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ESTUDIO PRELIMINAR DE LO S FLUIDO S ENZIMÁTIC OS PRO DUC IDO S PO R LA P LANTA C ARNÍVO RA Dio naea muscip ula Y EL USO DE ESTO S EN LA DEG RADACIÓ N DE SUS TRATO S PRO TÉIC OS Proyecto de grado presentado como requisito en el program a de Ingeniería Ambiental Por: DIANA PAO LA DÍAZ BETANCOURTH FELIPE VALDERRAMA ESCALLÓN Asesor: MANUEL SALVADO R RO DRÍGUEZ SUSA UNIVERSIDAD DE LO S ANDES FAC ULTAD DE ING ENIERÍA DEPARTAM EN TO DE ING ENIERÍA C IVIL Y AMB IEN TAL BO GO TÁ D. C. 2007
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ESTUDIO PRELIMINAR DE LOS FLUIDOS ENZIMÁTIC OS PRODUC IDOS POR LA PLANTA C ARNÍVORA Dionaea muscipula Y EL USO DE ESTO S EN
LA DEGRADACIÓ N DE SUS TRATOS PROTÉIC OS
Proyecto de grado presentado como requisito en el program a de Ingeniería Ambiental
Por: DIANA PAO LA DÍAZ BETANCOURTH FELIPE VALDERRAMA ESCALLÓN
Asesor: MANUEL SALVADO R RO DRÍGUEZ SUSA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FAC ULTAD DE ING ENIERÍA
DEPARTAMEN TO DE INGENIERÍA C IVIL Y AMB IEN TAL BO GO TÁ D. C.
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RES UMEN
Plantas de la especie Dionaea muscipula, caracterizadas como carn ívoras fueron compradas
en Medellín, momento en el que fue construido un invernadero para poder mantenerlas con
luz, agua, temperatura y el alimento adecuado para su crecimiento.
Entre octubre y diciem bre del año 2006 se extrajeron m uestras de enzimas de var ias plantas
con el fin de analizar su contenido y hacer una caracterización de la actividad enzimática.
Mediante pruebas de electroforesis en gel de poliacr ilamida se intentó determinar
cualitativamente la distribución de las proteínas en diferentes sustratos y en los complejos
sustrato-enzima que fueron extraídos de las trampas asociadas a las p lantas. Los sustratos
empleados para est udiar la actividad enzimática fueron carne de res y moscas de la especie
Drosophila melanogaster. Aunque los resultados de las electroforesis no fueron los
esperados, se pudo obtener información importante para futuros estudios.
Por último, se realizaron pruebas de digestión que permitieron vislumbrar la actividad
enzimática, midiendo el tiempo que le toma a una trampa el degradar cierta cantidad de
sustrato dada la producción de un cierto volumen de fluidos enzimáticos. Estas pruebas
permitieron saber que el efecto de degradación de las enzimas en las plantas si se presenta,
consolidando un primer paso hacia un estudio formal del potencial de degradación de diversos
compuestos de interés ambiental generados en industrias cárnicas, lecheras y otras donde el
contenido de proteínas es importante.
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AGRADEC IMIENTOS
A nuestro asesor, Manuel Rodríguez Susa, por transmitirnos su conocimiento y guiarnos
cuando no encontrábamos soluciones.
A nuestros padres por el apoyo moral que nos brindaron durante el desarro llo de éste
proyecto.
A Carlos Alberto Jaramillo y María Fernanda Gómez del Laboratorio de Diagnóstico
Molecular y Bioinformática (LDM B) de la Universidad de los Andes por su colaboración en
las pruebas de electroforesis.
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TABLA DE CONTENIDO S
1. INTRODUCCIÓN..............................................................................................................5 2. OBJETIVOS.......................................................................................................................6
2.1 Objetivo General ..............................................................................................................6 2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................6
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .........................................................................................7 3.1 Generalidades de la planta................................................................................................7
3.1.1 Hábitat natural...........................................................................................................7 3.1.2 Descripción de la planta ............................................................................................7 3.1.3 Propagación ............................................................................................................. 11 3.1.4 Períodos: Crecimiento y Dormancia ....................................................................... 11 3.1.5 Capt ura de las presas ............................................................................................... 11
3.2 Caracterización del fluido enzimático............................................................................ 13 3.2.1 Esterasas .................................................................................................................. 16 3.2.2 Glucosidasas ............................................................................................................ 17 3.2.3 Peptidasas................................................................................................................ 19 3.2.4 Proteasas .................................................................................................................. 20 3.2.5 Diaforasas................................................................................................................ 20
3.3 Electroforesis en gel de poliacr ilamida .......................................................................... 21 4. METODOLOGÍA Y RESULTADOS ASOCIADOS...................................................... 26
4.1 Teoría y obtención de las plantas ................................................................................... 26 4.2 Adecuación del hábitat ................................................................................................... 26 4.3 Muestreo y experimentos ............................................................................................... 28
4.3.1 Primeras pruebas ..................................................................................................... 28 4.3.2 Electroforesis........................................................................................................... 29 4.3.3 Ensayos de digestión ............................................................................................... 35
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS ...................................................................................... 38 5.1 Ensayos prev ios .............................................................................................................. 38 5.2 Electroforesis.................................................................................................................. 38 5.3 Ensayos de digestión ...................................................................................................... 39
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES P ARA T RABAJO FUTURO ............... 40 7. COSTOS........................................................................................................................... 42
6.1 Costos asociados a la consecución de las p lantas y la adecuación del hábitat:.............. 42 6.1 Costos asociados a las electroforesis:............................................................................. 42
8. REFERENCIAS............................................................................................................... 43
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ÍNDIC E DE FIGURAS
Figura 3-1 Dionaea muscipula con inflorescencia.. ...................................................................8 Figura 3-2 Estados en el cerramiento de la trampa.. ................................................................ 13 Figura 3-3 Secreción Acumulada.. ........................................................................................... 14 Figura 3-4 Secreción Acumulada.. ........................................................................................... 14 Figura 3-5 Molécula del Dinucleótido de Flavina y Aden ina. ................................................. 21 Figura 3-6 Movilidad de las moléculas a través del gel en función del logar itmo del peso molecular. ................................................................................................................................. 23
ÍNDICE DE IMÁGENES
Imagen 3-1 Coloración rojiza en hojas de D. m uscipu la en época de verano.. ..........................9 Imagen 3-2 Tonalidades rojas proporcionadas por la molécula de Antocianina. Glándulas de digestivas-absortivas. ............................................................................................................... 10 Imagen 3-3 Estructura de la flor de Dionaea. .......................................................................... 10 Imagen 4-1 Adecuación del hábitat.......................................................................................... 28 Imagen 4-2 Rotulación de plantas. ........................................................................................... 30 Imagen 4-3 (a) Extracción de fluidos enzimáticos con microjeringas, (b) Se guardaron las muestras por separado. ............................................................................................................. 31 Imagen 4-4 (a) Preparación muestra de carne de res, (b) Muestra completamente macerada. 32 Imagen 4-5 (a) Preparación muestra de Drosophila m elanogaster, (b) Muestra macerada..... 32 Imagen 4-6 (a) Inicio de corrida en la celda de electroforesis, (b) Final de corrida en la celda de electroforesis. ....................................................................................................................... 33 Imagen 4-7 Resultados electroforesis de carne de res. ............................................................. 34 Imagen 4-8 Segunda corrida. No hubo separación de proteínas. ............................................. 34 Imagen 4-9 Suministro de carne de res .................................................................................... 35 Imagen 4-10 Sumin istro de D. melanogaster........................................................................... 36 Imagen 4-11 Necrosis de tejido vegetal ................................................................................... 37
ÍNDIC E DE TAB LAS
Tabla 3-1 Enzimas específicas encontradas en D. muscipula. ................................................. 16 Tabla 4-1 Volúmenes de f luido enzimático producido por D. muscipula. Fuente: Autores. ... 28 Tabla 4-2 Volumen de f luido enzimático teórico producido en la digestión de carne como sustrato...................................................................................................................................... 36 Tabla 7-1 Costos de la compra de las plantas y adecuación de su hábitat.. ............................. 42 Tabla 7-2 Costos de los reactivos para las electroforesis.. ....................................................... 42
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1. INTRODUCCIÓN
Los residuos de las industrias cárn icas y lecheras son contaminantes ya que representan altas
cargas orgánicas debido a su contenido de proteínas y grasas. El tratamiento que se les da a
estos residuos en algunas empresas que son fuertes en el mercado de Colombia como el caso
de Zenú, Rica, Carn icol S.A., Alpina, Colanta y Parmalat, comprende entre otros,
tratamientos microbiológicos y físico-químicos. Actualmente, esta situación minoriza el
impacto que tiene sobre el medio ambiente la producción de los diferentes productos
alimenticios.
