expresión de los genes estimulados con IFN-α
disminuyen principalmente a las 24 h. El aumento continuo de inducción de ISGs se traduciría
en un efecto antiviral prolongado mediada por IFN-λ.
En 2010, investigadores de Zymogenetics (Bristol-Myers Squibb) realizaron estudios
clínicos fase II utilizando IFN-λ pegilado en pacientes con infección con VHC, mostrando una
eficaz acción antiviral y bajo perfil de efectos colaterales comparado con el tratamiento con
IFN-α. Así como evidencia de bioactividad a dosis bajas y alta biodisponibilidad en suero, y una
mayor actividad intrínseca a la mostrada en ensayos de efecto antiviral in vitro [124].
Tratamiento y vacuna contra el dengue
Recién se ha aprobado en nuestro país, la inmunización contra el dengue mediante la vacuna
Dengvaxia (Sanofi Pasteur) [125, 126], que ha mostrado una eficacia relativa (60.3%) de
manera global (Hadinegoro et al., 2015), sin embargo, habrá que esperar un año o dos para
evaluar la respuesta a la vacuna, y tomará varios años más antes de que se considere como
25
herramienta de prevención, clínicamente probada y demostrar ser eficaz como herramienta
de prevención de la enfermedad [127-129].
Para el virus del dengue, aún no se dispone de algún tratamiento antiviral, así que el
desarrollo de estrategias terapéuticas eficientes contra esta infección común y algunas veces
severa, es urgente. La actividad antiviral de los interferones se ha observado en diversos
estudios clínicos mostrando una relativa eficiencia contra diferentes infecciones virales.
Limonta Vidal et al., 1984 [130] administraron interferón leucocitario humano para el
tratamiento de niños con dengue, y demostró una disminución en el número de
complicaciones y muertes cuando el interferón fue aplicado [124, 131]. Sin embargo, el uso de
interferón para tratar el dengue, no es común, posiblemente debido a los efectos colaterales
por la administración de IFN-α asociados a su actividad sistémica. El IFN-λ es un interesante
tratamiento alternativo debido a que presenta una satisfactoria actividad antiviral con una
menor respuesta de efectos colaterales
26
3. JUSTIFICACIÓN
El virus del dengue es el agente causal de la enfermedad viral de mayor prevalencia transmitida
por un mosquito con una alta incidencia mundial, causando 500 mil hospitalizaciones anuales
y cerca de 20 mil muertes alrededor del mundo, debido a la falta de tratamiento específico y
la desregulación de la respuesta inmune antiviral que se presenta durante la enfermedad.
Puesto que el interferón IFN-λ se propone como un candidato prometedor como uso
terapéutico contra infecciones virales y por la capacidad que tiene de inhibir la replicación de
algunos virus, el presente trabajo se enfocó en estudiar si el IFN-λ tiene la capacidad de inhibir
la replicación del virus del dengue, así como en examinar las posibles vías involucradas en la
inhibición de la replicación viral.
4. HIPÓTESIS
La infección por el virus del dengue puede activar la expresión de los genes de interferón tipo
III (IFN-λ), activando genes efectores que promueven el establecimiento del estado antiviral
celular y en consecuencia inhibirán la replicación viral.
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5. OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar la activación de la vía del interferón tipo III y su posible papel inhibitorio durante
la infección por el virus del dengue.
Objetivos específicos
1. Establecer un modelo de estudio in vitro del interferón tipo III (IFN-λ) permisible a la
infección por el virus del dengue.
2. Determinar los niveles de transcripción de los genes de IFN-λ durante la infección por el
virus del dengue in vitro.
3. Evaluar el efecto del IFN-λ sobre la infección por el virus del dengue in vitro.
4. Analizar la activación de genes efectores de la vía del IFN-λ en células infectadas con el
virus del dengue.
5. Evaluar el efecto del interferón IFN-λ sobre la infección por el virus del dengue en un
modelo celular con la vía del IFN-α no funcional.
6. Determinar la concentración de IFN-λ en pacientes infectados por el virus del dengue.
28
6. MATERIAL Y MÉTODOS
Líneas celulares
Las diferentes líneas celulares que se utilizaron en la realización de este trabajo, se en enlistan
a continuación.
Línea celular epitelial humana C33-A (ATCC CRM-HTB-31), derivada de carcinoma de cérvix,
se cultivó en medio esencial mínimo modificado por Dulbelcco (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium, DMEM), adicionado con 5% de suero fetal bovino (SFB). El cultivo se realizó en una
atmósfera húmeda al 5% de CO2 y a 37 °C. Esta línea celular se utilizó en los ensayos de
infección con DENV y tratamiento con interferón lambda.
Línea celular C6/36 (ATCC CRL-1660), derivada de la larva del mosquito Aedes albopictus, se
cultivó en MEM (Minimum Eagle’s Medium) suplementado con 10% de SFB, 2 mM de L-
glutamina, 100 UI/ml penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 5 nM de NaHCO3. El
crecimiento se realizó a 27 °C. Las líneas celulares de mosquito son las más sensibles para el
aislamiento del virus del dengue. La línea celular C6/36 [132] es una clona obtenida de la línea
Aedes albopictus de Singh, que presenta una alta sensibilidad a los virus de dengue y
Chinkungunya. Algunas cepas de dengue son capaces de producir un efecto citopáticos de tipo
sincicial, aunque no es característico de la línea. En esta línea celular se replicó el virus del
dengue para obtener el inóculo utilizado en los experimentos.
Línea celular de fibroblastos de riñón de hámster neonato, BHK-21 [C-13] (ATCC: CCL-10), se
cultivó en MEM, adicionado con 5% de SFB, 2 mM de L-glutamina, 100 UI/ml penicilina
(GIBCO), 100 mg/ml de estreptomicina (GIBCO), 10 nM de NaHCO3. El crecimiento se realizó
en un ambiente húmedo a 37 °C y una presión de CO2 del 5%. Esta línea celular se utilizó en la
determinación del título viral mediante ensayos de placas líticas.
Línea celular U937 (ATCC CRL 1593.2), que corresponden a monocitos de linfoma histiocítico
de origen humano se replicaron como monocitos en suspensión, se cultivaron en medio RPMI
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1640 suplementado con 2 mM de glutamina, 100 UI/ml penicilina, 100 mg/ml de
estreptomicina, 10 nM de NaHCO3 y 10% de SFB. Las células se incubaron a 37 °C y CO2 al 5%.
Las células U937 se diferenciaron a macrófagos mediante el tratamiento con 10 ng/ml de PMA
(forbol, 12-miristato, 13 acetato) en medio RPMI al 5% SFB por 24 h. Después se lavaron con
PBS y se incubaron 24 h con RPMI al 10% para su posterior uso en la estandarización de la PCR
en tiempo real.
Células KG-1 (ATCC CCL-246), que corresponden a mieloblastos de leucemia mieloide humana
se replicaron como monocitos en suspensión, en medio de Iscove (IMDM) suplementado con
2 mM de glutamina, 100 UI/ml penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 20% de SFB. Las
células se incubaron a 37 °C y al 5% de CO2. Las células KG-1 se diferenciaron a células
adherentes (macrófagos) mediante el tratamiento con 10 ng/ml de PMA en medio IMDM al
10% SFB por 24 h. Después se lavaron con PBS y se incubaron 24 h con IMDM al 15% para su
posterior uso en la estandarización de la PCR en tiempo real.
Línea celular Vero (ATCC CCL81), células epiteliales de riñón de mono verde africano se
mantuvieron en medio DMEM, adicionado con 5% de SFB, 100 UI/ml penicilina y 100 mg/ml
de estreptomicina. El crecimiento de realizó a una atmósfera húmeda al 5% de CO2 y a 37 °C.
Ésta línea celular tiene una mutación genética que realiza la escisión del gen para el interferón
de tipo I (IFN-α) en ambos cromosomas [133] por lo que es deficiente en la producción de IFN-
α y se utilizó para ensayos de infección con DENV.
Replicación viral
La propagación viral se llevó a cabo mediante cultivo celular con el fin de obtener
sobrenadantes celulares con partículas infecciosas y ocuparlo en los ensayos de infección
planteados. La cepa del virus del dengue serotipo 2 (Thailand/16681/1984) fue donado por el
Dr. Álvaro Aguilar-Setién (Centro Médico Siglo XXI, IMSS, México). En los experimentos se usó
el mismo inóculo viral, obtenido por infección de células C6/36 en botellas de 25 cm2 con un
virus titulado a una dilución 1:5 en 1 ml de MEM sin SFB. Después de 2 h de incubación a 27
°C, las células se lavaron con amortiguador de fosfatos (PBS pH 7.4), a continuación, se
30
adicionaron 3 ml de MEM suplementado con SFB al 2% y se dejó transcurrir la infección por 72
h. Después de este tiempo las células y el sobrenadante se cosecharon por pipeteo y se lisaron
por acción mecánica, por pases sucesivos a través de agujas de diferentes calibres (24 y 22
Gauge). Los detritos celulares se eliminaron por centrifugación (3000 x rpm/10 minutos, 4 °C).
El sobrenadante se pasó por un filtro de 0.22 µm y el filtrado se mezcló con MEM al 20% de
SFB y antibiótico y fue congelado a -80 °C.
Titulación viral por placas líticas
Para preparar las infecciones celulares infectadas en los diferentes procedimientos realizados
en este trabajo fue necesario conocer la cantidad de virus con que se trabajaba, es decir el
“título" de la suspensión viral, el cual fue realizado por el método de plaqueo o titulación por
placas líticas. Este método consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo
del mismo en fase semisólida (agarosa). De esta manera, cuando un virus infecta una célula,
su progenie sólo puede migrar a las células inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que
el medio semisólido limita su movilidad. Coloreando las células se observarán zonas no teñidas
(placas de lisis), correspondientes a las células lisadas por la partícula infecciosa inoculada y las
nuevas partículas que ella produjo.
Los sobrenadantes virales obtenidos como producto de las infecciones celulares
realizadas, se titularon por el método de placas líticas usando células BHK-21. Las células BHK-
21 fueron sembradas en placas de 6 pozos (6 x 105 células/pozo) o de 12 pozos (3 x 105
células/pozo) en medio MEM con SFB al 5%, a una confluencia de aproximadamente 90%, las
células se lavaron con solución amortiguadora de sodio y fosfatos (PBS). Se hicieron diluciones
seriadas del sobrenadante viral obtenido (factor 10) con MEM sin suero y se adicionaron a los
pozos individuales con la monocapa celular y se incubaron para su adsorción a 37 °C por 1 h
en agitación cada 20 minutos. El inóculo se eliminó y se reemplazó por DMEM al 0.35% de
agarosa grado biología molecular. Una vez que la agarosa se solidificó, las placas se incubaron
por 72 h en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
31
Se procedió a la fijación de las células con ácido tricloroacético al 10% y tinción con
solución de cristal-violeta al 1% por 10 minutos, después de lo cual se lavó con agua corriente
y se dejó secar. Los sitios en donde hubo lisis celular por la infección viral se observan como
puntos sin teñir, los cuales son llamados placas líticas. Cada partícula infecciosa da origen a
una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). Para el
cálculo de las UFP, se contó el número de placas líticas en cada caja de Petri y tomando en
cuenta la dilución utilizada para calcular las unidades formadoras de placas/ml de acuerdo a la
siguiente fórmula:
Para que la infección viral sea eficiente se debe trabajar con determinada multiplicidad
de infección (MOI), que se define como la cantidad de virus inoculado por célula del cultivo
celular. La obtención de resultados reproducibles depende del control de todos los elementos
que intervienen en el ensayo, y la MOI es uno de ellos. En el presente trabajo, las infecciones
virales se trabajaron a diferente multiplicidad de infección (MOI 0.01, 0.1 y 1.0), por lo que los
sobrenadantes virales con los cuales se realizaba cada infección fueron titulados y diluidos
previamente antes de cada experimento según la MOI requerida.
Infecciones virales
las infecciones virales realizadas siguieron el mismo protocolo de infección, en las diferentes
líneas celulares que fueron infectadas con DENV, el cual consistió en sembrar las células en
placas de 12 (4 x 105 células/pozo) o 24 pozos (2 x 105 células/pozo), la monocapa fue infectada
a diferentes dosis infecciosas del virus (MOI 0.01, 0.1 y 1.0), realizando las diluciones
requeridas en 1 ml de medio DMEM sin SFB, el sobrenadante viral se dejó para su adsorción a
las células por 1 h y posteriormente el sobrenadante se retiró y las células se lavaron dos veces
para eliminar el virus residual. A continuación, se agregó medio DMEM nuevo con SFB al 2.5%
UFP/µl=
32
y se incubó el tiempo que requería el ensayo en particular, transcurrido el tiempo requerido,
se colectaron los sobrenadantes y fueron titulados por placas líticas.
Protocolos de estimulación celular
Para determinar el efecto del IFN-λ en las líneas celulares estudiadas, fue necesario realizar
diferentes tratamientos, con el fin de estimular la activación de los receptores que lleven a la
estimulación de ISGs y de esta manera determinar si el IFN-λ ejerce o no un efecto sobre la
replicación viral de DENV. Los diferentes tratamientos utilizados, se enlistan a continuación:
Tratamiento Dosis Tiempo con el tratamiento
Poly (I:C) (InvivoGen) 100 µg/ml 2 h
IFN-α (Probiomed) (100-500 UI/ml) 6 h
IFN-λ1 o IFN-λ2 (PeproTech) (10-50 ng/ml) 6 h
El ácido poliinosínico-policitidílico (poly (I: C)), fue utilizado como un control positivo
de inducción de interferón, ya que es un análogo sintético de ARN de doble cadena (ARNdc),
un patrón molecular asociado a la infección viral.
