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ESTUDIO MORFO-FUNCIONAL DEL TRANSPORTE DE YODO EN CULTIVOS TRIDIMENSIONALES DE ACINI DE LA GLÁNDULA PARÓTIDA DE RATÓN Morpho-Functional Study of Iodine Transport in Acini Three-Dimensional Cultures of Mouse Parotid Gland. Diana Margarita Victoria Morón Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiológicas Bogotá D.C., Colombia 2011
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ESTUDIO MORFO-FUNCIONAL DEL TRANSPORTE DE YODO EN CULTIVOS
TRIDIMENSIONALES DE ACINI DE LA GLÁNDULA PARÓTIDA DE RATÓN
Morpho-Functional Study of Iodine Transport in Acini Three-Dimensional Cultures
of Mouse Parotid Gland.
Diana Margarita Victoria Morón
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiológicas
Bogotá D.C., Colombia
2011
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ESTUDIO MORFO-FUNCIONAL DEL TRANSPORTE DE YODO EN CULTIVOS
TRIDIMENSIONALES DE ACINI DE LA GLÁNDULA PARÓTIDA DE RATÓN
Diana Margarita Victoria Morón
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Bioquímica
Directora
Clara Matilde Spinel Gómez PhD
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiológicas
Bogotá D.C., Colombia
2011
Dedicado
A mis padres
A Liberyoni
Denme un punto de apoyo y levantaré
el mundo.
Arquímedes.
4
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por ser un soporte en cada paso de mi vida.
A Liberyoni por su apoyo, ánimo y consejos para seguir adelante en situaciones difíciles.
A Atticus y Pilar por embarcarnos juntos en ésta travesía, por su amistad y por todos los
momentos compartidos dentro y fuera del ámbito académico.
A la profesora Clara Spinel por su constante apoyo, paciencia y dedicación en la dirección
de este trabajo y sobre todo por sus enseñanzas de vida.
A la Directora del Laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas del Centro
Internacional de Física, profesora Marcela Camacho por sus comentarios y aportes para la
realización de experimentos y discusión de resultados, así como proporcionarme un espacio
de trabajo.
Al Doctor Thierry Pourcher, director de la unidad TIRO en la Universidad de Niza Sophia-
Antipolis, por su colaboración con la línea, especialmente por donarnos el anticuerpo anti-
NIS.
Al Doctor Hernando Curtidor de la Unidad Ligando-Receptor de la Fundación Instituto de
Inmunología Colombiana (FIDIC) por permitirnos el uso de sus instalaciones para el
desarrollo de los experimentos.
A los profesores del Departamento de la Maestría en Bioquímica de la Facultad de
Medicina por sus constantes enseñanzas.
A mis compañeros de la línea Eleonora, Cristina, Jhon, Carolina, Alejandro y Magnolia.
A mis compañeros de maestría Eleonora, Alveiro, Dinary y Adriana.
Al Centro Internacional de Física por permitirme un sitio de trabajo y a sus administrativos
por sus constantes colaboraciones.
5
A la Universidad Nacional de Colombia por la formación académica y personal que recibí
desde mi pregrado.
A los Proyectos:
• La Dirección Académica, División de Investigación, Universidad Nacional de
Colombia (UN), Proyectos DIB 290310, 803857, 803825 y 8003014.
• Laboratorio de Biofísica, Centro International de Física, Departamento de Biología,
Facultad de Ciencias, UN. Bioterio Experimental, UN
• Laboratorio de Patología, UN.
• Unité TIRO, Université de Nice Sophia-Antipolis. France.
• COLCIENCIAS, Projet C04A02 Ecos-Nord. Proyecto 110140520161.
• Banco de la República de Colombia (2199).
que subsidiaron parte de los resultados obtenidos en este trabajo, así como mi formación
como joven investigador.
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TABLA DE CONTENIDO
Página
1. Resumen ……………………………………………………………………….. 7
2. Abstract ..……………………………………………………………………… 8
3. Lista de Abreviaturas ………………………………………………………… 9
4. Introducción ……………………………………………………………..…..... 12
5. Marco Teórico ………………………………………………………………… 15
6. Antecedentes ………………………………………………………………… 24
7. Objetivos ………………………………………………………………............. 25
7.1. General ………………………………………………………………... 25
7.2. Específicos …………………………………………………………… 25
8. Metodología …………………………………………………………………... 26
8.1. Obtención y Disección de la Glándula ……………………………… 26
8.2. Disociación y Cultivo ………………………………………………… 26
8.3. Captación de yodo radioactivo ……………………………………… 27
8.4. Organificación de yodo radioactivo ………………………………… 27
8.5. Cuantificación de DNA ………………………………………............. 28
8.6. Pruebas Estadísticas …………………………………………............. 28
8.7. Inmunohistoquímicas ……………………………………………… 28
9. Resultados y Discusión ……………………………………………………….. 29
10. Conclusiones …………………………………………………………………. 51
11. Perspectivas ………………………………………………………………… 52
12. Referencias ……………………………………………………………........... 53
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1. RESUMEN
El transporte del yoduro en la glándula tiroides involucra su captación en la membrana
basal de los tirocitos por medio de la proteína cotransportadora sodio/yoduro (NIS,
Natrium-Iodide Symporter), y en la región apical su unión a la proteína tiroglobulina para
formar las hormonas tiroides, las cuales juegan un papel fundamental en la regulación del
metabolismo. Sin embargo, se han caracterizado otros tejidos, entre los cuales se
encuentran las glándulas salivales, implicados en el transporte de dicho ión. En años
recientes se ha determinado la expresión de NIS en glándulas salivales pero su localización
todavía es controvertida así como su función en estas glándulas exocrinas.
En este trabajo se realizó el cultivo de acini y organocultivos de glándula parótida de ratón
y se estandarizó el método para determinar la entrada de 125I- y su posible organificación en
las estructuras acinares en cultivo. Se observó que en ambos sistemas de cultivo existe
captación y organificación de 125I- de manera proporcional a la concentración de NaI en el
medio extracelular, contrario a lo reportado en la literatura donde sugieren que en este
tejido no existe un proceso de organificación. Sin embargo, la evidencia experimental no
permitió implicar al cotransportador NIS como responsable del transporte de I-, ya que en
presencia de perclorato (inhibidor competitivo del transporte de yoduro mediado por NIS)
no hubo disminución en la captación, aunque por métodos inmunohistoquímicos se
corroboró la expresión de NIS en células de ducto de las glándulas submandibular, parótida
y sublingual de ratón.
Palabras Claves: Glándula parótida, cultivo tridimensional, acini, cotransportador de
sodio-yoduro (NIS), yoduro, captación, organificación.
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2. ABSTRACT
Active transport of iodide into the thyroid gland is catalyzed by the transmembrane
transport protein (natrium-iodide symporter, NIS) in the basal surfaces of the
thyrocytes. In the apical region, iodide binds to the thyroglobulin protein to form thyroid
hormones, which play a key role in metabolism. However, other tissues have been involved
in the iodide transport, like the salivary glands. In recent years, it has been determined the
expression of NIS in salivary glands but its location and role are still controversial in these
exocrine glands.
In this work, we standardized the method for measuring 125I - uptake and its possible
organification in acini cultures and organocultures of mouse parotid gland. We show that 125I- uptake and organification, in both types of cultures, are proportional to the NaI
concentration in the extracellular medium, contrary to reports in the literature where
salivary glands don’t show iodide organification. Nevertheless, we hadn’t enough evidence
to implicate natrium-iodide symporter in the iodide transport shown in mouse parotid gland
cultures because there was no decrease in iodide uptake in perchlorate presence
(competitive inhibitor of iodide transport mediated by NIS), although NIS presence was
confirmed by immunohistochemical methods in duct cells of mouse submandibular, parotid
and sublingual gland.
Keywords: parotid gland, three-dimensional culture, acini, sodium-iodide cotransporter
(NIS), iodide uptake, organification.
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3. LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Término
µCi MicroCurios (medida de radioactividad; 1 µCi = 37000 Bq)
125I- Ión yoduro 125 (radioisótopo)
131I- Ión yoduro 131 (radioisótopo)
ACh Acetilcolina
Acini Plural del latín acinus; acinos
Acinus Latín para racimo de uvas; acino
AMPc Adenosín monofosfato cíclico
AQP-5 Acuaporina-5
ATPasa Enzima cataliza la hidrólisis del adenosín trifosfato (ATP)
Bq Medida de radioactividad del Sistema Internacional
Br- Ion bromuro
Ca+2 Ion calcio
Cl- Ion cloruro
ClO-4 Ión perclorato
CO2 Dióxido de carbono
DAG Diacilglicerol
DIDS Ácido- 4,4’-diisotiociano- 2,2’-disulfánico-estilbeno
DIT Diyodotironina
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Fe2+ Ion ferroso
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Abreviatura Término
g Gramos
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
HCO3- Ion bicarbonato
HSG Líneas celular Human Salivary Gland cells
I- Ión yoduro 127 (no radiactivo o frío)
InsP3 Inositol-1,4,5–trifosfato (IP3)
K+ Ion potasio
LPO Lactoperoxidasa
M Molaridad (medida de concentración)
M1 Receptor muscarínico tipo 1
min Minuto
MIT Monoyodotironina
mL Mililítro
mOsm Miliosmoles
Na+ Ion sodio
NaCl Cloruro de sodio
NIS Sodium-iodide symporter (SLC5A5)
NO2- Ion nitrito
ºC Grados centígrados
PBS Phosphate buffered saline
PKA Proteína kinasa A
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Abreviatura Término
PLCβ Fosfolipasa Cβ
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucléico mensajero
SCN- Ion tiocianato
SFB Suero fetal bovino
SLC5A8 Solute carrier 5A8 (también denominada: apical
iodide transporter-AIT)
T3 3,5,3’- Triyodotironina
T4 3,5,3’,5’- Tetrayodotironina
Tg Tiroglobulina
TPO Tiroperoxidasa
TSH Hormona Tirotrópica (Thyroid-Stimulating
Hormone)
U/mL Unidades por mililitro
x g Gravedades
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4. INTRODUCCIÓN
El yoduro es un elemento fundamental para la síntesis de las hormonas tiroides. La
capacidad de transporte de yoduro (I-) en la glándula tiroides es un proceso regulado por la
hormona tirotrópica (TSH) y por la concentración de yodo en la circulación (Corvilain et
al. 1994, Eng et al. 1999 y. 2001, Kogai et al. 1997, Riedel et al. 2001).
