EVALUACIÓN DEL GRADO DE CONTAMINACIÓN POR PESTICID AS ORGANOFOSFORADOS, DE LA CUENCA DEL RIO OTÚN,

DEPARTAMENTO DE RISARALDA.

ANGELA CRISTINA CARDONA LONDOÑO LUISA FERNANDA GIRALDO TAMAYO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA 2008

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EVALUACIÓN DEL GRADO DE CONTAMINACIÓN POR PESTICIDA S ORGANOFOSFORADOS, DE LA CUENCA DEL RIO OTÚN,

DEPARTAMENTO DE RISARALDA.

TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico

Este trabajo hace parte del proyecto 9-07-06 EVALUACIÓN DEL GRADO DE CONTAMINACIÓN POR PESTICIDAS ORGANOCLORADOS Y ORGANOFOSFORADOS, DE LA CUENCA DEL RIO OTÚN, DEPARTAMENTO DE RISARALDA, MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A MASAS. Que fue aprobado por el comité central de investigación de la Universidad Tecnológica de Pereira

Presentado por:

ANGELA CRISTINA CARDONA LONDOÑO LUISA FERNANDA GIRALDO TAMAYO

Director

JUAN PABLO ARRUBLA VÉLEZ

Asesor

CARLOS HUMBERTO MONTOYA NAVARRETE

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA 2008

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NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

EVALUACIÓN DEL GRADO DE CONTAMINACIÓN POR PESTICIDA S

ORGANOFOSFORADOS DE LA CUENCA DEL RIO OTÚN, DEPARTAMENTO DE RISARALDA.

Presentado por:

ANGELA CRISTINA CARDONA LONDOÑO

LUISA FERNANDA GIRALDO TAMAYO

Los suscritos director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar: La nota de ______________________ Con la connotación: ______________________ Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy _________________________________. El director: _________________________________ Juan Pablo Arrubla Vélez Jurado: ________________________________ Nombre: Jurado:______________________________ Nombre:

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Dedicatoria A DIOS. Por darme la vida y la oportunidad de cumplir uno a uno mis sueños, por regalarme una familia maravillosa que son lo que mas amo en mi vida. A mi mamá María Cristina. Por estar siempre a mi lado apoyándome, dándome todo su amor y comprensión, por darme sus sabios consejos y dedicar gran parte de su vida a mis hermanos y a mí, enseñándonos a ser personas de bien y a luchar por nuestros sueños. Por ser mí amiga incondicional. Mami te quiero mucho. A mi papá Arturo por darme su apoyo incondicional, por creer en mí y estar siempre a mi lado. A mis hermanitos Arturo y Gina a los cuales adoro que siempre me han regalado todo su cariño. A mis amiguis Lina C, Cata, Alexa, Moni, Marce, Yorlady, Naty, Linis, Luisa F y a todas las personas que compartieron conmigo esos momentos tan lindos en la U, siempre los llevaré en mi corazón.

Angela Cristina Cardona Londoño.

A Dios: Por darme la vida y las fuerzas necesarias para seguir siempre adelante, pero sobre todo por acompañarme y ser la luz de mi camino. A mi super abue Maria Oliva: por ser mi gran apoyo, el ser mas maravilloso e importante en mi vida, por enseñarme todos los principios morales que me hacen ser lo que soy, por estar conmigo siempre y brindarme tu amor pero también por enseñarme que en esta vida las cosas se hacen con amor y se lucha para alcanzar los sueños, y que estos siempre son posibles si se quieren con el corazón. A mi tío pepe Gilberto: por creer en mi ya que de no ser por eso yo no estaría aquí. Gracias por no dejarme nunca sola y por apoyarme en todas mis decisiones. Pero lo más importante por ser ese padre incondicional para mi y mis hermanos. Eres el mejor del mundo. A mi papá Guillermo y mi mamá Gloria: por darme la oportunidad de existir porque gracias al amor que un día los unió es que ahora estoy aquí, y porque de ambos tengo algo que me hacen ser única. A mi hermana moni y mis hermanitos juanchito y sofí: A moni por estar siempre conmigo, por ser mas que mi hermana ser mi amiga y mi confidente. A sofi y juanchito por ser un motivo más para luchar en mi vida, los amo. A don Henando Maneny Dany Lauris y mi More: gracias por abrirme las puertas de sus corazones y convertirme en una miembro mas de la familia Alzate Bedoya, por acompañarme durante el transcurso de mi carrera y brindarme su apoyo incondicional. A mis amiguitas cata one, tim, lina, morochita y marce: por ser tan lindas conmigo. Luisa Fernanda Giraldo Tamayo

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Agradecimientos

• Agradecemos a nuestras familias por el apoyo y el amor incondicional, que nos han brindado durante el transcurso y culminación de nuestra carrera haciendo posible el cumplimiento de una de nuestras metas.