Para la evaluación del efecto con la estimulación de IFN-λ e IFN-α, al no contar con
unidades internacionales (UI/ml) establecidas para el IFN-λ, en este trabajo equiparamos 10
ng de IFN-λ con 100 UI/ml basándonos en la cantidad en nanogramos contenidos por UI de
IFN-α (220 ng de IFN-α en 2500 UI, Probiomed). Sin embargo, las comparaciones de las potencias
in vivo estimadas pueden variar según el modelo y los tiempos utilizados, entre 30 veces menor
a 10 veces mayor entre IFN-λ e IFN-α [134, 135] y la marca comercial del IFN utilizado.
Los protocolos de infección y tratamiento con interferón, fueron realizados de acuerdo
a los siguientes esquemas (Figura 7), en donde se muestra el tiempo de estimulación, infección
y la toma de sobrenadantes o células para la extracción de ARN de acuerdo al objetivo de cada
experimento.
33
Figura 7. Protocolos de infección y tratamiento con interferón
hpi= Horas post infección hpt= Horas post tratamiento
34
Microscopía de fluorescencia
Con la finalidad de corroborar la infección por el virus dengue, así como la presencia de los
receptores IFNAR e IL28RA en células C33-A y Vero, se cultivaron las células en portaobjetos
con cámaras de 6 pozos (Lab Tek, Nalgene-Nunc) e infectadas a una MOI de 0.1 con el
procedimiento de infección ya mencionado y se mantuvieron células sin infectar como control
negativo. Las células se lavaron con amortiguador de fosfatos (PBS) y fijaron con
etanol/acetona al 50% v/v por 10 min a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron
con Tritón X-100 al 0.2% por 2 minutos para la detección del virus del dengue y se incubaron
con anticuerpos (Tabla 1) que reconocen la proteína viral prM, IL28R1 o IFNAR1, se lavaron e
incubaron a temperatura ambiente por 1 h con anticuerpos secundarios acoplados a
fluorocromos para su detección. Los colorantes, SYBR-14 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)
y Hoechst 33258 (Santa Cruz Biotechnology, sc-391053) se utilizaron para teñir los núcleos. Las
células se analizaron en un microscopio con sistema confocal E600-C1 utilizando el programa
EZ-C1 (Nikon) y en un microscopio invertido Axio Observer Z-1 con sistema de epifluorescencia
y con el programa de imagen AxioVision SE64 (Zeiss).
En la línea celular C33-A se llevó a cabo la cuantificación del receptor IL28R1, mediante
el programa EZ-C1 (Nikon), mediante la cuantificación de 50 células tomadas aleatoriamente
de 10 campos diferentes de cada grupo evaluado: grupo control (mock), estimulado con IFN-
λ1 (35 ng) e infectado con DENV (MOI 0.1). El programa mide la intensidad de fluorescencia,
por lo que todas las fotografías tomadas se encontraban en la misma magnitud de
amplificación, estimuladas en un mismo voltaje y una misma área celular.
Inmunoelectrotransferencia
Con la finalidad de determinar la presencia de las citocinas IFN-λ1 e IFN-λ2 como producto de
la estimulación con interferón y la infección por dengue, se procedió a realizar una
inmunodetección en sobrenadantes de células tratadas o infectadas.
35
Preparación de extractos celulares
Las células C33-A cultivadas en placas p100 correspondientes a los grupos experimentales
(mock, infectada con DENV, tratada con IFN-λ1 e infectada con DENV), se lavaron con PBS pH
7.4 y se cosecharon con rastrillo de cultivo celular, se homogenizaron por pipeteo y se
centrifugaron a 2000 rpm por 10 minutos a 4 °C. La pastilla celular se lisó con el amortiguador
de lisis Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, Thermo Scientific), adicionado de un coctel
de inhibidores de proteasas (P8340; Sigma Aldrich; Thermo Scientific), según las indicaciones
del fabricante. Los homogenizados se centrifugaron a 14,000 rpm por 20 minutos a 4 °C y los
sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
Determinación de la concentración de proteínas
Para la cuantificación de las proteínas en los extractos celulares, se utilizó el método de
Bradford [136]. Alícuotas de los extractos obtenidos (10-20 µl) se diluyeron en 990 o 980 µL de
agua desionizada ultrapura a las cuales se les agregaron 200 µl del reactivo de Bradford. La
lectura de absorbancia de las muestras se realizó a una longitud de onda de 595 nm en el lector
multi-modal de microplacas Synergy2 (BioTek), analizado con el programa Gen5 (BioTek). La
absorbancia máxima del azul de Coomassie G-250 es de 470 nm en su forma libre y unido a
proteína es de 595 nm.
Electroforesis
Los extractos celulares se resuspendieron en el amortiguador de carga (SDS 1%, glicerol 15%,
β-mercaptoetanol 1%, fosfato de sodio 60 mM a pH 6.8) y se incubaron a 100 °C por 5 minutos.
En un gel de poliacrilamida al 12% se cargaron 30 µg por pozo de cada una de las muestras
contenidas en 20 µl de volumen final, así como un marcador de peso molecular preteñido
(Precision Plus Protein Dual Color, BioRad). Las proteínas se separaron por corrimiento en una
cámara de electroforesis (Hoefer, GE Healthcare) y un amortiguador de corrida (Tris-Glicina,
pH 8.3), a 100 Volts por 90 minutos.
36
Electrotransferencia
Una vez que concluyó el corrimiento electroforético, se realizó la transferencia de las proteínas
a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF, Merk Millipore), mediante transferencia
semi húmeda, utilizando un amortiguador de transferencia (tris-glicina-metanol) para
equilibrar el gel, membrana y papel filtro. La electrotransferencia se realizó a 30 mA y 24 Volts
por 45 minutos. Transcurrido el tiempo, la membrana se lavó con el amortiguador TBS (Tris-
NaCl pH 7.4) Tween 20 al 0.1% (v/v). La transferencia se corroboró mediante la tinción del gel
con azul de Coomassie y de la membrana con rojo de Ponceau.
Inmunorevelado
La membrana se bloqueó con leche baja en grasa al 5% y tween 20 al 0.2% en PBS por 1 h a
temperatura ambiente. Después recibió 5 lavados de 3 minutos con TBS/tween 20 al 0.1%. La
membrana se incubó con el anticuerpo primario para IFN-λ1, IFN-λ2 o β-actina (Abcam) (Tabla
1) diluido en TBST/ leche baja en grasa al 5% por 18 h a 4 °C. Se lavaron 3 veces con TBS/Tween
20 y se incubó con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano (HRP, Santa
Cruz Biotech) por 2 h. Las bandas reconocidas por los anticuerpos se visualizaron utilizando el
sistema de quimioluminiscencia ECL (EMD Millipore Immobilon Western Chemiluminescent
HRP Substrate, Merck Millipore), detectado mediante película fotográfica en un casete de
revelado. En todos los casos el peso molecular aparente fue estimado utilizando un estándar
de proteínas (Precision Plus Protein Dual Color, BioRad). La proteína β-actina se utilizó como
control de carga.
Densitometría
Las placas fotográficas reveladas y las fotos de los productos de PCR en gel de agarosa se
capturaron en escáner y se analizaron en el programa computacional ImageJ [137] para
determinar la intensidad de las bandas presentes. La densidad óptica de las muestras de los
grupos de estudio (control, DENV e IFN/DENV) se normalizaron con el correspondiente gen
endógeno β-actina o HPRT, según el caso. Con los datos obtenidos se realizó una gráfica que
representa la densidad óptica relativa de la expresión de las citocinas o ARNm de IFN-λ1, IFN-
λ2 e IFN-λ3 en los grupos de estudio.
37
Tabla 1. Anticuerpos utilizados
Anticuerpo
primario Descripción Anticuerpo secundario
Proteína viral
prM (ab41473)
Anticuerpo monoclonal de ratón [DM1] que
reacciona con la glicoproteína pre-membrana de
dengue virus 1,2,3 y 4.
Anti-ratón IgG-Rojo
Texas (ab6726)
Anti-IL28R
(sc-66541)
Anticuerpo policlonal de cabra contra una región
interna de la cadena α de IL28R humano
Anticuerpo anti cabra
IgG-CFL-647 (sc-362284)
IFN-α/BRα
(sc-7391)
Anticuerpo monoclonal de ratón contra los
aminoácidos 458-557 del C-terminal de la cadena α
de IFNAR humano.
Anticuerpo anti-ratón
IgG-CFL-488 (sc-362259)
IL-29 (C-19) (sc
67642)
Anticuerpo policlonal de cabra que reconoce el C-
terminal de IL-29 (IFN-λ1) humano.
Anticuerpo anti-cabra
IgG-HRP (sc-2354)
RbpAb IL28A
(ab 109820)
Anticuerpo policlonal de conejo contra IL28A (IFN-
λ2)
Anticuerpo anti conejo
IgG-HRP (ab 6721)
Anti-beta actina
(ab 119716)
Anticuerpo policlonal de conejo contra beta actina Anticuerpo anti conejo
IgG-HRP (ab 6721)
ab, Abcam. sc, Santa Cruz Biotechnology.
RT-PCR en punto final
Para determinar si la línea celular C33-A expresa IFN-λ bajo la infección con dengue, se
evaluaron los transcritos de IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3, mediante PCR en células control (mock) y
células infectadas con el virus de dengue. También se evaluó como control positivo de
inducción, células tratadas con IFN-λ.
La RT-PCR de punto final se realizó en dos pasos, primero se sintetizó el ADN
complementario (ADNc) y posteriormente se llevó a cabo la amplificación por PCR. Las
38
muestras de ARN obtenidas de las células de cada grupo analizado se obtuvieron con Trizol
(Invitrogen), de acuerdo con el instructivo del fabricante y se trató con 1 UI/µg DNasa I
(Promega), cuantificándose en un espectrofotómetro. El ADNc se obtuvo utilizando iniciadores
(hexámeros) de secuencia aleatoria y mediante el sistema comercial RevertAid H Minus
Reverse Transcriptase (Fermentas Thermo Scientific). El programa fue: 25 °C por 10 min, 42 °C
por 60 min y 70 °C por 10 min. La PCR se llevó a cabo utilizando iniciadores específicos para
IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-λ3 y HPRT (Tabla 2). Se utilizó el siguiente programa: 40 ciclos de 94 °C por
30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 30 s y 72 °C por 5 min.
PCR en tiempo real
Con el fin de analizar los transcritos de genes en respuesta a interferón (MXA, OAS1, IFN-β e
IFN-λ1) y genes reguladores de la vía de interferón (SOCS1 y SOCS3), en células bajo diferentes
estímulos y a diferentes horas después de éstos, se recurrió a la técnica de PCR en tiempo real,
mediante la cual se analizó el aumento de la transcripción de estos genes, normalizando con
el gen constitutivo HPRT y RNasaP. Los grupos evaluados fueron:
Grupo 1: células control (mock), las cuales son células C33-A sin ningún tratamiento, ni
infección.
Grupo 2: células tratadas con IFN-λ1 (IFN-λ1), células C33-A tratadas con IFN-λ1 (10 ng) por 6
h, posteriormente fue retirado el estímulo, se agregó medio nuevo y se tomaron las células
para su extracción de ARN total en 6 tiempos dentro de las 48 h post tratamiento (hpt),
correspondiente a las 0, 6, 12 18, 24 y 48 hpt.
Grupo 3: célula infectadas con DENV (DENV), células C33-A infectadas con el virus de dengue
a una MOI de 0.1, se retiró la infección y se tomaron las células para su extracción de ARN total
en 6 tiempos dentro de las 48 h post infección (hpi), correspondiente a las 0, 6, 12 18, 24 y 48
hpi.
Grupo 4: células tratadas con IFN-λ1 (10 ng) por 6 h, posteriormente fueron infectadas con
DENV (IFN-λ1/DENV), se retiró la infección y se tomaron las células para su extracción de ARN
total en 6 tiempos dentro de las 48 hpi, correspondiente a las 0, 6, 12 18, 24 y 48 hpi.
39
El ARN total se extrajo con Trizol como ya se mencionó. La transcripción inversa se realizó
usando oligonucleótidos aleatorios y el sistema RevertAid H Minus Reverse Transcriptase kit
como ya se describió. El ADNc obtenido se utilizó para amplificar los genes IFN-λ1, OAS1, MXA
utilizando el sistema Taqman universal PCR Master Mix no UNG (Applied Biosystem) y los
genes SOCS1 y SOCS3 utilizando el sistema SYBR Green/ROX gene Expression Assay kit (Thermo
Scientific). La mezcla de reacción fue: 5 µl de Master Mix, 200 nM de oligonucleótidos sentido
y antisentido, 200 nM de sonda marcada y 35-50 ng de ADNc en un volumen final de 10 µl. Se
realizaron 40 ciclos de acuerdo con el siguiente programa: 50 °C por 2 min, 94 °C por 10 min,
95 °C por 15 s, 60 °C por 30 s y 72 °C por 30 s, en un equipo StepOne Real-Time PCR System
(Applied Biosystems).
La cuantificación se realizó comparando los valores de CT de los genes analizados por
el método 2-ΔΔCT, que consiste en calcular el ΔΔCT, que es la diferencia entre el ΔCT de los grupos
a analizar (ΔCT gen problema - ΔCT gen endógeno) y hacer la operación matemática 2-ΔΔCT [138,
139]. El cambio relativo de número de veces de incremento en la expresión de genes se calculó
con respecto a las células control no infectadas (mock) y normalizadas con el gen HPRT. Los
oligonucleótidos y sondas utilizadas se muestran en la Tabla 2. Los oligonucleótidos iniciadores
para los genes celulares específicos se diseñaron en línea con el programa Probefinder
(http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp) de Universal probe Library (UPL) del centro de
diseño (Roche). Para el caso de los genes SOCS y los IFN-λs se realizó la corroboración de los
productos de RT-PCR mediante una curva de disociación y corrimiento en gel de agarosa para
asegurar un solo amplicón a diferentes Tm para cada transcrito amplificado y la no existencia
de productos inespecíficos.