El transporte de yodo en las células foliculares o tirocitos se encuentra a cargo de diferentes
proteínas. El cotransportador NIS ubicado en la membrana basal de los tirocitos (Dai et al.
1996, De La Vieja et al. 2000) utiliza el gradiente de sodio generado por la bomba de
sodio/potasio ATPasa a nivel basolateral para transportar iones I- (Dohán y Carrasco 2003).
En la membrana apical se encuentran la Pendrina y la SLC5A8 inicialmente denominada
Apical Iodide Transporter (AIT) y que presenta una alta homolología con NIS (Kohn et al.
2001, Rodríguez et al. 2002). La pendrina media en parte el transporte de yoduro del
tirocito al lumen, mientras que la SLC5A8 o AIT no actúa como transportadora de I- (Ondo
et al. 2010).
La expresión del cotransportador NIS en la glándula tiroides y en algunos tipos de cáncer
de origen tiroideo, ha permitido el uso de yoduro radioactivo (131I-) como terapia para
combatir esta enfermedad. Un estudio clínico demostró que un 33% de los pacientes que
son tratados con radioterapia para cáncer de cabeza y cuello presentan sensación de
sequedad en la boca (xerostomía subjetiva), mientras que un 15% continúan
experimentando este problema hasta tres años después del tratamiento. Adicionalmente, se
reportó disminución en la producción de saliva (xerostomía objetiva) en la mitad de sujetos
después del primer año de terapia y un 14% la mantienen hasta el segundo año (Solans et
al. 2001). Por lo tanto, aunque los efectos secundarios son observados transitoriamente, este
fenómeno se mantiene en un 15% de los pacientes, generando molestias y complicaciones
que han sido asociadas a daño y/o pérdida de tejido en las glándulas salivales.
A pesar de que las glándulas salivales son el tejido más importante en captación de yoduro
después de la tiroides, existen evidencias contradictorias sobre la expresión de la proteína
13
NIS en el parénquima de las glándulas salivales, desconociéndose aún su función en este
tejido (Dohán et al. 2003).
Muchas técnicas de cultivo se han desarrollado para tratar de imitar la morfología de las
células epiteliales y por ende conservar los dominios de membrana especializados y la
polaridad intracelular que caracterizan a este tipo de células. El cultivo de células aisladas
ha sido utilizado en diferentes estudios (Brown et al. 2004), conservando los gránulos de
secreción por un día y sugiriendo que en este tipo de cultivos hay una pronta pérdida de la
morfología y funcionalidad celular. Los estudios de Horie et al. (1996), indican que las
células en monocapa pierden su polaridad desde el inicio del cultivo y presentan escasas
microvellosidades, aunque conserven los complejos de unión en la región apical de las
células. Estas células sufren cambios rápidamente por lo que no necesariamente expresan
todas las funciones del tejido. Sin embargo, cultivos en monocapas donde hay mayor
confluencia, pueden mantener los gránulos de secreción hasta tres días y promover la
formación de estructura semi-esféricas (Qi et al. 2007).
Las líneas celulares también han sido ampliamente caracterizadas para validarlas como
modelos experimentales, pero se ha observado que pierden características del tejido acinar
parental (Carmel et al. 1999) como proteínas de uniones cerradas (tight junctions),
polarización celular, capacidad de transportar iones a través de la membrana (Baum y Tran
2006), entre otras. Un ejemplo de estas líneas celulares son las células HSG (human
salivary gland cells), provenientes de células de ducto intercalar de la glándula
submandibular humana transformadas por radiación y que tienen la capacidad de
diferenciarse hacia células con características acinares en cultivos con elementos de la
membrana o lámina basal (Crema et al. 2006) pero no expresan la proteína acuaporina 5
(AQP-5), la cual se encarga del transporte del agua a nivel apical en las células acinares
(Tada et al. 1999).
Actualmente, la reconstrucción tridimensional de estructuras acinares a partir de células
aisladas es un campo de estudio esencial, ya que podría tener aplicaciones clínicas para la
regeneración de tejido. Sin embargo, aunque se ha logrado la formación de estructuras
14
parecidas a acinos a nivel morfológico y la expresión de genes como el de amilasa, AQP-5,
entre otras, la expresión de éstas proteínas en sus respectivos dominios de membranas no es
muy clara (Joraku et al. 2007).
En nuestro laboratorio, se ha trabajado en cultivo tridimensional de acini y el organocultivo
de la glándula submandibular de ratón, conservándose la polaridad celular así como su
estructura hasta tres días de cultivo (Victoria 2006, Cuervo 2007). Por lo tanto, este
proyecto propone determinar la presencia de NIS en la glándula parótida. Además,
desarrollar el cultivo de acini de la glándula parótida de ratón y determinar su capacidad de
captación y organificación de yoduro.
15
5. MARCO TEÓRICO
El yodo es un elemento escaso pero esencial para la supervivencia, crecimiento y desarrollo
de los mamíferos debido a su importancia en la síntesis de las hormonas tiroides (3,5,3’-
triyodotironina y 3,5,3’,5’- tetrayodotironina; T3 y T4 respectivamente) (Ekholm y
Björkman 1972). En las últimas dos décadas han sido ampliamente estudiados los
mecanismos a nivel molecular responsables del transporte del I- en la glándula tiroides.
La tiroides es una glándula endocrina, constituida por folículos tiroideos formados por una
capa de células epiteliales (tirocitos) que aíslan una cavidad central o lumen, donde secretan
moléculas que forman el coloide (Werner e Ingbar 1971).
El transporte de I- desde el plasma hacia los tirocitos es mediado por NIS (Spitzweg et al.
2001). Esta glicoproteína de membrana (Levy et al. 1998), ubicada en la región basolateral
de los tirocitos, acopla la entrada de yoduro hacia el citoplasma de la célula (Fig. 1),
utilizando el gradiente de sodio extracelular, ya que estequiométricamente transporta
activamente un I- por dos Na+ (Dohán y Carrasco 2003). Se ha demostrado que NIS
también transporta el ión perclorato (ClO-4), siendo 10 veces más afín con respecto al I-, por
lo que actúa como inhibidor competitivo de dicho ión (Dohán et al. 2007).
Cuando el I- entra en las células es translocado hacia el lumen folicular a través de proteínas
transportadoras localizadas en la membrana apical de los tirocitos (Fig. 1). Estudios
funcionales han identificado a la pendrina como principal responsable del transporte de I-
apical (Yoshida et al. 2004). Sin embargo, se ha evidenciado que pacientes con el síndrome
de Pendred, enfermedad caracterizada por mutaciones que llevan a la pérdida de la
funcionalidad de esta molécula, pueden presentar disfunción parcial en la organificación o
ningún síntoma si son expuestos a concentraciones suficientes de yoduro (Iwata et al.,
2011). Adicionalmente, ratones knock-out para pendrina tampoco presentan problemas en
la producción de T3 y T4 bajo condiciones normales de I- (Everett et al. 2001). La SLC5A8
(AIT) es una proteína inicialmente postulada como transportadora apical de I- (Rodríguez et
16
al. 2002), pero estudios posteriores mostraron que está principalmente relacionada con el
transporte de monocarboxilatos (Paroder et al. 2006).
Figura 1. Representación esquemática de las proteínas involucradas en el transporte de
yoduro y formación de hormonas tiroides en un tirocito de un folículo de la tiroides.
Elaborado por Jhon Erick Rivera. TSH: Hormona tirotrópica, rTSH: Receptor de la TSH,
NIS: Cotransportador Na+/I-, TPO: Tiroperoxidasa, DUOX: Dual Oxidasa, AIT: SLC5A8,
Tg: Tiroglobulina, MIT: Monoyodotironina, DIT: Diyodotironina, T3: Triyodotironina,
T4: Tetrayodotironina, RER: Retículo endoplamático rugoso.
En presencia de peróxido de hidrógeno generado por la proteína dual oxidasa (DUOX), la
tiroperoxidasa (TPO) en la membrana apical realiza la oxidación y unión del I2 a residuos
tirosina de la tiroglobulina (Tg), denominando a este proceso organificación.
