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Estudio Sobre Algunos Elementos Traza en Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Ustilago maydis.
Alma Hortensia Serafín Muñoz1, Kazimierz Wrobel Zasada1, Felix Gutiérrez Corona2, Gerardo Martínez Soto3, Katarzyna Wrobel Kaczmarczyk1 1Instituto de Investigaciones Científicas, 2 Instituto de Investigaciones en Biología Experimental, 3 Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato, L. De Retana N° 5, 36000 Guanajuato, Gto., [email protected] Abstract
El objetivo de este trabajo ha sido conocer los contenidos totales de Al, Bi, Cd, Cr,
Cu, Fe, Mn, Ni y Pb en hongos comestibles (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus e
Ustilago maydis) así como evaluar su distribución macroscópica (sobreros, tallos) y
subcelular (paredes y membranas celulares, citosol) para avanzar en el conocimiento sobre
la incorporación de estos elementos a los hongos. Después de la homogeneización de
muestra (nitrógeno líquido y/o choque balístico), se obtuvieron las fracciones subcelulares
(dos centrifugaciones, a diferente velocidad) y se llevó a cabo la digestión ácida (HNO3,
H2O2) de las muestras de hongos y de cada una de las fracciones obtenidas. Los metales de
interés fueron determinados por espectrometría de absorción atómica con horno de grafito.
En paralelo, los mismos elementos fueron determinados en el Material de Referencia (NIST
1571 – hojas de citrus). Para cada uno de los metales en champiñón y hongo ostra, el mayor
contenido se encontró en la fracción de citosol. En el caso de huitlacoche, se observó más
efectiva incorporación de los elementos a la fracción de paredes celulares.
Introducción Los macro hongos comestibles ocupan un lugar cada vez más importante en la dieta
del hombre. Su composición rica en proteínas vegetales (hasta 7% m/m), fibra (en 100 g del
producto seco hasta 32% de la recomendada ingesta diaria en forma de quitina), vitaminas y
minerales así como su bajo contenido energético (100 g proporciona 30 – 130 kcal) deciden
que los hongos se consideran componentes de una dieta sana. Por otro lado, el desarrollo
de la tecnología de cultivo comercial ha provocado un aumento de la oferta de hongos en el
mercado. Así, la producción anual de Agaricus bisporus es aproximadamente de 4 millones
de toneladas. En algunas regiones geográficas el consumo alcanza 7 – 10 kg de hongos por
persona durante un año[1]. Entre hongos silvestres, considerados como delicias regionales
hay que mencionar huitlacoche mexicano (Ustilago maydis) – un parásito de maíz.
Los resultados de estudios, realizados en diferentes regiones geográficas demuestran
que los hongos contienen relativamente altos niveles de los metales y/o metaloides, lo que
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puede tener importantes implicaciones tanto para el ecosistema como para la salud del
hombre.[2-4] Existen evidencias que, algunas especies (incluyendo los de género Agaricus)
acumulan elementos tales como As, Cd, Cu, Hg, Ag, Pb, Se y Zn.[5-10] En consecuencia, la
investigación sobre los elementos traza en hongos comestibles ha sido enfocada a los
siguientes tópicos:
• Posible uso de los hongos silvestres en la evaluación de contaminación medio
ambiental con los metales pesados y/o radionuclidos en diferentes regiones
geográficas.
• Optimización del proceso de cultivo comercial para obtener un buen rendimiento con la
mínima posible ingesta de los elementos tóxicos.
• Estudios sobre la bioaccesibilidad, acumulación, distribución y especiación de los
elementos en hongos.
• Evaluación de los hongos como posible fuente dietética de bioelementos.
• El objetivo de este trabajo ha sido conocer los contenidos totales de Al, Bi, Cd, Cr, Cu,
Fe, Mn, Ni y Pb en tres especies de hongos comestibles (Agaricus Bisporus, Pleurotus
ostreatus y Ustilago maydis) así como evaluar su distribución en distintas fracciones
celulares (citosol, paredes y membranas celulares) para avanzar en el conocimiento
sobre la incorporación de estos elementos en los hongos.
Materoañes y Métodos Aparatos Para la determinación de los metales se utilizó el espectrómetro de absorción atómica,
modelo 3110 con el horno de grafito HGA 600 y automuestreador AS60. El fraccionamiento
subcelular se llevó a cabo en la muestra homogeneizada en nitrógeno líquido, utilizando una
centrífuga Beckman J2-21 y una ultracentrífuga Beckman XL-90.