• Agradecemos a la empresa de Acueducto y Alcantarillado “Aguas y Aguas de

Pereira” en especial a los ingenieros Nancy Henao y Adalberto Arroyave por su valiosa colaboración en el desarrollo del proyecto.

• Agradecemos al profesor José Hipólito Isaza, por permitirnos utilizar el

cromatógrafo de gases del laboratorio de CPN, y a Hugo encargado de la operación de este equipo, por su disponibilidad y colaboración en el manejo de este.

• Agradecemos a nuestro Director Juan Pablo Arrubla y a nuestro asesor Carlos

Humberto Montoya por el apoyo para la realización de este trabajo.

• Agradecemos a nuestros queridos profesores de la escuela de química por los conocimientos aportados durante todo el transcurso de nuestra carrera.

• Agradecemos a nuestros amigos por hacer más agradable nuestra estadía en la

universidad y compartir con nosotros esta etapa de la vida.

• Agradecemos al laboratorio de Aguas y Alimentos de la universidad tecnológica de Pereira por permitirnos utilizar sus instalaciones para el desarrollo de nuestro proyecto y al profesor Ariel Felipe Arcila por la colaboración y acompañamiento brindado.

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TABLA DE CONTENIDO

Pág ÍNDICE DE TABLAS 10 ÍNDICE DE FIGURAS 11 RESUMEN 13 INTRODUCCIÓN 14 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 16 1.2 OBJETIVOS 17 1.3 JUSTIFICACIÓN 18 2. MARCO TEÓRICO 19 2.1. RÍO OTÚN 19 2.2. LOS PLAGUICIDAS 20

2.2.1 Clasificación de los pesticidas 20

2.2.2 Plaguicida prohibido 20 2.2.3 Plaguicida rigurosamente restringido 20 2.2.4 Riesgos causados por plaguicidas 21 2.2.5 Categorización de los plaguicidas 21 2.2.6 Pesticidas Organofosforados 21 2.2.6.1 Usos de los pesticidas organofosforados 22 2.2.6.2 Toxicología 22 2.2.6.3 Señales y Síntomas de Envenenamiento 23 2.3 MÉTODOS ANALÍTICOS EMPLEADOS 27 PARA LA DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS. 2.3.1 Cromatografía de gases 27 2.3.1.1 Instrumentos para la cromatografía gas- líquido 27 2.3.1.2 Gas portador 27

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2.3.1.3 Sistema de inyección de la muestra 28 2.3.1.4 Configuración de la columna y del horno para la columna 28 2.3.1.5 Sistema de detección 29 2.3.1.6 Análisis cualitativo 29 2.3.1.7 Análisis cuantitativo 29 2.3.2 Espectrometría de masas 30 2.3.2.1 Impacto electrónico (IE) 30 2.3.2.2 Ion molecular 31 2.3.3. Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (CG/EM). 31 2.4 CALIBRACIÓN 33 2.4.1. Exactitud 33 2.4.2 La linealidad 33 2.4.3 El rango lineal 33 2.4.4 Precisión 34 2.4.5 Límite de cuantificación 34 2.4.6 Limite de detección 34 2.5 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN 35 2.5.1 Extracción líquido-líquido 35 2.6 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN LÍQUIDO-SÓLIDO. 36 2.7 INTERFERENCIAS EN EL ANÁLISIS DE PESTICIDAS. 36