Cuantificación de IFN-λ en suero de pacientes mediante ensayos de
inmunoabsorción (ELISA)
Para detectar la presencia de IFN-λ durante la infección por dengue in vivo, con el fin de
encontrar indicativos del comportamiento en la expresión de IFN-λ durante el transcurso de la
enfermedad por dengue, se evaluó por medio de ensayo de inmunoabsorción (ELISA, enzyme-
40
linked immunosorbent assay) la expresión de las citocinas IFN-λ 1 e IFN-λ3 en sueros de
pacientes
La concentración de IFN-λ en sueros de pacientes se midió utilizando un sistema comercial
específico para la determinación de IFN-λ1 e IFN-λ3 por ELISA en microplaca (DY1598B, R&D
Systems,).
Curva estándar y controles
Preparación de la placa
El anticuerpo de captura se diluyó a la concentración de 1.0 μg/ml en PBS. Inmediatamente se
recubrió una placa para inmunoensayo con por pocillo y se incubó a temperatura ambiente
por toda la noche. Después se lavó la placa y se procedió a bloquearla mediante la adición de
de reactivo diluyente a cada pocillo, incubando a temperatura ambiente por una hora y
posterior lavado.
Procedimiento del ensayo
ñadió 100 de suero en reactivo diluyente incubando por 2 h a temperatura ambiente.
Posteriormente se lavó la placa y se añadió 100 del anticuerpo de detección. Se llevó la
incubación por 2 h a temperatura ambiente y se lavó la placa, para finalmente revelarla
mediante estreptavidina-HRP y solución de sustrato. densidad óptica se determinó utilizando
un lector de microplacas ajustado a 450 nm corrección de longitud de onda a 540 nm y 570
nm.
Muestras sanguíneas de pacientes con dengue
Las muestras sanguíneas de pacientes con dengue fueron colectadas de junio a septiembre de
2013, tratadas para separar el paquete celular del suero. El suero fue utilizado para determinar
la presencia de IFN-λ. Todos los sueros fueron mantenidos a -70 °C, descongelados en hielo e
inmediatamente utilizados en el ELISA. Las muestras sanguíneas fueron de pacientes
infectados con dengue atendidos en el Hospital General de Zona No. 5 del IMSS, ubicado en
Metepec, Puebla. Todos los pacientes presentaban características clínicas de la enfermedad, y
41
la infección fue confirmada por anticuerpos IgM y por detección del antígeno viral NS1. Las
muestras de los pacientes incluidos en el estudio fueron obtenidas entre los días 3 y 5 del inicio
del episodio febril. El muestreo y el consentimiento informado fue realizado siguiendo las
regulaciones éticas aprobadas por el Comité de Ética en Investigación en Salud #2101, IMSS
(protocolo R.2011-2101-24) y en acuerdo con la Declaración de Helsinki. El consentimiento
informado fue obtenido de cada participante. Los controles tomados como valores de
referencia, fueron muestras de donadores de sangre sanos, sometidos a estudios
convencionales en el banco de sangre del hospital, y utilizados para comparar la concentración
de IFN-λ.
Análisis estadístico
El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante ANOVA de dos vías y prueba de
Bonferroni, empleando el programa Graphpad Prism 5(GraphPad Software). Diferencias con
una p<0.05 se consideraron estadísticamente significativas.
42
TABLA 2. Oligonucleótidos utilizados en la amplificación de los ISGs y SOCS analizados en este estudio.
Gen
No. Acceso
NCBI
Oligo-
nucleótido Secuencia (5' - 3')
Secuencia UPL
(UPL#) a
Amplicón
pb
Posición b
MXA
NM_00114492
5.2
MXA Fw TCCAGCCACCATTC
CAAG TTCTCCTG (2) 60
868-885
MXA Rv CAACAAGTTAAATG
GTATCACAGAGC 927-902
OAS1
XM_00671943
4.1
Oas1 Fw GGTGGAGTTCGAT
GTGCTG CCAGGGCA
(37) 64
538-556
Oas1 Rv AGGTTTATAGCCGC
CAGTCA 601-582
IFN-β
NM_002176.2
IFN-b Fw CTTTGCTATTTTCAG
ACAAGATTCA CTGGCTGG
(20) 69
336-360
IFN-b Rv GCCAGGAGGTTCTC
AAGAAT 404-389
IFN-λ1
NM_172140.1
IFN-λ1 Fw TCCTAGACCAGCCC
CTTCA
C 73
435-453
IFN-λ1 Rv GTGGGCTGAGGCT
GGATA 507-490
IFN-λ2
NM_172138.1
IFN-λ2 Fw CCTGGTGGACGTCT
TGGA
C 84
406-423
IFN-λ2 Rv GTGGGCTGAGGCT
GGATA 489-472
IFN-λ3
NM_172139.2
IFN-λ3 Fw AGGGCCAAAGATG
CCTTAG
C 123
167-185
IFN-λ3 Rv CAGCTCAGCCTCCA
AAGC 298-281
aUPL: Universal Probe Library, Roche Life Science. Número de sonda utilizada entre paréntesis. bPosición del oligonucleótido en la secuencia del gen correspondiente. cFue utilizado el fluorocromo SybrGreen.
43
Continuación Tabla 2.
dPosición específica del gen y la secuencia de los oligonucleótidos y la sonda no se encuentran disponibles por
Applied Biosystems.
Gen
No. Acceso
NCBI
Oligo-
nucleótido Secuencia (5' - 3')
Secuencia UPL
(UPL#) a
Amplicón
pb
Posición b
SOCS-1
NM_003745.1
SOCS1 Fw CACGCACTTCCGCA
CATTCC
C 300
310-329
SOCS1 Rv TCCAGCAGCTCGAA
GAGGCA 609-590
SOCS-3
NM_003955.4
SOCS3 Fw ACAATCTGCCTCAA
TCACTCTG
C 129
2526-2547
SOCS3 Rv TTGACTTGGATTGG
GATTTTG 2654-2634
RNasa P
AK_296196.1
RNasaP Fw AGATTTGGACCTGC
GAGCG
C 64
50-68
RNasaP Rv GAGCGGCGGCTGT
CTCCACAAGT 113-91
HPRT1
NM_000194.2d HPRT1
Applied Biosystem
Catálogo # 4331182 127 d
44
7. RESULTADOS
Replicación de virus del dengue
Para la realización de los ensayos de infección que se realizarían en este trabajo, era necesaria
la obtención de un inóculo viral, para lo cual el virus del dengue serotipo 2, se replicó en la
línea celular de mosquito C6/36. Una vez realizada la infección, el cultivo se monitoreó por
microscopía de contraste de fases para determinar la presencia de efecto citopático causado
por la infección viral, el cual se manifiesta por cambios en la morfología celular tales como
vacuolización, incremento de citoplasma, desprendimiento celular y formación de sincicios
[140]. Este efecto citopático se observó en el cultivo después de 48 h post infección el cual se
puede observar en la Figura 8.
Titulación de los sobrenadantes de cultivos infectados
Para determinar el título viral de los sobrenadantes virales obtenidos de la replicación del virus
de dengue en la línea celular C6/36, se realizaron ensayos de placas líticas en la línea celular
BHK-21, con el fin de conocer la cantidad de partículas virales (MOI) y el potencial infeccioso
Figura 8. Infección de células C6/36 por el virus del dengue serotipo 2. A) Células control no infectadas, B) Células a 48 horas post infección (hpi), C) Células a 48 hpi, se observa sincicio prominente.
45
de éstas. Obteniendo un título viral de 2.2 x 106 UFP/µl, lo que significa que hubo replicación
viral, liberación de la progenie y partículas virales maduras capaces de infectar.
El sobrenadante obtenido fue alicuotado y congelado a -70 °C. Debido a que puede disminuir
el título viral por su almacenamiento y manejo, en cada ensayo fue preciso determinar
nuevamente el título viral de las alícuotas a trabajar, obteniendo títulos virales entre 2.2 x 106
UFP/µl a 1.8 x 105 UFP/µl (Figura 9).
Figura 9. Formación de placas líticas en células BHK-21. Se muestra el procedimiento de infección y el ensayo de titulación viral por el método de placas líticas, en donde se ve una disminución de éstas según la dilución del sobrenadante viral utilizada.
46
Ensayos de permisividad a la infección en células C33-A
La línea celular C33-A ha sido utilizada en diversos experimentos dentro de nuestro grupo de
investigación, resultando ser un buen modelo de estudio [141-146], debido a su fácil manejo
y por ser negativas a genoma viral incorporado [147]. Hasta el momento, no habían sido
reportadas como permisivas a la infección por el virus del dengue, por lo que realizamos
ensayos de infección en esta línea celular y mediante los ensayos de titulación por placa lítica,
determinamos la presencia de partículas infecciosas en el sobrenadante de las células
infectadas que sumada a la detección de la partícula viral por medio de inmunofluorescencia
dirigida a la proteína prM, determinamos que la línea celular C33-A es permisible a la infección
por DENV y libera una progenie madura.
La monocapa de células C33-A se infectó con una MOI= 0.1, se dejó la adsorción por 1
h, posteriormente las células se lavaron con PBS y se añadió medio de cultivo (DMEM) fresco;
48 h posteriores a la infección, se obtuvo el sobrenadante viral y se tituló por placas líticas,
obteniendo un título viral de 1.1 x 105 UFP/µl. La replicación viral fue considerada eficiente, al
obtener un título viral muy cercano al obtenido en la línea celular de mosquito C6/36 (1.8 x
105 UFP/µl), indicando ser sensible a la infección y que la progenie viral liberada es infectiva.
Para confirmar la infección por DENV2 en las células C33-A, se realizó una
inmunofluorescencia, mediante un anticuerpo dirigido a la proteína prM del virus, el cual fue
revelado mediante el anticuerpo secundario marcado con el fluorocromo rojo Texas. En la
figura 10 se observa en rojo la presencia de la proteína prM en células infectadas (18 hpi),
alrededor del núcleo, probablemente en retículo endoplásmico, como ha sido reportado
previamente [17, 148]; en las células no infectadas, no se identifica florescencia.
La línea celular C33-A es permisible a la infección, mostrando que el virus del dengue
es capaz de ingresar y replicarse en la célula y liberar al sobrenadante una nueva progenie viral
infectiva.
47
Expresión de los transcritos de IFN-tipo III (IFN-λ1, λ2 y λ3) en células C33-A
Con el objetivo de determinar si la línea celular C33-A puede producir los genes de IFN-λ bajo
la infección con el virus del dengue, se llevó a cabo la determinación de los transcritos de IFN-
λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3, mediante RT-PCR de punto final, a partir de 400 ng de ARN total. Los grupos
evaluados fueron: grupo control negativo (mock), el cual no tenía algún tratamiento; un grupo
control positivo, el cual fue estimulado con IFN-α (tratamiento con 2000 UI/ml por 4 h); un
grupo estimulado con poly (I:C), el cual sirvió como control de estimulación, y el grupo
Figura 10. Permisividad de células C33-A a la infección por DENV-2. Las células fueron infectadas con virus del dengue (MOI= 0.1) por 2 h, mantenidas por 24 h y posteriormente lavadas y fijadas con metanol-acetona. El virus se detectó con anticuerpos contra la proteína viral prM y el anticuerpo secundario conjugado a rojo Texas. A-C) Células infectadas. D-F) Células control (mock). A, D) Contraste de fases. B, E) Fluorescencia. C, F) Imagen integrada. Barras= 30 µm.
48
problema, el cual fueron células infectadas con el virus del dengue a una MOI=1.0 (48 hpi)
(Figura 11-B).
La línea celular C33-A de manera convencional no produce IFN-λ, como se observa en
la figura 11-A, para que esto ocurra es necesaria la estimulación apropiada. Con estos datos
se concluye que la infección por el virus del dengue en células C33-A induce la expresión de
IFN-λ (Figura 11-B).
Producción de IFN-λ en células C33-A infectadas
Una vez determinados los transcritos de los genes de IFN-λ, fue preciso comprobar la presencia
en su forma proteica. Para lo cual se realizó por inmunoelectrotransferencia dirigida a las
proteínas IFN-λ1 e IFN-λ2, encontrando la presencia de las citocinas en las células que fueron
tratadas para su estimulación con interferón.
Los grupos evaluados fueron: control negativo, (mock, sin ningún tratamiento); un
grupo estimulado con IFN-λ1 (35 ng/ml), el grupo infectado con DENV a una MOI= 0.1 (48 hpi)
y un grupo tratado con IFN-λ1 (35 ng/ml) y posteriormente infectado con DENV (MOI= 0.1). Ya
que en anteriores ensayos se había visto que el IFN-α induce los transcritos de IFN-λ, ahora se
analizó si el IFN-λ exógeno también tenía dicho efecto. Puesto que el objetivo del trabajo es
determinar si el tratamiento con IFN-λ actúa sobre el virus del dengue, se incluyó un grupo en
el cual se administró previo a la infección con DENV, un tratamiento por 6 h con IFN-λ1 (35
ng/ml). En la figura 11C se muestra la presencia de las proteínas IFN-λ1 e IFN-λ2 en los grupos
tratados con IFN-λ1 e infectados con DENV y no para el control (mock) tal como se encontró
para los transcritos de estos genes en las condiciones anteriormente evaluadas.
