Evaluación de efectos antitumorales de un oligonucleótido ...Evaluación de efectos antitumorales...
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Evaluación de efectos antitumorales de un oligonucleótido (ODN) tipo señuelo dirigido a STAT3 en un modelo de línea celular de cáncer de pulmón. Michael Ramírez Parra Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Maestría en Bioquímica Bogotá. Colombia 2017
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Evaluación de efectos antitumorales de un
oligonucleótido (ODN) tipo señuelo dirigido a STAT3 en
un modelo de línea celular de cáncer de pulmón.
Michael Ramírez Parra
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina
Maestría en Bioquímica Bogotá. Colombia
2017
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Evaluación de efectos antitumorales de un oligonucleótido (ODN) tipo señuelo
dirigido a stat3 en un modelo de línea celular de cáncer de pulmón.
Michael Ramírez Parra
Tesis presentada como requisito parcial para optar por el título de:
Magister en Bioquímica
Director
Fabio A. Aristizábal G. PhD
Línea de investigación:
Búsqueda y caracterización de productos con actividad anticáncer Identificación de marcadores moleculares asociados a la respuesta de tratamientos en
Cáncer
Grupo de Investigación: Farmacogenética del cáncer
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina
Maestría en Bioquímica Bogotá. Colombia
2017
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AGRADECIMIENTOS
A Dios, mis padres y hermanos por su apoyo incondicional, paciencia y preocupación
durante todo este proceso de maestría.
A la Universidad Nacional de Colombia y a los profesores de la maestría en bioquímica
Carlos Guerrero, Luis Gómez, Orlando Acosta por todos los conocimientos brindados
su apoyo, disponibilidad y colaboración durante todo mí proceso de formación como
estudiante. Al laboratorio de parasitología por su colaboración y ayuda en los ensayos
de microscopía
A mi director de tesis, Fabio Aristizábal, por su paciencia, colaboración y brindar las
herramientas para llevar a cabo esta tesis. A mis compañeros del grupo
Farmacogenética del cáncer por su apoyo y por compartir sus conocimientos durante
este año.
A mis compañeros de maestría Ana María, Carolina, Diana, Yenith, Xiomara por su
apoyo incondicional a pesar de la distancia y colaboración durante estos años.
4
RESUMEN Actualmente el cáncer continúa siendo una enfermedad con altas tasas de incidencia y
mortalidad a nivel mundial. El desarrollo de nuevas moléculas para tratar los diferentes tipos
de cáncer se encuentra enfocado en la terapia molecular dirigida. Sin embargo, pocas
estrategias de este tipo han alcanzado la etapa de estudios clínicos debido a sus efectos
inespecíficos, inestabilidad o baja permeabilidad celular. Los oligonucleótidos (ODNs) tipo
señuelo son una alternativa para la terapia molecular dirigida. Estos han mostrado gran
efectividad en diversos modelos de líneas celulares, junto con una mejor selectividad y mayor
especificidad en sus efectos. Se seleccionó al factor de transcripción STAT3 como un blanco
molecular potencial ya que su sobrexpresión en el tejido tumoral claramente se ha asociado
con el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón y a fenómenos de resistencia a
medicamentos usados en clínica. El objetivo de este trabajo fue validar el potencial
antitumoral de ODNs dirigidos contra STAT3 en líneas celulares de cáncer de pulmón
teniendo en cuenta la selectividad y especificidad de los efectos.
La expresión y activación de STAT3 fue medida por inmunofluorescencia para asegurar la
presencia del blanco molecular en el modelo escogido. Posteriormente se cuantificó la
captación celular de los ODNs por medio de citometría de flujo. Los efectos citotóxicos de los
ODNs fueron determinados medio del ensayo metabólico de resazurina teniendo en cuenta
diferentes concentraciones y tiempos de tratamientos. Finalmente se evaluó el posible
mecanismo de muerte celular asociado a los tratamientos por medio de ensayos de actividad
de caspasas y fragmentación nuclear por microscopía de fluorescencia.
Los resultados mostraron que hubo una mayor expresión y activación del factor de
transcripción STAT3 en las líneas tumorales respecto a una línea control de fibroblastos
pulmonares. Además se encontró que los ODNs empleados fueron transfectados
eficientemente en las células localizándose principalmente en el citoplasma. Mediante los
ensayos de citotoxicidad se evidenció que los ODNs parental y modificado lograron la
disminución de la supervivencia celular de forma dosis y tiempo dependiente alcanzando
concentraciones letales 50 (CL50) en el rango nanomolar. Dichos efectos fueron exclusivos
para las líneas tumorales y no para la línea celular normal demostrando la selectividad de los
ODNs. Por otra parte se encontró que los ODNs bajo las condiciones de tratamiento indujeron
un proceso de muerte por apoptosis y generaron cambios en la expresión de mRNA de tres
genes blanco de STAT3. Estos resultados permitieron validar la tecnología de ODNs tipo
señuelo como un modelo potencial de terapia dirigida con efectos selectivos sobre líneas
celulares de cáncer de pulmón.
Palabras clave: Cáncer de pulmón, oligonucleótidos tipo señuelo, Factor de transcripción STAT3, fibroblastos pulmonares MRC-5
5
ABSTRACT Currently, the cancer is still a disease with high mortality and incidence rates. The
development of new molecules to treat the different cancer types is focused on targeted
therapy. However, very few strategies have reached the stage of clinical trials due to their
non-specific effects, instability or low cell uptake. Decoys oligonucleotides (ODNs) are an
alternative for molecular targeted therapy and have shown high effectiveness in many cell
lines with selectivity and specificity in their effects. We choose the STAT3 transcription factor
as a potential molecular target since its overexpression in tumor tissue has been associated
with development and progression of lung cancer and drug resistance in clinical practice. The
aim of this research was to validate the antitumor potential of ODNs targeting STAT3 in lung
cancer cell lines taking into consideration selective and specific effects.
Protein expression and activation of STAT3 was measured by immunofluorescence to ensure
the presence of the molecular target in the chosen model. Subsequently the cellular uptake of
ODNs was quantified by flow cytometry. The cytotoxic effects of ODNs were determined using
the resazurin metabolic assay, taking into account different concentrations and treatment
times. Finally, the probable mechanism of cell death associated with the treatments was
evaluated by caspase activity assays and nuclear fragmentation by fluorescence microscopy.
The results showed a greater expression and activation of STAT3 in the tumor lines compared
to a control line of pulmonary fibroblasts. In addition, it was found that the ODNs employed
were efficiently transfected into cells and located mainly in the cytoplasm. Cytotoxicity assays
revealed that the parental and modified ODNs achieved a decrease in cell survival in a dose
and time dependent manner reaching lethal concentrations 50 (CL50) in the nanomolar
range. These effects were exclusive for tumor cell lines and not for a normal cell line showing
the selectivity of the ODNs. On the other hand, it was found that the ODNs under the
conditions of treatment induced a death process by apoptosis and generated changes in the
mRNA expression of three STAT3 target genes. These results validated the decoy ODNs as a
potential model of targeted therapy with selective effects on lung cancer cell lines.
Key words: Lung cancer, decoy oligonucleotides, STAT3 transcription factor, pulmonary
fibroblasts MRC-5
6
Contenido
RESUMEN ............................................................................................................................................................................... 4
ABSTRACT ............................................................................................................................................................................. 5
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................................ 8
LISTA DE TABLAS .............................................................................................................................................................. 8
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS ................................................................................................................. 9
1. Capítulo 1 ....................................................................................................................................................................... 10
1.1 INTRODUCCION .................................................................................................................................................. 10
1.2. JUSTIFICACION ................................................................................................................................................... 11
2. Capítulo 2 – Marco Teórico .................................................................................................................................... 13
2.1 El cáncer .................................................................................................................................................................. 13
2.2 Cáncer de Pulmón – Aspectos moleculares............................................................................................ 14
2.3 Factores de transcripción en cáncer ......................................................................................................... 16
2.4 El factor de transcripción STAT3 ................................................................................................................ 16
2.5 STAT3 en el cáncer de pulmón..................................................................................................................... 18
2.6 Terapias moleculares anti-STAT3 .............................................................................................................. 20
2.7 Terapia molecular alternativa e innovadora en cáncer basada en deoxi-oligonucleótidos
(ODN) de doble cadena............................................................................................................................................ 21
2.8 Pregunta de investigación .............................................................................................................................. 23
3. Capítulo 3. Objetivos ................................................................................................................................................ 24
3.1 Objetivo general .................................................................................................................................................. 24
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................................................... 24
4. Capítulo 4 - Metodología ......................................................................................................................................... 25
4.1 Cultivos celulares ................................................................................................................................................ 25
4.2 Diseño de Oligonucleótidos ........................................................................................................................... 25
4.3 -Ensayos de expresión STAT3 y Y705-STAT3 ...................................................................................... 26
4.4 Transfección de Oligonucleótidos .............................................................................................................. 26
4.5 Caracterización del proceso de transfección de ODNs ..................................................................... 26
7
4.5.1 Inmunofluorescencia ............................................................................................................................... 27
4.5.2 Citometría de flujo ..................................................................................................................................... 27
4.6 Ensayo de citotoxicidad ................................................................................................................................... 27
4.6.1 Determinación de CL 50s ....................................................................................................................... 27
4.6.2 Cinética de crecimiento .......................................................................................................................... 27
4.7 Ensayos de apoptosis........................................................................................................................................ 28
4.7.1 Ensayo de TUNEL ...................................................................................................................................... 28
4.7.2 Determinación de actividad de caspasa 3 ...................................................................................... 28
4.8 Ensayos de expresión diferencial de genes blanco de STAT3 ..................................................... 28
4.8.1 Extracción de RNA ..................................................................................................................................... 28
4.8.3 Síntesis de cDNA......................................................................................................................................... 29
4.8.4 PCR en tiempo real .................................................................................................................................... 29
4.9 Análisis estadístico ............................................................................................................................................ 30
Capítulo 5. Resultados y discusión.......................................................................................................................... 30
5.1 ¿Hay expresión del factor de transcripción STAT3 en su forma basal o fosforilada (Y705)
en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5? ............................................................................................... 30
5.2 ¿Es transfectado de forma eficiente el señuelo dirigido a STAT3 en las líneas celulares
A549, H292 y MRC.5? ............................................................................................................................................... 33
5.3 ¿Tiene efecto citotóxico la transfección de ODNs (parental, modificado y control) sobre
las líneas celulares A549, H292 y MRC-5? ..................................................................................................... 36
5.4 ¿El tratamiento con los ODNs parental y modificado tiene efecto sobre la activación de
caspasas 3 y 7 en las líneas A549, H292 y MRC-5? ......................................................................................... 40
5.5 ¿Hay fragmentación nuclear en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 luego del
tratamiento con los señuelos parental o modificado?................................................................................... 41
5.6 ¿El tratamiento con los ODNs parental, modificado y control modula la expresión de los
genes blanco de STAT3 (BCL-XL, Ciclina D y VEGF) en las líneas celulares? ..................................... 46
Capítulo 6. Conclusiones y Recomendaciones................................................................................................... 51
6.1 Conclusiones ......................................................................................................................................................... 51
6.2 Perspectivas y recomendaciones ................................................................................................................ 51
Capítulo 7. Bibliografía ................................................................................................................................................. 53
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Expresión de STAT3 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. (PAG 30)
Figura 2. Expresión de Y705-STAT3 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. (PAG 31)
Figura 3. Localización subcelular del ODN modificado marcado con FITC transfectado en las
líneas celulares A549, H292 y MRC-5. (PAG 32)
Figura 4. Eficiencia de la transfección del ODN marcado con FITC transfectado en
concentraciones 6 – 100nM en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. (PAG 33)
Figura 5. Curvas de citotoxicidad de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 tratadas 24
horas con ODN par, ODN mod y ODN control. (PAG 35)
Figura No 6. Cinética de supervivencia de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 tratadas
entre 0 y 96 horas con ODN par, ODN mod y ODN control. (PAG 36)
Figura 7. Actividad relativa de caspasas 3 o 7 en las líneas A549, MRC-5 y H292 luego del
tratamiento con ODN Par, ODN mod y ODN control. (PAG 38)
Figura No 8. Ensayo de fragmentación nuclear de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5
tratadas con ODN par y ODN mod. (PAG 40-42)
Figura 9. Cuantificación del ensayo de fragmentación nuclear TUNEL de las líneas A549, H292
y MRC-5. (PAG 44)
Figura No.10. Expresión relativa de los genes BCL-XL, Ciclina D1 y VEGF en las células A549,
H292 y MRC-5 tratadas con ODN PAR, MOD o Control. (PAG 45)
LISTA DE TABLAS
Tabla No 1. Secuencias de los oligonucleótidos diseñados dirigidos contra STAT3. (PAG 25)
Tabla No 2. Secuencias de primers diseñados para los ensayos de RT-qPCR. (PAG 29)
Tabla No 3. Valores estimados de la CL30, CL50 e CL70 por medio del ajuste de las curvas de
supervivencia con una regresión no lineal (Modelo Log (Do) vs respuesta normalizada –
pendiente variable) con ayuda del software Graphpad prism. (PAG 35)
9
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS ALK: Quinasa de linfoma anaplástico Bcl2: Linfoma de célula B 2 Bp: pares de bases BSA: Albúmina sérica bovina CAD: DNAsa activada por caspasas CBP: Proteína de unión a CREB cDNA: DNA complementario CL: Concentración letal DAPI: 4 ',6-diamino-2-fenilindol DMEM: Medio mínimo esencial modificado por Dulbecco DNAsa I: Desoxirribonucleasa I EGF: Factor de crecimiento endotelial EGFR: Receptor del factor de crecimiento endotelial FITC: Isotiocianato de fluoresceína GCSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos H2O2: Peróxido de hidrógeno HER-2: Receptor de tirosina quinasa 2 HIF-1α: Factor inducible por hipoxia 1 alfa IL: Interleuquina JAK: Janus Kinasa LIF: Factor inhibitorio de leucemia MCSF: Factor estimulante de colonias de macrófagos MMP: Metaloproteinasa de matriz mRNA: RNA mensajero NF-κB: Factor nuclear kappa B nM: Nanomolar μM: Micromolar NSCLC: Carcinoma pulmonar de célula no pequeña ODN: Oligonucleótido ODN par: Oligonucleótido parental ODN mod: Oligonucleótido modificado ODN control: Oligonucleótido control PBS: Solución salina amortiguada por fosfatos PDGFR: Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas PI: Yoduro de propidio RPMI: Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute SCCHN: Carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello SFB: Suero fetal bovino SH2: Dominio de homología Src tipo 2 siRNA: ARN de interferencia pequeño SOCS: Supresor de la señalización por citoquinas. STAT3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3 TGFα: Factor de crecimiento transformante alfa TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling Tyk: Tirosina quinasa P-Y705-STAT3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3 fosforilado en Tyr705
10
1. Capítulo 1
1.1 INTRODUCCION El cáncer es una enfermedad con altas tasas de incidencia y mortalidad a nivel mundial
caracterizado por una proliferación incontrolada de las células que puede terminar en
invasión y metástasis de y a diferentes órganos. Es originado por diferentes factores de tipo
ambiental, genético o epigenético que llevan a la alteración de procesos vitales para la célula
como la estabilidad y reparación del DNA, metabolismo, proliferación, viabilidad y
diferenciación celular, muerte celular y senescencia.
En la célula normal estos procesos están regulados por vías de señalización en las que
participan proteínas y otras biomoléculas encargadas de generar toda la cascada de
señalización que puede terminar en la transcripción o represión de genes que controlan la
homeostasis celular. Se sabe que en la célula tumoral la alteración en las vías de señalización
es la que permite que estas adquieran el fenotipo maligno y por tanto lleven a la progresión de
la enfermedad. Por tanto las vías de señalización específicas que regulen procesos de
proliferación, supervivencia o muerte celular se convierten en un blanco potencial para el
diseño de nuevas moléculas para el tratamiento del cáncer, además que en teoría ofrecen una
mayor especificidad y menor toxicidad sistémica.