Los tratamientos microbio lógicos implican actividades enzimáticas que son bastante efectivas
y necesarias cuando se tienen contaminantes de origen orgánico como en el caso de estas
industrias; de ahí la importancia de desarrollar estudios que permitan generar nuevas
alternativas biológicas de degradación. Se plantea entonces el uso de f luidos enzimáticos
producidos por plantas carnívoras definidas literalmente como “comedoras de carne”. Entre
sus características generales se encuentra la atracción de la presa, atrapamiento, digestión a
partir de enzimas y la absorción de los materiales digeridos.
Es por eso que el propósito de este proyecto es realizar un estudio preliminar acerca de la
degradación de sustratos (carne y moscas) por parte de las enzimas producidas por las plantas
carnívoras de la especie Dionaea muscipula. Junto con lo anterior, poder iniciar una
investigación que promete obtener buenos aportes al estudio de alternativas para la
degradación de compuestos o residuos sólidos que son altamente contaminantes y con los
cuales Colombia tiene problemas asociados a salud pública y en general a la contaminación de fuentes hídr icas.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General Realizar un estudio preliminar de las enzimas producidas por Dionaea m uscipula y el
comportamiento de la degradación que estas enzimas llevan a cabo en proteínas de diferentes
sustratos.
2.2 Objetivos Específicos
• Analizar cualitativamente el contenido de las proteínas de los sustratos proporcionados
a las plantas y de las enzimas que están contenidas en los fluidos enzimáticos
secretados por ellas.
• Estudiar el comportamiento de la digestión realizada por las enzimas producidas por D. m uscipula en un tiempo determinado y con diferentes concentraciones de sustrato.
Esto con el fin de dar un primer paso para la investigación de nuevas alternativas en la
digestión de residuos sólidos.
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3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1 Generalidades de la planta
3.1.1 Hábitat natural Dionaea muscipula, de la familia Droseraceae, llamada también Venus Fly Trap (Venus
atrapamoscas) es endémica de las llanuras costeras de Carolina del Norte y del Sur, aunque
también se encuentra en los estados de Nueva Jersey y Virginia donde se les proporciona las
condiciones apropiadas para crecer. Estas condiciones están dadas por un suelo pobre en
nutrientes, especialmente en n itrógeno, con baja fertilidad, muy ácido (pH entre 3 y 5) y
compuesto por aproximadamente un 8% de materia orgánica y un 92% de material mineral;
éste último esta constituido por un 95% de arena (Pietropaolo, 1999). La luz es v ital para su
crecimiento y para la coloración de la superficie interna de las trampas. El nivel de humedad
del medio debe var iar en función de la etapa en la cual se encuentre la planta, ya sea en la
etapa de crecimiento o en la de dormancia.
3.1.2 Descripción de la planta La planta está compuesta por un r izoma corto no ramificado donde se forma una estructura
similar a un bulbo producto del solapamiento de porciones basales de ho jas alrededor del
punto de crecimiento. Cada hoja es una trampa, soportada por un peciolo de silueta
acorazonada. Las trampas están organizadas en un rosetón formando un arreglo circular
alrededor del punto de crecimiento como se puede apreciar en la Figura 3-1. Las ho jas pueden
llegar a medir hasta 20 cm (8 in) de longitud. El sistema de raíces no alcanza grandes
profundidades, aproximadamente se prolonga 10cm por debajo de la superficie (Pietropaolo,
1999).
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Figura 3 -1 Dio naea muscip ula con inflorescencia. Fuente: DeWitte, 2006 .
Hojas (tram pas)
La descripción de las hojas de D. m uscipula es un poco más compleja, ya que realizan la
captura y digestión de presas. Las características de las hojas varían con la estación del año.
Aquellas que se presentan primavera tienden a ser más verdes, con los pecíolos anchos y
medidas promedio de 7 cm de largo, con 2 cm de ancho. En este per iodo, que tiene f in cuando
aparece la flor durante el final de la primavera o a principio del verano, las hojas carecen de
coloración roja en la superficie interna. Por el contrario, las hojas de verano son más largas
que las de primavera pero son más estrechas y tienden a crecer verticalmente. Como en esta
época del año la radiación solar es intensa, las superf icies internas de las trampas desarrollan
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un color granate-rojizo (Imagen 3-1) en la mayoría de las p lantas, aunque a veces esta
coloración es controlada genéticamente.
Imagen 3-1 Coloración roji za en hojas de D. mus cipula en época de vera no. Fuente: Pi etropaolo, 1999.
Por otro lado, las trampas de invierno se caracterizan por ser más pequeñas y el ancho de los
pecíolos se encuentra entre el ancho presentado en pr imavera y verano.
Como se puede ver en la Imagen 3-1, la lámina foliar está constituida por dos lóbulos que en
condiciones normales presentan una apertura de cuarenta a cincuenta grados. En cada uno de
ellos se identifican varios gatillos o vellosidades distribuidas en patrones triangulares. Al ser
estimulados una o varias veces, dependiendo de la temperatura, la trampa se cierra y atrapa la
presa que t uvo contacto con los gatillos. A temperaturas cercanas a los 15º centígrados es
necesario que los gatillos sean estimulados dos veces para que la trampa active los
mecanismos de cerramiento (Pietropaolo, 1999). Además de esto, en la parte perimetral de
cada lóbulo de la trampa está ubicada una serie de filamentos rígidos que simulan dientes para
evitar que las presas escapen en el momento del cerramiento. Otras estructuras como las
glándulas de atracción (alluring glands) se encuentran en las zonas exteriores de los lóbulos.
Su función radica en secretar compuestos azucarados con olores agradables para las presas,
con el f in de dir igirlas hacia a la trampa. Mientras tanto las glándulas digestivas-absortivas
están ubicadas entre el fondo de la trampa y las glándulas de atracción. Estas glándulas de
digestión y absorción son fácilmente identificables ya que poseen antocianina, pigmento
soluble en agua que les proporciona tonalidades rojas (Pietropaolo, 1999).
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Imagen 3-2 Tonalidades rojas pro porciona das por la mol écula de Anto ciani na. Glándulas de digesti vas-absorti vas. Fuente: http://www.giardinaggio.it/carnivore/dionaea_giant.JPG
Flores
La Venus Fly Trap produce un tallo con flores blancas durante la primavera. Un tallo puede
llegar a producir entre 1 y 15 flores donde cada flor está constituida por 5 pétalos blancos, 5 sépalos verdes, 1 pistilo compuesto y aproximadamente 15 estambres (Ver Imagen 3-3).
Imagen 3-3 Estructura de la flor de Dio naea . Fuente: http://gri nnell.unh.edu/blogpi x/ Dionaea.jpg
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3.1.3 Propagación En D. muscipu la se presentan dos formas de reproducción: sexual y asexual1. En la
reproducción sexual ocurre la polinización de la parte femenina de una flor con el polen que
se encuentra maduro en la parte masculina de otra. En esta forma de reproducción se tienen
dos fases: la producción de semillas y su posterior germinación. En la reproducción asexual se
utiliza un tejido vegetal para hacer el cultivo y generar nuevas plantas.
3.1.4 Períodos: Crecimiento y Dormancia La dormancia o inactividad es un período en el cual las plantas descansan, suspenden su
crecimiento y las actividades son apenas las necesarias para mantener a la planta viva. El
inicio de esta etapa se presenta por la formación de brotes de invierno, es decir, hojas de
forma esférica sobrelapadas entre sí. Seguido a lo anterior se da inicio a la etapa de
crecimiento activo donde brotan nuevas hojas y las actividades en la planta se retoman
(Pietropaolo, 1999).