Posteriormente realiza el acoplamiento de los residuos yodotirosinas para la formación de
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las yodotironinas (Fig. 2). La tiroglobulina yodada es endocitada y en los lisosomas se
generan las hormonas tiroideas (T3 y T4) que son liberadas al torrente sanguíneo. El I- de las
monoyodotironinas (MIT) y diyodotironinas (DIT) es liberado por desyodasas en los
lisosomas y reciclado al lumen folicular (Braverman y Ütiger 2005).
Figura 2. Representación esquemática del acople de yodotirosinas para la formación de
hormonas tiroideas (yodotironinas).
Tomado de: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/thyroid/synthesis.html.
La tiroides es un tejido altamente especializado en el transporte de I-, concentrándolo de 20
a 40 veces con respecto al plasma. Las glándulas salivales también tienen la capacidad de
transportar I-, aún cuando no se ha descrito que se lleve a cabo el proceso de organificación
de dicho ión en estos tejidos (Cohen y Myant 1959).
En los mamíferos existen tres glándulas salivales principales: la parótida que produce una
secreción serosa (proteínas), la sublingual de secreción mucosa (mucopolisacáridos) y la
submandibular de secreción mixta (serosa y mucosa) (Fawcett 1995, Melvin et al. 2005).
El epitelio secretor de las glándulas salivales está compuesto por acini (latín plural de
acinus: racimo de uvas). Cada acinus presenta 10 a 30 células piramidales que forman una
luz muy pequeña en el centro (Fig. 3). Las células acinares se caracterizan por su polaridad
morfo-funcional: en la región o polo basal de las células se ubican los organelos de la
síntesis de proteínas alrededor del núcleo (Fawcett 1995), y en la región o polo apical se
acumulan los gránulos de secreción formados por la fusión de vesículas que salen del
18
complejo de Golgi, permitiendo llevar a cabo las funciones de secreción y regular el tráfico
transepitelial de iones y solutos (Williams 1984).
Figura 3. Representación esquemática de acinos de glándulas salivales. Tomado de
http://www.isto.ucl.ac.be/safe/digest.htm.
Las principales funciones de las secreciones de las glándulas salivales son: iniciar el
proceso de digestión, hidratar y lubricar la boca y esófago (Kagami et al. 2008) y generar
una primera defensa contra microorganismos, todas estas llevadas a cabo a través de la
saliva (Thomas y Aune 1978).
La saliva es un compuesto acuoso formado por electrolitos y proteínas (Fawcett 1995). Se
ha determinado que el fluido inicialmente secretado por las células acinares es una solución
isotónica con el plasma, rica en cloruro de sodio (NaCl). A través de su paso por los ductos
se lleva a cabo la reabsorción del NaCl mientras se secreta potasio y bicarbonato (K+ y
19
HCO3- respectivamente), produciendo una solución hipotónica de aproximadamente 100
mOsm (Melvin et al. 2005) (Tabla 1).
Tabla 1. Concentraciones de iones reportadas en plasma y saliva para el hombre.
Ion Plasma [mM] Saliva primaria
[mM] Saliva final [mM]
Na+ 145 136(b)* ----
Cl- 110; 100 – 140(b) 112(b)* 10 – 50(d)
K+ 5 8,4(b)* ----
Ca+2 2,5 – 5 ---- ----
SCN-
0,008 – 0,046(a)
0,02 – 0,12(b)
---- 1 – 5
(b); 0,5 – 2
(d);
0,17(e); 1,2(f)
Br- 0,02 – 0,1
(b) ---- 0,011 – 0,08
(e)
NO2- 0,0005 – 0,0036
(a) ---- ----
I- 0,0001 – 0,0006
(b) ----
0,01(d);
0,00028 – 0,022(e);
0,0138(f)
HCO3- ---- 25
(c) 140
(c)
NaCl ---- 140(c)
----
H2O2 ---- ---- 0,008 – 0,013(d)
(a) Exner et al. 2004;
(b) Furtmüller et al. 1998;
(c) Melvin et al. 2005;
(d) Ihalin et al. 2003;
(e) Hogg y Jago 1970;
(f) Tenovuo y Mäkinen 1976. *Valores reportados para rata.
(---) Valores no reportados en la literatura.
Para la producción del fluido inicial, las células acinares expresan varias proteínas que
trabajan en conjunto para secretar agua y electrolitos. Se ha identificado que éstas células
expresan a nivel basolateral la bomba Na+/K+ ATPasa que mantiene el gradiente
electroquímico utilizado por otras proteínas para la incorporación de iones, especialmente
Cl-. El cotransportador Na
+/K
+/2Cl
- y los antiporters Cl
-/HCO3
- y Na
+/H
+ (ubicados en la
20
región basolateral), son proteínas encargadas de concentrar Cl- en el citoplasma de las
células acinares en contra de su gradiente electroquímico, utilizando los iones sodio,
potasio, bicarbonato e hidrogeniones (los dos últimos generados en el citoplasma por la
enzima anhidrasa carbónica) (Melvin et al. 2005, Turner y Sugiya 2002) (Fig. 4).
Posteriormente, el Cl- sale hacia el lumen a través de canales cloruro ubicados en la
membrana apical y activándose canales potasio en la región basolateral para mantener el
eflujo de dicho ión (Melvin et al. 2005, Turner y Sugiya 2002). En la región apical de las
células acinares y de ducto de la glándula submandibular de ratón se expresa un
cotransportador Na+/ HCO3-, que podría estar involucrado en el movimiento de dichos
iones y la regulación del pH intracelular (Luo et al. 2001). Además, la expresión de
acuaporina 5 (AQP-5) en la región apical de las células acinares media el eflujo de agua
para la formación de la saliva primaria (Funaki et al. 1998, Gresz et al. 2001) (Fig. 4).
Actualmente se especula que NIS estaría a cargo del transporte de iones tiocinato y yoduro
en los ductos donde podrían empezar a ejercer su función bactericida (Geiszt et al. 2003).
Sin embargo, esto no ha podido confirmarse. Además, en los trabajos de Jhiang y
colaboradores (1998) y Spitzweg et al. (1999) muestran que el marcaje de esta proteína es
principalmente basal en células de ducto de glándulas exocrinas de humano (salivales y
lagrimal).
21
Figura 4. Representación esquemática del modelo de formación de saliva. Modificado de
Melvin et al. 2005 y Turner y Sugiya 2002. AQP: acuaporina 5, AC: Anhidrasa Carbónica,
ATP: Adenosín Trifosfato.
La salivación es un proceso regulado por la concentración de Ca+2
intracelular. En las
células acinares se expresan varios receptores que generan movilización de calcio como
son: los receptores muscarínicos, α1-adrenérgicos, receptores purinérgicos, entre otros. Sin
embargo, se ha demostrado que ratones knock-out para los receptores muscarínicos tipo 1 y
3 (M1 y M3) presentan disminución en la producción de saliva en un 60% y 85%
respectivamente, mientras que en los doble knock-out M1M3 la disminución es de casi el
100% (Gautam et al. 2004). Además, en presencia de fenilefrina (agonista de receptores
α1-adrenérgicos) se mantiene el proceso de secreción aún en los ratones knock-out para
M1M3 (Nakamura et al. 2004), lo cual sugiere que los receptores α1-adrenérgicos ayudarían
al proceso de formación de saliva pero en presencia de un estímulo diferente
(noradrenalina).
↑[Ca+2]intra
AC CO2 + H2O ↔ HCO3
- + H+
ATP
3Na+
2K+
K+
Cl-
HCO3+
H+
Na+
Cl-
AQP H2O
?
Na+
H+
Cotransportador
Na+/K+/2Cl-
?
Cotransportador
Na+/HCO3-
Cl- Na+
Cl- Na+
ATP
3Na+
2K+
Na+
H+
Na+
H+
HCO3-
Cl-
22
Los receptores muscarínicos son proteínas de membrana de siete dominios
transmembranales activados por acetilcolina (ACh) y acoplados a proteínas G. Los
receptores M1, M3 y M5 están ligados a proteínas Gq triméricas que estimulan la vía de la
fosfolipasa Cβ (PLCβ) y la produción de diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5–trifosfato
(InsP3), mientras que los tipos M2 y M4 están acoplados a proteínas G triméricas que
estimulan o inhiben la adenilato ciclasa y por lo tanto regulan la producción del segundo
mensajero adenosín monofosfato cíclico (AMPc) (Melvin et al. 2005, Caulfiel y Birdsall
1998).
Las proteínas de las glándulas salivales son sintetizadas por las células acinares,
almacenadas en gránulos de zimógeno que se ubican en la región apical y secretadas al
lumen por exocitosis en respuesta a un estímulo. Los componentes principales de los
gránulos de zimógeno son α-amilasa, lactoperoxidasa (LPO), lisozima, mucinas, lipasa,
histatina, cistatina, proteínas ricas en prolina y proteínas ricas en leucina, entre otras, que
intervienen en procesos de digestión y protección de la cavidad oral (Yao et al. 2003;
Wilmarth et al. 2004).
La lactoperoxidasa es una enzima que pertenece a la familia de las peroxidasas de
mamífero, se caracteriza por presentar un grupo hemo y generar la oxidación de sustancias
orgánicas e inorgánicas en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2), funcionando como
un agente antimicrobiano (Adak et al. 2001). La LPO cataliza la reacción (1), generando la
producción de hipoyodito (OI-) y ácido hipoyodoso (HOI) en el caso del ión yoduro.