Con el conocimiento actual sobre las vías de señalización, uno de los blancos para el
desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer se enfoca en los factores de transcripción, los
cuales regulan la expresión de genes que pueden estar asociados con procesos de desarrollo y
transformación tumoral. Además, para que sean blancos moleculares útiles, los factores de
transcripción deben estar sobre expresados o activados de forma constitutiva en las células
tumorales comparado con la célula normal y deben participar de una o varias vías de
señalización relacionadas con el proceso oncogénico.
STAT3 es un factor de transcripción expresado en diferentes tipos celulares y tejidos que
participa en la regulación de genes involucrados en procesos de crecimiento celular,
diferenciación y apoptosis. Sin embargo, hay suficiente evidencia en la que se asocia su
sobrexpresión y activación persistente en el desarrollo y progresión de diferentes tipos de
cáncer dado que sobre él convergen múltiples vías de señalización celular. Por lo tanto, el
bloqueo en su actividad transcripcional podría tener efectos positivos que se pueden emplear
como terapia antitumoral.
Gracias a las nuevas herramientas tecnológicas que permiten una evaluación detallada a nivel
molecular se ha encontrado que cada tipo de cáncer posee unas características definidas,
incluso entre diferentes individuos con el mismo tipo de cáncer, por lo que actualmente la
medicina moderna se está enfocando en el desarrollo de terapias individualizadas. De acuerdo
a esto es importante y necesario el desarrollo de nuevas moléculas dirigidas contra un blanco
molecular en particular y así producir un efecto más específico sobre este. Recientemente se
han desarrollado oligonucleótidos (ODNs) tipo señuelo que permiten bloquear la actividad
transcripcional de factores de transcripción. Hasta el momento este tipo de moléculas no han
alcanzado una fase de desarrollo importante, como los estudios clínicos, ya que aspectos como
11
su captación celular, estabilidad intracelular, concentración y tiempos de administración que
son determinantes para producir el efecto biológico deseado no han sido mejorados, lo que
hace necesario profundizar en la investigación de moléculas de este tipo.
1.2. JUSTIFICACION En la actualidad, el cáncer hace parte de las patologías con mayor incidencia y mortalidad en
el mundo. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud, para el año 2012 hubo alrededor
de 14.1 millones de nuevos casos, 8.2 millones de muertes por cáncer y 32.6 millones de
personas con esta enfermedad. El cáncer de pulmón sigue siendo el de mayor mortalidad,
estimado en un 19.4% respecto al total de cánceres y una incidencia del 13%. En hombres,
este tipo de cáncer permanece como el de mayor mortalidad en el mundo (23.6% del total) y
con una incidencia del 16.7% (1.2 millones de casos). En mujeres, el cáncer de pulmón es la
segunda causa de muerte por cáncer en el mundo con un 13.8% de mortalidad, por debajo del
cáncer de seno (14.7%) y en un cuarto lugar de incidencia (8.8% de nuevos casos). En
Colombia el cáncer de pulmón sigue siendo un problema importante de salud pública. Según
el estudio GLOBOCAN 2012, en hombres este tipo de cáncer se encuentra en el tercer lugar de
incidencia (8.8% de nuevos casos) y mortalidad de 14.3% por debajo del cáncer de próstata y
estómago. En mujeres se encuentra en quinto lugar con una incidencia de 4.7% y mortalidad
de 9.1% superado por cánceres de seno, cervical, colorrectal y de estómago (1).
A nivel molecular el cáncer de pulmón ha sido caracterizado por presentar sobre expresión de
algunos oncogenes, principalmente por mutaciones activantes en genes como el receptor del
factor de crecimiento epidermal (EGFR), la proteína K-Ras, p53 o la proteína fusión EMLA4-
ALK entre otras (2). La activación de estas proteínas favorece que las vías de señalización
corriente abajo de ellas se encuentren activadas de forma persistente para favorecer la
progresión tumoral. Además se ha demostrado que varias de estas vías de señalización
convergen directamente sobre el factor de transcripción STAT3, el cual se encuentra
sobrexpresado o activado constitutivamente en pacientes con cáncer de pulmón regulando la
transcripción de genes necesarios para la proliferación celular, evasión de apoptosis o
procesos angiogénicos. Recientemente también se demostró que en líneas celulares de cáncer
de pulmón con diferentes oncogenes mutados se presentaba resistencia a medicamentos
usados actualmente en clínica como el erlotinib a través de un feedback positivo de activación
de STAT3 (3). Por lo tanto este factor de transcripción se convierte en un blanco molecular
potencial importante para la célula tumoral, cuyo bloqueo permitiría contrarrestar los efectos
de iniciación, progresión tumoral o resistencia asociados no solo a una vía, sino a varias vías
de señalización.
Actualmente la terapia dirigida es el campo más estudiado en el tratamiento del cáncer debido
a que las nuevas tecnologías de secuenciación son cada vez más accesibles y permiten una
descripción a nivel molecular de los tumores de forma individual (4). El objetivo a futuro es el
desarrollo de inhibidores altamente selectivos hacia los oncogenes o proteínas alteradas
identificadas en el paciente para el diseño de un “coctel inteligente” que permita afectar la
señalización de la célula tumoral sin afectar células normales (5). Dentro de las terapias
moleculares nuevas se encuentran los señuelos oligonucleótidos (DNA de doble cadena corto)
12
que permiten el bloqueo de factores de transcripción teniendo efectos sobre el perfil de
expresión de sus genes blanco. Esta estrategia tiene ventajas sobre otras en cuanto a
selectividad y especificidad de los efectos y por lo tanto representa una alternativa
interesante para el diseño de nuevos agentes terapéuticos anti-STAT. Además en 2011 se llevó
a cabo un estudio pre-clínico corto de fase 0 en pacientes con cáncer de cabeza y cuello
utilizando un señuelo ODN para inhibir a STAT3 demostrando un efecto antitumoral
promisorio (6).
El grupo de investigación Farmacogenética del cáncer ha obtenido resultados importantes en
cuanto al efecto antitumoral de un señuelo ODN dirigido contra el factor de transcripción HIF-
1α en líneas celulares tumorales de seno y próstata por lo que el interés es continuar con el
diseño y evaluación de este tipo de moléculas con potencial terapéutico sobre diferentes
factores de transcripción para que a futuro este conocimiento permita el diseño racional de
fármacos para esquemas de terapia dirigida . Es necesaria esta evaluación ya que
dependiendo del modelo tumoral, aspectos como la concentración, tiempos de administración
a emplear, estabilidad y toxicidad pueden ser diferentes para cada señuelo ODN en particular,
y que además son fundamentales para asegurar buenas propiedades farmacológicas en este
tipo de moléculas.
13
2. Capítulo 2 – Marco Teórico
2.1 El cáncer El cáncer continúa como una de las principales causas de muerte alrededor del mundo y
alrededor del 53% de las muertes ocurren en países en desarrollo. Según la OMS, se estima
que para el año 2030 se incrementen a 23.6 millones de nuevos casos (1). El cáncer es una
enfermedad compleja que comprende alrededor de 100 enfermedades en los diferentes
órganos caracterizados principalmente por el crecimiento acelerado y la muerte celular
disminuida (5).
La transformación de una célula normal en tumoral es un proceso complejo de múltiples
pasos, explicado a través de diversos mecanismos. Puede verse desde un punto de vista
genético ya que durante el proceso tumorigénico, en la célula se puede generar
sobrerregulación de oncogenes a partir de ganancia de cromosomas o mutaciones puntuales
activantes, inactivar genes supresores tumorales por medio de deleciones intragénicas,
pérdida de cromosomas e inactivación de genes importantes en procesos de estabilidad y
reparación del DNA, proliferación, viabilidad y diferenciación celular (7). Además de esto, el
cáncer también se ha asociado a mecanismos epigenéticos. Casi todos los tipos de cáncer han
mostrado diferencias en el estado de metilación en las diferentes regiones de los genes
comparado con el tejido normal. En las regiones repetitivas intergénicas, se ha descrito que la
disminución de la cantidad de 5-metilcitosina favorece la inestabilidad genómica y por tanto
promueve el proceso tumoral. Por otra parte, la hipermetilación en las islas CpG se asocia al
silenciamiento de genes supresores tumorales. También, en genes de reparación de DNA o
que codifican para factores de transcripción este mecanismo favorece la tumorigénesis de
forma indirecta, por silenciamiento de genes corriente abajo o acumulación de errores
genéticos. Deregulación en las enzimas que modifican o leen marcas en las histonas también
es reportada en varios tipos de cáncer (8,9).
Estos cambios genéticos o epigenéticos llevan a que la célula adquiera las capacidades
necesarias para la progresión del proceso tumoral: señalización proliferativa sostenida,
evasión de supresores de crecimiento, resistencia a la muerte celular, inmortalización,
inducción de angiogénesis, reprogramación del metabolismo celular, evasión de la respuesta
inmune y activación de invasión y metástasis (10). Dichas capacidades adquiridas de la célula
tumoral son el reflejo de la alteración en las vías de señalización celular que regulan la
expresión de genes implicados en procesos de metabolismo, reparación del DNA,
proliferación, supervivencia, diferenciación y muerte celular. Estas vías no trabajan de manera
individual sino que se encuentran como redes de señalización creando un sistema muy
complejo de vías verticales y paralelas reguladas por mecanismos de retroalimentación
positiva o negativa (7). Esta complejidad hace que cada tipo de cáncer deba estudiarse de
forma individual por lo que el abordaje desde el punto de vista terapéutico debe hacerse
idealmente bajo este mismo parámetro. Por lo tanto, el conocimiento detallado de las vías de
señalización y los factores o proteínas implicadas en un tipo de cáncer es importante para el
desarrollo racional de nuevas terapias.
14
2.2 Cáncer de Pulmón – Aspectos moleculares
El cáncer de pulmón continúa siendo el de mayor mortalidad en el mundo. Además es una
patología altamente prevenible ya que la mayoría de los casos se asocian con el consumo de
tabaco. Sin embargo, aproximadamente un 15% de los casos en hombres y un 53% en mujeres
no se relaciona con este factor de riesgo. En personas no fumadoras, el cáncer de pulmón se
ha asociado con factores de tipo ambiental (exposición a asbestos, cromo, arsénico, níquel,
entre otros), contaminantes del aire, factores dietarios, genéticos, hormonales o virales (11).
También se ha encontrado que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)
constituye un factor de riesgo importante para el desarrollo de cáncer de pulmón (12). Aún no
ha sido definido cuál de estos factores es el más predominante en las personas no fumadoras.
De acuerdo a una clasificación clínico-patológica, se han descrito 2 grandes categorías de
cáncer de pulmón, el de célula no pequeña que corresponde alrededor del 85%, se diagnostica
en etapas avanzadas y tiene un peor pronóstico y el de célula pequeña (15%). A su vez, el
cáncer de célula no pequeña se divide en los siguientes subtipos histológicos: carcinoma de
célula escamosa que predomina en un 40% de los casos, se presenta principalmente en la vía
aérea proximal y está asociado al consumo de cigarrillo o inflamación crónica. El otro subtipo
es el adenocarcinoma que prevalece en un 50%, principalmente en la vía aérea a nivel distal y
es más común en personas no fumadoras. Por último se describe el cáncer de pulmón de
célula grande que representa formas poco diferenciadas por lo que su definición no es muy
clara (13,14).
A nivel molecular, se han identificado varias alteraciones relacionadas con estos tipos de
cáncer de pulmón. Las mutaciones conductoras oncogénicas son responsables de la iniciación
y progresión tumoral y se encuentran en genes que codifican para proteínas que participan en
vías de señalización de supervivencia y proliferación celular (15). La mayoría de cánceres han
demostrado un fenómeno de adicción a oncogenes debido a su dependencia sobre ciertos
genes específicos para mantener el fenotipo maligno, entre los que destacan factores de
crecimiento, receptores de factores de crecimiento, proteínas G, serina - treonina kinasas,
proteínas tirosina kinasas citoplásmicas y factores de transcripción (16). Respecto al cáncer
de pulmón varios oncogenes han sido descritos, principalmente el receptor del factor de
crecimiento epidermal EGFR, el oncogén K-Ras y el supresor tumoral p53.
EGFR
La familia de receptores del factor de crecimiento epidermal comprende cuatro formas: EGFR
(ErbB1 o HER1), ErbB2 (HER2, ErbB2), ErbB3(HER3) y ErbB4 (HER4). Estos poseen actividad
tirosina kinasa para desencadenar la respuesta celular a través de varias vías de señalización.
Estudios han mostrado que el EGFR se encuentra sobrexpresado en un 43-89% y HER2 en un
30-40% de los pacientes con cáncer de pulmón lo que se asocia a mal pronóstico (17). Además
en cáncer de pulmón de célula no pequeña se ha encontrado sobrexpresión de sus ligandos, el
EGF, amfiregulina y TGF-α, los cuales generan loops autocrinos llevando a la hiperactividad
del receptor. Su potencial oncogénico viene dado por mutaciones que permiten una continua
15
activación de las vías de señalización acopladas a este receptor. Aproximadamente en un 10%
de los adenocarcinomas de pulmón se han encontrado mutaciones somáticas que activan en
su dominio tirosina – kinasa y se producen principalmente en no fumadores o mujeres. Una
corresponde a una deleción dentro del marco en el exón 19 que elimina el motivo conservado
LREA (ΔEGFR) y se presenta en un 45% de las mutaciones del EGFR en cáncer pulmonar de
célula no pequeña. Otra es una sustitución de base (T a G) en el exón 21 que sustituye arginina
por leucina en la posición 858 (L858R) y se presenta en un 40 -45%. Otra mutación
clínicamente relevante es la T790M en el exón 20 la cual se presenta en el 50% de los casos y
se asocia con resistencia al tratamiento con gefitinib y erlotinib (18). Estas mutaciones
desencadenan la hiperactivación del EGFR promoviendo señales antiapoptóticas y de
supervivencia a través de las vías Ras-Raf-MEK, ERK1 y ERK2 y la vía Jak-STATs (19).
KRas
Hace parte de un grupo de oncogenes en humanos (K-Ras, H-Ras y N-Ras) que participa en
procesos de señalización a través de la membrana celular. Estas proteínas funcionan corriente
abajo de la señalización por el EGFR. Normalmente, Ras se une al GTP y GDP de forma
reversible. En su estado activado cuando se une al GTP participa en vías de señalización
inducidas por mitógenos o estrés para la posterior transcripción de genes para el crecimiento
y proliferación celular. Las mutaciones más comunes en esta proteína hacen que pierda la
actividad intrínseca GTPasa necesaria para devolverla a su estado inactivo unido a GDP por lo
que queda en un estado constitutivamente activo que favorece el proceso tumorigénico. En
cáncer de pulmón se han encontrado mutaciones en K-Ras, principalmente en el de tipo de
célula no pequeña (15-20% de los casos). En adenocarcinomas, esta mutación se encuentra en
el 30% de los casos, mientras que en los carcinomas de célula escamosa es apenas del 5% y
están asociadas con mal pronóstico en los pacientes (20). Además el porcentaje de mutaciones
en K-Ras es mayor en personas fumadoras respecto a las no fumadoras (10-43% vs 0-8%) a
diferencia de las mutaciones en el EGFR que predominan en los no fumadores. La mayoría de
mutaciones en los fumadores corresponde a transversiones G –T en el codón 12. En ensayos in
vitro se demostró que era iniciada por el Benzo(a)pireno diolepóxido (19). Por otra parte,
debido a que KRas está corriente abajo de la señalización por EGFR, se ha observado menor
eficacia de la terapia anti-EGFR en pacientes con cáncer de célula no pequeña con KRas
mutado (15).
p53 es una proteína con actividad supresora tumoral que cuando está activada, estimula la
expresión de otras proteínas efectoras que participan en la detención del crecimiento,
promueven la reparación en el DNA y estimulan la apoptosis celular para mantener la
estabilidad genómica en diversos procesos de estrés genotóxico. Las mutaciones en p53
ocurren mayormente en los dominios de unión al DNA produciendo formas mutantes que no
poseen esta capacidad. Principalmente se da por transversiones G –T en varios codones del
gen que además corresponde a una marca molecular asociada al consumo de tabaco. En no
fumadores las mutaciones de p53 son diferentes y se dan por transversiones G-C o
transiciones G-A en los dinucleotidos CpG, aunque son menos frecuentes (19). En cáncer de
16
pulmón se ha encontrado que p53 está mutado en un 75% de los cánceres de célula pequeña y
alrededor del 50% de los de célula no pequeña (21).