Las temperaturas en la etapa de crecimiento varían entre 21 y 38 °C (verano) mientras que en
la etapa de inactividad var ían entre 1.7 y 10 °C ( invierno) (Pietropaolo, 1999). La humedad
del suelo se requiere en bajos niveles durante la etapa de dormancia debido a que las
actividades demandan bajas cantidades de agua. Por el contrario, en la etapa de crecimiento se
requieren altos niveles de humedad en el suelo.
3.1.5 Captura de las presas En D. m uscipula existe el ingenio de obtener el nitrógeno -ausente en el suelo del hábitat
natural- a partir de las proteínas de los tejidos de las presas. Sus hojas armadas con largos
dientes se cierran cuando los insectos caen en ellas y luego se doblan segregando sustancias
que ahogan a sus presas y causan su muerte.
1 Dionaea muscipula: Venus Atrapamoscas/ Apuntes para el cultivo. Consultado de, http://www.geocities.co m/v enusatrap amoscas/p0204.ht m, el 20 d e o ctubre de 2006.
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Son tres fases las que se observan en este proceso: fase abierta, fase de cerramiento y fase de
estrechamiento (ver Figura 3-2). Como se dijo anteriormente, en la fase abierta, la planta
secreta compuestos azucarados con olores agradables sobre la superf icie interna de las
trampas para atraer a los insectos. Una vez el in secto se posa sobre la trampa y toca algún
gatillo, los lóbulos se cierran parcialmente en aproximadamente un segundo. En algunos
casos, el in secto que activa los gatillos es de m uy pequeño tamaño, y dado un escape, la
planta vuelve a abr ir la trampa después de 24 horas. Si el insecto no escapa, la hoja entra en
una etapa de cerramiento que dura treinta minutos. Luego de éste lapso de tiempo comienza la
fase de estrechamiento en la cual los dos lóbulos se unen hasta que uno se aplana f irmemente
contra el otro, dejando un espacio alrededor de la víctima y ahogándola en un fluido digestivo
como se muestra en la parte (c) de la Figura 3-2. La trampa permanece cerrada de una a dos
semanas, durante las cuales, la producción de este fluido se lleva a cabo. Desafortunadamente,
las ho jas pueden sobrellevar tan solo de tres a cuatro ciclos completos (Pietropaolo, 1999).
(a) Fas e A bierta
(b) Fase de cerramiento
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(c) Fase de estrechamiento
Figura 3 -2 Estados en el cerrami ento de la trampa . Fuente: Slack, 2000 .
El fluido producido por la planta, emitido por las glándulas de digestión y absorción desde la
etapa de estrechamiento hasta el fin de la degradación de la presa, permite que las enzimas
que lo componen realicen la tarea de facilitar la descomposición de la presa, para al f in poder
suplir necesidades nutricionales insatisfechas por la poca disponibilidad de nutrientes en el
suelo en el cual la planta se encuentra. Finalmente, las trampas se abren y se puede ver en su
interior el esqueleto quitinoso y las alas de las presas.
3.2 Caracterización del fluido enzimático Una caracterización del fluido enzimático se hace necesaria en términos cuantitativos y
cualitativos. Cuantitativamente, la secreción de fluido tiene un comportamiento prácticamente lineal en el tiempo hasta alcanzar siete días después de alimentar la trampa con sustratos de
manera diaria, ver Figura 3-3. Por otro lado, en la Figura 3-4 se puede observar la tendencia
que describe la secreción asociada a un sustrato natural como moscas de la especie Calliphora
sp, suministrado so lamente una vez, la cual se asemeja a una curva de distribución normal ya
que el estimulo desaparece cuando la degradación es terminada. Como un dato promedio se
puede ver que la emisión de secreción de cada lóbulo de la trampa por día es cercana a los 10
microlitros. Sin em bargo las trampas utilizadas en los ensayos que arrojaron los anteriores
resultados duplican en tamaño a las usadas en los experimentos asociados a este documento.
Queda entonces por hacer el análisis cualitativo, el cual es un poco más nutrido ya que ha sido
motivo de varios estudios (Robins & Juniperb, 1980).
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Figura 3 -3 Secreción Acumulada . Fuente: (Ro bins & J uni perb, 1980).
Figura 3 -4 Secreción Acumulada . Fuente: (Ro bins & J uni perb, 1980).
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Según la bibliografía encontrada, la secreción cruda presenta peptidasas, fosfatasas ácidas,
quitinasas, peroxidasas y diaforasas. Además, en estudios previos se comprobó la presencia
de componentes redox que hacen a las proteínas más susceptibles al ataque proteolítico 2 de las
proteasas (Galek et al, 1990).
Las h idrolasas pépticas tienen una actividad dependiente tanto del pH como de la temperatura.
Según los ensayos realizados por Robins y Juniper, se encuentran picos de la actividad a un
pH de cinco y a una temperatura de treinta grados centígrados. Por otra parte, a pesar de saber
de la existencia de ciertas hidrolasas pépticas, lo s diferentes est udios no arro jan los mismos
resultados. Sin embargo, se trata de enzimas que le deben parte de su funcionalidad a la
presencia de metales ya que se encuentran altas inhibiciones al someter la secreción a
secuestrantes de metales como lo es el EDTA. Robins y Juniper llegan también a que gran
parte de las enzimas que llevan a cabo la hidró lisis de péptidos poseen grupos amida que
reaccionan desfavorablemente al ser puestas en contacto con compuestos que las puedan
acetilar (Robins & Jun ipera, 1980).
Para la fosfatasa ácida, se encuentra el mismo pH óptimo para la actividad enzimática y
acorde con los resultados de los exper imentos se vislumbra una relativamente baja actividad
de este tipo, sin em bargo se pueden encontrar varias enzimas que corresponden a este grupo
en la secreción (Robins & Junipera, 1980). Por otro lado, las quitinasas no pueden ser
asociadas unívocamente a la secreción, ya que aun no se ha demostrado que éste tipo de
enzimas estén presentes en el medio intracelular de las glándulas. Según los investigadores,
no es posible obviar una posible contaminación del material vegetal con bacterias que
produzcan este tipo de sustancias.
En cuanto a las perox idasas, su presencia está confirmada, incluso se habla de que están
ubicadas en vacuolas unidas a las membranas celulares en zonas de abscisión, para facilitar su
emisión junto con la de otras enzimas hacia el exterior de la célula que vendr ía siendo parte de
una glándula de digestión y absorción (Robins & Junipera, 1980).
2 Ro mpi mi ento o lisis de las proteínas
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Enzimas específicas
A continuación se encuentra la tabla que resume las enzimas encontradas en los f luidos de D.
m uscipula:
Tabla 3-1 Enzimas específicas enco ntradas en D. muscipula. Fuente: Robins & Junipera, 1980
Enzima Actividad
Peroxidasa PeroxidasaFosfatasa ácida EsterasaDesoxiribonucleasa -------------------Amilasa GlucosidasaQuitinasa GlucosidasaLeucina aminopeptidasa PeptidasaCarboxipeptidasa A PeptidasaGlicina-glicina hidrolasa PeptidasaGlicina-leucina hidrolasa PeptidasaProlina dipeptidasa PeptidasaProteasa ProteasaQuimiotripsinasa ProteasaNucleosidetrifosfatasa Anhidrasa
3.2.1 Es teras as Fosfa tasa ácida
En general, las fosfatasas son enzimas de una distribución supremamente amplia, y están
divididas en dos grandes grupos dependiendo del pH óptimo que estas posean. Existen por lo
tanto fosfatasas ácidas y alcalinas (Araujo et al, 2006).
Las fosfatasas ácidas, llamadas ortofosfor ico-monoéster fosfohidrolasas, catalizan la hidrólisis
de una gran variedad de ésteres de fosfato en medios ácidos. Pueden encontrarse en tejidos
vegetales participando en procesos de gran importancia como los metabólicos, tanto
directamente como indirectamente, ya que están presentes en el proceso mismo o desempeñar
papeles en las rutas de transducción de señales celulares que regulan el metabolismo (Tabaldi
et al, 2005). Mientras tanto, en el tejido animal se presentan en células o fluidos de secreción
de la próstata, riñón, hígado, bazo y plasma sanguíneo (W u et al, 2006).