El proceso de exocitosis es regulado principalmente por la vía del AMPc el cual es
atribuido principalmente a los receptores β-adrenérgicos tipo 2 (estimulados por
noradrenalina). Estos receptores están unidos a proteínas G estimuladoras de la adenilato
LPO + H2O2 + X- ↔ OX-
OX- + H+ ↔ HOX (1)
23
ciclasa, la cual se encarga de generar AMPc y la activación de la proteína kinasa A (PKA)
que lleva a cabo procesos de fosforilación sobre diferentes proteínas. Sin embargo, también
puede ser necesaria la presencia de Ca+2 para la fusión de los gránulos de zimógeno en la
membrana plasmática y por lo tanto la liberación de su contenido (Ishikawa et al. 2006).
24
6. ANTECEDENTES
Se ha descrito que el transporte de yoduro ocurre en glándulas salivales, mucosa gástrica,
glándula mamaria lactante, carcinoma de pulmón, entre otros (De La Vieja et al. 2000) pero
fue hasta los trabajos de Spitzweg et al. (1998) y Ajjan et al. (1998), donde se evidenció la
expresión del ARN mensajero de NIS por amplificación del transcrito por RT-PCR en
varios tejidos humanos como el timo, pituitaria, estómago, testículos, próstata, ovario,
glándula adrenal, glándula mamaria, páncreas, corazón y glándulas salivales, entre ellas las
glándulas parótida y submandibular. Sin embargo, Lacroix y colaboradores (2001)
evaluaron nuevamente la expresión del ARNm de NIS en varios tejidos humanos a través
de la técnica PCR en tiempo real y determinaron expresión positiva en glándula
submandibular, mucosa gástrica y colon pero a diferencia de los trabajos de Spitzweg et al.
(1998) y Ajjan et al. (1998), no encontraron expresión del ARNm de NIS para glándula
parótida, páncreas, entre otros tejidos.
Estudios inmunohistoquímicos sugieren la presencia de NIS en células del ducto de
glándulas salivales de humano (Jhiang et al. 1998). En 1999, Spitzweg y colaboradores
reportan expresión de la proteína tanto en células acinares como del ducto en glándulas
salivales de humano, evidenciando un mayor marcaje para las últimas. Sin embargo,
aunque este último trabajo sugiere un marcaje positivo para NIS en acinos, este resultado es
aislado en la literatura y no ha sido corroborado. La información presentada para la
expresión del transcrito y la proteína NIS es contradictoria e insuficiente para concluir al
respecto, así que para entender el transporte de yodo en las glándulas salivales es
indispensable aclarar la expresión y localización de la proteína cotransportadora de
sodio/yoduro en la glándula parótida y su capacidad de captación y/u organificación de este
tejido.
25
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo General
Estudiar morfológica y funcionalmente el transporte de yoduro en acini en cultivo
de glándula parótida de ratón.
7.2 Objetivos Específicos
Establecer la presencia y localización de la proteína cotransportadora de
sodio/yoduro en tejido completo y en los acini de la glándula parótida en cultivo.
Determinar la localización de la proteína cotransportadora de sodio/yoduro en los
acini de la glándula parótida en cultivo con diferentes concentraciones de yoduro en
el medio de cultivo.
Determinar la capacidad de captación y/u organificación de los acini de la glándula
parótida en cultivo.
26
8. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1 Obtención y Disección de la Glándula
Se utilizaron ratones adultos de la cepa ICR de 30 g de peso del Bioterio Experimental de la
Facultad de Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. El manejo de
los animales se hizo bajo las exigencias del National Research Council, 1996 y las
condiciones éticas según la resolución No. 8430 de 1993 de la República de Colombia. Los
ratones fueron sacrificados con inyección intraperitoneal con Euthanex® (0,01mL/30 g) y
perfundidos con suero fisiológico durante 4 minutos. Posteriormente, se retiraron los
lóbulos de la glándula parótida e inmediatamente se colocaron en medio DMEM con
penicilina y streptomicina (1mL/100mL). Se realizó la microdisección bajo estereoscopio
(Wild M3C, Heerbrugg) en condiciones de asepsia, eliminando el tejido adiposo y
conectivo y cortando el parénquima en fragmentos pequeños.
8.2 Disociación y Cultivo
Los fragmentos de tejido se sometieron a cuatro digestiones enzimáticas con 250 U/mL de
colagenasa tipo II (EC 232-582-9; Sigma C-6885) y dispasa 0,05 U/mL (EC 3-4-24-4;
Gibco, 17105-041) a 37 °C con agitación continua de 120 osc/min y con tiempos de
digestión de 10, 15, 15, 15 min respectivamente. Al final de cada tiempo se realizó la
disociación mecánica con pipetas Pasteur de diámetro ancho (2 mm) y sin región capilar. El
material obtenido del proceso de disociación enzimática y mecánica fue centrifugado por 5
min a 100 x g para precipitar los acini. Se retiró la solución con colagenasa dejando sólo el
precipitado que fue lavado tres veces con medio DMEM + 2% de suero fetal bovino (SFB)
por centrifugación a 100 x g para eliminar la colagenasa y los desechos celulares. El
material de la última centrifugación fue filtrado a través de una malla de poros de 300 µm
de diámetro, para eliminar el material de mayor tamaño. El precipitado de acini se
resuspendió en DMEM + 0,5% SBF y se preincubaron de 4 a 12 horas a 37 ºC en una
atmósfera de 95 % aire - 5% CO2 y 100% de humedad. Se centrifugó y se realizó cambio de
medio. Antes de iniciar el cultivo se llevó a cabo el examen de exclusión con azul Trypan
27
0.5% para determinar la viabilidad (Herrera et al. 2008). El medio de cultivo se cambió
cada tres días.
El tejido de la glándula parótida que quedó después de las disociaciones enzimáticas fue
lavado y puesto en cultivo como se describió para los acini, dando origen a los
organocultivos.
8.3 Captación de yodo radiactivo
Los acini y los organocultivos fueron incubados a 37 °C, atmósfera saturada en humedad y
5% de CO2 -95% aire, en 500 µl de DMEM + 0,5% de SFB que contenía 2,5 µCi de Na125I
(caliente) como trazador y diferentes concentraciones de Na127I (frío): 1x10-10 M, 1x10-7 M,
1x10-5 M y 1x10-3 M. Después de dos horas de incubación, los cultivos fueron lavados con
medio HBBS y centrifugados a 100 x g. La radioactividad del precipitado de acinos y de
tejido fue determinada en un contador de pozo γ (eficiencia del 90%) y normalizada por µg
de ADN en cada muestra.
Como blancos se emplearon tubos vacios para determinar el background de cada pozo y el
control de decaimiento de la radiactividad se hizo con tres muestras de 0,001 µCi/µl de
Na125I para corregir todos los puntos en los que se empleó el mismo lote de yoduro
radioactivo, permitiendo determinar la confiabilidad del manejo del mismo.
8.4 Organificación del yodo radioactivo
Después de la medición de captación en acini y organocultivos se añadió 1 ml de PBS +
100 µl de albúmina pura al 5% + 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 20%, se agitó y se
dejó por 16 h a 4°C. Luego, se centrifugó a 3.400 x g por 10 min y se lavaron tres veces a
4°C con TCA al 10% que contenía 100 veces más NaI frío que la dosis empleada durante el
cultivo. La radioactividad se midió en un contador de pozo γ y se normalizó por µg de
ADN de cada muestra. De igual forma, se emplearon controles para el decaimiento de la
radioactividad y background de los pozos.
28
8.5 Cuantificación del DNA
La cuantificación del DNA se realizó por el método de difenilamina (Burton 1956), cuya
reacción produce un compuesto azul que es determinado por espectrofotometría a 600 nm λ
de longitud de onda.
8.6 Pruebas Estadísticas
El análisis estadístico se realizó con los programas GraphPad Prism versión 5.04 y
GraphPad InStat versión 3.10. Para el análisis de los datos se utilizó la prueba no
paramétrica de Kruskal-Wallis, ya que con el número de datos no se pudo demostrar si
presentan homogeneidad de varianzas por el método de Bartlett y tampoco que presentaran
distribución normal. Se utilizó un nivel de significancia de 0,05.
8.7 Inmunohistoquímica
La localización de NIS se realizó en secciones de tejido de la glándula parótida de ratón
previamente fijada en paraformaldehído y embebida en parafina. Los cortes se
desparafinaron con xilol por 5 min (dos veces).
La incubación con el anticuerpo policlonal anti-NIS (donado por el Dr. Thiery Pourcher,
Universidad de Nice Sophia-Antipolis, Francia) se realizó por 16 horas a 4°C a una
concentración de 1:1000. Posteriormente se lavó tres veces con solución de bloqueo
(tampón fosfato salino con 1% de suero). Después se incubó con el sistema avidina-biotina
acoplado con peroxidasa (1:100) por 1h a 18°C. Se reveló con diaminobenzidina por 30 seg
y se contrastó con hematoxilina-eosina. En este protocolo no se utilizó ninguna solución de
desenmascaramiento de antígenos.
29
A B
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los acini serosos de la glándula parótida de ratón fueron aislados y mantenidos en cultivo
hasta 24 h. Se realizó el monitoreo a través de microscopio invertido y azul de Trypan. Se
evidenció que los acini son estructuras abiertas con un tamaño aproximado de 30 µm (Fig.