2.3 Factores de transcripción en cáncer Los factores de transcripción son proteínas que inician y regulan la transcripción de genes.
Estos poseen dominios de unión al DNA que les dan la habilidad de unirse a secuencias
específicas (enhancers o promotores) y de esta forma regulan patrones de expresión de genes
que participan en diversos procesos celulares. En cáncer son importantes tres tipos de
factores de transcripción: 1) Receptores de esteroides en casos de cáncer de seno o próstata;
2) Proteínas nucleares activadas por vías de serina kinasas como la proteína c-Jun y 3)
Proteínas citoplásmicas latentes activadas por interacciones ligando-receptor a través de
tirosina o serina kinasas en la membrana celular que luego son transportadas al núcleo para
incrementar el proceso de transcripción (24).
Muchos factores de transcripción se han asociado en el proceso tumoral como oncogenes,
como el caso de c-Myc el cual se encuentra sobrexpresado por mecanismos como
amplificación génica, translocación cromosomal, mutaciones estabilizantes en cánceres como
leucemias, melanomas, carcinomas de próstata, seno, pulmón y colon. Además en modelos in
vitro, se encontró que su sobrexpresión lleva a transformación celular (25). Otro factor como
E2F también se ha catalogado como una oncoproteína. Aunque a nivel genético mutaciones o
amplificaciones génicas son raras, en modelos in vitro favorece que células quiescentes entren
en la fase S del ciclo celular mientras que en ratones su sobrexpresión induce la formación de
tumores de piel (26).
Por otra parte, como la mayoría de vías de señalización oncogénicas convergen en diferentes
sets de factores de transcripción, al estar persistentemente activas por mecanismos como los
descritos anteriormente, se puede generar una activación constitutiva o sobrexpresión de los
factores de transcripción favoreciendo las señales de crecimiento o proliferación incontrolada
de la célula tumoral. Por lo tanto, este tipo de proteínas representan un punto de intervención
importante para interferir y detener el proceso tumoral.
Para que un factor de transcripción pueda ser un blanco terapéutico potencial debe cumplir
con los siguientes requisitos: Debe estar sobreactivado en un gran porcentaje de células y
diferentes tipos de tumor. Sus genes blanco deben asociarse con patrones de expresión de
genes que permitan el fenotipo maligno como angiogénesis tumoral, evasión inmune o
alteración del metabolismo. También debe ser susceptible de inhibición por moléculas
pequeñas y las células tumorales deben depender más de la actividad del factor de
transcripción que las células normales (27). Estas características son propias de los factores
de transcripción de la familia STAT, especialmente STAT3 por lo que representa un blanco
molecular potencial para el desarrollo de terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer.
2.4 El factor de transcripción STAT3 La familia de transductores de señal y activadores de la transcripción (STAT) comprende 7
miembros identificados en mamíferos: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b y
STAT6. Estas proteínas tienen una longitud entre 750 y 850 residuos de aminoácidos y
17
comparten entre 20 -50% de identidad de secuencia (28). Estructuralmente contienen un
dominio N-terminal que favorece la cooperatividad de unión al DNA, un dominio con motivo
tipo “coiled coil” que permite interacciones proteína - proteína, un dominio de unión al DNA,
un dominio entre los residuo 600-700 con homología-Src tipo 2 (SH2) que permite la
dimerización por un reconocimiento fosfo-tirosina. El residuo tirosina se localiza alrededor
del residuo 700. Por último posee el dominio C-terminal importante en la activación a nivel
transcripcional el cual se regula por fosforilación de un residuo serina (29).
Las vías de señalización asociadas a los STATs inician a través de la activación de varios tipos
de receptores de membrana. Una es la vía JAK/STAT la cual es activada en respuesta a
diferentes ligandos como citoquinas e interferones. Para el caso de STAT3 se han descrito
como activadores de la vía a IL-6, IL-10, IL-23, IL-21, IL-11, LIF y OSM (Oncostatina M) (30).
Debido a que los receptores de citoquinas no tienen actividad tirosina kinasa intrínseca,
requieren su asociación con miembros de la familia Janus kinasas (JAK) o kinasas de la familia
SRC. Se han identificado 4 miembros de la familia JAK (JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2). Estas
proteínas contienen siete dominios de homología JAK (JH) en los que se incluye un dominio
kinasa conservado y un dominio catalíticamente inactivo en el extremo C-terminal, el cual
regula la actividad del dominio kinasa. Las proteínas JAK fosforilan residuos de tirosina en la
cola citoplasmática de los receptores, generando los sitios de acople para proteínas a través
de los dominios SH2 (31). Este factor de transcripción también puede ser activado en
respuesta a factores de crecimiento por medio de receptores con actividad intrínseca tirosina
- kinasa, como el EGFR y PDGFR. La activación puede ser directa (como en el caso de STAT1) o
indirecta mediante el reclutamiento de complejos de proteínas al receptor entre las que se
encuentra la proteína Src (32).
Una vez se han fosforilado los dominios citoplasmáticos de los receptores sobre residuos de
tirosina, se generan los sitios de unión para los dominios SH2 de las proteínas STAT, las cuales
permanecen latentes en el citoplasma y son reclutadas para posteriormente ser fosforiladas
en un residuo específico de tirosina. Para el caso de STAT3 la fosforilación se da sobre el
residuo Y705. Luego de este proceso, la proteína STAT fosforilada interactúa entre sí a través
de sus dominios SH2 y así poder formar homodímeros o heterodímeros. Este último proceso
va a ser dependiente del tipo celular, estado de activación o diferenciación, el tipo de receptor
expresado o el tiempo y la dosis de citoquinas ya que son específicos para cada miembro de la
familia STAT. Por ejemplo, La formación del heterodímero STAT3:STAT5 puede darse cuando
hay estimulación por IL-2, IL-7, MCSF y GCSF. Por otra parte, en respuesta a la activación de
IL-6 se puede favorecer la formación de heterodímeros STAT3:STAT1, especialmente en la
señalización tardía. Hasta el momento no es clara la función celular de estos heterodímeros,
pero se cree que podrían unirse a secuencias consenso diferentes y mediar la transcripción de
otros genes (33). Una vez se han formado los dímeros de STAT3, estos deben pasar al núcleo
para ejercer su función transcripcional. Este proceso es mediado por proteínas
transportadoras de la familia de kariopherina beta. La señal de localización nuclear de STAT3
ubicada dentro del dominio “coiled coil” es reconocida principalmente por las proteínas
adaptadoras importina-α3 y la importina-α6 (a diferencia de la proteína STAT1 la cual es
18
reconocida por la importina-α5) que posteriormente interaccionan con la importina- β la cual
media el paso a través de los poros nucleares (29,34).
El dímero STAT3 a través de su dominio de unión al DNA puede unirse a dos secuencias
consenso conocidas, ya sea en sitios tipo enhancer o los promotores de sus genes blanco para
favorecer su transcripción. Estas son la secuencia GAS (secuencia activada por interferón
gamma) o la secuencia HSIE que contienen los motivos de unión TTCN2-4GAA o TTN4-6GAA
(35), donde se tiene que N=4 para STAT6 y N=3 para los demás STATs. Para esta familia de
factores de transcripción la especificidad de unión dependerá tanto del número de
nucleótidos espaciadores como de variaciones en esta secuencia. Además, la porción variable
de la secuencia consenso también permite explicar la expresión de sets de genes diferentes en
respuesta a diferentes citoquinas o estímulos activadores de la vía de señalización (36,37). La
sobrexpresión de este factor de transcripción en cáncer favorece el aumento en la expresión
de diversos genes que participan en procesos de crecimiento y proliferación celular (Ciclina
D1, c-Myc, ), evasión de apoptosis (Bcl2, Bcl-xL, Mcl1, survivina), migración y metástasis
(MMP-2, MMP-9, Podoplanina PDPN) (38). Adicionalmente STAT3 favorece la transcripción
de genes como VEGF, IL-6, IL-10, TGF-β los cuales también son activadores propios de la vía
JAK/STAT estableciendo loops autocrinos en el microambiente tumoral y efectos de
inmunosupresión (39). También se ha demostrado que STAT3 puede unirse al promotor de
p53 disminuyendo su expresión en modelos in vitro e in vivo (40). Por otra parte STAT3 puede
interaccionar con otros factores de transcripción como NF-kB mediando la expresión de
factores pro-inflamatorios (30) o con HIF-1α al favorecer la estabilidad de la proteína por
disminución de la ubiquitinación mediada por pVHL (41).
La terminación de la señalización a través de los STATs se presenta por medio de diferentes
proteínas. Miembros de la familia PIAS (proteína inhibidora de STATs activados) pueden
interactuar con los STATs (PIAS1 y PIASY con STAT1; PIAS3 con STAT3) inhibiendo la unión
de los dímeros con el DNA y promoviendo su sumoilación. Este proceso también es regulado
por diferentes fosfatasas como PTP-1B, PP2A o SHP-1 que defosforilan e inactivan a los
STATs. Estas pueden estar tanto a nivel membranal (PTPRT y PTPRD), citosólico (PTPN2 o
PTPN11) o nuclear (TC-PTP). Por otra parte la familia de proteínas SOCS principalmente
SOCS1 y SOCS3 inhiben la activación de STAT3 interfiriendo con las proteínas JAKs al inicio de
la señalización (42). Sin embargo, varias de estas proteínas inhibidoras se encuentran
alteradas precisamente para favorecer el proceso oncogénico. En cáncer de pulmón se ha
encontrado a SOCS3 regulado a la baja por hipermetilación en el promotor. También, la
metilación frecuente del promotor de PTPN6 se correlaciona con disminución en su expresión
y aumento de la expresión de pSTAT3 en modelos de linfoma (38).
2.5 STAT3 en el cáncer de pulmón Se ha establecido la activación constitutiva o sobrexpresión de STAT3 tanto en líneas celulares
de cáncer humano como en tumores primarios de cáncer gástrico (43), cervical (44,45),
hepático (46), de seno (47), próstata (48) leucemias, linfomas y mieloma múltiple (49).
También se ha descrito esto en líneas celulares de cáncer de pulmón de célula no pequeña
(50–52), en pacientes con NSCLC (53) y en pacientes con adenocarcinomas de pulmón o
19
carcinomas de célula escamosa (54). La activación persistente de STAT3 se asocia con
mecanismos moleculares que alteran el control de las vías de señalización que convergen
sobre éste como se mencionó anteriormente. Se ha encontrado que en cultivos celulares la
señalización por EGFR aumenta la actividad de STAT3 y promueve la supervivencia en
tumores de pacientes con NSCLC. Sin embargo, en este modelo el EGFR funciona más como un
sitio de anclaje para STAT3 el cual es activado por medio de otras proteínas tirosina kinasa
como Src o Janus Kinasas que cooperan con el receptor. Adicionalmente la activación de
STAT3 se asoció con mayor resistencia a la quimioterapia (55). Otros estudios demuestran
que STAT3 también puede ser activado por varias formas mutantes del EGFR específicamente
la L858R, la deleción E746_A750 y la inserción del exón 20, las cuales contribuyen en los
efectos oncogénicos en líneas celulares de cáncer de pulmón. Además en fibroblastos, STAT3
es constitutivamente fosforilado sobre el residuo Tyr705 lo cual fue dependiente de la
presencia del EGFR mutante y actividad Src kinasa pero de forma independiente de Jak2. En
este modelo también se obtuvo fosforilación sobre el residuo Ser727 la cual requirió de la
actividad del EGFR y la kinasa MEK (56). Sin embargo, la activación de STAT3 por el EGFR
mutante también puede darse de forma indirecta, ya que en algunos casos es necesaria la
sobrerregulación de la IL-6 para activar la vía gp130/JAK (57). Por lo tanto STAT3 es
mediador clave de los efectos oncogénicos de mutaciones somáticas del EGFR y ofrece un
blanco potencial para tumores de pulmón con este tipo de mutaciones.
Otro modo de activación sostenida de STAT3 puede darse de forma independiente de
mutaciones en oncogenes a través de proteínas como JAK1 o JAK2. En varias líneas celulares
de NSCLC se demostró que STAT3 está constitutivamente activado independiente de
mutaciones activantes sobre KRAS o proteínas kinasas. La activación de STAT3 se daba por
fosforilación sobre el residuo Y705 mediada exclusivamente por la proteína JAK2 y no por
medio de otras vías de señalización (58). En un modelo con células de NSCLC con mutantes de
KRAS se obtuvo una regulación al alta de los niveles de fosfo-STAT3 por el knockdown de
KRAS el cual adicionalmente indujo aumento en la fosforilación del EGFR (59). En otro estudio
en líneas celulares se demostró que la inhibición de la actividad del EGFR no tuvo efecto sobre
la activación de STAT3. Sin embargo, la inhibición de JAK1 con RNAs interferentes si logró
disminuir la fosforilación de STAT3 e inhibir el crecimiento celular por lo que se considera
JAK1 como otro causante de la activación de STAT3 en cáncer de pulmón (51). Estos
resultados muestran la adaptabilidad de las células de cáncer de pulmón para que en ausencia
de alguno de estos factores oncogénicos, encuentren vías de señalización o proteínas
alternativas que permitan mantener la activación del factor de transcripción STAT3 y
continuar con la señalización oncogénica para favorecer la progresión tumoral.
Esta variabilidad en alteraciones genéticas o epigenéticas tanto en activadores como
desactivadores de la señalización que convergen sobre STAT3 hace que sea complejo el
desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y su aplicación sobre diferentes tipos de cáncer de
pulmón, por lo que intervenir directamente sobre el factor de transcripción STAT3 puede ser
una estrategia más efectiva. De esta forma, el bloqueo directo sobre STAT3 podría conducir a
reducir la proliferación y crecimiento celular y promover un mecanismo de muerte celular
que puede ofrecer efectos positivos para su empleo como terapia anticancerígena.
20
2.6 Terapias moleculares anti-STAT3 Varias moléculas y fármacos se han desarrollado para inhibir de forma directa o indirecta a
STAT3 en los últimos años. Su mecanismo de acción involucra el bloqueo de proteínas o
receptores que participan en las vías de señalización asociadas, o los procesos de
dimerización de este factor de transcripción. Ya se han aprobado inhibidores indirectos
enfocados en el bloqueo de tirosina-kinasas intracelulares o anticuerpos monoclonales que
compiten con factores de crecimiento para unirse en la superficie de los receptores. Un
ejemplo son el gefitinib y el erlotinib los cuales son inhibidores del EGFR en pacientes con
NSCLC avanzado y cáncer de páncreas. Se ha demostrado que estas moléculas pueden
disminuir la expresión de STAT3 de forma moderada. Por otra parte, el sorafenib ha mostrado
beneficios en cuanto a supervivencia, en pacientes con carcinoma hepatocelular en ensayos
clínicos de fase III. Este efecto se debe a la inhibición de varias proteínas de vías de
supervivencia como STAT3, ERK y la vía PI3K-AKT. Este fármaco también fue efectivo en
modelos celulares de glioblastoma asociado con la disminución de la señalización de STAT3 y
regulación a la baja de algunos de sus genes blanco (60). Dentro de los anticuerpos
monoclonales se encuentra el cetuximab el cuál inhibe la señalización a través del EGFR. Este
ha demostrado inhibir la fosforilación de STAT3 en células de cáncer gástrico y de pulmón
(61).