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3.2.2 Glucosidas as Amilasa y Quitinasa
Estas dos enzimas atacan compuestos catalogados como carboh idratos. La amilasa tiene como
objeto la degradación de almidón, mientras que por razones obvias, la quitinasa ataca al
sustrato que le da nombre, quitina.
El proceso normal para la degradación del almidón v ía amilasa se lleva a cabo en etapas donde actúan diferentes versiones de la misma enzima. Por otra parte, el proceso suele estar
acompañado de la actividad de otras enzimas que también se mencionarán a continuación.
La alfa amilasa es la ún ica de las amilasas que puede atacar la molécula de almidón sin que
esta última haya sido sometida previamente a otra actividad enzimática. Ésta enzima produce
en primera instancia cadenas de almidón todavía largas, ya que ataca aleatoriamente los
enlaces 1-4 tanto de la amilosa como de la amilopectina. La repetición de este proceso concluye en la formación de alfa maltosa cuando se trata de la hidrólisis de amilosa, mientras
que para la amilopectina, la degradación termina cuando aun están presentes cadenas cortas
con extremos reductores llamadas dextrinas. Esto radica en la presencia de uniones 1-6 en las
ramificaciones de la amilopectina las cuales no pueden ser hidrolizadas por la alfa amilasa
(Salisbury & Ross, 1992).
Ahora bien, la beta amilasa ataca los productos iniciales de la degradación provocada por la
acción de la alfa amilasa. En las etapas iniciales de su actividad, ataca los extremos no
reductores, para luego completar una degradación total a beta maltosa en el caso de la
amilosa. Por otro lado, al igual que en el acaso de la alfa amilasa, la beta amilasa no puede
romper los enlaces 1-6 en los puntos donde se presentan ramificaciones de la cadena, lo cual
conlleva de nuevo a la aparición de dextrinas (Salisbury & Ross, 1992).
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Quedan por mencionar las enzimas adicionales que participan en el proceso, las cuales son las
almidón fosforilasas y las enzimas supresoras de ramificaciones. Las almidón fosforilasas,
como su nombre lo indica, no son enzimas hidrolíticas, evidentemente corresponden a
enzimas fosforo líticas, que incorporan moléculas de fósforo a los productos de la degradación
que están llevando a cabo. En el caso de la amilopectina, la degradación se lleva a cado desde
los extremos no reductores hasta las cercanías de las ramificaciones, lo que indica que
dextrinas quedan remanentes. Comenzando de la misma manera, desde los extremos no
reductores, la almidón fosfor ilasa degrada casi en su totalidad al almidón, llevándolo a
glucosa 1-fosfato al igual que en la degradación parcial del amilopectina.
Las enzimas supresoras de ramificaciones, pullulanasas, isoamilasas y dextrinasas límite,
permiten la separación de porciones ramificadas con uniones 1-6 dejando que las amilasas o
fosforilasas puedan hacer su trabajo y conseguir una degradación completa del almidón
(Salisbury & Ross, 1992).
Teniendo en cuenta lo anterior, el almidón se degrada primero a maltosa, tanto por alfa como
beta amilasa, sin embargo, las dextrinas son resistentes a esta actividad enzimática. Es
necesario comentar que la actividad de la beta amilasa genera dextrinas de cadenas m uy
cortas. Al mismo tiempo, secciones de las dextrinas que no corresponden a los enlaces de
ramificación son degradadas por la fosforilasa. Luego, las dextrinas remanentes son sometidas
a las enzimas supresoras de ramificaciones que permiten que cualquiera de las amilasas o
fosforilasas culminen la degradación.
En cuanto a la quitinasa, ataca los enlaces beta 1-4 que unen las moléculas de N-
acetilglucosamina y que repitiéndose forman las cadenas de quitina. Este carbohidrato es
similar a la celulosa en estructura y por lo tanto son igualmente difíciles de degradar, sin
embargo se diferencian por un grupo acetamida el cual no se presenta en el componente
fundamental de las paredes celulares de las plantas (Raven & Johnson, 2002).
La quitina, al entrecruzarse con proteínas genera un material de gran resistencia al mismo
tiempo en que de alta flexibilidad. Es frecuente en los exoesqueletos de insectos, artrópodos y
crustáceos, haciéndo la muy abundante en el planeta tierra (So lomons, 2002).
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3.2.3 Peptidasas Leucina am inopeptidasa
De manera general las aminopeptidasas tienen como función la catálisis de la separación de
aminoácidos provenientes de sustratos proteicos sin restricción a partir de los terminales N-
amino. Por ende tienen relevancia en procesos metabólicos, de control celular y degradación
selectiva de proteínas a nivel intracelular (Oliveira et al, 1999).
La enzima leucina aminopeptidasa es una de las aminopeptidasas más importantes y
abundantes en el citoplasma. Corresponde a una metalo-enzima asociada al Zinc cuya
presencia es muy diversa ya que puede hallarse tanto en las membranas celulares como en
organelos intracelulares de diferentes tipos de organismos, entre ellos, plantas, bacterias y
protistas, invertebrados y vertebrados.
Según experimentos, esta enzima se encuentra en el interior de células en zonas del sistema digestivo de organ ismos hematófagos como por ejemplo Haem aphysalis longicorn is, un tipo
de garrapata. La cantidad a nivel intracelular de la enzima está directamente relacionada con
la ingestión de sangre haciendo evidente su actividad como peptidasa en la digestión de este
fluido (Hatta et al, 2006). Además, es común encontrar leucina aminopeptidasa en riñones e
intestinos de mamíferos como ratas y cerdos (Jost, 1973). Puede hallarse también en parásitos
que producen por ejemplo, schistosomiasis y paludismo, ya que esta les facilita la
degradación de la hemoglobina humana (McCarthy et al, 2004).
Carboxipetidasa A
Es utilizada por una amplia variedad de organismos para llevar a cabo procesos relacionados
con el metabolismo de péptidos y proteínas, además de participar en fenómenos de
biosíntesis. Es, al igual que la leucina aminopeptidasa, una metaloenzima que contienen Zinc
en sus sitios activos. Enzimas de este tipo eliminan residuos alifáticos e h idrofóbicos de los terminales C de las cadenas de aminoácidos. Además de esto requieren de activación y de
actividad previa de otras enzimas. Por ejemplo, esta enzima está presente en el sistema
digestivo de los mamíferos y funcional en el páncreas e intestino donde la quimiotripsinasa,
tripsinasa y pepsinasa, otras enzimas que tienen actividad peptidasa, actúan sobre el sustrato
antes de que sea atacado por la carboxipeptidasa (Fontenele-Neto et al, 2005). Está presente
también en la corriente sanguínea humana y como es de esperarse trabaja como peptidasa. Recientemente se evaluó su idoneidad para el diagnóstico de pancreatitis ya que está
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íntimamente relacionada con el funcionamiento del órgano que se ve afectado por esta
enfermedad (Stewart & Gilvarg, 1999).
Prolina Dipeptidasa
Esta enzima ataca dipéptidos y posee una baja especif icidad respecto al sustrato. Se encuentra
en grandes cantidades en los riñones de diferentes organismos, incluso en el de los seres
humanos (Priestman & Butterworth, 1985).
3.2.4 Proteas as Quim iotripsinasa
Corresponde a una ser ina endopeptidasa del páncreas; de igual forma se encuentra en grandes
concentraciones en el lúmen del intestino delgado. Ataca los enlaces peptídicos formados por
los aminoácidos fenilalanina, triptofano y tirosina. Esta enzima es complementaria al trabajo
de las peptidasas antes descritas como por ejemplo la carboxilasa A (Walker et al, 2001).
La actividad de estas enzimas es aprovechada con frecuencia en la industria de la comida,
sobre todo para el tratamiento de carne de mariscos y pescados donde es utilizada para
remover piel, escamas, membranas y para aislar sabores y co lores (Simpson et al, 1998).