Reactivos, disoluciones y muestras Las de Al, Bi, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni y Pb fueron los estándares para espectrometría de
absorción atómica de Sigma. Las soluciones de los modificadores de matriz para EAA-HG de
nitrato de paladio y nitrato de magnesio fueron de Perkin Elmer. Para control de calidad se
utilizó el material de referencia NIST 1571 “citrus leaves”. Además, se utilizaron las
disoluciones de los reactivos Sigma de ácido nítrico, ácido clorhídrico, agua oxigenada, TRIS
y hidróxido de sodio. Se analizaron tres especies de hongos: Agaricus bisporus, Pleurotus
ostreatus y Ustilago maydis, los que se adquirieron en el mercado local.
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El agua desionizada (18.2 MΩ cm) se obtuvo de un sistema de purificación de agua
Labconco.
Procedimientos Fraccionamiento celular
Se utilizó aprox. 1 kg de biomasa de cada uno de los macro hongos. Los champiñones
fueron separados en sombreros y tallos. Para el análisis total (0.5 kg), el material fresco fue
secado en estufa (40-60°C, 24 hrs), molido y se llevó a cabo la digestión de tres
submuestras (0.1 g) de cada uno de los materiales secos (tallos, sombreros de Agaricus
bisporus, Pleurotus ostreatus, Ustilago maydis y material de referencia NIST 1571). Para el
fraccionamiento celular, las muestras de hongos frescos (0.5 kg) fueron homogeneizadas en
nitrógeno líquido. Las sub-muestras del material seco (10 g) fueron suspendidas en 50 ml de
tampón Tris/HCl (50 mmol l-1, pH 5.5) y centrifugadas (10 000 rpm, 10 min, 4°C). El
sobrenadante obtenido del extracto crudo fue separado en dos porciones: una para el
análisis de los metales y la otra para realizar una segunda centrifugación (40 000 rpm, 65
min, 4°C). El segundo sobrenadante (citosol) y las pastillas (paredes celulares y fracción
mixta de membranas) obtenidas en dos centrifugaciones también fueron digeridas para el
análisis de los elementos.
Determinación de Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Mn y Pb por EAA con HG
Se llevó a cabo la digestión de todas las muestras (biomasa seca, dos sobrenadantes, dos
pastillas y NIST 1571) utilizando ataque por vía húmeda. Para ello, a 0.1- 0.5 g de la muestra
(3 réplicas ) se adicionaron 1 ml de HNO3 conc, y los tubos fueron colocados en un bloque
de calentamiento (65°C, 60 min y 120-140°C, 60 min). Finalmente, se agregaron 0.1-0.2 ml
de agua oxigenada y las muestras se dejaron por 30 min para completar la digestión. El
volumen final fue de 10 ml (con agua desionizada) y, después de una dilución apropiada (1:1
– 1:10 000), estas soluciones fueron introducidas al EAA con HG. Se utilizó la plataforma de
L´vov (excepto Cr) y dos modificadores-estabilizadores: nitrato de magnesio (5 µg Mg) para
Al, Cd, Cu, Fe y Mn y nitrato de palladio (0.2 µg de Pd) para Bi y Ni.
Resultados y Discusión
Los elementos seleccionados para el estudio incluyen algunos omnipresentes en
corteza terrestre (Al y Fe), micro nutrientes (Cu y Mn) y elementos considerados como
tóxicos (Bi, Cd, Ni, Pb). Para asegurar la exactitud de los resultados obtenidos en el análisis
de muestras reales, se llevó a cabo la determinación de todos los elementos seleccionados
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en el Material biológico de Referencia (NIST 1571, hojas de citrus). Los resultados de este
análisis se presentan en la Tabla 1, donde se observa una buena concordancia con los
valores certificados, confirmando la validez del procedimiento analítico.
Tabla 1. Resultados obtenidos en la determinación de Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni y Pb en el
material NIST 1571 (en µg g-1) y sus correspondientes valores certificados (el Bi
no ha sido certificado en NIST 1571).
Elemento Resultado promedio ± DE* Valor certificado*
Al 84.5 ± 2.7 92 ± 15
Cd 0.04 ± 0.01 0.03 ± 0.01
Cr 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2
Cu 18.4 ± 1.2 16.5 ± 1.3
Fe 101 ± 4 90 ± 10
Mn 21.5 ± 0.8 23 ± 3
Ni 0.9 ± 0.4 0.6 ± 0.3
Pb 11.8 ± 2.0 13.3 ± 2.4
Con el fin de evaluar la distribución de cada uno de los metales en diferentes partes
del hongo y sus fracciones celulares, se determinó su contenido total y se aplicó un sistema
de fraccionamiento basado en la centrifugación de la suspensión a diferentes
velocidades.[11] Para romper las células, la masa del hongo fresco fue homogenizada en
nitrógeno líquido, obteniéndose un polvo seco. Este polvo fue suspendido en tampón
Tris/HCl y sometido a una primera centrifugación a baja velocidad (10 000 rpm, 10 min). El
Sobrenadante 1 (extracto crudo) contenía el citosol y las membranas, mientras que las
paredes celulares y las células no rotas formaron la Pastilla 1. Posteriormente, el
Sobrenadante 1 fue centrifugado a alta velocidad (40 000 rpm, 65 min), obteniéndose el
Sobrenadante 2 (citosol) y la Pastilla 2 (fracción mixta de membranas). Como se indica en
los procedimientos, se llevó a cabo la digestión de cada una de las fracciones y la
determinación de los metales de interés. Para facilitar la evaluación de distribución de
metales entre las fracciones obtenidas, en cada caso el resultado fue calculado como la
masa del metal respecto a la masa del hongo seco.
En Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos en la determinación de contenidos
totales de nueve metales en tres especies biológicas junto con los rangos de estos
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elementos en hongos, reportados en la literatura. Generalmente, los datos obtenidos en este
trabajo para Agaricus bisporus y Pleurotas ostreatus concuerdan con los reportes
anteriores.[1,12] En cuanto a huitlacoche, no se han encontrado ningunos datos en la
bibliografía. Es importante resaltar que, los niveles de metales en huitlacoche, observados en
este trabajo, fueron significativamente inferiores respecto a los niveles en champiñón y ostra.
Estos resultados demuestran que, la bioaccesibilidad de los metales del sustrato es
diferente. En otras palabras, la planta de maíz funciona como un “filtro”, limitando el acceso
de los metales del suelo a hasta el hongo parásito. En consecuencia huitlacoche es la
especie menos contaminada con los metales respecto a los hongos que utilizan como
sustrato composta, paja o suelo.
Tabla 2 Contenidos totales de los elementos de interés en tres especies de hongos
comestibles (para Agaricus bisporus por separado se reportan niveles en tallo y
en sombrero) y los rangos de concentraciones reportados por otros autores.
Concentración total del elemento, µg/g , (peso
seco) Otros reportes
Agaricus bisporus Elemento
Pleurotus
ostreatus
Ustilago
maydis Sombrero Tallo Rango* Referencia
Al 44.3 10.5 19.5 20.8 14 – 85 [12-14]
Bi 2.01 0.19 0.53 5.65 1.9 – 9 [12]
Cd 5.39 <LC 0.54 0.20 <0.5 - 35 [1-4,8,12,15,16]
Cr 63.0 2.15 4.06 5.18 0.1 – 20 [4,12,13,17,18]
Cu 732 2.22 352 535 4.5 – 465 [1,2,4,6,12,13,19]
Fe 3285 19.0 1943 2456 33 – 170 [1-4,20]
Mn 18.3 0.37 9.42 8.47 5 – 60 [1-4,18]
Ni 31.5 0.43 9.02 4.32 0.4 – 145 [1,4,12,17,18]
Pb 0.91 2.47 0.41 0.88 <0.5 – 10 [1,2,4,12,13,16,19]
* El intervalo estimado en base a los resultados obtenidos en los análisis de diferentes
hongos comestibles, reportados en la literatura.
En el análisis de fracciones celulares, en primer lugar se determinaron las
recuperaciones de cada uno de los metales en dos etapas de centrifugación. La
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recuperación de primera centrifugación (R1, %) fue calculada como razón entre suma de los
contenidos del metal en Sobrenadante 1 + Sedimiento 1 y el contenido total; el valor de
recuperación de la segunda centrifugación se obtuvo como la relación entre suma de los
contenidos en Sobrenadante 2 + Sedimiento 2 y el contenido en Sobrenadante 1 (R2, %).
Los valores R1 varían entre 80 y 94 % y los R2 entre 79 y 106 %, lo que indica incompleta
recuperación de los metales en el proceso de fraccionamiento celular. Esto podría deberse
en primer lugar a las pérdidas de los analitos y/o a la contaminación con hierro durante
algunas etapas del procedimiento, que por su naturaleza es difícil de controlar. Otra fuente
de error fue la diferencia en procedimientos aplicados para obtener la biomasa seca: en el
análisis del contenido total la biomasa fue secada a 60°C, mientras que para el
fraccionamiento se llevó a cabo la deshidratación en nitrógeno líquido.
Tabla 2. Resumen de los resultados de la distribución relativa de los elementos en
hongos: para cada uno de macro hongos estudiados (PO – Pleurotas ostreatus,
Ab-s – Agaricus bisporus sombrero, Ab-t – Agaricus bisporus tallo, UM – Ustilago
maydis) se presenta el valor mínimo, máximo y promedio de la contribución de
los elementos en tres fracciones celulares obtenidas.