Otras moléculas incluyen a inhibidores de las JAK kinasas como AG490, WP1066 o TG101209
que permiten modular la activación de STAT3. También se han descrito productos naturales
como algunos derivados de la curcumina que inducen detención del ciclo celular e inhiben la
invasión en modelos de cáncer de pulmón por interferencia con la vía JAK/STAT a
concentraciones 15μM. Otros análogos con estabilidad y potencia mejorada como FLLL32 o
LLL12 han mostrado la supresión de STAT3 total y fosforilado asociado con disminución de la
viabilidad celular e inducción de apoptosis en líneas celulares de osteosarcoma y cáncer de
seno. Estas moléculas actúan por el bloqueo del reclutamiento de STAT3 hacia el receptor o
inhibiendo su dimerización. También se ha evaluado a JSI-124, una molécula de tipo
cucurbitacina que inhibe la activación de STAT3 en concentraciones de 10μM en líneas
celulares de cáncer de pulmón y de seno. En modelos in vivo también ha demostrado la
disminución en el crecimiento del tumor. Compuestos polifenólicos como el resveratrol
también han mostrado la inhibición de la señalización de STAT3 y respuesta antitumoral en
modelos in vitro de leucemia o mieloma múltiple (62). Un fármaco ya aprobado es el
ruxolitinib el cual es un inhibidor de JAK1y JAK2 que demostró el bloqueo de la activación de
STAT3 y STAT5 en líneas celulares de eritroleuciemia. En modelos de NSCLC también inhibió
activación de STAT3 y el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjertos in vivo (58). Sin
embargo, muchos de estos inhibidores indirectos pueden no dar el efecto esperado sobre la
inactivación de STAT3 debido a otros modos de activación dependientes de otras vías de
señalización o a que no se bloquean todas las kinasas que pueden regular este factor de
transcripción por lo que el desarrollo actual se enfoca en terapias más específicas.
Se han descrito varios inhibidores directos de STAT3 que actúan principalmente en el proceso
de dimerización. Estos inhibidores se basan en el bloqueo de los dominios SH2, necesarios
para el reclutamiento de STAT3 a los receptores y posterior fosforilación para su activación.
21
Principalmente se han usado estrategias con peptidomiméticos para este fin donde péptidos
como PY*LKTK (Y*=pTyr) han demostrado su unión con monómeros de STAT3 evitando su
dimerización y activación. Otro péptido denominado SP1, derivado a partir del dominio SH2
también inhibió la interacción entre los monómeros lo cual se asoció con disminución de la
viabilidad celular e inducción de apoptosis en modelos in vitro de cáncer pancreático, de seno,
próstata o NSCLC (63). Análogos no peptídicos como S3I-1757 pueden inhibir al STAT3
sobrexpresado y disminuir la transformación maligna por unión directa sobre el residuo Y705
en el dominio SH2 en modelos de cáncer de seno y pulmón (64). Sin embargo debido a su
naturaleza, estas moléculas tienen poca estabilidad y baja permeabilidad celular por lo que no
han logrado un paso hacia estudios clínicos. Otras moléculas pequeñas que también
interfieren con el proceso de dimerización como STA-21, S3I-201, Cpd30 o Stattic han
mostrado el bloqueo con la señalización de STAT3 y disminución del crecimiento celular en
diferentes modelos de cáncer (60).
Otra estrategia para la inhibición directa de STAT3 después de ser activado es el bloqueo de
su unión al DNA para interferir con su actividad transcripcional. Compuestos de platino (IV)
como IS3-295, CPA-1, CPA-7 han mostrado este efecto junto con el aumento en la apoptosis en
diferentes líneas celulares de cáncer humano aunque el mecanismo exacto no se ha elucidado
completamente (65).
Por otra parte se han desarrollado terapias moleculares basadas en la tecnología de
oligonucleótidos dirigidas hacia el bloqueo o inhibición de la expresión de genes blanco de
STAT3 entre las que se encuentran RNAs antisentido, o RNAs interferentes (siRNA) con efecto
en el aumento de apoptosis y disminución del crecimiento tumoral en modelos de cáncer
hepático y de próstata (66,67).
Recientemente se ha empleado la tecnología de oligonucleótidos tipo señuelo como modelo de
terapia molecular para la regulación de genes tanto in vivo como in vitro. Las ventajas
principales de esta estrategia sobre las otras mencionadas es que se espera que actúen con
alta selectividad y por tanto especificidad de los efectos.
2.7 Terapia molecular alternativa e innovadora en cáncer basada en deoxi-
oligonucleótidos (ODN) de doble cadena
Los deoxi-oligonucleotidos señuelo (Decoy ODNs) corresponden a un ODN sintético corto de
doble cadena que contiene un elemento cis con alta afinidad por un factor de transcripción
blanco, pero con baja afinidad por otros factores de transcripción, el cual puede unirse al
factor de transcripción luego de ser introducido en la célula blanco y así bloquear la
interacción cis-trans con los elementos regulatorios del DNA y modular la expresión de genes
(68) ya sea la inhibición de genes que son transactivados por el factor de transcripción o
regular a la alta genes que son suprimidos por la unión del factor (69).
Para ejercer su efecto, estos ODNs deben permanecer como una doble cadena dentro de la
célula, ser específicos contra su blanco molecular, ser captados fácilmente por la célula y ser
22
estables a la acción de enzimas intra y extracelulares como endo y exonucleasas. La
degradación ocurre principalmente sobre los extremos libres de la doble cadena por lo que se
requieren modificaciones químicas en estos sitios para mejorar su bioestabilidad mientras
son entregados en su sitio de acción (70). Estas modificaciones incluyen el cambio de enlaces
fosfodiester por fosforotioato los cuales logran un aumento en la estabilidad frente a
nucleasas. En algunos casos este tipo de oligonucleótidos actúan como inhibidores
competitivos de nucleasas. Además permite la captación y distribución del oligonucleótido
dentro de la célula aunque esto también depende del tipo celular, las condiciones de cultivo, la
secuencia y la longitud, por lo que son aspectos a evaluar en el diseño de este tipo de
moléculas. Sin embargo esta modificación puede generar uniones inespecíficas con otras
proteínas dando efectos independientes de la secuencia sobre aspectos como el crecimiento
celular, la morfología o actividades de enzimas (71). Otra modificación descrita son los
análogos de nucleótidos con enlaces metileno entre el oxígeno 2´ y el carbono 4´ del anillo
ribosa (Locked nucleic acids) la cual también mejora la vida media del ODN en suero
necesaria para su uso in vivo. Además también muestran baja toxicidad en animales dando
otra ventaja sobre los ODNs con enlaces fosforotioato (72).
Por otra parte se han diseñado oligonucleótidos sin modificaciones químicas (que puedan
afectar la afinidad de unión por su blanco molecular), pero que contienen una estructura tipo
circular, la cual se hace conectando los extremos 5’ y 3’ por medio de diferentes tipos de loops
o horquillas de nucleótidos. En este caso, se ha demostrado que la estabilidad frente a
nucleasas depende del número y tipo de nucleótidos que componen el loop. Las ventajas de
esta estructura son mayor resistencia a la degradación por exonucleasas y mayor
especificidad de la secuencia entre 5 a 10 veces más respecto a los ODNs con enlaces
fosforotioato, junto a una menor toxicidad y mayor captación celular en modelos in vitro e in
vivo (73).
La estrategia de señuelos ODN se ha usado en la inhibición de diferentes factores de
transcripción como NF-kβ, HIF-1α o E2F demostrando efectividad contra el crecimiento
tumoral en diferentes modelos como fibrosis hepática, colitis, osteosarcoma, cáncer cervical,
cáncer hepático, de pulmón tanto en modelos in vitro e in vivo (74–77). Por otra parte se han
diseñado y evaluado diferentes señuelos ODN dirigidos contra STAT3. En líneas celulares de
carcinoma hepatocelular un señuelo ODN con enlaces fosforotioato con concentraciones entre
25 y 50nm logró el aumento de la apoptosis y detención del ciclo celular por regulación a la
baja de genes como Bcl-xL, Ciclina D1 y c-myc (78). Otro estudio con líneas celulares de
carcinoma de colon mostró que un señuelo ODN tipo hairpin a concentración 400nm logró la
inducción de la muerte celular por el bloqueo específico de STAT3 y sin tener efecto en otros
miembros de la familia STAT con secuencias consenso similares como STAT1 (79).
También se han empleado señuelos contra STAT3 en cáncer de cuello y cabeza (SCCHN) que
lograron la disminución de la proliferación y regulación de genes blanco de forma selectiva, ya
que no tuvieron efecto sobre keratinocitos normales. Sin embargo, en este estudio el señuelo
ODN no tenía ninguna modificación química por lo que era necesaria una concentración de
25μM para obtener un efecto significativo en la diminución de la proliferación celular (80). En
23
el modelo in vivo en ratones con xenoinjertos de células de SCCHN, el señuelo ODN con
modificaciones fosforotioato logró inhibición del crecimiento tumoral, aumento de la
apoptosis y disminución en la expresión de genes blanco. El efecto se potenciaba con la
administración con cisplatino (81).
En cáncer de pulmón sólo se encontró un estudio en el que se evaluó un señuelo con
modificaciones fosforotioato en los extremos 5’ y 3’ para bloquear a STAT3 tanto in vitro como
in vivo. Sin embargo, los efectos sobre el aumento de la apoptosis y la regulación a la baja de
genes blanco de STAT3 no fueron tan significativos y en algunos genes no se obtuvo efecto. En
cuanto al crecimiento tumoral in vivo se muestra una disminución en la tasa de crecimiento
tumoral con el tratamiento, pero no se logró erradicar completamente el tumor (82).
En 2012 se reportó el primer ensayo clínico de fase 0 (ClinicalTrials.gov Identifier:
NCT00696176) empleando la terapia molecular con señuelos ODN en los Estados Unidos. Se
evaluó el efecto de la administración intratumoral de un señuelo contra STAT3 (con
modificaciones fosforotioato) sobre la expresión de sus genes blanco en pacientes con
tumores de cabeza y cuello. Como resultados de este ensayo el señuelo ODN mostró la
regulación a la baja de los genes Bcl-xL y Ciclina D1 respecto a los tumores de pacientes
tratados con solución salina. Además se demostró que el tratamiento no presentó efectos
tóxicos y los pacientes toleraron las dosis administradas. Posteriormente se realizaron
ensayos in vivo con xenoinjertos en ratones para mejorar la estabilidad del señuelo
modificando sus extremos por medio de circularización parcial o completa con loops de
diferentes longitudes (6). Posteriormente se demostró que este mismo señuelo contribuía a
ejercer sus efectos antitumorales por medio de la inhibición de la angiogénesis (83).
Como antecedente en el grupo de investigación, se realizó el primer diseño como parte de una
tesis de maestría en genética humana en la que se evaluó un señuelo ODN dirigido contra el
factor de transcripción HIF-1α al cual se le introdujeron modificaciones químicas para
mejorar su estabilidad. Dicho señuelo demostró actividad antitumoral frente a líneas celulares
de cáncer de seno y próstata y actualmente se encuentra en proceso para obtención de
patente. Por lo tanto es de gran interés en el grupo la evaluación de este tipo de moléculas y su
efectividad sobre otros blancos moleculares importantes en diferentes tipos de cáncer como
una alternativa de terapia molecular anticáncer.
2.8 Pregunta de investigación Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente y dado que diferentes vías de señalización
asociadas a oncogenes que favorecen la progresión tumoral convergen sobre STAT3, con este
trabajo se quiere responder la pregunta: ¿Señuelos ODNs con o sin modificaciones, dirigidos
contra STAT3 tendrán efecto sobre procesos de supervivencia celular, apoptosis y expresión
de genes blanco en líneas celulares de cáncer de pulmón?
24
3. Capítulo 3. Objetivos
3.1 Objetivo general Evaluar el potencial antitumoral de un oligonucleótido señuelo de doble cadena dirigido contra el factor de transcripción STAT3 como modelo de terapia molecular in vitro en líneas celulares de cáncer de pulmón.
3.2 Objetivos específicos
1. Evaluar la expresión del factor de transcripción STAT3 y la fosforilación en Tyr705 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5.
2. Caracterizar la captación celular del señuelo ODN dirigido contra STAT3 en las líneas celulares A549, H-292 y MRC-5.
3. Evaluar la citotoxicidad de los señuelos ODNs dirigidos contra STAT3 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5.
4. Establecer el efecto del señuelo ODN dirigido contra STAT3 sobre el proceso de apoptosis en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5.
5. Evaluar el efecto del señuelo ODN sobre la actividad a nivel transcripcional de STAT3 sobre la expresión de los genes BCL-XL, Ciclina D y VEGF en las líneas celulares A549,H292 y MRC-5.
25
4. Capítulo 4 - Metodología
4.1 Cultivos celulares Para este trabajo se utilizó como modelo de estudio las líneas celulares tumorales adherentes
A549 (ATCC: CCL-185; Carcinoma de pulmón) y H-292 (ATCC: CRL-1848; carcinoma
pulmonar mucoepidermoide). Estas se escogieron a partir de líneas disponibles en el
laboratorio de farmacogenética del cáncer perteneciente al Departamento de Farmacia
(Facultad de Ciencias) de la Universidad Nacional de Colombia. Se tuvo en cuenta, a modo de
criterio de exclusión según información relevante en artículos previos, cuáles líneas presentan
sobrexpresión o activación constitutiva de la proteína STAT3. También se tuvo en cuenta el
empleo de una línea celular no tumoral de Fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 (ATCC®
CCL171™).
Las líneas fueron mantenidas en los medios de cultivo recomendados por la ATCC:
DMEM(Gibco®) para A549, RPMI 1640(Gibco®) para H292 y MEM(Gibco®), suplementado
son suero fetal bovino (Gibco®) al 10%, Penicilina-estreptomicina (100u/mL) y Piruvato de
Sodio 1mM (sólo para la línea MRC-5) en frascos de cultivo celular de 25 y 75 cm2. Las
condiciones de cultivo fueron 37°C con 5 % de CO2 y 100% de humedad relativa.
Para el mantenimiento de los cultivos se realizó un cambio de medio cada 2 a 3 días. Cuando
se obtuvo una confluencia celular máxima de 70-80%, se desprendieron las células con ayuda
de una solución de tripsina-EDTA (0.025%-0.03% respectivamente) v/v durante 5 minutos en
incubadora a 37°C. Las suspensiones celulares obtenidas se emplearon para los ensayos
posteriores.
4.2 Diseño de Oligonucleótidos Los oligonucleótidos señuelo dúplex empleados fueron adquiridos a través de IDT (integrated
DNA technologies) y se diseñaron teniendo en cuenta la secuencia consenso para el factor de
transcripción STAT3 reportada en literatura (35). Se diseñó un señuelo parental, un señuelo
con los extremos 3’ y 5’ modificados con metilaciones, las cuales se usaron en señuelos
diseñados previamente en el grupo. Así mismo, se elaboró un señuelo control que
corresponde una secuencia generada al azar a partir de la secuencia blanco. También se
elaboraron señuelos marcados con 6-FAM (fluoresceína) para facilitar la caracterización de la
captación celular de éstos.