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL 37

3.1 EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA DE EXTRACCIÓN 37

3.1.1 Extracción líquido-líquido. 37

3.1.1.2 Extracción líquido-líquido continuo empleando concentrador 37 Kuderna-Danish.

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3.1.1.3 Extracción líquido-líquido por etapas con acetonitrilo. 37 3.2 CALIBRACIÓN DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA 38 DE GASES ACOLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS. 3.2.1 Estándar 40 3.2.2 Scan. 40 3.2.2.1 Condiciones para la realización del scan por IE 40 3.2.3 Elaboración de curva de calibración 41 3.3 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE AGUA 42 3.3.1 MUESTREO 42 3.3.2 Conservación de las muestras. 42 3.3.3 Descripción de los puntos de muestreo. 42 3.3.3.1 El Cedral 42 3.3.3.2 Antes del río Barbo 43 3.3.3.3 Después del río Barbo 43 3.3.3.4 Después del río San Juan 44 3.3.3.5 La Bananera 44 3.3.3.6 Bocatoma 45 3.3.3.7 Después de Quebrada Dosquebradas. 45 3.3.4 Extracción líquido- sólido 46 4. RESULTADOS Y DISCUCIONES. 48 4.1 SCAN. 48 4.2 CALIBRACIÓN 51 4.3 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO 55 4.4 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EVALUADOS 57 4.4.1 Extracción líquido-líquido continuo empleando concentrador 57 Kuderna-Danish.

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4.4.2 Extracción líquido-líquido por etapas con acetonitrilo. 58 4.5 MUESTREO 60 4.5.1 Mediciones en los puntos de muestreo. 60 4.5.2 Determinaciones y resultados fisicoquímicos de 61 Algunas estaciones de muestreo. 4.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS REALES 62 4.6.1 Determinación de los pesticidas en las muestras de agua recolectadas. 63 4.6.2 Determinación de los pesticidas en las muestras de sedimentos. 65 5. CONCLUSIONES 67 6. RECOMENDACIONES. 69 7. BIBLIOGRAFÍA 70 8. ANEXOS 75

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ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla No. 1 Usos de algunos pesticidas organofosforados 23

Tabla No. 2 Pesticidas organofosforados de la mezcla RESTEK catalogo 24 Nº 32277 Tabla No. 3 Composición de la mezcla de pesticidas 40 marca RESTEK catalogo Nº 32277

Tabla No. 4 Compuestos identificados por el scan por impacto electrónico. 49

Tabla No. 5 Patrones para la curva de calibración 51 de pesticidas organofosforados marca RESTEK catalogo Nº 32277

Tabla No. 6 Datos estadísticos para la calibración por IE 56

Tabla No. 7 Porcentajes de recuperación para el método de extracción 57 Líquido –líquido continúa con diclorometano empleando Concentrador Kuderna-Danish.

Tabla No. 8 Porcentajes de recuperación para el método de extracción 58 líquido –líquido por etapas con acetonitrilo. Tabla No. 9 Parámetros fisicoquímicos determinados en algunas estaciones 62 del río Otún Tabla No. 10 Resultados obtenidos en el total de los muestreos realizados en 63 la cuenca del Río Otún. Tabla No. 11 Resultados obtenidos en el muestreo realizado para sedimentos 65

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ÍNDICE DE FIGURAS

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Figura No. 1 Agricultor rociando los cultivos de cebolla larga 19 con pesticidas en el sector de la florida. Figura No. 2 Representación esquemática de un cromatógrafo de gases 28 Figura No. 3 Partes básicas de un espectrómetro de masas 30 Figura No. 4 Esquema de un cromatógrafo de gases de columna 31 abierta/espectrómetro de masas. Figura No. 5 Extractor líquido-líquido continuo 38 Figura No. 6 Concentrador de Kuderna-Danish 38 Figura No. 7 Diagrama de extracción líquido- líquido por etapas con acetonitilo 39 Figura No. 8 Programación del horno para el análisis cromatográfico por 41 impacto electrónico. Figura No. 9 Estación de muestreo el Cedral 43 Figura No. 10 Estación de muestreo antes del río Barbo 43 Figura No. 11 Estación de muestreo después del río Barbo 44 Figura No. 12 Estación de muestreo después del río San Juan 44 Figura No. 13 Estación de muestreo la Bananera 45 Figura No. 14 Estación de muestreo Bocatoma 45 Figura No. 15 Estación de muestreo después de quebrada Dosquebradas 46 Figura No. 16 Diagrama de extracción sólido- líquido con acetonitilo 47 para sedimentos Figura No. 17 Cromatograma total obtenido del patrón de 2 µg/mL por 48 el método de IE Figura No. 18 Espectro de masas obtenido para el pesticida 49 organofosforado methyl parathion. Figura No. 19 Diagrama de fragmentación para el pesticida 50

organofosforado methyl parathion

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Figura No. 20 Curvas de calibración para los compuestos presentes 51 en la mezcla estándar.