El contenido de proteínas en los insectos var ía entre 9,45% para la hormiga mielera hasta un
70% para los grillos (en especial los colorados) y más del 60% para las av ispas3. Es por esto
que la producción de proteasas se hace necesaria en D. m uscipula en beneficio de la obtención
nutricional de las proteínas.
Estas proteasas o peptidasas se clasifican como hidrolasas ya que rompen los enlaces
peptídicos de las proteínas usando una molécula de agua. Los productos de este rompimiento
son varios aminoácidos individuales o pequeñas cadenas de aminoácidos que dependen de la
cadena o secuencia original de la proteína.
3.2.5 Diaforasas Los ciclos redox en los cuales se encuentran asociadas las diaforasas o flavoenzimas son
importantes en el mecanismo de degradación de proteínas en D. muscipula. Las diaforasas se
clasifican en el grupo de las deshidrogenasas y son capaces de eliminar hidrógeno de los
3 Calidad de la proteína de los insectos comestibles. Consultado de http://www.ali mentacion -sana.com.ar/in formaciones/Chef/insectos %20p roteinas.htm, el 18 d e Octubre de 2006.
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sustratos y transferir lo a otra sustancia aceptora. De esta manera, catalizan la
deshidrogenación del NADH o del NADPH desencadenando otras reacciones de lisis o
degradación 4. Galek y colaboradores encontraron que los extractos de D. muscipula contienen
componentes de bajo peso molecular que aceptan los electrones de diferentes flavoenzimas
catalizando la reducción del ox ígeno, es decir, produciendo oxígeno reactivo y generando una
autoxidación.
Las flavoenzimas son enzimas que contienen FAD (Dinucleótido de Flavina y Adenina) o
FMN (Mononucleótido de Flav ina) para catalizar las reacciones de oxido reducción (Medina,
2005). El FAD actúa como grupo prostético o coenzima y su centro redox es el an illo
Isoaloxazina (Ver Figura 3-5).
Figura 3 -5 Molécula del Di nucleó tido de Fla vina y Adenina .
3.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida
La electroforesis es una técnica que se usa para separar moléculas orgánicas y principalmente
para pur ificar proteínas, ADN, ácidos nucleicos, entre otras, basándose en sus diferentes
propiedades como el tamaño, forma o punto isoeléctrico 5 . En esta técnica se usa una fuerza
4 Técnicas histológicas. NADP Diaforasa. Consultado de http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/ho me/tecnicas.ht m, el 20 de Octubre d e 2006 .
5 Electroforesis en gel . Wikipedia. La enciclop edia libre. Consultado d e http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel, el 19 de Octubre d e 2006 .
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electromotriz para desplazar las moléculas a través de la matriz, que en este caso es el gel de
poliacrilamida. La diferencia de potencial eléctrico proporcionado hace que las moléculas
cargadas positivamente se desp lacen a cierta velocidad hacia el ánodo y las cargadas
negativamente hacia el cátodo. Las velocidades de migración dependen de la estructura de las
moléculas, así que para las proteínas, dichas velocidades varían bastante debido a la
diversificación en las estructuras.
Algunas veces las proteínas no migran ni siquiera en presencia de la fuerza electromotriz, así
que generalmente se aplica un detergente para desnaturalizar las como el SDS (Dodecilsulfato
sódico) que las carga negativamente.
Para determinar la presencia de las moléculas tanto en el cátodo como en el ánodo, se agrega
un colorante que generalmente es azul brillante de Coomassie, permitiendo hacer visibles las
moléculas. La separación de cada componente de una mezcla muestra una banda y la distancia
a la cual se encuentra la banda del punto de partida de la corr ida es inversamente proporcional
al logar itmo del tamaño de la molécula como se muestra en la Figura 3-6.
La fuerza eléctrica que se aplica es dada por el campo eléctrico (E) en (V/m) y z, el número
neto de cargas en la molécula (Scopes, 1982):
νπηrEz 6=
donde: η = viscosidad
r = radio de la partícula
υ = velocidad
De esta manera, la movilidad específica para una pequeña molécula que no se ve afectada por
el gel es descrita por la siguiente ecuación (Scopes, 1982) :
rz
Euo πη
ν6
==
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Para la electroforesis en gel, aparece esta movilidad modificada por un término que representa
el rango de tamiz molecular:
AMWA
rz
AMWAuu o
)log(6
)log( −⋅=−⋅=πη
donde A= logar itmo del peso molecular de una molécula que podría no moverse
en el gel
Figura 3 -6 Mo vilidad de las moléculas a tra vés del g el en funció n del logaritmo del peso molecular. Fuente: Scopes, 1982 .
El término que modif ica a la movilidad específica de una molécula se puede reorganizar y
multiplicar por la viscosidad para obtener la viscosidad efectiva en la mitad del rango del
tamiz (Scopes, 1982):
)log(cos
MWAAefectivaidadvis
−= η
El gel está compuesto por poliacrilamida, la cual es fruto de la polimerización de acrilamida y
N, N’-metilenobisacrilamida. La migración estará definida entonces por el poro del gel, el
cual puede ser modificado dependiendo de las biomoléculas a separar, en presencia de un
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buffer en los extremos del gel. En el extremo superior se encuentra el polo negativo del
campo eléctrico y por lo tanto el polo positivo se ubica en la parte inferior del montaje. Dado que la carga neta de las proteínas es negativa debido al pH del buffer, migrarán de arriba hacia
abajo (Voet, 2004).
Existen varias técnicas para optimizar la resolución de la electroforesis. En primera instancia, se utiliza un gel de pH discontinuo el cual está compuesto por dos secciones cada una con diferente tamaño de poro y con diferente buffer. La primera fracción es llamada gel de
“stacking” con 1cm de profundidad y tiene un buffer con dos unidades de pH por debajo del buffer del reservorio inferior y del gel de corrida o “running”. El buffer del reservorio
superior, con un pK alrededor de 9.78, es ajustado a un pH similar al del reservorio inferior el
cual es cercano a 9 (Voet, 2004). Cuando se hace pasar corriente a través del gel discontinuo, los iones presentes en el buffer
del reservorio superior migran hacia abajo justo detrás de los del buffer del gel de “stacking”.
En la medida que esto sucede, los iones del buffer del reservorio superior se encuentran en una zona del gel cuyo pH es varias unidades menor que el pK antes mencionado. Por lo tanto,
los iones de este buffer son llevados a su versión neutra creando una banda de resistencia ya
que no son conducidos por la corriente. En vista que el campo eléctrico equivale a la multiplicación de la resistencia por la corriente (según la ley de Ohm), y teniendo una corriente constante, el campo eléctrico incrementa su intensidad haciendo que las moléculas
orgánicas a separar se organicen rápidamente en delgadísimas bandas dispuestas en función de la movilidad (µ) que posean, para luego represarse en la frontera entre el gel de “stacking”
y el de corr ida. El represamiento que se produce es debido a que los iones se disponen a entrar
en el gel de corrida y su velocidad de migración decrece ya que hay una reducción en el
tamaño de poro, es decir, el poro del gel de corrida es de menor tamaño que el propio del gel de “stacking”. Después de entrar en el del de corr ida, fenómenos de neutralización de cargas no se presentan debido al pH cercano a 9 y por lo tanto al pK del buffer ubicado inicialmente
en el reservorio superior (Voet, 2004).
Todo lo anterior conduce a un aumento en la resolución de la separación, pues la migración de
la muestra en el gel de corr ido tiene como tratamiento previo, una separación inicial en el gel de “stacking”.
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Adicionalmente, otro factor que influirá en la electroforesis es la presencia de SDS, detergente
que tiene propiedades altamente denat urantes. Este provoca que estructuras secundarias, terciaras y cuaternarias sean llevadas a cadenas de aminoácidos sin plegamientos o rotaciones
eliminando el factor forma de las mismas, permitiendo hacer una correlación entre el peso
molecular y la posición relativa en la que las proteínas denat uradas habiendo alcanzado su
posición última en la migración. El valor del peso molecular es conseguido haciendo regresiones a partir de las posiciones f inales de proteínas cuyo peso molecular sea conocido.