La línea celular C33-A es capaz de expresar IFN-λ1 e IFN-λ2 bajo la infección por DENV
y por presencia de interferón exógeno, y no expresa éstas citocinas de forma constitutiva, al
menos no detectable por esta metodología en las condiciones evaluadas, y necesitando de un
estímulo de activación para su expresión.
49
Figura 11. DENV-2 induce la expresión de IFN-λ en células C33-A. Las células C33-A se trataron con IFN-λ1 (35 ng/ml) o se infectaron con DENV-2 (MOI= 0.1) o se pre trataron con IFN-λ1 y subsecuentemente se infectaron con DENV-2. A las 48 hpi se aisló el ARN celular total y se utilizó para RT-PCR de punto final para la determinación cualitativa de los genes IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3, utilizando al gen HPRT como control endógeno. (A, B) Resultados de la amplificación por RT-PCR de los grupos experimentales descritos. C) Extractos de proteína total de cada condición se utilizaron para la determinación por inmunoelectrotransferencia de la presencia de las proteínas IFN-λ1 e IFN-λ2. La actina se usó como control de carga. Se realizó un análisis semicuantitativo de las bandas detectadas normalizados con la actina con el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
50
Expresión del receptor IL28R1 en células C33-A
Con la presencia de los transcritos y la determinación de la proteína de IFN-λ , fue de
importancia analizar si la línea celular C33-A también expresaba en membrana el receptor
IL28RA, ya que se ha descrito su expresión diferencial dependiendo del tipo celular [99]. Para
esto se realizó un ensayo de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra la subunidad
IL28R1 y revelada mediante un anticuerpo secundario acoplado al fluorocromo CFL-647. Los
grupos analizados fueron: células control (mock), células tratadas con IFN-λ1 (35 ng/ml) y
células infectadas con DENV (MOI=0.1, 24 hpi).
En la figura 12A-F se observa en color rojo el marcaje de la subunidad IL28R1 en los
grupos analizados. Para encontrar la diferencia en la expresión de esta subunidad en los grupos
evaluados, se procedió a analizar la intensidad de fluorescencia de grupos de células en
diferentes campos y representados en la figura 12G.
Podemos observar en la figura 12A-B que las células C33-A presentan el receptor para
IFN-λ en su membrana celular y considerando la intensidad del fluorocromo (Figura 12G), el
receptor se expresa de manera notable (Figura 12A-B). De manera relevante encontramos que
bajo el estímulo con IFN-λ1, la expresión del receptor se incrementa en un 60%, como se puede
observar en la figura 12E-F, lo que podría deberse a la interacción del IFN-λ con su receptor en
la membrana promoviendo la expresión de esta subunidad en la membrana celular, y de esta
manera amplificar su efecto. Similar a lo encontrado con el estímulo con IFN-λ1, en las células
infectadas con el virus del dengue, notamos un aumento en la expresión del receptor de un
40% comparada a las células mock (Figura 12C-D). Esto indica que las células responden a la
infección activando la expresión de IL28R1 y promoviendo una mayor expresión en la
membrana celular, posiblemente como mecanismo de defensa a la infección. Se han
identificado sitios de unión a STAT1 en la región promotora del gen codificante de IL28RA, por
lo cual, la activación de IL28RA regula su propia expresión, representando un mecanismo
específico para la amplificación de los efectos de IFN-λ [108, 149].
Mediante el ensayo de microscopia de fluorescencia, determinamos en la línea celular
C33-A la presencia de la subunidad IL28R1 del receptor para IFN-λ, la cual se expresa de
51
manera constitutiva y que aumenta su expresión bajo la infección con DENV o la presencia de
IFN-λ endógeno.
Figura 12. Expresión del receptor IL28R1 en células C33-A. La presencia de IL28R1se determinó en células C33-A: A, B) Células control. C, D) Células infectadas (MOI= 0.1). E, F) Células tratadas con IFN-λ1 (35 ng/ml). La inmunofluorescencia se realizó con un anticuerpo anti-IL28R1 y el anticuerpo secundario conjugado a CFL647. G) La intensidad de fluorescencia se cuantificó por análisis de 150 células en tres diferentes campos tomados al azar, utilizando el programa de análisis de imagen EZ-C1 v2.3. *p<0.005, ***p<0.001. Tinción de núcleos celulares con SYBR-14. Barras= 30 µm. Magnificación de 40X
52
Determinación de la IC50 de IFN-α, IFN-λ1 e IFN-λ2 en la infección con DENV
La IC50 representa la concentración que se requiere de un fármaco para una inhibición del 50%
in vitro y los valores de IC50 se pueden utilizar para comparar la potencia de dos antagonistas
[150]. Con el fin de identificar el potencial antiviral del IFN-α e IFN-λ por su inhibición de la
replicación viral en cultivo celular (IC50), diferentes concentraciones de estas citocinas fueron
examinadas sobre la infección de DENV. Encontrando que la IC50 de IFN-λ1 o λ2 (8.705ng/ml,
8.24 ng/ml) fue menor que la determinada para IFN-α (12.2-13.8 ng/ml).
La IC50 fue determinada mediante la construcción de una curva de dosis-respuesta y
examinando el efecto del interferón en la replicación viral en células C33-A tratadas
previamente con interferón α o λ (6 h de tratamiento) a la concentración evaluada y
posteriormente infectadas por DENV2 (MOI= 0.1). Los sobrenadantes virales obtenidos
después de 48 hpi fueron titulados por placas líticas. Las concentraciones de interferón
evaluadas, fueron: IFN-λ1 e IFN-λ2: 0, 10, 20, 30, 40 ng/ml
IFN-α: 0, 100, 200, 300, 400 UI/ml (equivalente a 0, 10, 20 30, 40 ng/ml)
Los valores de IC50 obtenidos para cada interferón, se presentan como el logaritmo de
la concentración de IFN, y corresponden a: 1.12 (130 UI/ml) de IFN-α, 0.94 (8.705 ng/ml) para
IFN-λ1 (Figura 13B); 1.53 (340 UI/ml) IFN-α y de 0.91 (8.2 ng/ml) para IFN-λ2(Figura 13C). Los
resultados que arroja el estudio de dosis-respuesta fue un comportamiento de inhibición de la
replicación viral dependiente de la concentración de interferón, como podemos ver en la
figura 13 existe una mayor inhibición cuando las células son tratadas con IFN-λ1 o λ2 en
comparación al IFN-α (Figura 13A). Podemos notar que cuando existe un tratamiento con IFN-
α, el título viral disminuye conforme aumentamos la concentración de interferón en el medio
(Figura 14A). En la concentración más alta utilizada de IFN-α (400 UI) se pueden detectar placas
líticas y a la misma concentración con IFN-λ1 o λ2 (40 ng IFN-λ ≈ 400 UI de IFN-α) la titulación
no muestra partículas virales. Como se puede observar, la IC50 para IFN-λs es menor a la
concentración de IFN-α, lo que muestra un mayor potencial de inhibición.
53
Figura 13. IFN-λ1 inhibe la replicación de DENV-2 en un proceso dependiente de la dosis en células C33-A. Las células C33-A se trataron con concentraciones crecientes de IFN-α (A), IFN-λ1 (B) o IFN-λ2 (C) y posteriormente se infectaron con DENV-2 (MOI= 0.1). A las 48 hpi, el título viral se determinó por ensayos de placas líticas. Las dosis utilizadas fueron 10-40 ng/ml de IFN-λ1 o IFN-λ2 y 100-400 UI/ml por IFN-α. Las gráficas muestran el porcentaje de inhibición del título viral en cada grupo comparado con las células no tratadas. Las líneas en puntos representan los valores de IC
50 los cuales corresponden a IFN-λ1= 8.705 ng/ml, IFN-λ2= 8.24 ng/ml, IFN-α= 122-138 UI/ml. Los puntos graficados
son representativos de dos ensayos independientes realizados por triplicado. Los datos de los experimentos se ajustaron a la ecuación de Hill, utilizando regresión no lineal para estimar la IC
50 de cada tratamiento.
IC50
: concentración de IFN que inhibe al 50%, la producción de UFP de DENV, comparado con cultivos libres de tratamiento de IFN.
54
Cinéticas de replicación viral
En los ensayos anteriores se demostró que el tratamiento de IFN-λ exógeno inhibe la
replicación del virus del dengue, para determinar si la inhibición de la infección es por el
bloqueo en la entrada, sobre la replicación del virus en la célula o la liberación de la nueva
progenie, se realizó una cinética de replicación de DENV en células C33-A, midiendo el título
viral desde el inicio de la infección y hasta las 48 h post infección. Encontrando que el
tratamiento con IFN-λ1 o IFN-λ2 inhiben el proceso de replicación viral.
Las células C33-A se inocularon con diferentes dosis infectivas (MOI=1.0, 0.1, 0.01) y se
dejó adsorber el virus por 1 h. Posteriormente las células se lavaron y se agregó medio nuevo,
dejando transcurrir la infección según el tiempo requerido. El sobrenadante viral para la
titulación por placas líticas se recuperó a los tiempos 0, 6, 12, 18, 24 y 48 hpi. A la par, se realizó
un tratamiento a las células C33-A, con IFN-λ1 o IFN-λ2 (10 ng/ml, ≈IC50) por 6 h. Transcurrido
el tiempo, las células se inocularon con diferentes dosis infectivas (MOI=1.0, 0.1, 0.01) y los
sobrenadantes virales se titularon a los mismos tiempos post infección que el ensayo sin
tratamiento con IFN (control). Los datos se graficaron y analizaron estadísticamente. Los
resultados obtenidos se muestran en la figura 14.
En la cinética de replicación se puede observar que la entrada del virus a la célula ocurre
en las primeras horas, ya que alrededor de las 6 hpi el título viral en el sobrenadante disminuye
de manera considerable, posiblemente porque la mayoría de las partículas virales se han
desensamblado al entrar a las células y en este momento no se han producido todavía grandes
cantidades de partículas nuevas. Las partículas virales se pueden determinar en el
sobrenadante a partir de las 12 h y el mayor número de partículas es notorio a partir de las 24
hpi, lo cual continúa hasta las 48 hpi. Este comportamiento de replicación se conserva en todas
las dosis infecciosas utilizadas. Cuando las células fueron tratadas con IFN-λ1 o IFN-λ2, se
muestra una inhibición de la replicación viral, lo cual es notable a partir de las 12 hpi, en donde
la nueva progenie viral disminuye hasta en 2 logaritmos (MOI 0.1) (figura 14) comparada con
el grupo control, manteniéndose bajo hasta las 48 hpi.
55
Figura 14. Cinética de inhibición por IFN-λ1 en la infección por DENV-2 en células C33-A. Las células C33-A se trataron con 10 ng/ml de IFN-λ1 (A-B) o IFN-λ2 (C) por 6 h previo a la infección por DENV-2 a diferentes dosis infecciosas (MOI= 0.01, 0.1 y 1.0). Los sobrenadantes se titularon por ensayos de placas líticas a 0, 6, 12, 18, 24 y 48 hpi. Los puntos son representativos de dos experimentos independientes realizados por triplicado. En todos los casos se utilizó un control de células infectadas no tratadas con interferón.
56
En el caso de la dosis infectiva de 0.01, en las células tratadas con IFN-λ2, la cantidad de
partículas infecciosas es tan baja que ya no se detectaron placas líticas (figura 14B), o no se
encontraron en el sobrenadante suficientes partículas virales para cuantificarse por el método
utilizado.
Los datos muestran que el tratamiento a la IC50 (10 ng/ml) por 6 h con IFN-λ1 o IFN-λ2
inhibe en 2 logaritmos la replicación viral y no la entrada del virus a la célula y que es suficiente
para mantener su actividad hasta por 48 h, indicando que posiblemente el virus del dengue
está evadiendo las vías de señalización de IFN-α, pero no las activadas por IFN-λ.
Ensayo dosis-respuesta con aumento en tiempo de tratamiento con interferón
En el ensayo anterior, usando 6 h de tratamiento con IFN-λ1 y λ2, la infección disminuyó hasta
en 2 logaritmos. Para conocer si el aumento en el tiempo de estimulación se refleja en la
actividad inhibitoria, se realizó un ensayo utilizando 24 h de tratamiento.
El ensayo consistió en la realización de una curva dosis-respuesta determinando la IC50
utilizando una dosis infecciosa de 0.1. Se utilizaron las mismas concentraciones de IFN-λ
anteriormente analizadas (0, 10, 20, 30, 40 ng/ml) comparadas con IFN-α (0, 100, 200, 300,
400 UI/ml) y titulando los sobrenadantes 48 hpi por el método de placas líticas.
El efecto dosis-respuesta muestra una mayor inhibición de la replicación viral, cuando
se trata con IFN-λ1 o IFN-λ2, que cuando son tratadas con IFN-α (Figura 15) comparado con el
ensayo de 6 h de tratamiento previo a la infección (Figura 14), además la IC50 para IFN-λs se ve
disminuida, IFN-λ1 IC50= 3.8019, IFN-λ2 IC50= 4.897, lo que significa que el efecto de inhibición
se ve potenciado con el tiempo de estímulo previo a la infección y no así en el caso de IFN-α,
en donde la IC50 se conserva en el mismo valor (IFN-α IC50= 158-170 UI/ml).
Estos resultados muestran que el tratamiento de interferón es dependiente de la dosis y del
tiempo. Lo cual influye en la activación de vías de transcripción en tiempos tardíos a diferencia
de la inducción temprana descrita para IFN-α [151-153].