SEÑUELO SECUENCIA
ODN Parental 5´- TAT CAT TTC CCG TAA ATC TAT –3´ 3´- ATA GTA AAG GGC ATT TAG ATA-5´
ODN modificado 5´-m UmAmU CAT TTC CCG TAA ATC mUmAmU - 3´
3´-mAmUmA GTA AAG GGC ATT TAG mAmUmA-5´
ODN control 5´-ATA TTA CGT TAC TCT ATA CCT-3´
3´-TAT AAT GCA ATG AGA TAT GGA-5´
ODN marcado 5´-ATA TTA CGT TAC TCT ATA CCT-3´
3´-TAT AAT GCA ATG AGA TAT GGA-6-FAM-5´ Tabla No 1. Secuencias de los oligonucleótidos diseñados dirigidos contra STAT3
26
4.3 -Ensayos de expresión STAT3 y Y705-STAT3 Para corroborar que las líneas celulares expresaran STAT3, se realizó la evaluación por medio
de microscopía de fluorescencia. Las células fueron sembradas en placas de 12 pozos que
contenían cubreobjetos de 14mm de diámetro y se incubaron por 24 horas. Posteriormente
fueron fijadas con paraformaldehido al 4% en PBS por 20 minutos y permeabilizadas con
tritón x-100 al 0.2% en PBS por 10 minutos. Luego se agregó una solución para reducir
autofluorescencia (50mM NH4Cl, 100mM glicina en PBS) por 30 minutos y se adicionó
solución de bloqueo (BSA al 1% en PBS) por 30min a 37°C.
Las láminas fueron incubadas con anticuerpos monoclonales anti-STAT3 (abcam ref:
ab68153, 1:400 en PBS) o anti-STAT3 (phospho Y705) (abcam ab202873, 1:300 en PBS)
durante toda la noche a 4°C. Posteriormente realizar 3 lavados con PBS para retirar el exceso
de anticuerpo y se adicionó el anticuerpo secundario goat-anti rabbit IgG H&L (Alexa Fluor®
488 ab150077) 1:800 en PBS y se incubó a 37°C por una hora. Finalmente las láminas fueron
lavadas 3 veces con PBS y se realizó tinción de núcleos con DAPI. Las láminas se colocaron
sobre cubreobjetos con medio de montaje (glicerol al 70% en PBS), se visualizaron en
microscopio de epifluorescencia Nikon eclipse 50i con el objetivo de 40X y fueron analizadas
con el software de imágenes Imagej.
4.4 Transfección de Oligonucleótidos Los oligonucleótidos en los diferentes tratamientos fueron transfectados usando
lipofectamina®2000 (Thermo Scientific™) de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante.
Brevemente, se preparó una solución conteniendo 1μL de lipofectamina por cada 50μ de
medio libre de suero (Opti-MEM® Gibco) y se permitió la mezcla por 10 minutos a
temperatura ambiente. Luego se prepararon las soluciones de oligonucleótidos en medio de
cultivo libre de suero y sobre estos se adicionó la solución de lipofectamina en proporción
1:1, se mezcló y se dejó por 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de
los complejos DNA-lipofectamina. Finalmente los complejos se adicionaban gota a gota sobre
los pozos de las placas de cultivo que contenían las células a tratar y se incubaba a 37°C por el
tiempo descrito para cada ensayo.
4.5 Caracterización del proceso de transfección de ODNs Para evaluar la eficiencia de transfección las células fueron sembradas en placas de 12 pozos a
una densidad celular previamente establecida (A549: 17000 cel/cm2, H292: 20000 cel/cm2 y
MRC-5: 22000 cel/cm2). Para alcanzar una confluencia entre el 70 – 80% el día de la
transfección. Las células fueron transfectadas por 24 horas con el oligonucleótido marcado
con fluoresceína a las mismas concentraciones usadas en el ensayo de citotoxicidad (100nM,
50nM, 25nM, 12.5nM y 6,25nM). También se incluyeron células sin transfectar como blanco.
Luego de esto las células fueron lavadas 3 veces con PBS para retirar el oligonucleótido que no
fue captado y se procedió de la siguiente manera:
27
4.5.1 Inmunofluorescencia
Se fijaron las células con paraformaldehido al 4% en PBS por 20 minutos y se agregó una
solución para reducir autofluorescencia (50mM NH4Cl, 100mM glicina en PBS) por 30
minutos. Luego se marcaron los núcleos con DAPI y se tomaron imágenes de las láminas
correspondientes a cada concentración por microscopía de fluorescencia.
4.5.2 Citometría de flujo
Las células fueron desprendidas con solución de tripsina-EDTA (0.025%-0.03%) por 5
minutos y se centrifugaron por 5 minutos a 1800rpm. Se realizó un lavado con PBS para
retirar el remanente de tripsina, se centrifugó nuevamente y se resuspendió el pellet en
200μL de PBS y se analizó en clitómetro de flujo FACSAria II (BD Biosciences).
4.6 Ensayo de citotoxicidad
4.6.1 Determinación de CL 50s
Las células fueron sembradas en placas de 96 pozos (A549: 17000 cel/cm2, H292: 20000
cel/cm2 y MRC-5: 22000 cel/cm2) y se incubaron 24 horas para permitir su adherencia.
Luego, para valorar el efecto citotóxico de los oligonucleótidos, se prepararon cinco diluciones
obteniendo las siguientes concentraciones finales: 100, 50, 25, 12.5 y 6.25nM. Cada pozo fue
tratado con 100 μL de cada una de las diluciones, dejando un grupo de pozos no tratado como
control de crecimiento, un grupo de pozos sin células como blanco de tratamiento. Como
control positivo se utilizó el fármaco antitumoral Doxorrubicina en dosis entre (0.0005 -
50μM). Después del tratamiento de 24 horas se retiró el medio de cultivo, se realizó un lavado
con PBS y se adicionaron 100μl de medio de cultivo sin suplementar con Rezasurina (4.4μM).
Posteriormente, se incubaron las placas por 4 horas a 37°C, y la fluorescencia fue medida en
un lector TECAN a una longitud de onda de emisión de 595nm. Con los datos de fluorescencia
obtenidos se calculó el porcentaje de viabilidad celular de acuerdo a la siguiente fórmula:
%𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =𝐿𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 − 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
𝐿𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 − 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑥100
A partir de los datos obtenidos se realizaron gráficas del % viabilidad vs concentración de
oligonucleótido y a partir de estas se realizó una regresión no lineal por medio del software
Graphpad Prism5 grafica con el fin de obtener las CL50 estimadas para cada ODN. De la misma
gráfica se interpolaron las CL30 y CL70 respectivas para el ensayo siguiente.
4.6.2 Cinética de crecimiento
Con el fin de determinar si los oligonucleótidos evaluados tenían un efecto citotóxico
sostenido en el tiempo, las células fueron sembradas en placas de 96 pozos (A549: 17000
cel/cm2, H292: 20000 cel/cm2 y MRC-5: 22000 cel/cm2) y se incubaron 24 horas para
permitir su adherencia. Luego, se prepararon 3 diluciones que correspondían a la CL30, CL50
e CL70 determinadas en el ensayo anterior, correspondientes a cada oligonucleótido y línea
celular. Cada pozo fue tratado con 100 μL de cada una de las diluciones, dejando un grupo de
pozos no tratado como control de crecimiento, un grupo de pozos sin células como blanco de
28
tratamiento. Como control positivo se utilizó el fármaco antitumoral Doxorrubicina en
concentración 25μM. Se realizaron lecturas con el método de resazurina a las 24, 48, 72 y 96
horas y se calculó el % de viabilidad como se mencionó anteriormente.
4.7 Ensayos de apoptosis Para aproximarnos al mecanismo de muerte celular inducido por el tratamiento con los ODNs,
se realizaron dos ensayos de apoptosis por medio de kits comerciales para determinar
fragmentación del DNA y actividad de caspasa 3.
4.7.1 Ensayo de TUNEL
Las líneas celulares fueron sembradas en láminas de 4 pozos (Millicell® EZ SLIDES, Millipore)
a las mismas densidades celulares empleadas en los ensayos anteriores. Luego de 24 horas,
las láminas fueron tratadas con ODN parental o modificado a una concentración
correspondiente a la CL50 y se incubaron por 24 horas a 37°C. Posteriormente se evaluó la
fragmentación nuclear por medio del kit “Click-iT® Plus TUNEL Assay for In Situ Apoptosis
Detection, Alexa Fluor® 488 dye” (C10617 Life technologies) siguiendo el protocolo del
fabricante. Finalmente las láminas se lavaron con PBS, se realizó tinción con DAPI y fueron
observadas por microscopía de fluorescencia. Como control positivo de fragmentación
nuclear se utilizó DNAsa I (ref: 18068015 Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones sugeridas
en el kit.
4.7.2 Determinación de actividad de caspasa 3
Las líneas celulares fueron sembradas en placas de 12 pozos a las mismas densidades
celulares empleadas en los ensayos anteriores. Luego de 24 horas, las láminas fueron tratadas
con los oligonucleótidos a una concentración correspondiente a la CL50 y se incubaron por 24
horas a 37°C. Posteriormente se evaluó la actividad de caspasa 3 por medio del kit
colorimétrico “ApoTarget Caspase-3 Protease Assay” (ref: KHZ0022 Life technologies) de
acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados se expresan como el incremento de la
actividad de caspasa de las células tratadas relativo a las células sin tratamiento.
4.8 Ensayos de expresión diferencial de genes blanco de STAT3 Con el fin de evaluar cambios en los niveles de expresión de genes transactivados por STAT3,
producidos por el tratamiento con los ODNs, se realizó un ensayo de qRT-PCR en tiempo real.
Para esto las líneas celulares (A549, H292 y MRC-5) se sembraron en placas de 6 pozos
manteniendo las densidades celulares empleadas en los ensayos anteriores y fueron tratadas
con los ODNs parental, modificado y control a las CL50 respectivas por un período de 24
horas. Como condición control se incluyó un pozo con células sin tratamiento. Posteriormente
se realizó la extracción de RNA como se detalla a continuación.
4.8.1 Extracción de RNA
Se realizó por el método de TRIzol® (Invitrogen 15596-018) de acuerdo a las instrucciones
del fabricante. Brevemente, luego de las 24 horas de tratamiento, estos fueron retirados de los
pozos y se adicionó 1mL de TRIzol. Luego se adicionaron 200 µL de cloroformo y se procedió
29
a la separación de fases. Sobre la fase acuosa se agregaron 500 µL de isopropanol para la
precipitación del RNA. Finalmente se realizó un lavado con etanol al 70% y el RNA obtenido
fue cuantificado por medio del Qubit® RNA Assay Kit (Q32852: Invitrogen®) y se almacenó a
-20°C hasta iniciar el proceso de retrotranscripción.
4.8.3 Síntesis de cDNA
El RNA extraído fue retro-transcrito por medio del kit QuantiNova Reverse Transcription Kit
(Cat. No 205413) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En cada experimento de
retrotranscripción se tuvo en cuenta un control negativo adicional (RT -) conteniendo el RNA
extraído pero que omitió la adición de la retrotranscriptasa con el fin de corroborar la
ausencia de DNA genómico que pudiera alterar los resultados de la qPCR.
4.8.4 PCR en tiempo real
Para la amplificación se diseñaron primers específicos para los genes de interés. Con base en
literatura (38, 39) se escogieron 3 genes blanco que son transactivados por STAT3 (Ciclina D,
VEGF y BCL-XL implicados en procesos de supervivencia celular, angiogénesis y evasión de
apoptosis. Como genes de referencia para los cálculos de expresión relativa se utilizó β-
actina (ACTB) y el gen que codifica para la subunidad lateral P0 de la proteína ribosomal
(RPLP0). Para el diseño de los primers se utilizaron diferentes herramientas, como IDT
SciTools (Integrated DNA technologies®) o primer BLAST (NCBI) para minimizar la presencia
de homo o heterodímeros y de inespecificidades. Además se tuvo en cuenta que los primers se
encontraran entre las uniones exón-exon para evitar la amplificación de DNA genómico. Las
secuencias utilizadas se describen a continuación:
Gen de interés Secuencia forward (5´ - 3´) Secuencia reverse (5´ - 3´) RPLP0 CAG ATC CGC ATG TCC CTT C GAA CAC AAA GCC CAC ATT CC ACTB GTC TTC CCC TCC ATC GTG GTA CTT CAG GGT GAG GAT GC BCLXL GTG GAA AGC GTA GAC AAG GAG CTG CAT TGT TCC CAT AGA GTT C
CICLINA D CCGTCCATGCGGAAGATC GAAGACCTCCTCCTCGCACT VEGF AGG GCA GAA TCA TCA CGA AG GGA TGG CTT GAA GAT GTA CTC G
Tabla No 2. Secuencias de primers diseñados para los ensayos de RT-PCR
Los ensayos de PCR en tiempo real se realizaron con el kit LightCycler® 480 SYBR Green I
Master (Roche). El perfil de amplificación fue el siguiente: Denaturación a 95°C por 10
minutos seguida de 40 ciclos de 10 segundos a 95°C, 15 segundos a 58°C (Anillamiento) y 10
segundos a 72°C (extensión). Finalmente se realizó una curva melting entre 58°C y 97°C
aumentando de forma continua 0.11°C/seg. Los ensayos se realizaron en un termociclador
Light Cycler 480 II (Roche®).
A partir de los valores CT (threshold cycle) se establecieron los cambios en los niveles de
expresión de los genes por medio de una cuantificación relativa por el método de delta-Cq, la
cual tiene en cuenta las eficiencias de reacción obtenidas para cada gen en particular
(Ecuación 1 y 2)(84). Como condición control se tomaron las diferentes líneas celulares sin
tratamiento. Estos ensayos se realizaron por duplicado (réplicas técnicas) y con dos replicas
biológicas para cada condición evaluada.
30
𝑬𝒄 𝟏: 𝑁𝑅𝑄 =𝑅𝑄 𝑔𝑒𝑛 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜
√𝑅𝑄𝑔𝑒𝑛 𝑟1 𝑥 𝑅𝑄𝑔𝑒𝑛 𝑟22
𝑬𝒄 𝟐: 𝑅𝑄 𝑔𝑒𝑛 = 𝐸𝑔𝑒𝑛(𝐶𝑇 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐶𝑇 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜)
Donde NRQ: Cuantificación relativa normalizada
RQ: Cuantificación relativa para el gen
Egen: Eficiencia de la amplificación para el gen respectivo
CT control: CT promedio en la condición sin tratamiento
CT tratamiento: CT promedio luego del tratamiento
Gen r1: Gen de referencia 1 Gen r2: Gen de referencia 2
4.9 Análisis estadístico
Los datos y gráficas obtenidas corresponden al promedio ± desviación estándar de 2
experimentos independientes realizados por triplicado. El análisis estadístico fue realizado
por medio del software GraphPad 5 (Prism 5, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Se utilizó
el análisis de Mann-Whitney para comparación múltiple, para determinar si existen
diferencias significativas entre grupos. Los valores p obtenidos son expresados de la siguiente
manera:
*Si el valor-p es menor a 0.05
** Si el valor-p es menor a 0.01
*** Si Si el valor-p es menor a 0.001
Capítulo 5. Resultados y discusión
5.1 ¿Hay expresión del factor de transcripción STAT3 en su forma basal o fosforilada (Y705) en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5?
Para corroborar que las líneas celulares a emplear expresaran el blanco molecular, la proteína
STAT3, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia en la cual se hizo la marcación con
anticuerpos que reconocen el factor en su estado basal (STAT3) o con fosforilación en el
residuo de tirosina 705 (STAT3-Y705).