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4. METODOLOGÍA Y RESULTADOS ASOCIADOS
4.1 Teoría y obtención de las plantas El primer paso fue la consecución de documentos, libros y artículos de experimentos
realizados con las plantas y en especial, con la caracterización de fluidos digestivos y sus
ciclos secretorios. A partir de lo encontrado se estableció qué pruebas experimentales se deberían realizar, logrando plantear en primera instancia electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida y en segundo lugar, pruebas de digestión. Además, fue necesario extraer de la
bibliografía obtenida la mayor cantidad posible de recomendaciones relacionadas con las condiciones a las cuales se debía mantener a las plantas en el laboratorio y así poder asegurar
un buen estado fisiológico de las mismas. Efectivamente condiciones como la luz artificial, el
medio de cultivo, la humedad, las temperaturas adecuadas y el alimento eran descritas en los documentos consultados y por lo tanto se trató de permanecer siempre entre los rangos óptimos de cada uno de los factores ambientales antes mencionados.
En cuanto a la obtención de las plantas carnívoras se presentaron diferentes inconvenientes. Primero, se importaron treinta plantas de D. muscipula que fueron compradas vía Internet en
el portal de Lee´s Botanical Gardens6 establecimiento sit uado en LaBelle, Florida. A pesar de
todos los cuidados que se tuvieron, estas plantas no se adaptaron a las condiciones ambientales de Bogotá, probablemente porque el estado en el que llegaron después del envío era un tanto precario, provocando el marchitamiento y muerte de todos los especimenes.
Siguiente a esto se compraron nueve plantas en la Feria de las Flores que se realiza en la ciudad de Medellín7, las cuales fueron sembradas y cultivadas en condiciones parecidas a las
de Bogotá. Estas plantas permanecieron en el laboratorio donde se adaptaron
satisfactoriamente.
4.2 Adecuación del hábitat
6 Ver su p ágina Web: www .lbg-cp.co m 7 Contacto en Med ellín: Luis Fernando Mejía. Correo electrónico: j mejia1885@hotmail .co m. Número de celular: 3127436204
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En el CITEC8, complejo que pertenece a la Universidad de los Andes, fue asignada un área en
un laboratorio en la cual se construyó una estruct ura de madera envuelta por una malla plástica con poros muy pequeños o angeo que permitía controlar el ingreso y salida de
insectos de la estructura además de proteger a las plantas. Dentro del pequeño invernadero
ventilado se dispuso una lámpara fluorescente de 40 vatios para proporcionar a las plantas la
luz artificial necesaria para su crecimiento y coloración. Esta lámpara se ubicó a una distancia aproximada de 20cm de la superficie de las plantas para evitar exceso de temperatura, pero al mismo tiempo asegurar suficiente radiación para cada una de las plantas. Se procuró que las
plantas recibieran al menos 12 horas de luz artificial diaria. Aparentemente el periodo de luz es m uy largo con respecto a los fotoperiodos a los cuales las plantas están sometidas en
condiciones normales. Este tipo de plantas precisan de al menos ocho horas de radiación solar
directa, por lo cual se trató de compensar la disminución de la calidad de la luz con la prolongación del fotoperiodo.
Adicionalmente y tratando de simular las condiciones normales en la que se desarrolla esta
especie, cada una de las plantas fue dispuesta en pequeñas materas individuales para luego ser sumergidas en un recipiente que contenía agua de manera permanente y de esa forma
mantener una mayor humedad en el medio de cultivo. Este medio esta compuesto por una
parte de arena y una de Sphagnum. Éste último es una briofita típica de t urberas; sus hojas están compuestas por células fotosintéticas rodeando un grupo de células muertas, que presentan una serie de poros, cuya función es la de retener el agua y mantener la humedad. La
Imagen 4-1 muestra el montaje antes descrito.
La temperatura dentro de la estruct ura de protección era la temperatura ambiente de Bogotá,
influida ligeramente por la pequeña emisión de calor por parte de las lámparas dispuestas
sobre las plantas. En cuanto a la alimentación, fueron suministrados distintos tipos de sustratos a lo largo del
tiempo. Inicialmente se intentó con zancudos de género Culex los cuales no fueron bien asimilados por las plantas. Después se intentó con diferentes especies de moscas domésticas
comunes (Musca domestica L.) obteniendo los mismos resultados a los encontrados con los
8 Centro d e Innov ación y D esarrollo Tecnológico
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28
zancudos. Finalmente se definió una dieta constituida por carne de res y moscas de fruta o
Drosophila melanogaster.
Imagen 4-1 Adecuación del hábi tat.
4.3 Muestreo y experimentos Los experimentos propuestos tuvieron como fin el arrojar datos que pudieran ser asociados a
patrones de degradación de sustratos. Esta degradación se lleva a cabo en las plantas y por lo tanto, debido a las pequeñas cantidades de muestra que se obtuvieron, todas las pruebas desarrolladas dependen de manera directa de la disponibilidad de trampas y del
funcionamiento normal de las mismas.
4.3.1 Primeras pruebas Después de la llegada de las plantas al laboratorio, fueron dispuestas durante un mes en periodo de adaptación y crecimiento con el fin de que estuvieran en óptimas condiciones para
resistir eventual estrés fisiológico asociado a los ensayos a los cuales ser ían sometidas
posteriormente. Pasada la etapa de adaptación, se iniciaron las extracciones de prueba. Estas pretendían conocer un volumen aproximado de fluidos enzimáticos producidos. Las
extracciones se hicieron por medio de micro jeringas marca Hamilton y a continuación se
muestran los resultados:
Tabla 4-1 Volúmenes de fluido enzi mático produci do por D. muscip ula. Fuente: A utores.
Extra cció n Nº Vol umen extraído a pro xi mado (µlitros)
1 30
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29
2 20
Estos volúmenes fueron extraídos de trampas de dos diferentes plantas de D. m uscipula. Cada
trampa con área aproximada de 1cm x 0,5cm. Se desconocía la especie de insecto que habían atrapado y los días de digestión que llevaba la planta, sin embargo éstas pruebas serían
determinantes para definir de manera aproximada el volumen de la muestra que se utilizaría
en las electroforesis.
4.3.2 Electroforesis
El primer paso fue hacer los debidos cálculos de las cantidades necesarias para realizar las
electroforesis en gel de poliacrilamida. Una vez definidas las cantidades a utilizar, se procedió a la compra de los reactivos cuyo valor se encuentra en el capít ulo de costos.
Se hicieron ensayos de asimilación de sustrato usando diferentes insectos que podrían ser degradados de forma natural por D. muscipula. Como se dijo anteriormente, se probó con
moscas domésticas comunes pero las trampas se abrieron después de un tiempo y la digestión
no se llevó a cabo. Finalmente, se alimentaron con carne de res y Drosophila melanogaster.
Con estos sustratos la digestión si se produjo y se extrajeron fluidos enzimáticos del segundo y tercer día de degradación con el fin de analizarlos por medio de ensayos de electroforesis. Cada trampa era rotulada con la información de la fecha en la cual había sido alimentada y el
tipo de sustrato con el cual se alimentó como se puede ver en la Imagen 4-2.
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30
Imagen 4-2 Rotulación de plantas .
Durante la realización del proyecto se llevaron a cabo 2 corridas de electroforesis. La primera
tuvo como fin el describir el patrón de proteínas contenidas en la carne con la cual fueron alimentadas las plantas, mientras que el patrón asociado a las moscas no fue contemplado en
este caso. Para la segunda corrida se incluyen en el análisis, m uestras tanto de los dos
sustratos (carne y moscas) antes de la degradación como de los complejos sustrato-enzima respectivos.