5B), ya que tienden a separarse del ducto intercalar (Fig. 5A). Se observó en las secciones
semi-finas que los acini serosos aislados y en suspensión, presentan la morfología descrita
para el tejido completo, donde el núcleo se ubica en la parte basal de la célula acinar y los
gránulos de secreción en la región apical. En trabajos previos sobre la glándula
submandibular de ratón se mostró que las células mantienes sus uniones cerradas,
conservando la ultra-estructura del acini hasta tres días en cultivo sin emplear matriz
extracelular (Cuervo 2007). Adicionalmente, los cultivos fueron viables en todos los grupos
experimentales, incluso en presencia de concentraciones de NaI de 10-3 M en el medio de
cultivo, la cual ha sido reportada como tóxica en algunos trabajos en tiroides en monocapa
y otros modelos que tratan de imitar la estructura folicular tiroidea, entre otros tejidos
(Vitale at al. 2000, Many et al. 1992; Shrivastava et al. 2006).
Figura 5. Corte semi-fino de acinus seroso de ratón a 0 días de cultivo (coloración con azul
de toluidina, MO, barra 5 µm), (Cuervo 2007) (A). Agrupación de acini a 24 horas de
cultivo fijados con paraformaldehído (MI, barra 15 µm) (B).
La captación y la organificación de yoduro se basaron en los protocolos descritos para
cultivos de folículos de la glándula tiroides (Spinel 1987). Sin embargo, fue necesaria la
30
estandarización de diferentes condiciones experimentales que permitieran la medición de
yoduro radiactivo (125I-) en los cultivos de acini y organotípicos de la glándula parótida de
ratón, ya que en la literatura no existen antecedentes de medición de éstos parámetros en
cultivos de acini.
Se realizó una curva de calibración con diferentes dosis de radiactividad con el fin de
determinar la cantidad de 125I- que puede ser detectado por el contador γ. Se observó que
hasta 6 µCi la detección es lineal (Fig. 6), indicando que la concentración de yoduro
radioactivo que se utilizó como marcaje en los experimentos (2,5 µCi/500 µL de medio) es
apropiada como trazadora del yoduro frío, ya que en este punto no hay sobre-estimulación
del sistema de detección del equipo. La figura 6 es representativa de seis experimentos
consecutivos.
Figura 6. Curva de calibración para dosis crecientes de Na125I detectados por el contador γ.
cpm: cuentas por minuto; R2: Coeficiente de determinación de la ecuación de la gráfica;
µCi: microcurie.
Posteriormente, se estandarizaron las mejores condiciones de lavado para lograr una
determinación real del yoduro captado y organificado, evitando artificios en las mediciones.
Con las diferentes soluciones de lavado empleadas se obtuvo que a partir del tercer lavado
la radiactividad es aproximadamente 10 veces menor con respecto al primero y este valor
no varía al realizar un cuarto lavado (Fig. 7A). Adicionalmente, se evaluaron diferentes
soluciones de lavado. Cuando se utilizan 4 mL de solución hay una menor cantidad de
yoduro con relación a las otras soluciones desde el primer lavado, por lo que la captación
31
de yoduro tiende a ser menor con los lavados sucesivos. Se observó que con sólo PBS
(tampón fosfato salino) como solución de lavado, la captación es mayor comparado con los
otros dos tratamientos, mientras que con la presencia de perclorato (ClO4- 30 µM) en los
lavados, tiende a disminuir este valor, lo cual podría deberse por un eflujo del yoduro que
entró a las células o que en esta solución el perclorato actúe como un ión de lavado,
removiendo uniones inespecíficas del 125I-.
Se ha descrito que las uniones inespecíficas de yoduro se dan sobre moléculas que son
susceptibles a la oxidación como ocurre con Fe2+ de los grupos hemo y que este error
experimental puede controlarse colocando exceso de I- frio que compita con el 125I- caliente
para dichas uniones y evitando que interfieran con las mediciones (Harmatz et al. 1987). Se
puede concluir que con tres lavados (2 mL c/u) son suficientes para eliminar el yoduro libre
en cultivo de acini sin utilizar gran cantidad de soluciones de lavado y obteniendo valores
de captación de manera repetitiva, confirmándose lo descrito para folículos tiroideos (datos
no publicados). El ClO4- se eliminó en los lavados, ya que podría estar interfiriendo en la
dinámica de movimiento del yoduro en el modelo por ser un inhibidor competitivo para el
transporte a través de NIS, de acuerdo a lo reportado para la tiroides (Dohan et al. 2007).
Los resultados de captación fueron de 0,00045 pmol de yoduro/µg ADN, 0,00025 pmol/µg
ADN y 0,0002 pmol/µg ADN para las diferentes soluciones de lavado, mientras que los
valores de organificación fueron de 0,00035 pmol de yoduro/µg ADN y 0,00015 pmol/µg
ADN (Fig. 7B), lo cual sugiere que tanto la captación como la organificación de yoduro
disminuyen en presencia de perclorato y al aumentar el volumen de la solución de lavado.
El porcentaje de organificación/captación fue de 77%, 56% y 73% respectivamente (Fig
7C), indicando que del 100% del yoduro captado un 77% fue unido a molécula(s)
orgánica(s) para el primer caso.
La organificación en las diferentes condiciones evaluadas fue un resultado innovador, ya
que indicaría que el yoduro se une a alguna(s) molécula(s) en los acini de glándula parótida
de ratón, contradiciendo los datos existentes en la bibliografía de glándulas salivales con
respecto a este tema (Brown-Grant 1961, Cohen y Myant 1959, Fletcher et al. 1956), y es
similar a lo observado en folículos cerrados de tiroides de rata en cultivo, donde la relación
32
A B
C
organificación/captación es de aproximadamente 75% en condiciones de 1 x 10-10 M de
Na127I en el medio de cultivo en ausencia de TSH (Spinel et al. 1990), aunque en el tejido
tiroideo se conoce que el yoduro se une principalmente a la proteína tiroglobulina. En los
demás modelos de cultivo de tejido tiroideo la organificación del yoduro es del 15 al 25 %,
ya que se pierde la estructura folicular por ser modelos de monocapa o pseudofolículos
(Herrera et al. 2008).
Figura 7. Número de lavados empleados en las diferentes soluciones para medir la
radioactividad captada por los acini (A). Captación y organificación del I- para las
diferentes soluciones de lavado en el cultivo de acini (B). Los porcentajes corresponden a
la relación de los valores de organificación/captación para cada tratamiento (C). Los acini
fueron expuestos a concentraciones de 1 x 10-10 M de NaI frío en el medio de cultivo.
PBS: Tampón fosfato salino; Inhibidor: 30 µM de perclorato (ClO-4).
33
En la Figura 8A se presenta que, de igual forma al experimento anterior, el tercer lavado es
aproximadamente 10 veces menor con respecto al primero y no hay diferencia en la
captación a partir del tercer lavado con PBS + 1 x 10-5 M de NaI. Adicionalmente, se
realizó un experimento sin células donde el medio es marcado con yodo radioactivo y se
observó que con el tercer lavado de 2 mL c/u, las cuentas por minuto (cpm) son cercanas a
cero (dato no mostrado), confirmándose que con tres lavados de 2 mL son suficientes para
retirar el yoduro libre.
Para evaluar si el transporte de yoduro es mediado por la proteína NIS, se incorporó el
perclorato (12,5 µM) al mismo tiempo que el 125I- en el medio de cultivo y se incubó por
2h. En los acini se observó que en ausencia de inhibidor la captación fue de 0,012 pmol de
yoduro/µg de ADN, mientras que la presencia de perclorato se asocia con una disminución
en este valor (aprox. 0,008 pmol de yoduro/µg de ADN). La organificación es de
aproximadamente 0,006 pmol de yoduro/µg de ADN tanto en ausencia como en presencia
del inhibidor (Fig. 8B) y la relación organificación/captación fue de 53% y 62%
respectivamente (Fig 8C), mostrando que por lo menos la mitad del yoduro captado es
organificado, sin importar la cantidad que entre a las células. Estos valores parecen sugerir
que existe un efecto del perclorato (12,5 µM) sobre la captación. Sin embargo, el análisis
estadístico no muestra diferencias significativas en los valores de captación con y sin
inhibidor.
34
Figura 8. Número de lavados empleados para medir la captación en el cultivo de acini en
presencia y ausencia del inhibidor ClO-4 (12,5 µM) durante 2h de cultivo (A). Captación y
organificación del I- en presencia y ausencia de perclorato durante la incubación; p =
0,0725 (B). Los porcentajes corresponden a la relación de los valores de
organificación/captación para cada tratamiento (C). Los acini fueron expuestos a
concentraciones de 1 x 10-10 M de NaI frío en el medio de cultivo y los lavados fueron
realizados con 2 ml PBS + Na127I (1 x 10-5 M). * n = 3 y n = 2 para cultivo en ausencia y
presencia de perclorato respectivamente.