Como se observa en la figura No.1 las células tumorales (A549 y H292) expresan el factor de
transcripción STAT3, el cual se encontró distribuido uniformemente en todo el citoplasma,
junto con algunas estructuras más acumuladas que rodean el núcleo celular (A y D). También
se observó presencia de STAT3 a nivel nuclear, aunque en baja proporción (C y F). Respecto a
31
la línea celular de fibroblastos MRC-5, también se encontró presencia de STAT3 a nivel
citoplasmático (I) pero la marcación fue de menor intensidad frente a las dos líneas
tumorales.
Figura 1. Expresión de STAT3 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. Microfotografías de las células A549, H292 y MRC-5 en condiciones normales de cultivo. Las células fueron fijadas y marcadas con un anticuerpo monoclonal específico para STAT3 (1:400) y un anticuerpo secundario conjugado a Alexafluor 488 (1:800). Las imágenes fueron tomadas con microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse IX50 (Objetivo 40X)
Simultáneamente se evaluó la presencia de STAT3 fosforilado en el residuo Y705 con el fin de
determinar la activación en la vía de señalización ya que en este estado, STAT3 es capaz de
formar homodímeros para su posterior translocación en el núcleo. De acuerdo a las imágenes
de la figura No.2 se encontró que las líneas A549 y H292 en condiciones normales de cultivo
A B C
D E F
G H I
A5
49
H
29
2
MR
C-5
STAT3 DAPI MERGED
32
presentan una acumulación de estructuras Y705-STAT3 positivas, siendo más intensas
alrededor del núcleo. (Flechas, A y D). También se observan algunos puntos que colocalizan en
el núcleo. Sin embargo, estas características no se observaron en las células MRC-5, las cuales
presentaron una marcación positiva más tenue, sin acumulación visible en alguna región
celular específica.
Figura 2. Expresión de Y-705-STAT3 en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. Microfotografías de las células A549, H292 y MRC-5 en condiciones normales de cultivo. Las células fueron fijadas y marcadas con un anticuerpo monoclonal específico para STAT3 (1:300) y un anticuerpo secundario conjugado a Alexafluor 488 (1:800). Las imágenes fueron tomadas con microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse IX50 (Objetivo 40X).
A B C
D E F
G H I
DAPI MERGED Y-705-STAT3
A5
49
H
29
2
MR
C-5
33
Estos resultados confirmaron la expresión de STAT3 en las 3 líneas celulares empleadas, en mayor medida en las líneas tumorales. Un aspecto interesante es que se observa la presencia de STAT3 a nivel nuclear o formando agrupaciones en algunas partes de la célula. Este resultado es coherente con varios reportes en los que se demuestra que STAT3 puede ser translocado al núcleo independiente de su fosforilación en Y705 (34) y de esta forma puede incluso unirse al DNA para favorecer la transcripción de otros genes diferentes a los descritos en la vía de señalización convencional (85, 86).
Por otra parte, a pesar que la marcación obtenida en la proteína STAT3 fosforilada en Y705 no fue la esperada ya que no se concentró dentro del núcleo, si se observan algunos cúmulos que rodean al núcleo en el caso de las líneas tumorales, lo que podría sugerir que en nuestro modelo Y-705-STAT3 se acumula en la región perinuclear y podría estar transcripcionalmente activo. Esto se apoyaría en un reporte de Shaiken y Opekun, quienes lograron aislar el espacio perinuclear en líneas tumorales (MDA-MB-435, HeLa) y MEFs inmortalizados y demostraron la presencia de STAT3 y otros factores de transcripción en esta región (87). Adicionalmente, otro estudio describe la acumulación nuclear de STAT3 activado en estructuras semejantes a cuerpos nucleares que además colocalizan con la histona acetilada H4 y la proteína CBP (88) lo cual asociaría la presencia de STAT3 en dicha región con su papel en procesos de transcripción de genes.
5.2 ¿Es transfectado de forma eficiente el señuelo dirigido a STAT3 en las líneas
celulares A549, H292 y MRC.5?
Para determinar si el proceso de transfección utilizado permitía la captación celular de los
ODNs, se evaluó la localización celular y la eficiencia de la transfección de un señuelo marcado
con FITC. Se pudo determinar que luego de 24 horas de transfección, el señuelo logra ingresar
a la célula y se localiza mayoritariamente a nivel citoplasmático, que corresponde con el sitio
de acción esperado (Figura No.3). Posteriormente se evaluó la captación del señuelo en un
rango de concentraciones entre 0 – 100nM para asegurar que este era eficientemente
transfectado a concentraciones más bajas.
A549 H292 MRC-5
Figura 3. Localización subcelular del ODN modificado marcado con FITC (100nM) transfectado en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5.
34
De acuerdo a la figura No.4A se encontró un aumento de la fluorescencia asociado al
aumento de la concentración del señuelo, luego de un período de transfección de 24 horas. A
6nM se evidencian algunos puntos de fluorescencia, indicando que a la menor concentración
evaluada el ODN ya es captado en las 3 líneas celulares. Además se observa que entre las
concentraciones 50nM y 100nM no hay diferencias apreciables en la intensidad de
fluorescencia indicando que probablemente a estas dosis se alcance la eficiencia máxima de la
transfección.
Para corroborar estas observaciones, se realizó una citometría de flujo para cuantificar la
eficiencia de la transfección (Fig 4B). Se encontró que las 3 líneas fueron transfectadas con el
señuelo incluso a la menor concentración de 6nM. En esta condición se encontró que entre el
60- 65% de las células captaban en su interior el señuelo. Adicionalmente se observa que la a
50nM se alcanza el máximo nivel de transfección y no hay diferencias significativas incluso si
se duplica la concentración de señuelo a 100nM.
El uso de oligonucleótidos tipo señuelo como modelo de terapia dirigida ha sido ampliamente
descrito en diferentes tipos de enfermedades, entre ellas el cáncer. Sus ventajas frente a
terapias convencionales incluyen la selectividad y especificidad de sus efectos, lo cual
depende directamente de aspectos como la concentración, tiempos de tratamiento o la
secuencia del ODN. En primer lugar, los resultados de la evaluación del proceso de
transfección de un ODN marcado (Figura 4) mostraron que este fue captado efectivamente en
las 3 líneas celulares con eficiencias mayores al 50%. Llama la atención que a diferencia de
varios estudios en otros modelos celulares, en los que se demuestra que este tipo de
moléculas aparte del citoplasma pueden incluso localizarse en el núcleo (68,80) luego del
período de tratamiento, el ODN se localiza de forma uniforme en el citoplasma y no es capaz
de entrar al núcleo bajo las condiciones de transfección utilizadas (Figura 3). Esto podría
sugerir que en nuestro modelo, el bloqueo de STAT3 con el señuelo debe ocurrir en
citoplasma evitando que el factor de transcripción pueda entrar al núcleo.
35
Sin
trto
vehíc
ulo6.
2512
.5 25 50100
Sin
trto
vehíc
ulo6.
2512
.5 25 50100
Sin
trto
vehíc
ulo6.
2512
.5 25 50100
0
20
40
60
80
100
A549
H292
MRC-5
B)
concentración nM
% c
élu
las
FIT
C +
Figura 4. Eficiencia de la transfección del ODN marcado con FITC transfectado en
concentraciones 6 – 100nM en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5. A) Imágenes de
inmunofluorescencia del proceso de transfección. B) Cuantificación de la eficiencia de
transfección del ODN por citometría de flujo.
6nM 12nM
M
25nM
M
50nM 100nM
A549
H292
MRC5
36
5.3 ¿Tiene efecto citotóxico la transfección de ODNs (parental, modificado y
control) sobre las líneas celulares A549, H292 y MRC-5?
Para establecer el efecto de los ODNs transfectados sobre la viabilidad celular de las líneas
tumorales y control, se realizó un ensayo de citotoxicidad. Las células fueron transfectadas
con los señuelos parental, modificado y control a concentraciones entre 0-100nM y luego de
24 horas de tratamiento se realizó el ensayo metabólico de resazurina. Como se observa en la
figura No.5, bajo estas condiciones se logró una disminución significativa en la viabilidad
celular de forma dosis dependiente en las células A549 y H292 que fueron transfectadas con
los señuelos parental y modificado. En A549 se alcanzó una reducción de la supervivencia
hasta un 45% (Parental) y 36% (modificado) a concentraciones de 100nM (5A). En H292 se
alcanzó una reducción hasta el 43% de supervivencia con ambos señuelos (5B). Sin embargo
en esta línea no hay una disminución significativa de la supervivencia más allá de la
concentración 50nM.
Con respecto al señuelo control, se encontró una respuesta diferente en cada línea celular. En
A549 se obtuvo una disminución máxima de la supervivencia hasta el 60% a 50nM (5A)
mientras que en H292 la supervivencia disminuyó hasta un 83% a 50nM (5B). Estos
resultados sugieren que probablemente haya efectos inespecíficos del señuelo control siendo
más importantes para la línea A549 pero que en gran medida son generados a
concentraciones significativamente altas.
Con respecto a la línea celular no tumoral, se encontró que en los tres señuelos no tuvieron un
efecto significativo sobre la supervivencia celular, ya que en todo el rango de concentraciones
los valores permanecieron entre un 80 -90% (Fig 5C). Comparando con lo obtenido para las
líneas tumorales, estos resultados indican que el efecto citotóxico de los señuelos es selectivo
para las líneas tumorales y no para los fibroblastos de pulmón.
Debido a que los datos anteriores no sugieren si los efectos de los señuelos son sostenidos en
el tiempo, se decidió evaluar la cinética de supervivencia hasta un tiempo de tratamiento de
96 horas a 3 dosis diferentes que se escogieron teniendo en cuenta las concentraciones letales
30, 50 y 70 (CL30, CL50, CL70) del experimento anterior. Para esto, a partir de las gráficas
obtenidas se realizó una regresión no lineal y así poder estimar dichas concentraciones (Tabla
No 3).
37
Figura No 5. Curvas de citotoxicidad de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 tratadas 24 horas con ODN par, ODN mod y ODN control. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos. 24 horas después, fueron transfectadas con los señuelos a concentraciones (6.25nM, 12.5 nM, 25nM, 50nM, y 100nM). Se realizó una lectura 24h post-transfección por el método de Rezasurina. Las gráficas corresponden a dos experimentos independientes por triplicado. A) Línea celular A549, B) Línea celular H292, C) Línea celular MRC-5.
Línea ODN CL30(nM) CL50(nM) CL70(nM) R2
A549 Parental 11.80±1.16 64.43±1.25 351.56 0.8285
Modificado 8.89±1.29 36.93±1.09 153.46 0.9534
H292 Parental 15.03±1.35 52.82±1.11 173.78 0.9284
Modificado 14.82±1.56 58.99±1.18 234.96 0.8641
Tabla No 3. Valores estimados de la CL30, CL50 e CL70 por medio del ajuste de las curvas de supervivencia con una regresión no lineal (Modelo Log (Do) vs respuesta normalizada – pendiente variable) con ayuda del software Graphpad prism.
A549
0 50 1000
20
40
60
80
100
12.5 25
ODN nM
% s
up
erv
iven
cia
H292
0 50 1000
20
40
60
80
100
12.5 25
ODN nM
% s
up
erv
iven
cia
MRC-5
0 50 1000
50
100
ODN parental
ODN modificado
ODN control
12.5 25
ODN nM
% s
up
erv
iven
cia
A B
C
38
Como se observa en la figura 6, en general se encontró un efecto bifásico de los señuelos sobre
las líneas tumorales, mostrando una disminución inicial de la supervivencia de forma tiempo
dependiente entre las 0 y 48 horas de tratamiento con posterior recuperación hasta las 96
horas post- transfección. Además se puede ver que el inicio del efecto citotóxico de los
señuelos es temprano ya que a las 12 horas post transfección ya hay una disminución
significativa del porcentaje de supervivencia.
Figura No 6. Cinética de supervivencia de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 tratadas entre 0 y 96 horas con ODN par, ODN mod y ODN control. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos. 24 horas después, fueron transfectadas con los señuelos a concentraciones CL30, CL50 e CL70 (A549 y H292) y 100nM para MRC-5. . Se determinó la supervivencia por el método de Rezasurina. Las gráficas corresponden a dos experimentos independientes por triplicado. AB) Línea A549, CD) Línea H292, E) Línea MRC-5. Como control positivo se utilizó el agente antitumoral doxorrubicina (25μM)
A549 ODN parental
00
50
100
CL 30 ODN parental
CL 50 ODN parental
CL 70 ODN parental
12 24 48 72 96
100nM ODN control
Doxo 25M
horas post transfección
% s
up
erv
ive
nc
ia
A549 ODN modificado
00
50
100
CL 30 ODN modificado
CL 50 ODN modificado
CL 70 ODN modificado
12 24 24 48 72
100nM ODN control
Doxo 25M
horas post transfección%
su
pe
rviv
en
cia
H292 ODN parental
00
20
40
60
80
100
CL 30 ODN parental
CL 50 ODN parental
CL 70 ODN parental
12 24 48 72 96
100nM ODN control
Doxo 25M
horas post transfección
% s
up
erv
ive
nc
ia
H292 ODN modificado
00
20
40
60
80
100
CL 30 ODN modificado
CL 50 ODN modificado
CL 70 ODN modificado
12 18 24 48 72 96
100nM ODN control
Doxo 25M
horas post transfección
% s
up
erv
ive
nc
ia
MRC5
00
50
100
100nM ODN Parental
100nM ODN Modificado
100nM ODN control
24 48 72 96
Doxo 25M
horas post transfección
% s
up
erv
ive
nc
ia
A) B)
C) D)
E)
39
Por otra parte, se encontró un comportamiento diferente entre los señuelos dependiendo de
la concentración evaluada. A una dosis baja (CL30) los señuelos generan una disminución de
la supervivencia hasta las 48 horas (A549: Parental 44%, Modificado 42%; H292 Parental
75%, Modificado 56%) de tratamiento y posteriormente se presenta una recuperación hasta
las 96 horas. Este comportamiento se presentó en las dos líneas tumorales evaluadas.
Cuando se empleó la CL50 (curva azul), en la línea A549 (6A y 6B) se obtuvo una disminución
de la supervivencia considerable, alcanzando el mínimo a las 72 horas (ODN par 4%, ODN
mod 17%). Sin embargo, a las 96 horas se alcanzó una recuperación hasta el 43% de
supervivencia con el ODN mod a diferencia del ODN par en el que el efecto citotóxico fue
constante. Por otra parte, en la línea H292 (6C y 6D) se alcanzó el punto máximo de muerte a
las 48 horas (ODN par 28%, ODN mod 22% supervivencia) con posterior recuperación que
fue leve para ODN mod (31% en 96 horas) y más significativa para ODN par (57% en 96
horas). En este caso dicha diferencia podría atribuirse a la presencia de modificaciones en el
señuelo que podrían favorecer su mayor estabilidad en la célula y por tanto un efecto
citotóxico sostenido a diferencia del señuelo sin modificaciones.
En el caso del ensayo con la CL70 (curva roja), se obtuvieron efectos citotóxicos muy fuertes
para la línea A549, en la cual la supervivencia se mantuvo constante por debajo del 10%
entre las 24 y 96 horas de tratamiento para ambos señuelos. A diferencia de esto, la línea
H292 tuvo un comportamiento en el que se alcanzó el mínimo de supervivencia a las 48horas
(ODN par 19% y ODN mod 16%) y una ligera recuperación sólo para el ODN parental a las
96horas. Este resultado apoyaría la idea que el ODN modificado presenta ventajas sobre el
parental dando un efecto sostenido en el tiempo.