Procedimiento para la electroforesis
i) Reactivos:
• Solución de acrilamida (contiene 30%T y 2,67%C)
• Persulfato de amonio al 10% (contiene 15 mg en 0,15 ml de H2O)
• Catalizador TEMED (N, N, N , N tetrametiléndiamina)
• 4x TrisCl/SDS pH 6,8
• 4x TrisCl/SDS pH 8,8 • Buffer de muestra SDS o “Laemmli” buffer (contiene 3,55 ml de agua
desionizada, 1,25 ml de 4x TrisCl/SDS pH 6,8, 2,5 ml de glicerol al 20%, 0,38
g de SDS y 0,2 ml de azul de bromofenol)
• Buffer Tris Glicina SDS (10x) para 500 ml (contiene 15,15 g de Tris base, 72 g
de glicina, 5 g de SDS y 500 ml de agua desionizada)
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• Solución de fijado (contiene 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético
y 40% (v/v) de agua)
• Solución de desteñido (contiene 5%(v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético
y 88% (v/v) de agua)
• Azul de Coomasie al 0,05% (w/v)
ii) Preparación de muestras:
La segunda corrida se realizó con muestras de los extractos de las plantas, producidos durante
el segundo y tercer día de digestión, y con las muestras preparadas a partir de carne de res y
moscas. La Imagen 4-3 (a) muestra la manera como se obtuvieron los extractos por medio de microjeringas y en (b) como era su posterior almacenamiento.
(a) (b)
Imagen 4-3 (a) Extra cción de fluidos enzimáticos con microjeringas , (b) Se g uardaro n las muestras por separa do.
Por otro lado, las m uestras de carne y mosca se maceraron en presencia de buffer para poder y
así obtener las proteínas contenidas en ellas. En el caso de la carne de res se usó un poco de arena para facilitar el rompimiento de las paredes celulares (ver Imagen 4-4 (a)), incluso se
intentó sustituir el buffer con acetona, otro reactivo en el cual podrían entrar en solución las proteínas. Para las muestras de D. melanogaster sólo fue necesario el buffer. El buffer usado fue Tris Glicina SDS (10x).
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(a) (b)
Imagen 4-4 (a) Preparación muestra de carne de res, (b) Muestra completamente macerada.
(a) (b)
Imagen 4-5 (a) Prepa ración mues tra de Drosop hila melanogaster , (b) Muestra macera da.
Una vez se maceraban las muestras, se centrifugaban para obtener un sobrenadante con el mayor contenido posible de proteínas. Este sobrenadante se llevaba durante 5 minutos al baño
maría y luego se mezclaba con buffer de muestra SDS (Laemmli buffer) de color azul. Por
último, estas muestras eran sembradas en los pozos de corrido del gel.
iii) Preparación del gel de “stacking” y de separación:
La pantalla donde se prepara el gel de poliacrilamida consta de dos láminas de vidrio que están separadas entre sí. El primer gel que se prepara es el de separación, ya que es el que
ocupa la parte inferior de la pantalla y llega hasta 1cm por debajo del extremo superior de la
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pantalla. Este gel de separación se prepara sirviendo entre las dos láminas de vidrio una
solución preparada a partir de 2 ml de la solución de acrilamida (30%T y 2,67%C), 1,25 ml de 4x TrisCl/SDS pH 8,8, 25 µl de persulfato de amonio al 10%, 5 µl de TEMED y 1,75 ml de
agua.
Una vez se aplica esta solución se debe cubrir rápidamente la solución con agua desionizada con el fin de emparejar el borde superior del gel y para evitar que entre el oxígeno, que actúa como inhibidor de la polimerización. De esta manera, se deja polimerizar durante 25 minutos,
se retira el agua y se vierte la solución del gel de “stacking” que contiene 325 µl de la solución de acrilamida, 625 µl de 4x TrisCl/SDS pH 6,8, 25 µl de persulfato de amonio al
10%, 5 µl de TEMED y 1,525 ml de agua. Se deja polimerizar durante 20 minutos y se realiza
el montaje de la cámara de electroforesis como se muestra en la Imagen 4-6. Finalmente, cada corrida se deja aproximadamente una hora y media a 150 voltios dentro de la cámara.
(a) (b)
Imagen 4-6 (a) Inicio de corri da en la celda de electroforesis, (b) Final de co rri da en la celda de electroforesis.
Resultados de las electroforesis
Un primer gel de poliacrilamida fue usado para hacer una identificación de las proteínas de la carne de res usada para alimentar las plantas. El resultado obtenido se muestra en la Imagen
4-7. Esta prueba se hizo para evaluar la efectividad del procedimiento usado para preparar las muestras de carne y mosca en estado sólido, ya que en la electroforesis se usan muestras
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líquidas. Dicha imagen corresponde a los resultados obtenidos tras un tratamiento previo con
buffer y arena. Los resultados asociados al uso de acetona no pudieron ser vistos ya que aparentemente no hubo separación y por lo tanto la tinción no mostró bandas.
Imagen 4-7 Res ultados electroforesis de carne de res.
El segundo gel se usó para analizar tanto los f luidos enzimáticos extraídos, como los sustratos
con los cuales se habían alimentado las trampas. Esta corrida no dio resultados posiblemente
por fallas en el buffer usado. Las muestras se dejaron correr en la celda de electroforesis durante 80 minutos y no alcanzaron a pasar el gel de “stacking”, por ende, no se logró la
separación de las proteínas. Al final del ensayo se obtuvo lo siguiente:
Imagen 4-8 Segunda corrida. No hubo s epa ración de pro teí nas.
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35
4.3.3 Ensayos de digestión Se busca con éstos, definir tiempos de degradación sujetos a diferentes cantidades de sustrato.
Como en los ensayos de las electroforesis, las plantas se alimentaron con carne de res y Drosophila melanogaster. En el caso de la carne, se suministró a cuatro trampas 0.027, 0.058, 0.074 y 0.105 gramos de este sustrato (Imagen 4-9). Mientras tanto, se utilizaron diferentes
cantidades de moscas medidas en individuos, es decir, en cuatro trampas se suministraron
desde 1 hasta 4 individuos; lo cual es equivalente a 7.0x10-4, 1.6x10-3, 2.3x10-3, 3.8x10-3
gramos de mosca por trampa (Imagen 4-10).
Imagen 4-9 Suministro de carne de res
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Imagen 4-10 Suministro de D . melanogaster
Finalmente, se buscó realizar gráficas en las cuales se explique el comportamiento de las plantas al ser sometidas a diferentes cantidades de sustrato. La variación será expresada en el
tiempo que le tome a la planta la apertura de la trampa, proceso que se da cuando la
degradación ha sido terminada. Por otra parte, es posible hacer una relación entre la cantidad
de enzima producida por área por tiempo con los gramos de sustrato degradados. Los datos f inales debieron ser corregidos por el factor de área de 10microlitros de secreción
por cada lóbulo de la planta por día, ya que se usaron trampas de diferentes tamaños, todo esto con el f in de que no se presenten problemas al hacer el análisis de los resultados.
Como se menciona en la caracterización cuantitativa del fluido enzimático, el tamaño de las
trampas usadas en los experimentos de los cuales se obtuvo el dato de emisión de enzimas tienen un área promedio de 205 milímetros cuadrados, un poco más del doble del área que
presentan las utilizadas en esta ocasión. Por lo tanto, se encontró una cantidad de enzima producida teórica utilizando en factor modificado el cual equivale a 0.049 microlitros de
secreción por milímetro cuadrado por lóbulo por día.
Resultados del ensayo de digestión
Tabla 4-2 Volumen de fluido enzi mático teórico produci do en la digestión de carne como sus trato
Sustrato (gr)
Área (cm2) 1 lóbulo
Ár ea (mm2) 1 lóbulo
Ár ea to tal (mm2)
Tiempo (días)
Fluido enzimático teórico producido (uL)
0,105 0,77 77 154 6 45,07
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37
0,074 0,77 77 154 27 202,83 0,058 0,84 84 168 26 213,07
0,027 0,91 91 182 21 186,44
Los resultados obtenidos no son aptos para definir patrones de degradación en el tiempo ya
que en todos los casos se produce necrosis del tejido vegetal. En el caso de la trampa a la cual le fue suministrada la mayor cantidad de carne, se muestra un marchitamiento prematuro de la
estructura de digestión (Imagen 4-11) tan sólo después de 6 días a partir del cerramiento. Esto
puede estar relacionado con una inhibición por exceso de sustrato o simplemente se trataba de una trampa que ya había realizado varios ciclos de digestión y por lo tanto estaba sujeta a un
fenómeno de marchitamiento como el presenciado.