Se quiso evaluar el efecto de diferentes soluciones de lavado con o sin NaI. En la figura 9
se muestra disminución en los pmol de yoduro captados y organificados cuando se lava en
presencia de exceso de yoduro, aproximadamente 0,004 pmol de yoduro/µg de ADN para
la captación de I- y 0,002 pmol de yoduro/µg de ADN para la organificación del I- con
lavados en exceso de NaI frío, mientras que en ausencia de NaI frío se obtuvo valores
cercanos a 0,008 pmol de yoduro/µg de ADN para la captación y 0,004 pmol de yoduro/µg
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
NaI NaI + Perclorato
% O
rga
nif
ica
ció
n/C
ap
tació
n
Incubación
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
1 2 3 4
Ca
pta
ció
n (
I-to
tal p
mo
l/µ
g A
DN
)
No. de Lavados
NaI + inhibidor
NaI + inhibidor
NaI
NaI
NaI
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
NaI NaI + Perclorato
yo
du
ro t
ota
l (p
mo
l/µ
g A
DN
)
Incubación
Captación
Organificación
A B
C
35
A B
de ADN para la organificación. Posiblemente como se mencionó anteriormente, el I- se une
inespecíficamente a ciertas moléculas y la adición de yoduro frío en los lavados remueve el 125I- de estas uniones.
Los porcentajes de organificación/captación del I- son cercanos al 60%, por lo que no
difieren en las diferentes soluciones de lavado, aún en presencia o ausencia de NaI. Se
puede concluir que cuando se utiliza un medio como DMEM es necesaria la adición de
exceso de yoduro frío en los lavados para disminuir las uniones inespecíficas en esta parte
del marcaje.
Figura 9. Efecto de diferentes soluciones de lavado con y sin Na127I (1 x 10-5 M) sobre la
captación y organificación de acini cultivados en medio DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle Medium) suplementado con 0,5% de SFB (A). Los porcentajes corresponden a la
relación de los valores de organificación/captación para cada tratamiento (B).
Concentración de Na127I disuelta en el medio de cultivo 1 x 10-10 M.
36
Debido a que en este tejido no se han descrito procesos de organificación del yoduro, se
evaluó si algún componente del suero podrían estar actuando como sustratos para la unión
dicho ión. En la figura 10A se muestra que al cultivar los acini en DMEM con y sin 0,5%
de SFB presentan valores muy cercanos entre sí, captación de 0,001 pmol de yoduro/µg de
ADN y organificación de 0,0005 pmol de yoduro/µg de ADN. Adicionalmente, los
porcentajes de organificación/captación fueron de 49% y 48% respectivamente (Fig. 10B),
sugiriendo que ni las proteínas u otras moléculas del suero están generando los datos de
organificación del I-.
Figura 10. Efecto del suero fetal bovino (SFB) sobre la captación y organificación de acini
cultivados en medio DMEM (A). Valores de organificación/captación para cada
tratamiento (B). Concentración de Na127I disuelta en el medio de cultivo 1 x 10-10 M, los
lavados fueron realizados con HBBS + 1 x 10-8 M de Na127I.
Se evaluó la dosis de perclorato necesaria para inhibir el transporte de I- en cultivos de acini
con el fin de determinar si podría estar mediado por el cotransportador NIS. Se evidenció
que ni 30 ni 120 µM de ClO-4 inhiben el transporte de yoduro en concentraciones de
1 x 10-10 M ni 1 x 10-7 M de NaI presentes en el medio de cultivo, ya que los valores de
captación en las diferentes concentraciones de perclorato son similares con y sin inhibidor
(Fig. 11A). En presencia de 30 µM de perclorato aparece una tendencia a dismunir la
captación del I-. Sin embargo, con 120 µM se observa un efecto similar a lo mostrado en
ausencia del inhibidor (Fig. 11A). En la literatura no ha sido descrito un aumento del
A B
37
transporte de dicho ión en presencia de perclorato para ninguno de los tejidos que
concentran I- y estos resultados no pueden ser explicados con la variabilidad de los
individuos ya que los experimentos fueron realizados a partir del mismo tejido.
Al analizar los datos estadísticamente no muestran diferencias significativas en los
tratamientos a pesar de las tendencias que se observan en las gráficas. Los resultados
demuestran que en el cultivo de acini el transporte de yoduro no se ve afectado en presencia
de dosis crecientes de perclorato (30 y 120 µM), lo que sugiere la ausencia de un efecto
dosis-respuesta y por lo tanto, que posiblemente la entrada de yoduro no es mediado a
través NIS, ya que la dosis empleada en este experimento ha sido descrita como inhibitoria
en varios sistemas incluyendo el tejido tiroideo (Dohan et al. 2007). Se ha reportado que
NIS tiene una afinidad 10 veces mayor por el ClO-4 con respecto al I- en tiroides (Dohán et
al. 2007), lo cual indicaría que bajo estos parámetros incluso 30 µM de ClO-4 sería
suficiente para disminuir la captación del I- ya que se encontraría en exceso (100000 y 100
veces con relación a 1 x 10-10 M y 1 x 10-7 M de NaI respectivamente).
Adicionalmente, las gráficas de organificación del I- mostraron variabilidad de manera
acorde a los valores de captación (Fig. 11B), mientras que la relación organificación/
captación fue del 60 al 30% (Fig. 11C), aunque debe destacarse que siguen reportándose
valores de organificación en los diferentes tratamientos evaluados.
38
0
20
40
60
80
100
0 30 120 0 30 120
1E -10 NaI 1E -7 NaI% O
rga
nif
ica
ció
n/C
ap
tació
n
[Inhibidor]
C
BA
Figura 11. Efecto de diferentes concentraciones de perclorato sobre la captación (A) y
organificación (B) de acini en cultivo en presencia de concentraciones de 1 x 10-10 M y
1 x 10-7M de NaI disuelta en el medio de cultivo. Valores de organificación/captación para
cada tratamiento (C). p = 0,0585 y p = 0,4666 respectivamente. *n = 2.
Se evaluó el efecto de diferentes dosis de perclorato sobre el transporte de yoduro en
organocultivos de la glándula parótida y se evidenció que de manera similar a lo ocurrido
en acini, no hay disminución en la captación de I- en presencia de dosis crecientes de
perclorato (30 y 120 µM) bajos las diferentes concentraciones de NaI presentes en el medio
extracelular (Fig. 12A). Para valores de 1 x 10-5 M y 1 x 10-3 M de NaI se llegó a emplear
hasta 300 µM del inhibidor sin evidenciar disminución en la captación (datos no
mostrados). Es importante destacar que a concentraciones de 1 x 10-10 M y 1 x 10-3 M de
NaI pareciera que existe una leve tendencia a aumentar la captación con 30 y 120 µM de
perclorato con respecto al control (Fig. 12A). Sin embargo, el análisis estadístico demostró
que las diferencias presente no son significativas.
1
39
De igual forma que los acini en cultivo, se observa organificación de yoduro en los
organocultivos incluso a grandes concentraciones de NaI en el medio extracelular y el
comportamiento es acorde a los valores de captación registrados para cada tratamiento
(Fig. 12B). Sin embargo, cabe destacar que el comportamiento que se obtuvo de la relación
organificación/captación es menor en presencia de 1 x 10-3 M de NaI en el medio
extracelular (Fig. 12C).
Cohen y Myant (1959) demostraron que aunque la glándula parótida contribuye al
transporte de I- en ratones, esta función es llevada a cabo principalmente por la glándula
submandibular, lo que podría explicar en parte que los cultivos de parótida no se vean
afectados en presencia del perclorato, contrario a lo que ocurre en humanos donde la
principal responsable es la parótida. Además, Fletcher y colaboradores (1956) reportaron
que el ión ClO-4 (0,5 µM) es capaz de inhibir del 60 al 80 % la captación de I- en
organocultivos de glándula submandibular de ratón. Debe tenerse en cuenta que tanto en
glándulas salivales como en páncreas exocrino han sido descritos una gran variedad de
canales Cl- (Melvin 1999) que podrían estar mediando el transporte de yoduro, ya que
incluso algunas de estas proteínas presentan mayor afinidad por el yoduro y pueden
transportar iones más grandes como formato, propionato, entre otros (Arreola et al. 1995).
Para evaluar el transporte de I- a través de éstas proteínas, sería necesario llevar a cabo
experimentos de captación en presencia de DIDS (ácido- 4,4-diisotiociano-2, 2’-
disulfónico-estilbeno) u algún otro inhibidor de canales cloruro.
40
0
20
40
60
80
100
0 30 120 0 30 120 0 30 120 0 30 120
1E -10 NaI 1E -7 NaI 1E -5 NaI 1E -3 NaI% O
rga
nif
ica
ció
n/C
ap
tació
n
[Inhibidor]
BA
C
Figura 12. Efecto de diferentes concentraciones de perclorato sobre la captación (A) y
organificación (B) de I- en organocultivos de glándula parótida en presencia de
concentraciones de 1 x 10-10 M, 1 x 10-7M, 1 x 10-5M y 1 x 10-3M de Na127I disuelta en el
medio de cultivo. Valores de organificación/captación para cada tratamiento (C). p=0.2573;
p=0.0774; p=0.1376 y p=0.6677 respectivamente. *n = 2.
Para el analisis de la cinética del perclorato se realizó el análisis de Lineweaver-Burk con el
fin de determinar los valores experimentales de los parámetros cinéticos de Km (constante
de Michaelis) y Vmax (velocidad máxima de la reacción) de Michaelis-Menten para las
diferentes dosis utilizadas en los experimentos. En acini se obtuvo que 30 µM de ClO-4
genera una disminución del Km y Vmax (Tabla 2, Fig. 13A) con respecto a los valores sin
inhibidor, sugiriendo una inhibición acompetitiva, es decir, que el perclorato se estaría
uniendo al complejo transportador-yoduro por un sitio diferente al de unión de yoduro. Sin
embargo, a 120 µM del inhibidor se obtuvo una disminución del Km y un pequeño
aumento de la Vmax, sugiriendo que se da la formación de un complejo terciario donde el
perclorato estaría afectando la captación de yoduro, al disminuir la afinidad del
41
BA
transportador por éste ión. Ahora bien, los datos en organocultivos de parótida muestran
disminución tanto de la Vmax como del Km en las dos concentraciones de perclorato
empleadas (Tabla 2, Fig. 13B), sugiriendo que afecta la afinidad y la captación del yoduro.