Con respecto al señuelo control (curva gris), se decidió evaluar a la concentración máxima
(100nM) ya que debido a la tendencia de la gráfica (Fig 5A-C) no era posible estimar una CL50
por medio de regresión. Para la línea A549 se obtuvo nuevamente una disminución
considerable del porcentaje de supervivencia llegando hasta un 57% a las 48 horas y
posterior recuperación a diferencia de la línea H292 en la que el efecto sobre la supervivencia
fue mucho más leve. Por lo tanto, este resultado confirma la presencia de efectos de inhibición
inéspecíficos significativos del ODN control en la línea A549, pero a una concentración mucho
mayor que la empleada para los señuelos parental y modificado.
Finalmente, la gráfica de este ensayo en la línea de fibroblastos MRC-5 (Fig 6E) muestra que
hay una ligera disminución del porcentaje de supervivencia con el ODN mod luego de 48
horas de tratamiento (75%) pero permanece constante hasta las 96 horas. Con los ODNs
parental y control no se obtuvo un efecto considerable sobre la supervivencia celular.
Es posible especular que los mayores efectos con el ODN modificado sean el resultado de un
aumento en su estabilidad al interior de la célula y así brindar un efecto sostenido en el
tiempo. En nuestro diseño se incluyeron modificaciones químicas en los extremos 3’ y 5’ del
señuelo ya que estos son los sitios más susceptibles de degradación por nucleasas. En relación
a esto, un reporte de Sen y Col demostró que el uso de modificaciones químicas tipo hairpin
en oligonucleótidos les confiere un aumento de la vida media en suero respecto a un ODN
40
parental, lo que a su vez se asoció con una mayor disminución de la viabilidad in vitro (6). Sin
embargo, en la línea A549 se obtuvo el comportamiento contrario ya que con la CL50 a las 96
horas post tratamiento, el ODN parental tuvo un efecto sostenido mientras que con el ODN
modificado se obtuvo una recuperación significativa de la supervivencia (Fig 6A y 6B). En este
caso la diferencia podría estar más relacionada a un efecto por la dosis usada ya que la CL50
del ODN parental es casi el doble que la del ODN modificado.
En conjunto, estos resultados sugieren que por una parte hay una selectividad en el efecto
citotóxico de los señuelos parental y modificado probablemente asociado a la mayor
presencia del blanco molecular (STAT3) y a la dependencia sobre este para la supervivencia
de las líneas tumorales y no la línea celular control. Por otra parte las diferencias en el efecto
citotóxico entre el señuelo parental y modificado en especial en la línea H292 podrían sugerir
que dichas modificaciones le ofrecen ventajas como una mayor estabilidad para ejercer un
efecto sostenido en el tiempo y así evitar las fases de recuperación de la supervivencia.
5.4 ¿El tratamiento con los ODNs parental y modificado tiene efecto sobre
la activación de caspasas 3 y 7 en las líneas A549, H292 y MRC-5?
En la sección anterior se demostró que los ODNs parental y modificado tuvieron un efecto
citotóxico sobre las líneas tumorales. Sin embargo dichos resultados no permiten relacionar el
efecto obtenido con algún mecanismo de muerte celular. Teniendo en cuenta un trabajo
previo llevado a cabo en nuestro grupo de investigación y algunos reportes de literatura se ha
encontrado que este tipo de moléculas (ODNs) producen muerte celular principalmente por
medio de apoptosis. Por lo tanto se evaluó la activación de caspasas 3 y 7 luego del
tratamiento de las líneas células con los señuelos a las concentraciones CL50 durante 24
horas. De acuerdo a la figura 7 se encontró que el tratamiento con los ODNs indujo un
aumento en la actividad de caspasas 3 y 7 el cual fue alrededor de dos veces para la línea
A549 y alrededor de 4 veces para H292 respecto a las células sin tratamiento. Sin embargo,
no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre tratamientos en
ninguna de las tres líneas evaluadas lo que indicaría que las modificaciones químicas en el
ODN no generan ventajas en cuanto a la inducción de actividad de caspasas y por lo tanto no
es posible afirmar que cualquiera de los tratamientos ejerza igual influencia en el fenómeno
de inducción de apoptosis celular. Respecto a la línea celular A549, a pesar que hay un
aumento del doble en la actividad de caspasas luego de los tratamientos no se puede aseverar
que las diferencias cualitativamente observadas tengan robustez y significancia biológica.
En la línea MRC-5 también se observa un aumento de la actividad de caspasas luego del
tratamiento con los ODNs parental y modificado pero no se encontraron diferencias
significativas entre el ODN control y las células sin tratamiento.
Estos resultados indicarían que los ODNs estarían induciendo un proceso de apoptosis. Sin
embargo es necesario evaluar el proceso de muerte en etapas posteriores a la activación de
caspasas para confirmar dicha observación.
41
A549 H292 MRC5
0
2
4
6
**
*
*
*
Sin tratamiento
ODN PAR
ODN MOD
ODN CON
H2O2
*A
cti
vid
ad
rela
tiva
casp
asa 3
/7
Figura 7. Actividad relativa de caspasas 3 o 7 en las líneas A549, MRC-5 y H292 luego del tratamiento con ODN Par, ODN mod y ODN control. Las células fueron tratadas a la CL50 (A549 y H292) y 100nM para MRC-5 por 24 horas en placas de 48 pozos. La actividad de caspasas 3/7 fue medida usando un kit colorimétrico ApoTarget Caspase-3 Protease Assay de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Todas las medidas son relativas a las células sin tratamiento. Como control positivo se usó H2O2 100μM por 6 horas. Cada barra representa el promedio ± SD de dos ensayos independientes por duplicado. Prueba Mann-Whitney comparando los tratamientos vs las líneas no tratadas. P<0.05*
5.5 ¿Hay fragmentación nuclear en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5
luego del tratamiento con los señuelos parental o modificado?
Para confirmar un proceso de muerte por apoptosis se decidió evaluar la fragmentación a
nivel nuclear que corresponde a uno de los cambios morfológicos característicos en las
etapas finales de este modo de muerte celular. Para esto, las líneas celulares fueron tratadas
por 24 horas con los ODNs parental y modificado y luego se realizó un ensayo de TUNEL in
situ que fue visualizado por microscopía de fluorescencia. De acuerdo a la figura No 8A y B
tanto en la línea A549 como en la H292 se observan cambios en la morfología nuclear luego de
los tratamientos, con algunas células en las que se evidencia condensación del núcleo y otras
que además presentan marcación TUNEL positiva similar a la obtenida con el control positivo
(DNASa). Adicionalmente y de forma interesante también se evidencia la formación de
estructuras nucleares pequeñas que contienen DNA fragmentado (recuadros) y que podrían
corresponder a cuerpos apoptóticos.
En cuanto a los fibroblastos MRC-5, también se encontró marcación TUNEL positiva luego de
los tratamientos (8C). Sin embargo en esta línea sólo se observaron características de núcleos
condensados y a diferencia de las líneas tumorales no se encontró evidencia de cuerpos
apoptóticos. Además en las células sin tratamiento también se observaron células con el
núcleo fragmentado, probablemente debido a un proceso normal de muerte.
42
Figura No 8. Ensayo de fragmentación nuclear de las líneas celulares A549, H292 y MRC-5 tratadas con ODN par y ODN mod. Las células fueron tratadas a la CL50 (A549 y H292) y 100nM para MRC-5 por 24 horas. Luego se realizó marcación para núcleos fragmentados por medio de un kit de TUNEL. Se muestran imágenes representativas tomadas con microscopio de fluorescencia (objetivo 40X). Flechas: indican núcleos con marcación TUNEL positiva. Recuadros: ampliación mostrando cuerpos apoptóticos. A) A549, B) H292 y C) MRC-5
TUNEL DAPI MERGED
Sin
tra
tam
ien
to
DN
Asa
O
DN
pa
ren
tal
OD
N m
od
ific
ad
o
A)
43
Continuación Figura No 8. Ensayo de fragmentación nuclear de las líneas celulares A549, H292 y
MRC-5 tratadas con ODN par y ODN mod. B) H292
TUNEL DAPI MERGED
Sin
tra
tam
ien
to
DN
Asa
O
DN
Pa
ren
tal
OD
N m
od
ific
ad
o
B) H292
44
Continuación Figura No 8. Ensayo de fragmentación nuclear de las líneas celulares A549, H292 y
MRC-5 tratadas con ODN par y ODN mod. C) MRC-5
TUNEL DAPI MERGED
Sin
tra
tam
ien
to
DN
Asa
O
DN
pa
ren
tal
OD
N m
od
ific
ad
o
C) MRC-5
45
A partir de las imágenes obtenidas, se realizó un conteo de 300 células/tratamiento para
determinar el porcentaje de células con núcleo fragmentado luego de los tratamientos. (Figura
9). Los resultados muestran que en la línea A549 y H292 hay un aumento significativo en el %
de células TUNEL positivas luego de los tratamientos con los ODNs. Además, en la línea A549
se observan diferencias significativas entre los tratamientos, siendo el ODN parental el de
mayor inducción de núcleos fragmentados. En la línea H292 no hubo diferencias entre el ODN
parental o modificado, siendo esto consistente con lo obtenido en los ensayos de citotoxicidad.
Con el ODN control, hubo un aumento del porcentaje de células TUNEL positivas respecto a
las células sin tratamiento, pero este efecto es menor comparado con los ODNs parental y
modificado. Este resultado es congruente con los ensayos de citotoxicidad en los que también
hay un pequeño porcentaje de células muertas luego de este tratamiento.
En cuanto a la línea MRC-5, se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre
los tratamientos y las células sin tratamiento. Sin embargo el aumento en el porcentaje de
células TUNEL positivas relativo a las no tratadas es bajo ya que en esta condición se
encuentra un 6.5% de células con núcleo fragmentado por procesos normales de muerte
celular.
A549 H292 MRC-50
5
10
15
2050
100Sin tratamiento
ODN parental
ODN modificado
ODN control
DNAsa
* * *
**
**
**
**
*
**
% C
élu
las T
UN
EL
+
Figura 9. Cuantificación del ensayo de fragmentación nuclear TUNEL de las líneas A549, H292 y MRC-5.
Porcentaje de células que presentaron marcaje TUNEL positivo luego del tratamiento por 24 horas con CL50 de los
ODNs parental, modificado y control. Como control positivo se empleó DNAsa- I(1U/100µL). Cada barra representa
el promedio ± SD de dos ensayos independientes. Prueba Mann-Whitney comparando los tratamientos vs las líneas
no tratadas. P<0.05*
Como es sabido, la fragmentación internucleosomal del DNA de doble cadena en fragmentos
de 180-200 bp ocasionada por varios sustratos de caspasas como la CAD, constituye uno de
los marcadores principales de un proceso de apoptosis (89). Como se describió en la figura 8
(A y B), luego del tratamiento con los ODNs en la líneas A549 y H292 se evidenció la
formación de cuerpos esféricos distribuidos con DNA fragmentado, aparentemente
encapsulados en alguna membrana lo que hace pensar en cuerpos apoptóticos. Este tipo de
estructuras definidas se consideran características en fases tardías del proceso de apoptosis
46
(90). En la cuantificación realizada, para la línea celular A549 se podría afirmar que las
modificaciones en la molécula pueden variar la respuesta de las células luego del tratamiento.
Sin embargo, esto también depende de las características propias de cada línea celular ya que
en la línea H292 no fue posible encontrar diferencias entre ODNs.
En general, en estudios in vitro que emplean ODNs de tipo señuelo en células tumorales no se
describe el uso de algún modelo control no tumoral para demostrar la selectividad de los
efectos observados. Un aporte de este trabajo fue el uso de los fibroblastos pulmonares MRC-5
y en cuanto a los ensayos de apoptosis se puede destacar en la figura 9, que los tratamientos
produjeron mayor fragmentación nuclear relativa a las células sin tratamiento en las líneas
tumorales comparado con la línea de fibroblastos. En un estudio se demostró que ODNs anti-
STAT3 indujeron apoptosis en líneas tumorales de cáncer de páncreas DU145 a diferencia de
lo obtenido en fibroblastos dermales humanos donde la inducción de apoptosis fue mucho
menor (91). Con base a lo anterior y a lo expuesto sobre las curvas de citotoxicidad para la
línea MRC-5 se podría sugerir que los efectos de los ODNs anti-STAT3 ensayados son
selectivos sobre las líneas tumorales.
En conjunto con lo descrito para el ensayo de caspasas, se podría relacionar a que el
tratamiento con moléculas tipo oligonucleótido sobre un blanco específico, en nuestro caso
STAT3, logra efectos controlados sobre procesos como la muerte celular lo cual es muy
importante para la validación de nuevas terapias dirigidas.
Los resultados obtenidos no permiten saber realmente el mecanismo de inducción de
apoptosis por parte de los señuelos, si es a través de la vía intrínseca o extrínseca de
apoptosis. De acuerdo a lo que se ha reportado en literatura, es posible especular que el
mecanismo se asocie a una alteración en la proteínas de la vía mitocondrial, teniendo en
cuenta que STAT3 modula la expresión de genes como BCL-XL o BCL-2 que regulan el proceso
de apoptosis en otros modelos tumorales (92).
5.6 ¿El tratamiento con los ODNs parental, modificado y control modula la expresión de los genes blanco de STAT3 (BCL-XL, Ciclina D y VEGF) en las líneas celulares? Para determinar de forma indirecta si el efecto citotóxico observado de los ODNs se debe a
un efecto directo sobre el factor STAT3, se usó la metodología reportada por Gao y Zhang (68,
82) donde se asocia la efectividad de los ODNs sobre la función transcripcional del factor de
transcripción con cambios en la expresión de algunos de sus genes blanco. Para esto se
escogieron 3 genes blanco de STAT3 relacionados con procesos celulares de proliferación
(Ciclina D1), angiogénesis (VEGF) y evasión de apoptosis (BCL-XL). Adicionalmente este
último permitiría describir más el interrogante planteado sobre el mecanismo puntual de
muerte celular. Para este ensayo las líneas celulares fueron tratadas con los ODNs por 24
horas a las CL50 respectivas teniendo en cuenta que en estas condiciones las células
remanentes aun cuentan con ODN en su interior y están en proceso de muerte celular. Luego
de esto se procedió con la extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR en tiempo real.
47
Inicialmente se llevó a cabo una estandarización de la técnica de PCR para determinar las
eficiencias de amplificación para los genes blanco y de referencia con el fin de escoger el
método apropiado para la cuantificación relativa. Como se observa en el Anexo 1, debido a
que las eficiencias entre los genes de referencia y los genes blanco no fueron
significativamente similares para todos los casos, se optó por la cuantificación relativa
reportada por Hellemans y col (84) basada en el método de pfaffl, que tiene en cuenta las
eficiencias para cada gen y que permite expresarla de forma normalizada a los dos genes de
referencia seleccionados (RPLP0 y ACTB) de forma simultánea, como se describió en la
sección de metodología (Pág. 29-30)
A continuación se encuentran los resultados obtenidos en las 3 líneas celulares tratadas e
indican los cambios en la expresión de los genes blanco seleccionado relativa a las células sin
tratamiento.
Figura No.10: Expresión relativa de los genes BCL-XL, Ciclina D1 y VEGF en las células A) A549, B) H292 y C) MRC-5 tratadas con ODN PAR, MOD o Control . Se realizó una cuantificación relativa por RT-PCR de los cambios de expresión de 3 genes blanco de STAT3 luego del tratamiento por 24 horas con los ODNs. Las barras indican el promedio± SD (n= 2 experimentos independientes por duplicados) expresados como el nivel de mRNA relativo a las células sin tratamiento y normalizado con dos genes de referencia (RPLP0 y ACTB). Prueba Mann- Whitney (*) p< 0.05 diferencias respecto a células sin tratamiento. SIN: Sin tratamiento; PAR: Parental; MOD: Modificado; SCR: Control.