57
Figura 15. El aumento del tiempo de estimulación aumenta la eficacia de IFN-λ para inhibir la replicación de DENV-2. Las células C33-A se trataron con concentraciones crecientes de IFN-α, IFN-λ1 (A) o IFN-λ2 (B) 24 h previas a infectarlas con DENV-2 (MOI= 0.1). A 48 hpi, el título viral se determinó por ensayos de placas líticas. Las dosis utilizadas fueron 10-40 ng/ml de IFN-λ1 o IFN-λ2 y 100-400 UI/ml por IFN-α. Las gráficas muestran el porcentaje de inhibición del título viral comparado con células no tratadas con interferón. Las líneas en puntos representan los valores de IC
50 los cuales corresponden a IFN-λ1= 3.8019 ng/ml, IFN-λ2= 4.897 ng/ml, IFN-α= 158-170
UI/ml. Los puntos graficados son representativos de dos ensayos independientes realizados por triplicado.
58
Inhibición de la replicación de DENV por IFN-λ1 en células Vero determinado
por IC50
Con el objetivo de identificar el efecto producido en la replicación de DENV por el tratamiento
con el IFN-λ1 sin la presencia del IFN-α, se utilizó la línea celular Vero, la cual no produce
interferón tipo I (IFN-α), pero sí responde al estímulo exógeno de IFN-λ [154, 155].
Determinamos que la línea celular Vero, es permisible a la infección por DENV, que expresa los
receptores IFNAR e IL28RA y que responden al tratamiento con IFN-λ1, inhibiendo la
replicación del virus en esta línea celular.
En primer lugar, se determinó la permisividad a la infección por el virus del dengue en
la línea celular Vero por inmunofluorescencia mediante anticuerpo anti-prM y el anticuerpo
secundario conjugado a el fluorocromo CFL-488. En la figura 16D-F podemos visualizar la
presencia de la proteína prM en las células infectadas (18 hpi). En las células no infectadas, no
se identifica florescencia (Figura 16A-C). Demostrando que la línea celular Vero es permisible
a la infección por DENV.
Era importante encontrar la presencia de los receptores para interferón α y λ, como
indicativo de que las células Vero pudieran responder al estímulo de interferón exógeno, por
lo se determinó la expresión de las subunidades IL28R1 e IFNAR1 mediante
inmunofluorescencia. El receptor IFNAR1 fue evaluado también en células C33-A, para
evidenciar su presencia como control del ensayo (Figura17A). En la figura 17B se visualiza la
presencia del receptor IFNAR en la línea celular Vero y en la figura 18 la presencia del receptor
IL28R1. La presencia de ambos receptores nos dice que esta línea celular puede responder a
la inducción por interferón endógeno tanto por interferón α como de interferón λ.
Como podemos observar en la figura 18F, se ve una inducción de la expresión de la
subunidad IL28R1 cuando las células son tratadas con IFN-λ1. Al igual que en la línea C33-A
(Figura 12F) la expresión del receptor a IFN-λ es activada en respuesta a su propio ligando.
Cuando las células son infectadas, la expresión de IL28R1 (Figura 18I) aumenta aún más,
probablemente a causa de que DENV activa un estado antiviral en la célula reflejado en el
59
aumento de receptores de interferón y la expresión de IFN-λ (Figura 11) induce la expresión
de su propio receptor.
La IC50 fue determinada mediante la construcción de una curva de dosis-respuesta y
examinando el efecto de diferentes concentraciones de interferón en la replicación viral,
titulando los sobrenadantes de las células infectadas 48 hpi. Los grupos evaluados fueron:
Células tratadas con IFN-α e infectadas: 0, 100, 200, 300, 400 UI/ml, MOI=0.1
Células tratadas con IFN-λ1 e infectadas: 0, 10, 20, 30, 40 ng/ml, MOI=0.1
Células tratadas con IFN-λ1 más IFN-α e infectadas: 0, 10, 20, 30, 40 ng/ml de IFN-λ1, 400 UI/ml
de IFN-α, MOI=0.1
Encontrando que con el tratamiento con IFN-α, aunque el título viral disminuye, éste
no alcanzó el 50% y por lo consiguiente no se pudo determinar la IC50 (Figura 19A). El
tratamiento con IFN-λ1 disminuye la progenie viral en un 50% con 37.15 ng/ml (Figura 19B). y
el tratamiento con IFN-λ1 más IFN-α mostró ser el más eficaz con una IC50 de 14.12 ng/ml
(Figura 19C).
Estos resultados nos dicen, que el IFN-λ es capaz de inhibir la replicación del virus del
dengue en células Vero, una línea celular carente de IFN-α. Una disminución de los niveles en
la progenie viral después del tratamiento con IFN-λ1 y no así en las células control, claramente
muestran la capacidad antiviral contra el virus del dengue. Adicionalmente, nuestros datos
indican que esta inhibición viral es dada primariamente en respuesta a IFN-λ, puesto que la
replicación viral no se ve inhibida con el tratamiento con IFN-α, y el tratamiento IFN-λ1 más
IFN-α, se muestra una mayor eficacia de inhibición, debido ya sea al aumento de la expresión
del receptor IL28RA, la activación de vías de señalización independiente a la mediada por
Jak/STAT mediada por IFN-λ o a un mecanismo de sinergismo entre interferones.
60
Figura 16. Permisividad de células Vero a la infección por DENV-2. Las células se infectaron con el virus del dengue (MOI= 0.1) por 2 h. Se mantuvieron por 24 h, se lavaron y posteriormente se fijaron con metanol-acetona. El virus se detectó usando anticuerpos contra la proteína viral prM y el anticuerpo secundario conjugado a CFL488. La fluorescencia se analizó por microscopía. A-C) Células control (mock). D-F) Células infectadas. A, D) Tinción de núcleos con colorante de Hoechst B, E) Fluorescencia (pseudocolor por cuestión ilustrativa). C, F) Imagen integrada. Barras= 20 µm.
61
Figura 17. Expresión del receptor de membrana IFNAR1 en células C33-A y Vero. La presencia de IFNAR se determinó en células C33-A sin tratamiento (A), células Vero sin tratamiento (B) mediante microscopía de fluorescencia detectada con anticuerpo anti-IFNAR y el anticuerpo secundario conjugado a CFL488. C) Presencia de IFNAR en células Vero infectadas con DENV-2. D-F) Controles respectivos de tinción con solo el anticuerpo secundario (MOI= 0.1). Barras= 20 µm.
62
Figura 18. Expresión del receptor de membrana IL28R1 en células Vero. La presencia de IL28R1 se determinó en células Vero: A-C) Células control. D-F) Células infectadas con DENV-2 (MOI= 0.1). G-I) Células tratadas con IFN-λ1 (35 ng/ml). La inmunofluorescencia se detectó con anticuerpo anti-IL28R1 y el anticuerpo secundario conjugado a CFL488 (se muestra en pseudocolor con fines ilustrativos). A, D, G) Tinción de núcleos con colorante de Hoechst. B, F, H) Fluorescencia. C, F, I) Imagen integrada. Barras= 20 µm.
63
Figura 19. IFN-λ1 inhibe la replicación de DENV-2 en células carentes de IFN-α. Las células Vero se trataron con concentraciones crecientes de IFN-α (A), o IFN-λ1 (B) o IFN-λ1 más IFN-α (C) y posteriormente se infectaron con DENV-2 (MOI= 0.1). Las dosis utilizadas fueron 10-40 ng/ml de IFN-λ1 o 100-400 UI/ml de IFN-α. A las 48 hpi, el título viral se determinó por ensayos de placas líticas. Las gráficas muestran el porcentaje de inhibición del título viral en cada grupo comparado con las células no tratadas. Las líneas en puntos representan los valores de IC
50, los cuales corresponden a IFN-λ1= 37.15 ng/ml, IFN-λ1 en presencia de IFN-α = 14.12 ng/ml, el valor de IC
50 para IFN-α no pudo ser
calculado, porque no se alcanzó la inhibición del 50% bajo las condiciones experimentales utilizadas. Las barras de error representan la desviación estándar de los promedios de los valores obtenidos en dos experimentos independientes. ND: no determinado.
64
Cuantificación relativa del nivel de transcripción de los genes IFN-λ1, SOCS1,
SOCS3, OAS1, MXA e IFN-β durante el proceso de infección y tratamiento con
IFN-λ1
Ensayo control de inducción
Anteriormente se determinó que la infección por DENV y la administración de IFN-λ1 exógeno,
activa la transcripción de los genes de IFN-λ. Para corroborar estos datos y verificar la inducción
de los genes OAS1, MXA, INF-λ1 e IFN-β en la línea celular C33-A, administramos un
tratamiento de poly (I:C), como un ensayo control de inducción.
Poly (I:C) se utiliza como control positivo de inducción porque es reconocido por TLR3,
que activa a IRF3, NF-kB y AP-1 y por lo tanto induce IFN-αβ e IFN-λ. El poli (I: C) también es
reconocido por RIG-I y MDA-5 moléculas relacionadas en el reconocimiento del virus del
dengue [156-158] .
Se utilizaron 200 ng/ml de poly (I:C) diluido en DMEM por 2 h. Posteriormente las
células se lavaron, agregando medio nuevo y 24h después se llevó a cabo la cuantificación
relativa de los genes en comparación a un grupo de células control las cuales no recibieron
ningún tratamiento (Figura 20).
Como se puede observar en la figura 20, las células C33-A no producen de manera
constitutiva los transcritos de los genes OAS, MXA e IFN-λ1 y necesitan de estimulación para
activar su expresión. El IFN-β presenta un nivel de expresión. La inducción por poly (I:C) activa
la transcripción de OAS1 en 60 veces, para el caso de MXA incrementa su expresión 80 veces,
la producción IFN-λ1 está aumentada en 70 veces y en cuanto IFN-β presentó un aumento de
50 veces, todos esto con respecto a células sin tratamiento (Figura 20).
La expresión de estos ISGs indica que la línea celular C33-A es funcional en las vías de
señalización inducidas por interferón y que su sistema de defensa antiviral es activo, como lo
muestra la presencia de la expresión de OAS1 y MXA.
65
Cinética de expresión de ISGs durante el proceso de infección
Una vez valorada la expresión con el control positivo de inducción (poly I:C), se procedió a
analizar el nivel de transcripción de los genes INF-λ1, SOCS1, SOCS3, OAS1, MXA e IFN-β con el
fin de estudiar el comportamiento de estos a través del proceso de infección o con el
tratamiento con IFN-λ1. La cuantificación relativa del nivel de transcripción de los genes se
llevó a cabo por el método de 2-ΔΔCT.
Los grupos analizados corresponden a:
Grupo control (mock), células C33-A sin ningún tratamiento o infección.
Figura 20. Inducción de ISGs por tratamiento con poly (I:C). Como ensayo control positivo de la inducción y producción de genes estimulados por interferón, las células C33-A se trataron por 2 h con 200 µg de poly (I:C). El incremento de los niveles de transcrito de los genes OAS1, MXA, IFN-λ1 e IFN-β en células tratadas con poly I:C y sin tratamiento se determinó por PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm se normalizaron con el gen HPRT. La gráfica representa los valores de dos ensayos por triplicado y las barras de error indican la desviación estándar.
66
Grupo IFN-λ1, células tratadas con 10 ng/ml de IFN-λ1 por 6 h.
Grupo DENV2, células infectadas con el virus del dengue a una MOI= 0.1
Grupo IFN-λ1/DENV2, grupo de células tratadas con 10 ng/ml de IFN-λ1 por 6 h y
posteriormente infectadas con DENV2 a una MOI= 0.1.
La determinación de los niveles de los transcritos se realizó a las 0, 6, 12, 18, 24 y 48
hpt con IFN-λ1, u hpi dependiendo del grupo en cuestión.
La figura 21A muestra que el grupo IFN-λ1 incrementan la transcripción del gen OAS1
de manera similar entre las 6 y 48 hpt. La infección con DENV incrementa el ARNm a las 6 hpi.
Sin embargo, el efecto más visible fue presentado en el grupo IFN-λ1/DENV a las 6 y 18 hpi,
debido probablemente a que el IFN-λ activa mecanismos de degradación de ARN y en
consecuencia inhibe la replicación viral. También, el grupo IFN-λ1 aumenta la transcripción del
gen de MXA a las 6 hpi, registrando el pico más alto cerca de 100 veces a las 24 h (Figura 21B),
sugiriendo que existe una eficiente activación de la transducción de señales de IFN-λ,
contrarrestando la infección de DENV. El incremento del gen MXA a las 24 h podría ser por la
producción de IFN-λ2. Se ha demostrado que el INF-λ2 puede inducir una actividad tardía en
respuesta a la infección; horas posteriores a la activación de los ISGs (entre éstos, IFN-λ2) por
IFN-λ1 o IFN-β, habría una segunda inducción de genes en respuesta a interferón por la unión
de IFN-λ2 a su receptor [159]. En el grupo DENV el ARNm de MXA fue detectado de manera
similar que en las células control en todos los tiempos analizados, sugiriendo un bloqueo de la
vía de transducción de señales; aunque este experimento no puede discriminar entre las vías
por IFN-α o IFN-λ. En grupo IFN-λ1/DENV el ARNm se incrementa entre las 18 y 48 hpi, pero el
incremento visto es solo del 25 veces a las 24 hpt en comparación al incremento máximo
alcanzado por el grupo IFN-λ1 que es de 95 veces.
Para determinar la manera en que el tratamiento por IFN-λ y la infección por DENV
estimula la producción de IFN-λ1 e IFN-α durante la cinética evaluada, se analizó los niveles de
ARNm del IFN tipo I (IFN-β) y del tipo III (IFN-λ1). La figura 21C muestra que el transcrito de
67
IFN-β no se incrementa en el grupo DENV en los tiempos evaluados. El estímulo con IFN-λ1
incrementa el ARNm de IFN-β cerca de 20-30 veces entre 6 y 24 hpt (Figura 23C). Sin embargo,
el grupo IFN-λ1/DENV, solo aumenta en 10 veces, siendo mucho menor que el observado en
el grupo IFN-λ1. Por lo tanto, DENV podría afectar la transcripción del gen de IFN-β, actuando
sobre alguno de los IRFs.