Evidentemente la digestión no fue completa, sin embargo, las plantas alimentadas con 0.074 y 0.058 gramos de carne, a pesar de tener un final similar al de la trampa anterior, casi
conquistan una degradación completa determinada por la cantidad de sustrato remanente en
ellas. La única trampa que logró finalizar la degradación, costándole igualmente su funcionalidad,
fue aquella a la que se le suministró la menor cantidad de sustrato.
Imagen 4-11 Necrosis de tejido vegetal
Desafortunadamente, las trampas que no fueron utilizadas en el ensayo de digestión de carne de res no lograron dar inicio al ciclo digestivo cuando se les suministró las cantidades antes
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definidas de D. melanogaster. Por lo tanto no se presentan datos que describan la actividad
enzimática sobre este tipo de sustrato.
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Ensayos previos Por medio de ensayo y error se encuentra que tanto la carne de res como moscas de la especie
D. m elanogaster son sustratos indicados para asegurar secreción enzimática y por ende la degradación. Especies como Culex y mosca doméstica común fueron rechazadas por las plantas en la medida en que el cerramiento producido por estímulos físicos de los gatillos no
es permanente, impidiendo que la trampa entre en la etapa de estrechamiento y por lo tanto de
emisión de f luidos enzimáticos.
Por otra parte, las extracciones de fluido enzimático mostraron congruencia en el volumen
para áreas de trampa similares, sin em bargo, estos datos no pueden ser asociados a tiempos de degradación o a sustratos específ icos pero constituyen aproximaciones a cantidades de fluido
disponible para realizar ensayos como por ejemplo, las electroforesis.
5.2 Electroforesis Evidentemente este ensayo no arrojó los resultados esperados. A pesar de una prometedora corrida inicial que muestra las bandas asociadas a las proteínas encontradas en la carne de res,
por problemas relacionados con los reactivos usados en la electroforesis, la segunda corrida no fue exitosa.
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En primera instancia, se encontró el patrón de las bandas que corresponden a las proteínas de
la carne de res, a partir del cual, se realizaría la comparación entre la composición del sustrato crudo y las muestras extraídas de las plantas compuestas por el f luido enzimático y el sustrato
en degradación. Además de haber sido encontrado el patrón, se pudo definir el procedimiento
experimental adecuado para la extracción de proteínas del sustrato crudo de carne, es decir,
realizar una maceración previa con arena junto con el buffer, en lugar de acetona. La segunda electroforesis pretendía obtener diferencias entre los patrones de las bandas
correspondientes al sustrato crudo tanto de la carne como de las moscas, así como el patrón asociado a las extracciones de los complejos enzima-sustrato. Sin em bargo, por cuestiones
ajenas a la extracción y tratamiento previo de las muestras, la corrida fue infructuosa ya que la
migración hacia el gel de corrida fue interrumpida. Según los integrantes del Laboratorio de Diagnóstico Molecular, este fenómeno pudo haber sido causado por un buffer en mal estado.
5.3 Ensayos de digestión Se encuentra de manera generalizada que las cantidades de sustrato utilizadas son superiores a
las que las trampas pueden degradar. Presentan tiempos de digestión supremamente largos, incluso cercanos a los treinta días que en caso de haber sido completados hubieran duplicado
el tiempo esperado de máximo quince días. Esto indica, que el ensayo como fuente de
información para la determinación de tendencias de degradación en el tiempo es insuficiente.
Por otra parte, dado que la trampa a la cual se le suministró la menor cantidad de carne
completó la degradación, se puede concluir que no se debe superar una relación de 0.15 miligramos de sustrato por milímetro cuadrado de trampa.
También arroja un dato asociado a la cantidad aproximada de secreción requerida para la
digestión del sustrato utilizado. Usando la información de la trampa que lleva a cabo todo el proceso excepto la reapertura final, se concluye que la planta debió utilizar 6.9 microlitros de
secreción para digerir cada miligramo de sustrato. Sin embargo este dato no tiene relevancia
alguna desde el punto de vista estadístico ya que por desgracia no se realizaron réplicas a causa de la limitada disponibilidad de trampas funcionales.
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6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO
• Los resultados de este proyecto de grado no son los esperados, incluso no son
representativos del comportamiento digestivo que llevan a cabo los fluidos enzimáticos de D. muscipula. Sin embargo, permite plantear las bases experimentales
y teóricas para una investigación posterior, definiendo así, datos de importancia en los
aspectos de alimentación, consecución de las plantas, condiciones ambientales y características de los ensayos a realizar.
• Se recomienda planificar varias electroforesis teniendo en cuenta la disponibilidad y
actividad de las trampas, por lo tanto, se haría necesaria la consecución de una cantidad mayor de plantas con las cuales se podría también, desarrollar ensayos de digestión con un amplio seguimiento. Este seguimiento implicaría mediciones estrictas
del tiempo de digestión y determinaría perf iles de degradación en el tiempo.
• La segunda electroforesis que fue llevada a cabo no mostró resultados, sin embargo,
diferentes estudios utilizan secreción cruda como muestra para realizar ensayos
similares lo cual corrobora que este proceder es el correcto. Se sugiere realizar un mayor número de electroforesis y prever inconvenientes como extracciones insuficientes y mal funcionamiento de los reactivos en la celda.
• Se recomienda usar marcadores de peso con el fin de conocer los pesos moleculares asociados a las bandas de proteínas encontradas después de culminada la electroforesis
y así, poder realizar la regresión correspondiente.
• El proceso utilizado para extracción de proteínas de sustratos crudos de carne es el indicado ya que se obtienen resultados coherentes y claros haciendo fácil el proceso de comparación entre sustrato crudo y en degradación.
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• Con el fin de facilitar la manutención de las plantas y de esa manera controlar su
estado fisiológico se deben garantizar condiciones adecuadas de temperatura, humedad y radiación solar o artificial. Además, se recomienda emplear plantas que
hayan sido cultivadas o que estén adaptadas a condiciones ambientales similares a las
del sitio donde se vayan a hacer las pruebas.
• Se debe evitar a toda costa suministrar sustrato en exceso. Este provoca marchitamiento y por lo tanto la pérdida de trampas funcionales, las cuales son de
vital importancia ya que no todas aquellas que aparentemente son aptas para la digestión la pueden llevan a cabo correctamente.
• Se recomienda buscar minimizar el estrés fisiológico durante los ensayos, para
proteger a las plantas y así asegurar un funcionamiento normal de las estructuras de degradación ya que de esto depende de manera directa la obtención de datos representativos. Por esta razón no se debe forzar jamás cerramientos manualmente y
tener contemplado que una vez la secreción cruda es extraída, el marchitamiento de la trampa es inminente.
• A pesar de recomendar la carne y las moscas como sustratos, en teoría, cualquier tipo
de sustrato proteico puede ser degradado siempre y cuando, se completen las etapas de cerramiento, estrechamiento y emisión de f luidos enzimáticos.
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7. COSTOS
6.1 Costos asociados a la consecución de las plantas y la adecuación del hábitat:
Tabla 7-1 Costos de la co mpra de las plantas y a decuació n de su hábitat.
Artículo (objeto o concepto) C antidad C osto total en pesos Plantas importadas 30 $140.000 Plantas de Medellín 9 $90.000 Madera 3 barras (1 barra tiene 3m) $28.000 Puntillas 1 caja $2.000 Malla 3 metros ($2500/metro) $7.500 Lámpara fluorescente 40 vatios 1 $35.000 Total $302.500
6.1 Costos asociados a las electroforesis:
Tabla 7-2 Costos de los reacti vos pa ra las electroforesis.
Reactivo o sustancia* Cantidad Costo total en pesos Poliacrilamida (MW CA. 1 500) 1 frasco x 1 litro $498.916 Sulfato de sodio (Lauryl)SIGM A 1 frasco x 25 gramos $627.096 Azul de Coomasiee SIGMA 1 frasco $729.060 Total $1.855.072 * Los reactivos fueron vendidos por G&G Sucesores Ltda.
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