Figura No. 21 Gráfica del pH frente a los puntos de muestreo 60 seleccionados de la cuenca del río Otún Figura No. 22 Gráfica de la temperatura frente a los puntos de muestreo 61 seleccionados de la cuenca del río Otún

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RESUMEN

El uso intensivo de pesticidas empezó con el desarrollo masivo de la agricultura y la agroindustria, una parte de la gran familia de los pesticidas la constituyen los organofosforados siendo estos los que con mayor facilidad se degradan en el medio ambiente con relación a los pesticidas organoclorados. Este trabajo tuvo como propósito evaluar el grado de contaminación por pesticidas organofosforados presentes en la cuenca del río Otún ubicado en el departamento de Risaralda. Se realizaron muestreos puntuales en siete puntos del Río en un periodo comprendido entre el 22 de noviembre del 2007 y el 30 de julio del 2008. Para el tratamiento de las muestras se evaluaron dos metodologías de extracción; una líquido-líquido continuo empleando diclorometano y una líquido-líquido por etapas con el empleo de acetonitrilo. Para el análisis cuantitativo se realizó la calibración de la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Los resultados mostraron porcentajes de recuperación entre el 72.30-124.35% para los pesticidas Ethoprophos, Demetón-o, Diazinon, Disulfostón, Methyl Parathión, Ronnel, Chlorpyrifos, Fenthión, Tricloronat, Tokutión (Prothiofos), Fensulfothión, Bolstar (Sulprofos), Coumaphos. En los muestreos realizados sólo se determinó la presencia del pesticida chlorpyrifos el realizado el día 1 de julio de 2008 en las estaciones de muestreo antes del río Barbo, después del río Barbo, después del río San Juan, la Bananera, Bocatoma y después de Quebrada Dosquebradas en concentraciones de (0.003, 0.004, 0.008, 0.009, 0.008, 0.010) ppm, respectivamente. Estos valores se encuentran dentro del nivel máximo permitido para pesticidas organofosforados estipulado en el artículo 45 del decreto 1594 de 1984.

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INTRODUCCIÓN

El uso de plaguicidas en zonas cercanas a cuerpos de agua, establece la necesidad de realizar análisis de estas sustancias a bajos niveles de concentración para determinar si se encuentran en los rangos establecidos por los organismos de protección ambiental. La contaminación de aguas naturales por residuos de plaguicidas organofosforados puede perturbar el balance de los sistemas ecológicos. El río Otún reviste gran importancia para el municipio de Pereira, ya que desde 1936 se ha constituido en la única fuente abastecedora de agua para su acueducto. Aproximadamente medio millón de habitantes de la ciudad de Pereira y parte de Dosquebradas, es abastecido de agua potable proveniente del río Otún; presentándose una demanda creciente del recurso, a raíz del acelerado crecimiento de estas dos ciudades [1]. El incremento constante de la población mundial requiere de una producción muy elevada de alimentos, por lo que la protección de cultivos contra el ataque de parásitos y de otros agentes biológicos es más que necesaria. El empleo de plaguicidas en la agricultura es imprescindible para mejorar su potencial económico, permitiendo la protección de los cultivos en áreas en las que no sería posible, aumentando el periodo de desarrollo de las plantas, incrementando el periodo de almacenamiento post-cosecha, reduciendo los costos de producción de los alimentos y disminuyendo el riesgo de aparición de plagas (FAO 2003) [2]. En la cuenca hidrográfica del río Otún se presentan prácticas agrícolas donde las actividades económicas predominantes en el área son el cultivo de la cebolla larga (Allium fistulosum), de café (Coffea) y el establecimiento de un importante número de granjas avícolas y porcícolas [1]. Esto genera el consumo de pesticidas por parte de los agricultores como una defensa frente a los factores que puedan impedir el desarrollo de sus cultivos. Estos pesticidas podrían llegar a las aguas superficiales del Río por medio del viento, aguas de escorrentía, o por medio de personas que arrojen desechos contaminados con estas sustancias. Los plaguicidas se introdujeron después de la Segunda Guerra Mundial para sus diversos beneficios, pero en general en todo el mundo su uso intensivo ahora plantea peligros potenciales para el medio ambiente y la salud humana. En un intento de sustituir los plaguicidas organoclorados los cuales presentan una alta persistencia en el medio ambiente, sectores agrícolas han pasado a emplear plaguicidas organofosforados, sin embargo, los plaguicidas organofosforados son en general mucho más tóxicos para los vertebrados en comparación con otras clases de insecticidas a pesar de que se degradan rápidamente en el medio ambiente. El uso de estos plaguicidas ha provocado gran preocupación en la comunidad científica sobre los posibles efectos tóxicos de estos tanto a la flora y la fauna acuática, así como a los seres humanos [3]. Existe un marco normativo expedido por el ministerio de salud, el decreto Nº 1594 del 26 de junio de 1984, en el cual, en el artículo 20 los pesticidas organofosforados son