*
*
* *
* * * * *
*
*
*
*
* *
*
48
Como se muestra en la figura, se encontraron cambios en la expresión de los genes evaluados
en las 3 líneas celulares luego de los tratamientos, pero con algunas características
particulares y de forma general en las líneas tumorales en contra de la hipótesis planteada. Se
esperaba en las líneas tumorales que luego del tratamiento con los ODNs parental o
modificado se obtuviera una disminución en la expresión de dichos genes respecto a la
condición de células no tratadas. De modo inverso, en la línea no tumoral se esperaba que no
hubiera un cambio significativo en la expresión de los genes dado el poco efecto citotóxico de
los ODNs. Únicamente se encontró una disminución de la expresión alrededor del 10% para
BCL-XL con el ODN parental (en A549) y para VEGF con el ODN modificado (en H292). En
cuanto al ODN control, este produjo una disminución aparente de la expresión de BCL-XL y
Ciclina D en la línea A549 aunque sin significancia estadística debido a la variabilidad de los
datos.
Respecto a los demás tratamientos aplicados en las líneas tumorales se encontró una
tendencia de aumento de la expresión de Ciclina D1 en ambas líneas, de BCL-XL en la línea
H292 pero sin diferencias significativas entre los tres tratamiento. Por último y de forma
interesante en obtuvo un aumento considerable en la expresión de VEGF en la línea A549 con
diferencias entre los ODN parental y modificado frente al ODN control indicando un posible
efecto diferencial.
Los cambios observados de aumento en la expresión de genes de las líneas A549 y H292
podrían deberse a diversas situaciones generadas en el contexto celular bajo las condiciones
de tratamiento evaluadas. En primer lugar, se ha descrito que las vías de señalización celular
no funcionan de forma aislada sino que están interconectadas entre sí a través de diversas
proteínas, mecanismos de retroalimentación junto con modos de control espaciales y
temporales. En este contexto, las respuestas obtenidas al inducir una vía de señalización
necesitan de la actividad de otra vía en cuanto a que dependen de la disponibilidad o de la
activación de alguna proteína (93). Varios reportes demuestran que STAT3 se ha convertido
en una proteína fundamental para favorecer la resistencia a nuevos medicamentos. En uno de
ellos se encontró que el tratamiento con anticuerpos monoclonales o moléculas pequeñas que
bloquean receptores de tirosina kinasa como el EGFR, MEK o HER2 o el oncogen KRAS se
encuentra directamente asociado con la activación por feedback de STAT3 (94).
Por tanto, de forma inversa, se podría especular que el hecho de bloquear una proteína
puntual como STAT3 con los ODNs, no asegura que corriente abajo se obtenga una
disminución considerable en la expresión de sus genes blanco sino que a través de otras vías
de señalización las células respondan y presenten un aumento neto en la expresión de genes
con el fin de balancear el efecto y favorecer de cierta forma su supervivencia, como se
observó en la línea H292 que recuperó levemente la viabilidad luego de las 24 horas de
tratamiento (Figura 6C y D). Respecto a esta observación, en el modelo in vitro de cáncer de
pulmón diferentes estudios han demostrado que factores de transcripción como NF-κB,
presentan comunicación cruzada con STAT3 y regulan de forma cooperativa grupos de genes
similares, entre ellos Ciclina D1, BCL-XL (95) o VEGF (96). Además, en modelos de líneas
celulares de glioblastoma (97) y cáncer de ovario (98) se demostró que el uso de inhibidores
49
de STAT3 favoreció la activación de la vía NF- κB y el aumento en la expresión de genes (IL-6,
IL-8, BCL-2, SOCS3) como una vía de escape para favorecer la supervivencia. También se sabe
que otros factores como HIF-1a, esfingosinas (99) o vías como PI3K/AKT controlan dichos
genes directamente y pueden relacionarse con la vía Jak /STATs (100). De acuerdo a lo
expuesto anteriormente, se podría pensar que en el tiempo donde se evaluó la expresión de
genes (24 horas) las células remanentes ya están en un punto donde favorecen mecanismos
de supervivencia a través de otras vías de señalización como respuesta a la acción de los
ODNs.
Por otra parte, se sabe que los siete miembros de la familia STAT reconocen la misma
secuencia consenso en el DNA (TTCN4GAA o TTCN3GAA) y que los cambios en las bases
adyacentes son los que determinan la afinidad por uno u otro de los STATs (101). Dada esta
similaridad, se podría pensar que los resultados contradictorios o los efectos inespecíficos
obtenidos se deban a la inhibición de otros miembros de la familia y no sólo a STAT3. Debe
tenerse en cuenta que este grupo de proteínas se expresan diferencialmente y son específicas
para diferentes tipos de tejidos y pueden formar heterodímeros lo que da mayor complejidad
a esta vía de señalización (102). Además, se han descrito efectos antagónicos, en especial
entre STAT3 y STAT1 ya que éste último actúa como un inhibidor del ciclo celular e inductor
de muerte celular en algunos casos, regulando los mismos genes blanco de STAT3 de forma
inversa (103). Por tanto, se podría pensar que el estado de activación o la cantidad de
proteína también pueden determinar la respuesta obtenida con los ODNs y sería importante
contemplar estos aspectos en el diseño futuro de ODNs, para tener una mayor especificidad en
la respuesta.
En cuanto a la línea de fibroblastos pulmonares se encontró que los tratamientos favorecieron
un aumento leve de la expresión de BCL-XL y un aumento más marcado, de entre 2 a 3 veces
mayor expresión de VEGF respecto a las células sin tratamiento. Este resultado podría tener
alguna relevancia biológica teniendo en cuenta lo obtenido en los ensayos de citotoxicidad en
los que hubo resistencia a los tratamientos con los diferentes ODNs. En cuanto a Ciclina D1,
no es posible saber si hubo un efecto significativo sobre la expresión de este gen luego de los
tratamientos teniendo en cuenta la dispersión de los datos.
Los resultados obtenidos son un aporte de este trabajo ya que en muchos de los reportes
revisados donde evalúan ODNs no se usan líneas celulares control lo cual consideramos
importante para establecer el verdadero potencial de este tipo de moléculas como terapia
dirigida. Llama la atención el aumento considerable en la expresión del VEGF (más del doble)
en esta línea luego de los tratamientos con los tres ODNs. Este resultado podría estar
relacionado con las características propias de la célula, teniendo en cuenta que el VEGF es uno
de los factores de crecimiento más abundantes en el pulmón, cuya producción es esencial para
el mantenimiento de la microvasculatura pulmonar y su pérdida en la señalización puede
llevar a muerte del endotelio pulmonar (104). No hay estudios en donde evalúen el efecto de
una molécula tipo ODN en este modelo celular. Sin embargo, en un reporte en un modelo
murino de carcinoma pulmonar se encontró que la administración de un ODN tipo CpG
favoreció la liberación de VEGF proveniente de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
50
que a su vez se asoció con el favorecimiento de la progresión del tumor (105). Estos datos
podrían indicar un posible rol del VEGF para favorecer la supervivencia de las células MRC-5,
lo cual genera nuevas preguntas a futuro para profundizar en los mecanismos de
supervivencia de este modelo celular.
De acuerdo a estos resultados se puede concluir que en las líneas tumorales, la evaluación de
estos tres genes no permitió validar si los efectos de los ODNs dirigidos contra STAT3 se
deben a un mecanismo directo sobre la actividad a nivel transcripcional de este factor de
transcripción. Por lo tanto no se descarta que su modo de acción esté relacionado con efectos
inespecíficos.
Limitaciones del estudio
Se considera que este trabajo abordó variables importantes que lograron demostrar el
potencial antitumoral de ODNs dirigidas contra el factor de transcripción STAT3 en el modelo
in vitro. Sin embargo, para validar este tipo de moléculas como una estrategia de terapia
dirigida, quedan varias preguntas por resolver. En primer lugar es necesario aclarar el por
qué se observó en varios casos recuperación de la supervivencia celular luego de periodos
largos de tratamiento, en especial en la línea A549, si es algo que tiene que ver con la
estabilidad intracelular de los ODNs o algún mecanismo de depuración propio de la célula
teniendo en cuenta que la mayoría de las células son eficientemente transfectadas. Esto es
relevante ya que lo ideal sería mantener el ODN dentro de la célula el tiempo suficiente para
asegurar efectividad de los tratamientos.
Otro aspecto a investigar para corroborar la especificidad de los ODNs, sería determinar las
causas asociadas a los efectos inespecíficos encontrados en el ODN control en la línea A549. A
pesar que en cierta forma este tipo de efectos pueden ser esperados ya que la introducción de
fragmentos de DNA foráneo puede desencadenar efectos inflamatorios, no se descarta que
también sea un efecto dependiente de la dosis empleada. Adicionalmente es necesario
establecer si hay una interacción directa entre los señuelos y el factor de transcripción y si las
modificaciones químicas tienen algún efecto en dicha interacción para dar mayor rigurosidad
a los resultados.
También es importante determinar si los ODNs inducen exclusivamente un proceso de
apoptosis ya que los resultados de esta sección no permitieron sacar conclusiones sobre
características de necrosis luego de los tratamientos.
Por último, a pesar que los resultados obtenidos permiten sacar conclusiones sobre los
potenciales efectos antitumorales de los ODNs en tiempos puntuales de tratamiento, hace
falta una evaluación más detallada en diferentes tiempos de tratamiento, en especial con los
ensayos de expresión diferencial de genes blanco de STAT3 para validar el mecanismo de
acción específico de los ODNs que debe suceder en un tiempo temprano del tratamiento
mucho menor a las 24 horas donde se realizó la evaluación. Además sería interesante evaluar
el efecto de los ODNs de forma más amplia ya que como se discutió, la interconexión entre
51
diferentes vías de señalización hace más complejo el análisis de los resultados en el modelo de
líneas celulares.
Capítulo 6. Conclusiones y Recomendaciones
6.1 Conclusiones
Se encontró que las líneas celulares A549 y H292 presentan mayor expresión del factor de
transcripción STAT3 y activación constitutiva por fosforilación en el residuo Y705 respecto a
la línea celular MRC-5.
Mediante el proceso de transfección de los ODNs en las líneas celulares A549, H292 y MRC-5,
se logró una captación celular con eficiencias mayores al 80% luego de 24 horas. Se
determinó que el sitio de acción de los ODNs es a nivel citoplasmático.
Se demostró que los ODNs parental y modificado presentaron un efecto citotóxico
considerable dependiente de la dosis y los tiempos de exposición evaluados. Dicho efecto fue
selectivo para las líneas celulares tumorales A549 y H292.
Se determinó que los efectos citotóxicos de los ODNs evaluados están asociados con la
inducción de un mecanismo de muerte celular por apoptosis.
El patrón de expresión de los genes BCL-XL, Ciclina D1 y VEGF luego del tratamiento con los
ODNs no permitió comprobar su mecanismo de acción sobre la actividad transcripcional del
blanco STAT3 en las líneas tumorales como se esperaba a las 24 horas post-tratamiento.
6.2 Perspectivas y recomendaciones
De acuerdo a lo discutido en las limitaciones del trabajo realizado se pueden proponer una
serie de experimentos en el corto plazo para dar más robustez y validar el uso de
oligonucleótidos como potencial terapia antitumoral en modelos in vitro.
Respecto a la estabilidad de los señuelos, se propone evaluar por medio de
inmunofluorescencia el proceso de degradación intracelular de los señuelos, haciendo un
seguimiento a una población de células luego del proceso de transfección en un intervalo
hasta las 96 horas. Otras estrategias encontradas en la literatura incluyen evaluar la cinética
de degradación de los señuelos en sueros o plasmas para intentar estimar un tiempo de vida
media en estos sueros. Esto además podría confirmar las ventajas de usar modificaciones en
el diseño de los ODNs.
Para asegurar el bloqueo específico de los señuelos al factor de transcripción podría evaluarse
la interacción por medio de ensayos de colocalización a través de microscopía confocal. Otra
alternativa sería la propuesta por Souissi et al (97) a través de un ensayo de pull-down para
52
oligonucleótidos y posterior detección de la proteína STAT3 por medio de inmunoblot. De
forma indirecta se podría evaluar si el señuelo es capaz de alterar el transporte de STAT3
entre citoplasma y nucleó a través de una técnica cuantitativa como western blot.
Por otra parte se recomienda complementar los ensayos de apoptosis evaluando por medio de
pruebas que evalúen si existe necrosis luego de los tratamientos y establecer el posible
mecanismo de inducción de muerte asociado a los efectos del señuelo evaluando la función de
proteínas mitocondriales o la actividad mitocondrial.
Para validar el mecanismo de acción de los ODNs y la especificidad en los efectos se
recomienda en primer lugar evaluar el patrón de expresión de los genes blanco de STAT3
escogidos, en diferentes puntos entre 0 y 24 horas y así establecer si los efectos de inhibición
se observan mejor en períodos tempranos de tratamiento. También podrían evaluarse los
efectos de forma global mediante ensayos de RNAseq o micro arreglos, que permitan saber la
acción de los ODNs sobre una mayor cantidad de genes blanco de STAT3 para así profundizar
en el mecanismo de inducción de citotoxicidad y muerte celular y evaluar la posibilidad de
efectos inespecíficos o de interacción entre otras vías de señalización.
Finalmente se recomienda que para futuros estudios se incluyan más repeticiones
experimentales que permitan aumentar el número de ensayos y por tanto la robustez de los
análisis y ajustes estadísticos, así como las medidas de tendencia de los cuales estos
dependen.
53
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104. Kamio K, et al. Prostacyclin analogs stimulate VEGF production from human lung fibroblasts in
culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294: L1226–L1232, 2008.
105. Sorrentino R, et al. CpG-ODN increases the release of VEGF in a mouse model of lung carcinoma
Int. J. Cancer: 128, 2815–2822 (2011)
Anexo 1. Histogramas de citometría de flujo de la eficiencia de transfección
Histogramas de citometría de flujo: Análisis de los datos obtenidos en el ensayo de eficiencia de la transfección por medio de citometría de flujo. Para generar los histogramas se utilizó el software Flowjo® y se seleccionaron ventanas (gates) para discriminar el porcentaje de células FITC positivas y negativas luego de la transfección con los ODN a diferentes concentraciones en las tres líneas celulares.
Sin tratamiento 6 nM 12 nM 25 nM 50 nM 100 nM
A5
49
H
29
2
MR
C5
2
Anexo 2. Curvas de eficiencia qRT-PCR
Curvas de eficiencia para la validación técnica de la qPCR de los genes de referencia empleados (RPLP0 y β-actina) y los genes blanco de STAT3 (BCL-XL, Ciclina D y VEGF). El valor de eficiencia indicado se obtuvo a partir de la pendiente de la gráfica. La curva incluye puntos por triplicado de diluciones 1:10 del cDNA obtenido a partir de 385ng de RNA.
RPLP0
-6 -5 -4 -3 -2 -1 015
20
25
30
35
40
y=-2.934X+15.81
r2=0.996 Ef: 2.1927
Log cDNA input
Ct
ACTB
-6 -5 -4 -3 -2 -1 00
10
20
30
40
y=-3.102X + 19.03
r2=0.9921 Ef: 2.1007
Log cDNA input
Ct
BCL XL
-6 -5 -4 -3 -2 -1 015
20
25
30
35
40
y=-2.989X+20.05
r2=0.999 Ef: 2.164
Log cDNA input
Ct
Ciclina D
-6 -5 -4 -3 -2 -1 020
25
30
35
40
y=-3.013X+20.68
r2=0.984 Ef: 2.15
Log cDNA input
Ct
VEGF
-5 -4 -3 -2 -1 020
25
30
35
40
y=-2.894X+23.30
r2=0.996 Ef: 2.22
Log cDNA input
Ct