Por lo tanto, estos datos no muestran el efecto competitivo que el ión perclorato tiene sobre
la captación de yoduro que ha sido descrito para la glándula tiroides (Cohen et al, 2007) y
sugiriendo, junto con la evidencia experimental obtenida, que el cotransportador NIS no es
el principal responsable de la captación de yoduro en la glándula parótida de ratón o que
presenta un comportamiento distinto a lo descrito en la literatura.
Figura 13. Gráfico Lineweaver-Burk para la captación de yoduro en presencia de
diferentes dosis de perclorato en cultivo de acini (A) y organocultivo (B) de glándula
parótida de ratón. µM: concentración en micromolar de perclorato. *n = 2.
Captación Acini Captación Organocultivo
[ClO4-]
µM Ecuación Vmax Km Ecuación Vmax Km
0 Y=8E-09x + 5,9234 0,169 1,352E-09 Y=6E-08x + 0,0199 52,631 3,1579E-06
30 Y=8E-09x + 15,576 0,0642 5,136E-10 Y=3E-08x + 0,1368 7,353 2,2059E-07
120 Y=5E-09x + 5,0931 0,196 9,8E-10 Y=2E-08x + 0,1821 5,494 1,0988E-07
Tabla 2. Valores de Km (Constante de Michaelis-Menten) y Vmax (Velocidad máxima de
reacción) para el cultivo de acini y organocultivo, obtenidos a partir del diagrama
Lineweaver-Burk en las diferentes concentraciones de perclorato.
42
Al evaluar la captación de yoduro en el tiempo en organocultivos de glándula parótida de
ratón bajo diferentes concentraciones de Na127I en el medio de cultivo, se observó que en
1 x 10-10 M de NaI (Fig. 14A) hay un aumento progresivo en la captación y organificación
hasta 6h y una pequeña disminución hasta las 12h. En concentraciones de 1 x 10-7 M de NaI
se alcanza un máximo de captación a las 9h en cultivo (Fig. 14B). En condiciones de
fuertes concentraciones de yoduro 1 x 10-5 M y 1 x 10-3 M se alcanza un máximo de
captación a las 3h y 0,5h respectivamente (Fig. 14C y D), lo que sugiere una saturación del
sistema ya que los valores no varían en el tiempo. En cuanto al proceso de organificación
de este yoduro captado, también presenta una tendencia a aumentar con el tiempo inclusive
a concentraciones de 1 x 10-3M de NaI, aunque la relación organificación/captación en las
dosis 1 x 10-5 M y 1 x 10-3 M de NaI son inferiores respecto a las otras dosis de yoduro,
posiblemente debido a que este proceso requiera de la activación de diferentes proteínas
como ocurre en tiroides. Los datos indican que es un sistema saturable en el tiempo
asociado a la concentración de yoduro existente en el medio extracelular.
En tiroides se ha evidenciado que grandes concentraciones de yoduro (1x10-3 M) actúan
como regulador de NIS, disminuyendo su expresión a nivel de ARNm y proteína (Eng et al.
2001) y asociándose con la presencia de la proteína en vesículas citoplasmáticas (Riedel et
al. 2001). Serrano-Nascimento y colaboradores (2001) demostraron que la presencia de
yoduro se asocia con reducción de la longitud de la cola poliA de ARNm de NIS, lo cual
podría generar susceptibilidad al ataque de ribonucleasas, cambios en la vida media del
ARNm, diminución en la eficiencia de la traducción, incluso que el yoduro afecte la
transcripción del gen; así mismo se propone que puede ejercer un papel regulador sobre
otras proteínas.
Si bien este trabajo no propone resolver la presencia de un sistema de regulación similar
sobre la expresión de ARNm y proteína de NIS en glándulas salivales, si propuso
determinar cambios en la localización de la proteína en presencia de dosis crecientes de
yoduro. Sin embargo, no fue posible llevar a cabo dicho objetivo debido a problemas de
inespecificidad observados en las inmunohistoquímicas con los anticuerpos anti-NIS.
43
Cabe resaltar que nuestros resultados parecen indicar un sistema de regulación del
transporte de yoduro, ya que la relación organificación/captación muestra una reducción en
presencia de fuertes concentraciones de yoduro en organocultivos de glándula parótida de
ratón.
Figura 14. Captación y organificación del yoduro en el tiempo en organocultivos de
glándula parótida de ratón en presencia de diferentes concentraciones de Na127I en el medio
de cultivo 1 x 10-10 M (A), 1 x 10-7M (B), 1 x 10-5M (C), 1 x 10-3M (D). Valores son
expresados como promedio ± SE (n = 2).
Adicionalmente, los organocultivos de parótida de ratón muestran una tendencia lineal en la
captación y organificación de yoduro en presencia de dosis crecientes de yoduro en el
medio extracelular hasta por un periodo de 2h (Fig. 15A y B). A partir de las 3h y hasta las
24h evaluadas no se observa un comportamiento lineal (Fig. 15C y D). Sin embargo, se
muestra que a dosis de hasta 1 x 10-5M de NaI no existe saturación a estos tiempos mientras
44
que a concentraciones de 1 x 10-3M de NaI el sistema se satura al igual que ocurre en la
tiroides, sugiriendo que el sistema de captación de yoduro se satura rápidamente en el
tiempo y es dependiente de la concentración del yoduro en el medio de cultivo. Harden y
Alexander (1968) obtuvieron que se requieren concentraciones mayores de 10-3M de
yoduro en plasma para disminuir la concentracion de I- en saliva, lo cual podría sustentar
este comportamiento lineal hasta 2h en presencia de dicha dosis y que no se alcanza una
saturación máxima en el tiempo.
Figura 15. Efecto de la concentración de NaI [M] extracelular en la captación y
organificación de yoduro a diferentes tiempos de exposición en organocultivos de glándula
parótida de ratón. 0,5 h (A), 2h (B), 3h (C), 24h (D). *n = 2.
Se ha demostrado que el metimazol (MMI) es un compuesto que inhibe de manera
irreversible la acción de las peroxidasas (Adak et al. 2001, Brandyopadhyay et al. 1993,
Brandyopadhyay et al. 1995). Se empleó este compuesto para determinar si el proceso de
A B
C D
45
B A
organificación visto reiterativamente a través de los diferentes experimentos de esta tesis es
dependiente de una reacción enzimática mediada por la lactoperoxidasa, como ha descrito
para la tiroperoxidasa en la tiroides. En la figura 16A se muestra que hay una disminución
en la captación de yoduro correspondiente al 30 y 40% a 2 y 50 µM de metimazol
respectivamente con respecto al control, aunque en la literatura no se ha descrito algún
efecto de este compuesto sobre la captación.
Para el caso de la organificación (Fig. 16B), se observa que 2 µM de MMI no se afecta la
organificación con respecto al control pero con 50 µM de MMI los valores son cercanos a
cero. Se ha demostrado que el yoduro en exceso protege a las peroxidasas de ser inhibidas
por metimazol, ya que este inhibidor se une cerca o en el sitio de unión al yoduro de la
lactoperoxidasa (Brandyopadhyay et al. 1995). Por lo tanto, a bajas concentraciones del
inhibidor si se evidencia el efecto protector mientras que con 50 µM habría una mayor
cantidad de moléculas que podrían estar compitiendo con el yoduro. Estos datos sugieren
que la organificación podría ser un proceso enzimático mediado por LPO y no una reacción
inespecífica. Sin embargo, faltaría complementar estos resultados con las diferentes
concentraciones de yoduro que se muestran a lo largo de este documento para confirmar
esta hipótesis.
Figura 16. Efecto del metimazole sobre la captación y organificación del yoduro en
organocultivos de glándula parótida de ratón en presencia de 1 x 10-3M (A). Efecto del
metimazole sobre la organificación en unidades relativas de yoduro total
(pmol/µg ADN) (B).
46
Para corroborar la presencia de NIS se llevaron a cabo inmunohistoquímicas en secciones
de tejido de glandula tiroides (Fig. 17B) y en glándulas salivales (Fig. 17D-F). Con los
anticuerpos anti-NIS se observó marcaje en algunos folículos tiroideos principalmente
aquellos que tienen un lúmen pequeño y en las células del ducto primario y estriado de
glándulas salivales, lo cual es acorde a lo reportado en la literatura (Jhiang et al. 1998);
siendo cualitativamente más evidente el marcaje en las glándulas submandibular y
sublingual que en la parótida de ratón, lo cual confirmaría lo propuesto por Cohen y Myant
(1959), donde muestran que la glándula submandibular de ratón es la principal involucrada
en el transporte de yoduro. Adicionalmente, en glándula submandibular se observó un
marcaje que podría estar relacionado con la presencia de NIS en acinos (Figura 17E). En
trabajos previos de nuestro laboratorio se ha observado un marcaje intracelular evidente en
algunas células acinares serosas (Bernal 2006).