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considerados sustancias de interés sanitario. En el artículo 38 donde se establecen los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para tratamiento convencional no está especificada la concentración permitida para estos pesticidas. Por esta razón se toma como referencia el articulo 45 donde están asignados los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para preservación de flora y fauna, en aguas dulces, frías o cálidas y en aguas marinas o estuarinas, en el cual el valor permitido para pesticidas organofosforados expresado como concentración de agente activo (cada sustancia) es de 0.05 CL96

50. En este trabajo se pretendió contribuir a evaluar la calidad en la que se encuentran las aguas de la cuenca del Río Otún con respecto a este parámetro [4]. El agua del río Otún es la fuente de captación para las plantas potabilizadoras de agua de los municipios de Pereira y Dosquebradas, en este sentido el presente trabajo pretende contribuir a estimar la concentración de los pesticidas organofosforados que en su determinado momento puedan ser factor de riesgo para la población consumidora del agua, para lo cual, en la República de Colombia, la resolución 2115 de 2007 define los valores máximos permitidos de estos pesticidas en el agua tratada.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la actualidad, sectores de la comunidad mundial como la Organización de las Naciones Unidas (ONU), Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Agencia de Protección Ambiental (EPA) están interesados en la preservación de medio ambiente y en especial del recurso agua. En el departamento de Risaralda organizaciones como la CARDER, Aguas y Aguas de Pereira y la Contraloría General de Risaralda han llevado acabo estudios y análisis para preservar este recurso [5]. Un aspecto importante en este sentido, es la cuantificación del grado de contaminación en las fuentes de agua, con pesticidas organofosforados, ya que éstos son los insecticidas más utilizados para el control de plagas en los cultivos, tanto a nivel internacional, como en nuestro país. Junto con los carbamatos y bipiridilos, son los más frecuentemente involucrados en intoxicaciones en todo el mundo. Los organofosforados pueden afectar seriamente la salud humana provocando daños en el sistema nervioso de las personas expuestas a ellos [6]. Debido a que en la cuenca del Río Otún hay cultivos a los que se le aplican estas sustancias, existe la posibilidad de que estos se encuentren presentes en las aguas. No hay certeza del grado de contaminación por pesticidas organofosforados en la cuenca del río Otún porque no existe información ni estudios actualizados acerca de esta problemática. Los resultados presentados en la siguiente investigación constituyen un aporte de la Universidad Tecnológica de Pereira, donde se diagnostica el estado de contaminación por pesticidas organofosforados del Río para las entidades de control y protección del medio ambiente; las cuales podrán llevar a cabo capacitaciones para las personas de la zona que se encuentran en contacto con estos pesticidas y así evitar que este recurso hídrico se encuentre en un futuro, seriamente contaminado.

Aparentemente son muchos los beneficios económicos que con frecuencia sustentan el uso de pesticidas, sin tener en cuenta los desastres ecológicos y humanos que se están generando, como el deterioro ambiental y la disminución drástica en la biodiversidad. Es preocupante el uso y abuso en la aplicación de pesticidas e insecticidas en todas las zonas agrícolas y ganaderas del país [7].

En la zona seleccionada para llevar a cabo el muestreo, en la cuenca hidrográfica del Río Otún se presentan prácticas agrícolas de envergadura, donde los principales cultivos son de cebolla larga (Allium fistulosum), de café (Coffea) y otros menores como la habichuela o algunas hortalizas. Esto obliga al uso intensivo de agroquímicos y pesticidas, prácticas que pueden modificar la calidad de las aguas superficiales [1,8].

En 1987 la CARDER, emitió el acuerdo número 036 por medio del cual se presenta el interés de la entidad por la dinámica antrópica en la cuenca del Río Otún y en la cual se encuentra localizada la bocatoma del acueducto para los municipios de Pereira y Dosquebradas. Se han realizado monitoreos anteriores de carácter fisicoquímico y bacteriológico, los cuales motivaron a la institución para abordar la problemática de los agroquímicos cuya utilización es para todos conocida en dicha zona [9].

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1.2 OBJETIVOS Objetivo General Evaluar el grado de contaminación por pesticidas organofosforados, en la cuenca del río Otún, ubicado en el departamento de Risaralda, mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas Objetivos Específicos Calibrar la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para la mezcla de pesticidas organofosforados catalogo #32277 marca Restek. Evaluar métodos de extracción líquido-líquido y adaptar el mejor para una mezcla de 21 pesticidas organofosforados.