Citosol Paredes celulares Fracción mixta de
membranas
Distribución
relativa
PO Ab-s Ab-t H PO Ab-s Ab-t H PO Ab-s Ab-t H
Min, % 50.1
(Fe)
26.0
(Cr)
44.4
(Cd)
11.9
(Al)
6.1
(Cd)
14.0
(Cd)
7.9
(Fe)
20.5
(Cu)
0.7
(Cd)
1.0
(Bi)
3.6
(Mn)
0.31
(Pb)
Max, % 93.2
(Cd)
79.1
(Cd)
66.0
(Ni)
78.6
(Cu)
40.4
(Bi)
52.0
(Mn, Cr)
47.2
(Cd)
87.1
(Al)
18.2
(Fe)
22.0
(Cr)
24.0
(Fe)
6.8
(Bi)
Promedio, % 73.6 57.1 58.6 38.5 22.0 32.4 32.1 57.0 4.4 10.3 9.3 4.5
La distribución relativa de los metales entre paredes celulares, citosol y membranas
se presenta en la Figura 1 y se resume en Tabla 3. En los resultados obtenidos para
Pleurotas ostreatus y Agaricus bisporus se observa claramente alta contribución de los
elementos en citosol, mientras que para huitlacoche la mayor contribución de los metales
existe en paredes celulares. En particular, los datos obtenidos sugieren que los metales se
acumulan en citosol de la especie Pleurotas con mayor preferencia respecto a otros tipos de
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hongos. Por otro lado, independientemente de la especie biológica relativamente menor
contribución de los metales se observó en las membranas celulares.
Parece interesante que, la distribución relativa en fracciones celulares observada en
tallos y sombreros de Agaricus fue diferente para diferentes elementos. Como se puede
observar en Tabla 3, las contribuciones promedias (evaluadas para 9 elementos) en paredes
celulares y en membranas fueron similares (respectivamente 32.4 %, 10.3 % en tallos y 32.1
%, 9.3 % en sombreros). Sin embargo, se observa claramente en la Fig. 1 que para los
cuatro elementos (Al, Bi, Cd and Pb), su contenido en las estructuras insolubles en agua fue
mayor en sombreros que en tallos (valor promedio para paredes y membranas celulares 40.4
%, 7.2% en sombreros versus 21.3 %, 5.3 % en tallos). Al contrario, la contribución relativa
de Ni, Mn y Cr en paredes y membranas celulares fue mayor en tallos que en sombreros
(promedio para 3 elementos: 48.7 %, 16.8 % en tallos y 31.5%, 5.7 % en sombreros).
303
Fig. 1. Distribución relativa de los metales en las fracciones celulares de: (a) Ustilago
maydis; (b) Pleurotus ostreatus, (c) Agaricus bisporus (sombreros) y (d) Agaricus
bisporus (tallos).
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304
Conclusiones
Los resultados obtenidos en el análisis de los contenidos totales fueron dentro de los
intervalos reportados por otros autores en diferentes tipos de hongos. En este trabajo, se
encontraron significativamente inferiores niveles de los metales en huitlacoche respecto a
champiñón y hongo ostra, lo que se relacionó con más baja bioaccesibilidad de los
elementos en maíz respecto a otros tipos de sustratos. En cuanto a la distribución celular, los
resultados obtenidos para Pleurotus osteratus y Agaricus bisporus demuestran mayor
contribución de los elementos en citosol. Se puede deducir que las formas mayoritarias de
los metales en estos hongos son los compuestos solubles en agua. Se demostró también la
asociación de cantidades relativamente inferiores de estos metales con los compuestos
insolubles en agua, separados en fracciones de paredes y membranas celulares. Por otro
lado, en Ustilago maydis, se observó la mayor contribución de los elementos en la fracción
de paredes celulares, lo que sugiere su incorporación más efectiva a los compuestos
contenidos en esta fracción.
En conclusión, la distribución relativa de los metales en las fracciones celulares de
hongos depende de la especie biológica del hongo, su parte morfológica (sombrero, tallo) y
también de las propiedades de metal. Así, en Pleurotus ostreatus el contenido total de los
elementso y su acumulación en citosol fueron mayores respecto a otras dos tipos de hongos.
En Agaricus bisporus, los contenidos totales fueron inferiores con clara tendencia hacia más
eficiente incorporación de metales en paredes y membranas celulares. La asociación de Al,
Bi, Cd y Pb con las estructuras insolubles en agua fue más notoria en sombreros que en
tallos, mientras que la contribución de Cr, Cu y Ni en membranas y paredes celulares fue
mayor en tallos. Finalmente, el hongo huitlacoche contenía más bajos niveles de todos los
elementos y su incorporación preferente a la fracción de paredes celulares.
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