Con respecto a la inducción del ARNm de IFN-λ1 (Figura 23D), la estimulación con IFN-
λ1 incrementa el ARNm a las 6 hpt (70 veces) y a las 48 hpt (170 veces). La infección por DENV
incrementa 65 y 55 veces el nivel de ARNm a las 6 y 48 hpi, respectivamente. De manera
similar, el grupo con IFN-λ1/DENV aumenta a las 6 h (40 veces), y mostrando un incremento
de al menos 120 veces a las 48 hpi. Estos resultados sugieren que la inhibición de la
transcripción de los genes MXA observada ocurre principalmente por inhibición de la vía del
IFN-α realizada por el virus del dengue.
Otros factores importantes en la vía de IFN son los reguladores negativos SOCS1 y
SOCS3, los cuales se incrementan a las 12 hpt, tiempo en el cual las células C33-A se infectaron
(Figura 21E-F). Es notable que la infección por DENV induce un incremento significante de
SOCS1, lo cual se ve reflejado en el incremento a las 24 h (40 veces) mientras que la
estimulación con IFN-λ1 induce un incremento, pero en menor proporción (20 veces).
Para analizar otros aspectos de la cinética de expresión, los mismos datos de la figura
21, se graficaron por condición experimental (Figura 22). Las células control no muestran
activación de los genes evaluados. Indicando que es requerido un estímulo externo para
activar su transcripción en estas condiciones (Figura 22A). En el grupo DENV, el ARNm de IFN-
λ1 muestra un incremento entre las 6 y las 12 h, después disminuye y aumenta nuevamente a
las 48 hpt (Figura 22B). La infección por DENV estimula la transcripción de IFN-λ1, donde la
expresión máxima se alcanza a las 48 hpi, siendo 65% menor comparado con las células
tratadas con IFN-λ1 (Figura 22C). En el caso de OAS1, el nivel máximo de ARNm se observó en
el grupo IFN-λ1/DENV a las 18 hpi (Figura 22D).
68
Figura 21. Niveles de transcripción de genes estimulados por IFN durante la infección por DENV-2. La expresión de los genes OAS1 (A), MXA (B), IFN-β (C), IFN-λ1(D), SOCS1 (E) y SOCS3 (F) en células infectadas con DENV-2 (MOI= 0.1) o tratadas con 10 ng/ml de IFN-λ1 previo a la infección con DENV-2, se determinaron por RT-PCR en tiempo real a 0, 6, 12, 18, 24 y 48 hpi u hpt. Los resultados son presentados como la expresión relativa a células no tratadas. Se presentan los promedios de los valores obtenidos en tres réplicas y las barras de error indican la desviación estándar.
69
Figura 22. El incremento del transcrito de SOCS1 coincide con la disminución de la transcripción de IFN-λ1. Los mismos valores utilizados en la figura 23 fueron graficados y ordenados de acuerdo a la condición experimental: A) Células control. B) Células infectadas con DENV-2 (MOI= 0.1). C) Células tratadas con 10 ng/ml de IFN-λ1. D) Tratadas con IFN-λ1 y posteriormente infectadas con DENV-2. Las gráficas representan el promedio de los valores obtenidos en tres ensayos por duplicado y las barras de error indican la desviación estándar.
70
La infección por DENV incrementa la transcripción de IFN-λ1 con picos de expresión a las 6 y
48 hpi. Por otro lado, el máximo pico mostrado para el transcrito de MXA fue observado en el
grupo tratado con IFN-λ1 a las 6 h (40 veces) y 24 h (90 veces). Además, se muestra un aumento
de MXA, a partir de las 12 hpi y un aumento de hasta 25 veces en el grupo IFN-λ1/DENV, lo
cual se muestra en la figura 22D. Este incremento fue menor en el grupo IFN-λ1, y es de
particular interés porque el grupo DENV no muestra ningún incremento significativo en este
gen en ningún tiempo evaluado.
Este análisis de expresión de genes en los diferentes grupos, nos refiere que la infección
por DENV activa la transcripción de los genes IFN-λ1 y OAS1 a las 6 hpi, posteriormente hay un
aumento delos genes de SOCS3 y SOCS1 lo que conlleva a la disminución de estos genes y
repuntando nuevamente la transcripción de IFN-λ1 hasta las 48 hpi. En el grupo IFN-λ1, se ve
estimulada la transcripción de los genes de IFN-λ1, MXA entre las 6 y 12 hpi, una disminución
a las 18 hpi y un aumento importante en el transcrito de MXA a las 24 hpi y a las 48 hpi para
IFN-λ1. Comparando estos dos grupos, podemos hablar de que la infección por dengue inhibe
en parte la transcripción de los genes OAS1, MXA e IFN-λ1 por la activación de los genes SOCS1
y SOCS3. En el grupo IFN-λ1/DENV encontramos un aumento de los genes de IFN-λ1 entre las
primeras horas (6-12 hpi), OAS1 y MXA a las 12-18 hpi y un aumento en IFN-β a las 24 hpi,
posteriormente a las 48 hpi solo el transcrito de IFN-λ1 se ve aumentado. Los transcritos de
SOCS1 y SOCS3 se ven aumentados a las 12 y 24 hpi, posiblemente regulando negativamente
la transcripción de los ISGs evaluados, puesto que el pico en la expresión de SOCS1 coincide
con la disminución en la expresión de IFN-λ1 (Figura 22B).
Estos datos nos hablan de una inducción de MXA inducida antes de IFN-β, pero
claramente después de la expresión máxima de IFN-λ1, sugiriendo que el IFN-λ secretado es el
principal inductor de MXA durante la infección por dengue en la línea celular 33-A.
71
Incremento de IFN-III en pacientes con dengue
DENV induce una respuesta de IFN-α/β en infecciones naturales, de hecho, se ha encontrado
que, está presente por periodos después de la defervescencia [160]. Sin embargo, la
abrogación de IFN-α/β y la señalización por éste resulta en por el incremento de la viremia y
la respuesta muy temprana a la infección mediada por IFN-α/β, donde los niveles de IFN
disminuyen con la progresión de la enfermedad [44]. Los niveles de IFN-λ en sueros de
pacientes con dengue no han sido reportados y dado los resultados in vitro obtenidos,
analizamos la presencia de IFNλ1 e IFN-λ3 mediante ensayo de ELISA en pacientes con fiebre
por dengue y fiebre hemorrágica por dengue (dengue severo) con el objetivo de determinar si
los pacientes con dengue producen IFN-λ como respuesta al proceso infeccioso. Encontrando
que los niveles de IFN-λ1/λ3 en los sueros de pacientes con fiebre por dengue se encontraron
elevados, no así en el grupo de dengue hemorrágico y el grupo de referencia.
Para el análisis de la expresión de IFN-λ en pacientes con fiebre por dengue y dengue
hemorrágico, se utilizó como referencia sueros de donadores sanos. Nosotros analizamos los
niveles de IFN-λ1 y λ3. El kit de ELISA utilizado (R&D systems) sólo detecta y cuantifica dichas
citocinas.
Los niveles en suero para IFN-λ1/λ3 en el grupo de referencia (56.12 ± 6.0 ng/ml) y el
grupo de pacientes FHD (63.36 ± 4.0 ng/ml) no difieren significantemente entre ellos. Sin
embargo, los niveles de IFN-λ1/λ3 en el grupo de pacientes FD (110.84 ± 5 ng/ml) se ven
aumentados (Figura 23).
La Figura 23 muestra también los niveles de concentración de IFN-λ1/λ3 en los
sobrenadantes de células C33-A infectadas con DENV (112.94 ± 4 ng/ml) y células Vero
infectadas con DENV (62.87 ± 5 ng/ml). Lo que representa que la infección por DENV activa la
transcripción y traducción de IFN-λ, permaneciendo activo por más de 48 hpi.
72
Estos resultados indican que los bajos niveles circulantes de IFN-λ1/λ3 en pacientes con
dengue hemorrágico probablemente haya potencializado la inmunopatología del dengue, tal
como lo visto con IFN-α, influyendo a que la enfermedad evolucione con mal pronóstico.
Hemos demostrado in vitro, la capacidad de inhibir la replicación del virus del dengue mediante
Figura 23. Pacientes con fiebre por dengue aumentan sus niveles de IFN-λ1 en sangre. Los niveles de IFN-λ1/ λ3 (pg/ml) en suero de pacientes clínicamente con dengue y de donadores sanos fueron medidos por ELISA. Los sobrenadantes de células C33-A y Vero infectadas con DENV-2 (MOI= 0.1, 48 hpi) también fueron analizados para determinar los niveles de IFN-λ1/ λ3. El experimento se realizó por triplicado. Las barras de error indican la desviación estándar, los asteriscos (*p<0.5, ***p<0.001) señalan los resultados con diferencias significativas respecto a los donadores sanos.
73
la administración de IFN-λ1 y aunque no evaluamos su capacidad inmunomoduladora, los
niveles aumentados de IFN-λ1/λ3 en los pacientes con fiebre por dengue, podrían indicar que
la presencia del IFN-λ favorece la eliminación del virus y de esta manera no evoluciona a su
forma más severa o estaría involucrado en la regulación de la inflamación, evitando la
presencia de signos de alarma.
74
8. DISCUSIÓN
El interferón tipo III (IFN-λ) fue identificado recientemente [99, 100] y existe información
limitada acerca de su expresión y funciones biológicas. Mientras la mayoría de las células
responden a interferón tipo I, ciertos tipos celulares, especialmente las células epiteliales
pueden responder a interferón IFN-λ , debido a la restricción de la expresión de su receptor,
IL28R1 [111, 116]. La actividad particular del IFN-λ durante la infección con el virus del dengue
no había sido explorada.
Varios estudios se han realizado en cultivos de líneas celulares para estudiar la
respuesta a IFN-λ [114]. En este trabajo encontramos que la línea celular C33-A es permisible
a la infección con el virus del dengue, produce y responde a IFN-λ. El receptor IL28RA es
expresado en esta línea celular, lo cual es esencial para llevar a cabo la acción antiviral de IFN-
λ. Encontramos que la expresión de IL28R1 se incrementa durante la infección por DENV. La
expresión de IL28R1 es inducible bajo infecciones virales que es simultánea con la expresión
de IFN-λ [109]. El incremento en la expresión del receptor durante la infección por el virus del
dengue podría potenciar el efecto de la señalización por IFN-λ, permitiendo la estimulación de
la transcripción de genes de la respuesta antiviral y promoviendo la inhibición de la replicación
de DENV, así como se ha demostrado para las infecciones con otros virus tales como los virus
de la hepatitis B y C y el virus de la inmunodeficiencia humana [161, 162].
En este estudio hemos demostrado la eficacia del IFN-λ1 en la inhibición de la
replicación del virus del dengue. IFN-λ1 reduce la cantidad de partículas virales secretadas en
el sobrenadante cuantificadas por ensayos de placas líticas. Experimentos de dosis-respuesta
mostraron que los valores de IC50 para IFN-λ1 e IFN-λ2 fueron de 8.705 ng/ml y 8.24 ng/ml
respectivamente, mientras que la IC50 de IFN-α fue de 130-340 UI/ml (Figura 13). No es claro
si las concentraciones utilizadas para IFN-λ1 e IFN-λ2 son comparables con la eficiencia
antiviral para dengue, como ha sido reportado para otros virus [134, 163].
Con estos datos se plantea que los interferones alfa y lambda no siempre son
expresados de manera concomitante y se propone que existen diferencias entre los
75
mecanismos regulatorios de la expresión de IFN-α e IFN-λ y el grupo de genes que pueden
activar individual o conjuntamente [164] (Figura 24 ).
La línea celular Vero son células epiteliales que por su permisividad se prefieren para el
aislamiento y/o propagación de varias familias de virus. La utilidad de estas células para la
propagación de virus es al menos dada por tres características, primero son infectables por
varios tipos de virus, quizás debido a una amplia variedad de receptores o por adsorción no
específica de partículas virales; segundo, tienen una mutación genética que realiza la escisión
del gen para el interferón de tipo I (IFN-α) en ambos cromosomas [133] y en tercer lugar, el
IRF3, factor necesario para la generación de respuesta a la infección por virus es relativamente
ineficiente, lo que resulta en respuesta inicial débil a la infección [165].
La línea celular Vero no produce interferón tipo I, pero tiene una respuesta funcional a
éste. Se ha demostrado que el gen MXA es inducido en células Vero cuando son tratadas con
IFN-α recombinante, mostrando que la línea celular Vero puede responder a la estimulación
con interferón [154, 155].
Nuestros experimentos en esta línea celular tenían el objetivo de elucidar el papel del
IFN-α en la inhibición de la replicación del virus del dengue encontrada en nuestros
experimentos con la línea celular C33-A con administración de IFN-λ exógeno. Observamos
que el tratamiento con IFN-λ1 antes de la infección no inhibe la replicación de DENV en células
Vero de igual forma que en la línea celular C33-A (Figura 13 y 19). El virus del dengue estaría
bloqueando vías de señalización activadas tanto por IFN-α [16] como de IFN-λ, o inhibiendo la
señalización que active la producción de ambos interferones.
Aunque los títulos de la progenie viral no se ven reducidos en su totalidad aún en la
dosis de IFN-λ1 más alta utilizada, sí se puede observar una disminución en la cantidad de
partículas virales, lo que significa que aunque no de manera acentuada como se vio en la línea
celular C33-A, la replicación del virus del dengue puede ser inhibida por el empleo de IFN-λ1
exógeno, en ausencia de IFN-α (Figura 19), tal como se ha reportado en infecciones con otros
virus [114, 166].