Cuantificar los pesticidas organofosforados en las muestras de agua del río Otún, y comparar estos resultados con el decreto Nº 1594 del 26 de junio de 1984 expedido por el ministerio de salud. Complementar la batería de análisis realizados en la cuenca del río Otún y presentar un diagnostico actual del grado de contaminación por pesticidas organofosforados.

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1.3 JUSTIFICACIÓN

En la actualidad el uso de pesticidas organofosforados es muy común para el control de plagas y enfermedades que afectan a los cultivos utilizados en ciertos casos de manera indiscriminada y con falta de conocimiento del tema por parte del manipulador, pudiéndose convertir en una fuente clara de contaminación para las aguas del río Otún, ya que en zonas aledañas a la cuenca, los agricultores utilizan estos agroquímicos en sus cultivos, como una defensa frente a los factores que puedan impedir su desarrollo[9]. Estos pesticidas podrían llegar a las aguas superficiales del Río por medio del viento, aguas de escorrentía, o por medio de personas que arrojen los desechos contaminados con estas sustancias [8]. Por desgracia los beneficios aportados por los pesticidas organofosforados han ido acompañados por una serie de perjuicios que ahora representan una amenaza para la supervivencia a largo plazo de algunos ecosistemas, como alteraciones en la biodiversidad. Según estudios realizados en Suecia, la aplicación de plaguicidas es uno de los factores que mas influyen en la biodiversidad ya que tienen el efecto de reducir el hábitat, disminuir el número de especies de malas hierbas y desplazar el equilibrio de especies en la comunidad vegetal [5]. Es de gran importancia conocer el estado en que se encuentran las aguas del Río Otún y evaluar sus condiciones de calidad porque éstas posteriormente son empleadas para el consumo humano en las ciudades de Pereira y Dosquebradas. Los análisis de las muestras de agua recolectadas fueron realizados en el laboratorio de Aguas y alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira empleando métodos analíticos y buscando un método de extracción líquido-líquido efectivo, posteriormente se realizó el análisis cuantitativo empleando la técnica analítica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. El decreto 1594 del 26 de junio de 1984 que actualmente rige en Colombia presenta restricciones en cuanto a las cantidades presentes en el agua para los pesticidas organofosforados. En el artículo 20, estos pesticidas son considerados sustancias de interés sanitario y en el artículo 45 del mismo decreto el valor permitido para estos pesticidas expresado como concentración de agente activo (cada variedad) es de 0.05 CL96

50 [4]. En este momento no existen registros actualizados que permitan verificar su cumplimiento en la cuenca del río Otún. Por tal razón este proyecto constituye un apoyo para las entidades encargadas de proteger el medio ambiente en el departamento, como la CARDER y Aguas y Aguas de Pereira, para evaluar la calidad en la que se encuentran las aguas de la cuenca del Río Otún con respecto a este parámetro. Este trabajo a su vez es parte fundamental en la formación profesional de las personas implicadas en el proyecto brindándoles la posibilidad de adquirir conocimientos en la investigación, muestreos, análisis de laboratorio e instrumental, además de fortalecer la sinergia de la universidad y el sector público y privado para la solución de un problema puntual de impacto social.

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2. MARCO TEÓRICO.

Para comprender mejor el contenido del trabajo de grado es necesario dar a conocer los siguientes conceptos que se citan a continuación. 2.1 Río Otún El río Otún, lugar donde se llevó acabo el muestreo para evaluar el grado de contaminación por pesticidas organofosforados, nace en la laguna del Otún, jurisdicción del Parque Nacional Natural de los Nevados en los municipios de Pereira y Santa Rosa de Cabal, a 3950 m.s.n.m. y, tras un recorrido de casi 67 Km, desemboca al río Cauca, en el caserío “Estación Pereira”, jurisdicción del municipio de Marsella, a una altura de 900 m.s.n.m. aproximadamente [10]. En el anexo 1 puede observarse un mapa de la cuenca del Río Otún.