La diferencia en la resolución de las imágenes puede deberse a que en las
inmunohistoquímicas realizadas para este trabajo no se utilizó la solución targer retrieval
(Dako), la cual ayuda a desenmascarar sitios de unión y mejora la detección para los
sistemas enzimáticos, debido a que los blancos iniciales de la tiroides eran positivos sin la
solución. Por otro lado, los anticuerpos empleados tanto en el 2006 como en este trabajo
fueron anticuerpos donados gentilmente por el Profesor Thierry Pourcher y corresponden a
anticuerpos policlonales no comerciales de los cuales no se conoce el epítope de
reconocimiento.
Para determinar la presencia de NIS en acinos se propone utilizar un sistema de detección
más sensible como inmunofluorescencia, que permitiría realizar el marcaje directamente
sobre los acini en el cultivo, mejorando el sistema de detección de proteínas que están en
poca cantidad y determinar su localizacion específica por medio de la tecnica de
localización de dos proteínas (colocalización).
47
Figura 17. Marcaje de la proteína NIS (1:1000) en secciones de tejido normales de ratón.
Control anticuerpo primario en tiroides 10x (A), tiroides 20x (B), control anticuerpo
primario en parótida 40x (C), parótida 40x (D), submandibular 40x (E), sublingual 40x (F).
Folículo tiroideo (Fo), Ducto (Du), Acinus (Ac).
F
C
E
D
B A
F
Du
A
Ac
Ac
Du
Du
Du
Ac
F
48
El yoduro puede unirse a la lactoperoxidasa por medio de uniones electrostáticas
posiblemente a través de residuos Arg e His presentes cerca al grupo hemo de la proteína,
ya que al ser modificados disminuye la afinidad por yoduro. Además, ésta unión es
favorable para valores de pH < 6 mientras que a pH neutro diminuye su afinidad aunque
siguen presentandose algunas interacciones (Adak et al. 2001, Huang et al. 2006). Por lo
tanto, aunque la unión de yoduro a la lactoperoxidasa podria estar relacionada con los datos
de organificación obtenidos en la tesis, no podrían descartarse interacciones del yoduro con
otras moléculas presentes en las células.
Sarimo y Tenovuo (1977) marcaron 1 mL de saliva humana con Na125I en presencia de
60 µM H2O2 y 50 µg de lactoperoxidasa por 30 min a 30ºC y se evidenció que existía
incorporacion de 125I- de manera covalente en proteínas, principalmente albúmina sérica y
amilasa, pero sólamente en presencia de LPO y peróxido de hidrógeno. Sin embargo, no
pudieron determinar el papel fisiológico de esta incorporación de yoduro sobre las proteínas
de la saliva. Igualmente, Huber y colaboradores (1989) demostraron que la LPO está
asociada a la presencia de proteínas yodadas. En sus experimentos separaron la fracción de
proteínas del sistema LPO-I- a través de una membrana de díalisis y observaron que el
proceso de yodación se mantenía, lo cual les hizo proponer que la LPO podría estar
produciendo un intermediario del I- que puede incorporarse en las proteínas. Se ha
establecido que el poder oxidante para tiocianato, yoduro y cloruro es -0.77, -0.54 y -1.36 V
respectivamente, los cuales podrían explicar su capacidad de oxidarse y reducir diferentes
moléculas (Exner et al. 2004.)
En la literatura existen reportes sobre el efecto antibacterial que el ion tiocianato ejerce
sobre diferentes organismos, incorporadonse de manera covalente sobre residuos His, Tyr,
Arg principalmente y generando procesos de óxido-redución en grupos sulfidrilo de
cisteínas, lo cual podría estar alterando la la estructura terciaria de las proteínas (formación
de puentes disulfuro) y por lo tanto su función (Hogg y Jago 1970, Thomas y Aune 1977,
Thomas y Aune 1978). En general, los ácidos de halógenos como ácido hipocloroso, ácido
hipoyodoso, ácido hipobromoso (HOCl, HOY, HOBr) pueden reaccionar con diferentes
moléculas como ADN, proteínas y lípidos. En las proteínas, el HOCl puede incorporarse de
49
manera covalente pero esta unión es inestable, transfiriendose a otras moléculas y
generando clivajes sucesivos en las diferentes proteínas. Estas reacciones son dependientes
del pH, de la concentración y las especies de iones formados, ya que se ha visto que
algunos iones pueden ser más reactivos con respecto a otros y actúan de manera diferencial
sobre los distintos grupos funcionales (Hawkins et al. 2003). En presencia de yoduro se
pueden dar procesos de oxidación sobre diferentes aminoácidos y generar clivaje sobre las
proteínas involucradas pero el rango óptimo de pH para este proceso es de 4 – 6, mientras
que en el pH fisiológico de la saliva (6,7 – 7,5) se favorece principalmente la formación de
I3- (reacción 2), que también puede actuar en los procesos anteriormente descritos
(Alexander 1974).
A pesar de que la evidencia experimental podría sugerir que los mecanismos por los cuales
se genera yodación de moléculas en glándulas salivales corresponden a funciones
desestabilizantes (antimicrobianas), no puede descartarse que existan otros roles para dicho
proceso. Hörnberg y colaboradores (2005) demostraron que en la transtirretina, proteína
dimérica presente en el suero que se encargada de transportar y distribuir la T4 en el
organismo, presenta tres bolsillos de unión a iones yoduro que están involucrados en la
estabilización del dimero así como del sitio de unión a la hormona tiroidea. Así mismo, en
un estudio diferente se demostró que existe máxima incorporación de I- en proteínas y baja
en en lípidos a concentraciones de 1 x 10-5M de K131I; mientras que la unión del yoduro a
proteínas disminuía en aproximadamente un 50% con respecto a la incorporación máxima a
concentración de 1 x 10-4M y que la unión de I- a lípidos aumenta con la concentración de
yoduro en el medio extracelular. Además, en presencia de dosis crecientes de metimazole
hay disminución en la incorpuración de yoduro tanto en proteínas como en lípidos (en un
80% y 20% respectivamente a 10 µM del inhibidor). Se ha descrito que los ácidos grasos
insaturados pueden ser yodados por accion de la LPO y que a partir de ácido araquidónico
pueden derivarse diferentes compuestos yodados. Pereira y colaboradores (1990)
identificaron que el 2-yodohexadecanal es el principal yodolípido formado en las diferentes
I3- ↔ I2 + I-
(2)
50
condiciones experimentales evaluadas en el modelo de tiroides de caballo y sugirieron la
presencia de diferentes yodolactonas, las cuales se han visto involucradas en la regulación
de diferentes procesos fisiológicos.
51
10. CONCLUSIONES
- La expresión de la proteína NIS se evidenció en los ductos de las glándulas salivales
principales pero no se puede descartar su presencia en acini de la glándula parótida.
- Se logró estandarizar el protocolo de marcaje de yoduro radioactivo para el cultivo de
acini y organocultivo de glándula parótida de ratón:
Marcaje por 2h con Na125I y tres lavados cada uno con 2 mL de solución HBSS y
exceso de yoduro frío (100 veces con respecto a la concentración de NaI colocado
en el medio extracellular al inicio del cultivo).
- El cultivo de acini y los organocultivos evidenciaron captación y organificación del 125I-, las cuales están asociadas a la concentración de NaI en el medio de cultivo y son
saturables en el tiempo.
- La adición de 0,5% de suero fetal bovino no interfiere en los datos de organificación
obtenidos en este trabajo.
- El perclorato pareciera estar afectando tanto la capacidad de captación de yoduro como
la afinidad por dicho ión aunque su papel como inhibidor competitivo de NIS no logró
evidenciarse claramente en la glándula parótida de ratón.
- 50 µM de metimazol se asocia con disminución en la capacidad de organificación en
organocultivos de parótida de ratón en presencia de 10-3M de NaI en el medio de
cultivo.
Los resultados de este trabajo muestran por primera vez procesos de organificación del
yoduro en acinos y organocultivos de glándula parótida de ratón en cultivo. Sin embargo,
hay que tener en cuenta que con los métodos empleados no fue posible determinar la
identidad de las moléculas yodadas. En este trabajo se demostró que al conservar la unidad
secretora de la glándula parótida en cultivo, es posible estudiar la entrada de iones a las
células acinares y determinar otros procesos funcionales, como la organificación del
yoduro.
52
11. PERSPECTIVAS
Para complementar los datos obtenidos en este trabajo, es necesario realizar las mediciones
de eflujo del yoduro ya que los acini son estructuras abiertas que presentan diferentes
proteínas transportadoras tanto a nivel basal como apical. Adicionalmente, sería interesante
mirar el comportamiento de la captación y organificación de yoduro en presencia de varios
inhibidores de canales cloruro para relacionar estas moléculas como posibles implicadas en
el transporte de I-. En cuanto a la organificación, falta complementar el efecto del
metimazole en diferentes concentraciones de NaI en el medio extracelular y verificar si la
organificación se da en proteínas y/o en lípidos, identificando sobre que molécula
específica se da la yodación para poder mirar la posible función que este mecanismo pueda
ejercer en glándulas salivales. Por último, es indispensable determinar la expresión de la
proteína NIS en acini por un método más sensible que el empleado en esta tesis. La
utilización del microscopio confocal no sólo daría luces en la presencia o ausencia de la
molécula sino también la localización en compartimentos específicos.
53
12. REFERENCIAS
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