76
De alguna manera, IFN-λ podría inducirse de manera independiente al IFN-α en células
Vero, tal como se ha sugerido recientemente en otros modelos celulares (células
mononucleares derivadas de sangre periférica) en donde se ha propuesto que la organización
de los potenciadores en los promotores de IFN-α e IFN-λ son fundamentales en la diferencia
de la expresión de estos genes [167]. Souza-Fonseca, et al. demostraron la capacidad del IFN-
λ de regular directamente las funciones efectoras de células NK in vivo, fuera del contexto del
IFN-α [168], lo que hace hipotética que el IFN-λ juega su propio papel de manera
independiente a la expresión de IFN-α, y que la subversión de éste último por la infección por
DENV podría verse restaurada por los efectos antivirales del IFN-λ. Encontramos que existe
una mayor reducción de la progenie viral cuando se trata simultáneamente con IFN-λ1 e IFN-
α, lo cual podría deberse a un efecto sinérgico entre ellos, tal como se ha sugerido para otras
infecciones virales, tales como el virus respiratorio sincicial, virus de la hepatitis C, virus del
Nilo occidental, entre otros [169-171]. Algunos estudios demuestran que la estimulación con
IFN-λ antes de la infección con virus de herpes simple tipo 1, en macrófagos derivados de
monocitos, induce la expresión de IFN-α e IFN-β [172]. Sin embargo, la relación entre la
activación o inducción entre IFN-α e IFN-λ depende del tipo celular y la infección en particular,
lo cual demuestra que estos sistemas no son necesariamente redundantes, como se muestra
en nuestros experimentos, en donde la expresión de IFN-λ existe aun cuando DENV puede
evadir la respuesta inmune como ya ha sido reportado [7, 170, 171, 173] .
En el presente trabajo exploramos el efecto de IFN-λ sobre la infección del virus del
dengue en cultivo celular, en donde la cinética de expresión de genes y el efecto antiviral
encontrado, indican el establecimiento del estado antiviral por inducción de la activación de
ISGs, los cuales pueden ser activados por la expresión de IFN-α o IFN-λ. El efecto antiviral
muestra que el IFN-λ podría estimular genes antivirales en células tratadas con IFN-λ1 y
posteriormente infectadas. Es notable que la infección por DENV induce la activación de
transcritos de ISGs, pero estos no alcanzan niveles altos como los observados cuando se
estimula con IFN-λ1. Sin embargo, cuando las células son pre tratadas con IFN-λ1 y después
77
infectadas con DENV, los niveles de transcritos para los ISGs fueron mayores y se mantuvieron
por más tiempo con respecto al grupo infectado con DENV. Los genes SOCS1 y SOCS3 se
indujeron después de que los ISGs alcanzaron su pico máximo, ejerciendo su regulación
negativa por retroalimentación. Sin embargo, los ISGs analizados en presencia de IFN-λ1 se
mantienen en niveles bajos, pero suficientes para alcanzar un segundo pico de expresión y esta
amplificación de señalización, puede inhibir la replicación del virus en etapas tardías (Figura
21).
Los genes antivirales MXA y OAS1 muestran una activación a las 6 h y un pico a las 18 y
48h, respectivamente, en el grupo IFN-λ1/DENV. El transcrito para OAS1 fue mayor en el grupo
IFN-λ1/DENV, en relación con el grupo IFN-λ1. Esto a consecuencia del incremento en la
activación del gen en presencia de la infección y la activación de genes mediados por
interferón.
El gen OAS1 tiene actividad antiviral contra la infección por DENV-2 [174]. El sistema
antiviral OAS/RNasa L es inducido por el IFN y juega un papel crítico en la respuesta inmune
innata, controlando la producción de partículas virales. La RNasa L tiene acción antiviral en la
escisión del ARN viral, induciendo apoptosis en las células infectadas e incrementando la
producción de IFN-β a través de MDA5/RIG1/IPS-I [175].
La máxima activación del gen MXA ocurre por la estimulación con IFN-λ1 debido a que
es un gen específico de respuesta a interferón, indica una funcionalidad propia de la vía en la
línea celular. En el caso del grupo IFN-λ1/DENV, la expresión mostrada de este gen pudiera ser
causada por el tratamiento con IFN-λ1 debido a que en el grupo DENV no se muestra un
aumento del transcrito. No obstante, los niveles de transcripción no fueron similares al grupo
IFN-λ1, los niveles observados pueden ser suficientes para inhibir la replicación viral, aún en
presencia de SOCS1 y SOCS3, los cuales podrían causar la inhibición de la transcripción de MXA
observada a las 12 hpt, sin embargo los niveles de transcrito de SOCS1 parecen no ser
suficientes para completar la inhibición de la vía del interferón en tiempos posteriores a las 12
hpt, lo cual se refleja en la inhibición de la replicación del virus.
78
Los niveles de transcripción de los diferentes grupos muestran una clara relación entre
el tratamiento con IFN-λ y su papel en la inhibición de la replicación de DENV. Es posible que
el proceso observado de la evasión de la respuesta inmune, mediada por la infección viral,
muestre una disminución en la transcripción de los ISGs evaluados comparado con las células
tratadas con IFN-λ1 y un incremento en los genes SOCS1 y SOCS3 como parte de una probable
evasión de la respuesta inmune mediada por DENV. La transcripción de SOCS1 y SOCS3 se
incrementó a las 12 y 24 h post infección y ello podría haber causado la supresión de los ISGs
(Figura 22).
Sin embargo, el gen IFN-λ1 fue activado en las primeras y las últimas horas (6 y 48 hpi),
indicando probablemente su escape a la actividad supresora de las proteínas SOCS. Cuando se
evalúan las células que fueron tratadas con IFN-λ1 e infectadas, existe un ligero y persistente
incremento en los ISGs evaluados, los cuales tienen un pico a las 12 y 48 h post infección en el
caso de IFN-λ1 y 18 y 48 h post infección en el caso de OAS1 y MXA, aún en presencia de SOCS1
y SOCS3.
Es de considerar que los picos mayores de los ISGs evaluados (12 y 18 h) corresponden
a los tiempos en que los títulos virales se reducen en los sobrenadantes (48h), sugiriendo que
la inhibición de la replicación del virus del dengue en consecuencia al tratamiento con IFN-λ y
la activación de ISGs.
Se ha visto que el IFN-λ se incrementa después del tratamiento con IFN-α [123, 176].
En nuestros resultados el tratamiento con IFN-λ1 incrementa la producción de la expresión de
IFN-β durante la infección del virus del dengue, permitiendo proponer que existe una
intercomunicación entre interferones del tipo α y λ en ciertos tipos celulares para producir y
responder hacia ambos tipos de interferones durante las infecciones virales, así como se ha
visto en células mononucleares o células dendríticas plasmocitoides [172, 177].
Otros estudios muestran el efecto potencial de regulación cruzada entre IFN-λ e IFN-α,
en donde el pretratamiento con cualquiera de ellos, suprime la subsecuente respuesta a IFN-
α, pero no a IFN-λ [178].
79
Estudios con IFN-α en modelos con encefalitis japonesa han demostrado que el proceso
de inflamación disminuye [179] con su administración, sin embargo el tratamiento con IFN-α
se ha asociado con diversos efectos secundarios debido a la ubicua expresión de su receptor
[124, 180, 181]. En contraste, el receptor del interferón tipo III (IFN-λ), presenta una expresión
limitada lo que disminuyen estos efectos colaterales.
En nuestro estudio con sueros de pacientes con dengue, encontramos niveles elevados
de IFN-λ1/λ3 en el grupo de fiebre por dengue, y sin diferencia entre los pacientes con fiebre
hemorrágica comparados al control (Figura 23). Estos datos muestran que la presencia de la
infección viral dispara y mantiene los niveles de IFN-λ durante el proceso infeccioso, de una
manera similar a lo encontrado en nuestros estudios realizados in vitro, y que los niveles bajos
de IFN-λ en el grupo de DH podrían ser un indicador del pronóstico clínico de los pacientes,
aunque para tener datos concluyentes haría falta hacer estudios con más pacientes.
Modelo de señalización por interferón tipo III en la infección por el virus del
dengue
Los interferones son las citocinas principales contra las infecciones virales [72]. La
infección por DENV pueden activar las vías de señalación que inducen interferón tipo III. Hay
que recordar que el ARN viral de doble cadena es reconocido como un patrón molecular
asociado a patógeno (PAMP) los cuales pueden ser reconocidos por receptores de
reconocimiento de patógenos (PRR), tales como el receptor TLR-3, TLR-9, TLR-7 y RIG-1 (Figura
24A) Aunque que el genoma de DENV es de cadena sencilla, el intermediario de replicación se
presenta como de doble cadena y activa a PRR [72, 73]. La activación de TLR-3 por el adaptador
TRIF lleva a la fosforilación del factor 3 regulador de interferón (IRF-3) y la activación de los
factores de transcripción AP-1 y NF-kB. El IRF-3 fosforilado forma un dímero que se transporta
al núcleo, uniéndose al ADN y regulando la expresión de IFN-λ1 con la colaboración de AP-1 y
NF-kB. Después del reconocimiento del ARN viral, RIG-1 y Mda5 reclutan al estimulador-1 del
promotor de IFN-β (IPS-1, también conocido como Cardif). IPS-1 está localizado en la
mitocondria y juega un papel crucial en la activación del IRF-7, IRF-3 y NF-kB [157]. IRF-7 forma
80
dímeros que son transportados al núcleo induciendo al IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3; homodímeros
de IRF-3 junto con NF-kB inducen a IFN-λ1 (Figura 24B).
Los IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3 expresados autócrina/parácrinamente se une a su receptor
expresado en la membrana celular (Figura 24C). El interferón unido a la cadena IL-28R1 inicia
el acoplamiento de la segunda cadena del receptor, IL-10R2, activando las cinasas Jak en su
lado citoplásmico e iniciando la activación de la vía Jak-STAT, fosforilando las proteínas STAT1
y STAT2 y uniendo a IRF-9, formando del factor de transcripción ISGF3, el cual se une a
elementos de respuesta a interferón en los promotores de varios genes estimulados por
interferón [86] (Figura 24C-D). El resultado es la activación de genes implicados en el
establecimiento del estado antiviral, tales como MXA, OAS1, RNasaL, PKR, IFN-λ y al promotor
de su receptor (IL28RA), tal como vimos en el presente estudio.
Es sabido que proteínas no estructurales de DENV, están implicadas en la subversión
de la respuesta inmune. Por ejemplo, NS2A, NS4A, NS4B y NS5, las cuales se ven implicadas en
la estimulación de citocinas supresoras de señalización (SOCS)-1 y SOCS3, inhibiendo de la vía
Jak/STAT y limitando la inducción de señalización de genes estimulados por interferón para
evadir la respuesta antiviral [93, 94, 182]. En este trabajo encontramos estimulación de genes
en respuesta a interferón, MXA, OAS, IFN-λ1, IFN-β, expresándose durante la infección por
DENV y durante la administración de IFN-λ1 exógeno, mostrando un efecto antiviral,
inhibiendo la replicación del virus del dengue. Adicionalmente, nuestros resultados sugieren
que la activación del promotor de IL-28R1 lleva a el aumento de la expresión del receptor en
membrana durante la infección y por administración de interferón exógeno, siendo una
estrategia de amplificación de la señalización inducida por IFN-λ en la respuesta antiviral
contra DENV.
Proponemos que la vía por la cual pueda estar ejerciendo esta actividad antiviral y
activando la expresión de MXA y los ISGs estudiados, es independiente de proteínas STAT,
activándose mediante la vía p38a MAPK (Figura 24).
81
Figura 24. Modelo de respuesta inmune por interferón tipo III durante la infección por DENV. El virus del dengue puede inducir diferentes vías de señalización. (A) Señalización por receptores del tipo Toll. La activación de TLR3 lleva al reclutamiento de cinasas IKK, cinasa de unión a TANK 1 (TBK1) y de IKKi. Estas cinasas, conjuntamente con los adaptadores TANK y NAP1, catalizan la fosforilación del factor 3 de regulación del interferón (IRF3). La activación de TLR3 también resulta en la activación de factores de transcripción AP-1 y NF-kB. El IRF3 fosforilado forma un dímero que se transporta al núcleo, se une al ADN y regula la expresión del IFN-λ1 en colaboración con AP-1 y NF-kB. (B) Señalización por el receptor RIG-1 (del inglés, retinoic acid-inducible gene-I), después del reconocimiento del ARN viral, RIG-1 y Mda5 (no mostrado) recluta al factor IPS-1 vía interacción CARD-CARD (dominio de reclutamiento de caspasas). IPS-1 está localizado en la mitocondria y actúa como adaptador jugando un papel importante en la activación de IRF-3 e IRF-7 de manera dependiente de TBK1 e IKKi. IRF-7 forma un dímero que se transporta al núcleo para inducir IFN-λ1/ λ2/λ3. Homodímeros de IRF-3 colaboran con NF-kB para inducir IFN- λ1. (C) Señalización por IFN. Los IFN-λ1/λ2/λ3 endógeno, se unen a su receptor expresado en la célula blanco, activando a STAT1 y STAT2, que junto con IRF9 forman el factor de transcripción ISGF3, el cual se une a elementos de respuesta a interferón (ISRE) (D) en el promotor de varios genes inducibles, tales como OAS, RNasa L, PKR, IRF-7, produciendo un estado antiviral celular. La activación de IRF-7, lleva a la inducción de los genes IFN-λ1/λ2/λ3 amplificando su señalización, la estimulación mediado por STAT1 activa la expresión de su receptor. DENV inhibe la vía de señalización Jak/STAT mediante las proteínas virales NS2A, NS4A, NS4B Y NS5, e induce la expresión de los reguladores negativos SOCS1 y SOCS3, sin embargo, IFN-λ1 podría ejercer su función mediante una vía independiente de STAT, la cual consiste en la activación del promotor IFN-λ1 mediada por p38a MAPK y NF-kB.