Aproximadamente medio millón de habitantes de la ciudad de Pereira y parte de Dosquebradas, es abastecido de agua potable proveniente del río Otún; presentándose una demanda creciente del recurso, a raíz del acelerado crecimiento de estas dos ciudades. La Empresa de Acueducto y Alcantarillado de Pereira – EAAP- capta del río Otún un caudal equivalente a 1.8 m3/s, en el sitio conocido como Nuevo Libaré, ubicado en la vereda El Porvenir. Desde la vereda San José hasta la vereda La Florida (incluida) se ha delimitado la cuenca media del río Otún. En esta zona se presentan la mayor dinámica socioeconómica y densidad de población de la región comprendida entre el punto de captación y el nacimiento del río Otún (parte alta). Las actividades económicas predominantes en el área son el cultivo de la cebolla larga (Allium fistulosum), de café (Coffea) y el establecimiento de un importante número de granjas avícolas y porcícolas [1]. Como una defensa frente a factores que puedan impedir el desarrollo de los cultivos los agricultores de la zona hacen uso de los plaguicidas. En la figura 1 puede observarse como un agricultor rocía sus cultivos de cebolla con estos agroquímicos en el sector de la florida.

Figura 1. Agricultor rociando los cultivos de cebolla larga con pesticidas en el sector de la florida.

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2.2 Los plaguicidas. Son sustancias o mezcla de sustancias químicas de origen organosintético, de naturaleza tóxica y por consiguiente con un alto poder para alterar en forma drástica la fisiología de los organismos. Se utilizan en las actividades agrícolas como medio de control para enfermedades, plagas y malezas. Normalmente, la acción del plaguicida no es específica para la especie objetivo y en consecuencia se producen efectos de diferentes magnitudes sobre otras especies y sobre los ámbitos expuestos a su acción [11]. Los plaguicidas son productos de síntesis donde, además del principio activo, se encuentran impurezas, emulsificantes, solventes y aditivos de toxicidad no despreciable. Debido a su toxicidad intrínseca, mas no a su selectividad, los plaguicidas pueden poner en riesgo el medio ambiente, organismos no blanco y causar lesiones agudas y crónicas en la salud humana [6]. 2.2.1 Clasificación de los pesticidas. La agencia de Protección del Medio Ambiente (EPA) clasifica todos los pesticidas con respecto a su uso, en pesticidas de uso general o de uso restringido.

La clasificación de uso general se aplica a pesticidas que generalmente no causarán efectos adversos no razonables al medio ambiente. Una clasificación de uso restringido se aplica a pesticidas que generalmente pueden causar, sin restricciones reglamentarias adicionales, efectos adversos no razonables sobre el medio ambiente, incluyendo daño al aplicador. Los pesticidas a los cuales se les asigna la clasificación de restringido solo podrán ser aplicados por o bajo la supervisión directa de un aplicador certificado. Como resultado, la clasificación de un pesticida tiene un impacto significativo sobre el eventual mercadeo del producto. Es importante notar que la clasificación de un pesticida se aplica a la formulación etiquetada (o uso de etiqueta) de un pesticida y no necesariamente al ingrediente activo del producto pesticida [12].

2.2.2 Plaguicida prohibido. Plaguicida del que se han prohibido todos los usos mediante una medida definitiva de reglamentación, con el fin de proteger la salud humana o el ambiente. El termino comprende todo plaguicida que no haya sido aprobado para utilizarse por primera vez o que la industria haya retirado del mercado interno de examen ulterior en el proceso nacional de aprobación, cuando haya pruebas claras de que esta medida se ha adoptado con objeto de proteger la salud humana o el ambiente [11]. 2.2.3 Plaguicida rigurosamente restringido. Todo plaguicida del que para proteger la salud humana o el ambiente, se han prohibido prácticamente todos los usos mediante una medida definitiva de reglamentación, pero siguen autorizándose ciertos usos específicos. Comprende todo plaguicida al que prácticamente para todos los usos se haya negado la aprobación o que la industria haya retirado ya sea del mercado interno o de consideración ulterior o en el proceso nacional de aprobación cuando existan pruebas claras de que esta medida se ha adoptado para proteger la salud o el ambiente [11].