82
Se ha reportado que la vía de señalización de p38 MAPK está involucrada en la
regulación de la expresión del gen de IFN-λ1, en respuesta a PAMPs, específicamente ARN de
doble cadena. La inhibición de la p38 MAPK reduce de manera importante la expresión del IFN-
λ1 y su sobre expresión potencializa su expresión [183]. La regulación de la expresión de genes
de interferón por la señalización de p38 MAPK es independiente a la síntesis de proteínas y
son el resultado directo de la estimulación por ARN. Por lo cual es requerida la vía RIG-1/MDA-
5-MAVS-IRF3 para la activación de la expresión de IFN-λ1, no es necesaria la vía MyD88-IRF-7
y no involucra la expresión de IFN-α. Se ha sugerido que la vía p38a MAPK está ligada a la
señalización por el receptor RIG-1 y regula la expresión de genes de IFN expresados en una
etapa inicial, después de la estimulación cooperativa con IRF-3 y NF-KB para inducir una
respuesta antiviral mayor [183].
Encontramos una clara expresión de SOCS1 y SOCS3, que inhiben la señalización por
IFN-λ, tal como lo hacen con IFN-α [91], sin embargo, encontramos una respuesta favorable
en la inhibición de la replicación viral, sobre todo del establecimiento del estado antiviral
(mayor transcrito de ISGs) en horas tardías pos infección (24-48 hpi). Es posible que las
diferencias entre las cinéticas de activación de las vías de señalización involucradas jueguen un
papel importante, de hecho, las cinéticas de inducción de los diferentes ISGs difieren entre las
dos citocinas, así como IFN-λ actúa lentamente, pero permite un estado continuo de
activación, incrementando la inducción de ISGs, mientras que IFN-α no solo induce a ISGs
rápidamente, sino que también conduce a su rápido descenso [122, 170, 184]. Tomando en
consideración nuestros resultados, podría decirse que la activación retardada pero prolongada
de la señalización Jak / STAT por IFN-λ1, se debe probablemente a la inducción rápida pero
corta de la expresión de SOCS1 [185]. De acuerdo con un estudio reciente, la más rápida, pero
menos intensa activación de STAT y la inducción de ISGs por IFN-λ, pueden dar lugar a una
desensibilización parcial a IFN-α, mediante la isopeptidasa UPS18, la cual media la inhibición
de las actividades de IFN-alfa por IFN-λ [186].
83
El IFN-λ muestra un efecto antiviral [187-189], capacidad de inducción diferencial de
citocinas y quimiocinas y un efecto modulador de la respuesta pro inflamatoria [190, 191].
Nuestros resultados indican que el IFN-λ está implicado en la resolución de la infección por
DENV, abriendo posibilidades como recurso terapéutico en la infección por virus del dengue.
Con mayores estudios se podría elucidar el papel de IFN-λ en la regulación de la inflamación, y
su uso en la mejoría de la inmunopatología por DENV.
En conclusión, en este trabajo se demuestra que el interferón tipo III (IFN-λ) puede
activar la transcripción de genes en respuesta a interferón de manera independiente al
interferón tipo I (IFN-α) y favorece la eliminación de la infección por DENV. De manera
importante, mostramos que los mecanismos que permiten la producción de IFN-λ y los genes
en respuesta a IFN-λ pueden estar separados de aquellos que producen IFN-α/β durante la
infección por el virus del dengue, tales como el aumento en la expresión del receptor IL28RA
y la activación de MXA. Así como su posible papel en el progreso de la enfermedad, evitando
el desarrollo de signos de alarma.
84
9. CONCLUSIONES
1. La línea celular epitelial C33-A es un modelo útil y práctico para el estudio in vitro de la
replicación del virus del dengue y su interacción con la respuesta innata inducida por IFN-
λ.
2. La infección por el virus del dengue serotipo 2, induce la expresión del IFN-λ1.
3. Los IFN-λ1 e IFN-λ2 inhiben la replicación del virus del dengue en un proceso dependiente
de la dosis.
4. La administración de IFN-λ endógeno induce la transcripción de diversos ISGs, cuyos picos
de expresión corresponden al tiempo en el cual se presentan los títulos virales bajos en los
sobrenadantes.
5. En células Vero, las cuales no producen IFN-α, se observó una inhibición de la replicación
viral por la administración de IFN-λ1 exógeno, sugiriendo que el IFN-λ1 por sí solo puede
inhibir la infección por el virus del dengue y esta inhibición puede ser potencializada con la
administración de IFN-α.
6. No obstante, la evasión de la respuesta inmune por el virus del dengue reportado para el
IFN-α, en este trabajo se encontró la presencia y aumento del IFN-λ, sugiriendo que las vías
de interferón tipo I (IFN-α) e interferón tipo III (IFN-λ) no son necesariamente sistemas
redundantes, sino que, posiblemente exista una intercomunicación entre vías,
favoreciendo la potenciación de sus efectos.
7. Existe un incremento en los niveles de IFN-λ en sangre de pacientes con FD en comparación
a los pacientes con DH y donadores sanos, lo que podría sugerir la activa participación del
IFN-λ en la acción antiviral ejercida contra el virus de dengue in vivo.
85
10. PERSPECTIVAS
1. Evaluar la expresión de transcritos de los ISGs en células Vero durante la infección con el
virus del dengue.
2. Determinar el efecto de la administración de IFN-λ durante la infección con los serotipos
no evaluados del virus del dengue.
3. Evaluar el papel del receptor de IFN-λ en la respuesta antiviral.
4. Evaluar la expresión de IFN-α e IFN-λ en un grupo mayor de pacientes clínicamente
clasificados con fiebre por dengue y con dengue severo.
5. Determinar el grupo de genes activados en respuesta a la administración exógena de IFN-
λ e IFN-α en células C33-A y aquellos activados por la infección con el virus del dengue.
6. Evaluar el efecto inmunomodulador del interferón IFN-λ en la infección por el virus del
dengue.
86
11. ANEXOS
87
Confirmación del virus del dengue y serotipo que se utilizó
Construcción del plásmido pJET1.2/Blunt DENV2
Con el objetivo de confirmar el serotipo del virus de dengue utilizado en los experimentos
realizados en este trabajo, se realizó una RT-PCR de un solo paso utilizando iniciadores
previamente reportados por el grupo de Lanciotti R, [192] para la serotipificación del virus del
dengue (serotipo 2) y al mismo tiempo el fragmento amplificado se clonó a un vector con la
finalidad de utilizar esta construcción en la cuantificación absoluta del genoma viral por PCR
en tiempo real.
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en la construcción del plásmido pJET1.2/Blunt DENV2.
Nombre Secuencia (5’ - 3’) Posición Amplicón
(pb) Referencia
VD-D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACC 134 a 160a
511
Lanciotti R. et
al. 1992.
VD-D2 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC 616 a 644a Lanciotti R. et
al.1992.
VD-TS2 CGCCACAAGGGCCATGAACAG 232 a 252a
119
(VD-D1 +
VD-TS2)
Lanciotti R. et
al.1992.
pJET1.2
forward CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 310 a 332b 630
(119 pb +
inserto)
CloneJET PCR
Cloning Kit
(Thermo
Scientific) pJET1.2
reverse AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 428 a 450b
a Posición respecto al genoma viral DENV-2 (NC_001474.2). b Posición en el vector pJET1.2/blunt
(GenBank: EF694056.1)
88
Células C6/36 se infectaron con DENV2 por 48 h, posteriormente se realizó la
extracción de ARN viral a partir del sobrenadante mediante el sistema QIAamp Viral RNA Mini
Kit (Qiagen) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Se utilizaron los oligonucleótidos
VD-D1 y VD-D2, (Tabla 3) para amplificar una región de 511 pb del genoma del virus, que
comprende los marcos de lectura de las proteínas C y prM, utilizando el sistema SuperScript
One-Step RT-PCR with Platinum Taq (Invitrogen).
El producto amplificado por RT-PCR, se purificó del gel de agarosa mediante el sistema
ZymocleanGel DNA recovery Kit (Zymo Research) y ligado a el vector pJet1.2 (CloneJET PCR
Cloning Kit de Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células
Figura 25. Clonación de un fragmento del genoma DENV2. A) Electroforesis de la amplificación por RT-PCR de un fragmento de 511 pb que incluye los genes C y prM. B) Mapa del plásmido pJET DV2.0, conteniendo el fragmento de los genes C-prM de DENV2. C) Confirmación por PCR de la construcción obtenida.
89
transformadas (E. coli Top10, Invitrogen) con el plásmido se seleccionaron por su resistencia a
ampicilina. El vector cuenta con un gen eco471R, que se encuentra interrumpido por la
inserción del fragmento clonado, debido a que este gen es letal para la célula, sólo las células
con plásmidos que han ligado el producto de RT-PCR son capaces de propagarse (Figura 25).
Las clonas se analizaron con enzimas de restricción (XhoI) y mediante PCR con el uso de los
iniciadores VD-D1 y VD-TS2 (Tabla 3) para producir un amplicón de 119 pb. La comprobación
de la clonación se realizó por PCR con los iniciadores contenidos en el sistema de clonación,
pJET1.2/blunt-forward y pJET1.2/blunt-reverse (Tabla 3), para obtener un producto de 630 pb
que puede verse en la Figura 25C. Posteriormente la construcción se secuenció y se comparó
con secuencias del virus del dengue presentes en GenBank.
Validación de la PCR en tiempo real
Con el objetivo de cuantificar de manera relativa la concentración de los transcritos de los
genes INF-Λ1, SOCS1, SOCS3, OAS1, MXA e IFN-Β mediante RT-PCR en tiempo real, fue
necesario validar las condiciones de la PCR cuantitativa (qPCR), las concentraciones de
oligonucleótidos, concentración de sondas, concentración de ARN y eficiencia de amplificación
para después hacer los cálculos por el método de 2-ΔΔCT.
La validación del intervalo dinámico de la concentración de ARN total, para el PCR de
cada gen estudiado, normalizado contra el gen endógeno (HPRT, Applied Biosystems), se
determinó por ΔCT (ΔCT=CTproblema - CT endógeno), en donde el ΔCT obtenido sea cercano para las
concentraciones específicas de ARN, y los valores de cada ΔCT para cada concentración sean
similares, de manera que al graficar el ΔCT obtenido contra el logaritmo de la concentración de
ARN utilizada, presente una tendencia lineal de R≤ 0.03.
Se realizó una RT-PCR en tiempo real a diferentes concentraciones de ARN total
proveniente de macrófagos KG-1 (10, 20, 40, 80, 160, 320 ng), en los que se amplificaron el
gen INF-λ1 y el gen endógeno HPRT, para obtener un producto específico mostrado en la curva
90
de disociación para el transcrito de IFN-λ1, el cual se muestra en la figura 26A. Posteriormente
se realizó el cálculo de ΔCT, donde: ΔCT = CTifn-λ1 – CThprt (CT = ciclo en el que el gen blanco o el
gen endógeno alcanzan el umbral de fluorescencia en determinada dilución). Los ΔCT
obtenidos de dos muestras por duplicado, se graficaron contra el logaritmo de la
concentración analizada (Figura 26B). Al graficar los datos se obtienen una recta cuya
pendiente debe ser ≤ 0.1. De esta manera se determina la eficiencia de amplificación entre los
genes blanco y el endógeno. El intervalo dinámico encontrado fue de 40 a 160 ng de ARN total.
Se decidió utilizar para los ensayos de cuantificación relativa, una concentración de 80 ng.
Figura 26. Validación del gen HPRT como control endógeno para la cuantificación del transcrito de los genes analizados por PCR en tiempo real. A) Curva de disociación para los genes HPRT (pico izquierdo) e IFN-λ1 (pico derecho) para la determinación de la PCR en tiempo real por SYBR Green. B-E) Gráfica del intervalo dinámico de la concentración de ARN total para la cuantificación relativa de los genes OAS1, MXA, IFN-λ1 e IFN-β). Se utilizó el gen constitutivo HPRT. Se muestra la gráfica del logaritmo de la concentración de ARN contra el ΔCt (n=4).
91
En los genes SOCS1 y SOCS3 se utilizaron 100 ng de ARN total para los ensayos
realizados, y utilizando el gen endógeno RNasaP. La validación y el intervalo dinámico para
estos genes fueron determinados anteriormente [182].
Para los genes de IFN-β, OAS1 y MXA y el gen endógeno HPRT, se realizó la RT-PCR en
tiempo real a diferentes concentraciones de ARN total proveniente de macrófagos U937 (0.5,
1, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ng), mediante la utilización de oligonucleótidos específicos y sondas
tipo Taqman (Roche y Applied biosystems) para obtener productos específicos para cada
amplicón, se realizó el cálculo de ΔCT. Los ΔCT obtenidos de dos muestras por duplicado, se
graficaron contra el logaritmo de la concentración analizada (Figura 26C-E). El intervalo
dinámico a utilizar para OAS1 es entre 5 a 80 ng de ARN total, el intervalo dinámico a utilizar
para IFN-β es entre 10 a 80 ng de ARN total; decidiendo utilizar para los ensayos de
cuantificación relativa, una concentración de 40 ng. Para el gen MXA el intervalo de validación
fue entre 0.5 a 10 ng de ARN, utilizando para la cuantificación relativa, una concentración de
10 ng.
92
12. REFERENCIAS
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13. PRESENTACIÓN Y PUBLICACIÓN DE RESULTADOS
14. ESTANCIA DE INVESTIGACIÓN
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e