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2.2.4 Riesgos causados por plaguicidas Son la probabilidad de que un plaguicida cause un daño o efecto adverso por la utilización agrícola en las condiciones de uso. Normalmente se consideran dos aspectos: el riego para la salud humana y el riesgo ecológico. Se puede afirmar que el uso de plaguicidas siempre constituye un riego tanto para la salud humana como para el medio ecológico. En relación con plaguicidas, el riesgo se puede estimar mediante la determinación de dos factores: La toxicidad del compuesto y la exposición a dicho compuesto tóxico [11]. 2.2.5 Categorización de los plaguicidas Los plaguicidas se dividen en cuatro categorías, de acuerdo con su grado de toxicidad, clasificación elaborada por la FAO y la OMS y avalada por el Ministerio de la Protección Social así: [11]. I- Extremadamente tóxico II- Altamente tóxico III- Medianamente tóxico IV- Ligeramente tóxico. Este trabajo se centra en los pesticidas organofosforados que en la actualidad son altamente empleados en el sector agrícola sustituyendo a los pesticidas organoclorados los cuales presentan una alta resistencia en el medio ambiente [3]. 2.2.6 Pesticidas Organofosforados Desde la remoción de los insecticidas de cloruros orgánicos, los insecticidas organofosforados se han convertido en los insecticidas de mayor uso en la actualidad. Actualmente, más de cuarenta de ellos están registrados para uso, y todos corren el riesgo de toxicidad aguda y subaguda. Los organofosforados son utilizados en la agricultura, en el hogar, en los jardines y en la práctica veterinaria [13].

Los pesticidas organofosforados constituyen un amplísimo grupo de compuestos de síntesis, en general altamente tóxicos, con un precedente en los gases de guerra, a menudo conocidos bajo el apelativo de ‘gases nerviosos’. Las propiedades de estos compuestos como insecticidas fueron el motivo de que ya en 1959 se hubieran sintetizado alrededor de 50.000, al revelarse como útiles elementos de lucha contra las plagas de insectos, por lo que forman parte, como ingredientes activos, de muchos formulados comerciales (en los que se integran distintos componentes, para obtener una mayor eficacia del ingrediente activo) [14].

Se trata de compuestos, en general, marcadamente apolares, lo que significa que desde el punto de vista químico la mayoría son escasamente solubles en agua, aunque con grandes diferencias de un compuesto a otro, y desde el punto de vista biológico tienden a disolverse en grasas. Por tal motivo, la piel, donde se encuentra una importante capa de tejido con elevado contenido en lípidos, puede constituirse en una importante vía de entrada. La estabilidad de los organofosforados depende del pH del medio; a pH fuertemente alcalino se descomponen, lo que puede ser utilizado para destruirlos [14].

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La fórmula estructural general de estos compuestos, que se caracterizan por la presencia de (en general) tres funciones éster, es la siguiente:

En la que R1 y R2 son radicales alquilo, generalmente metilo o etilo, el grupo X es característico de cada especie química, siendo frecuentemente un radical arilo, y suele contribuir de forma importante a sus propiedades físicas, químicas y biológicas. A tenor de los elementos concretos que ocupen determinadas posiciones en la molécula, los organofosforados se pueden dividir en 14 grupos, de los que los más importantes son:

Fosfatos, con un O en las posiciones (1) y (2).

O-fosforotioatos (o tionatos), con un S en (1) y un O en (2).

S-fosfortioatos (o tiolatos), con un S en (2) y un O en (1)

Fosforoditioatos (o tiolotionatos), con un S en (1) y en (2)

Fosfonatos, con R1 (en lugar de R1O), O o bien S en (1) y O en (2), y

Fosforoamidatos, con un O en (1) y un N en (2)

2.2.6.1 Usos de los pesticidas organofosforados Se utilizan como insecticidas, nematicidas, herbicidas, fungicidas, plastificantes y fluidos hidráulicos (en la industria). Son utilizados como armas químicas, Y también de uso domestico. Los insecticidas de uso doméstico que contienen compuestos organofosforados vienen en concentraciones muy bajas, generalmente del orden del 0.5% - 5%. Se presentan generalmente en forma de aerosoles y cintas repelentes. Por otro lado los compuestos de uso agrícola están formulados a altas concentraciones que varían desde 20% - 70% del principio activo. Su presentación más frecuente es en líquido con diferentes tipos de solventes, generalmente hidrocarburos derivados del petróleo como tolueno, xileno, esto favorece la absorción del principio activo. Estas presentaciones reciben el nombre de concentrados emulsionables. Existen además presentaciones sólidas en forma de polvos, polvos humectables, gránulos, que son menos tóxicas por la forma de presentación dada la menor absorción [15]. En la tabla 1 se muestra algunos pesticidas organofosforados y sus usos. 2.2.6.2 Toxicología La toxicidad real por vía dérmica depende de la rapidez con que el ingrediente activo sea capaz de alcanzar la circulación general y de la toxicidad inherente al propio producto. Algunos ingredientes activos se absorben escasamente por esta vía (menos del 1%),

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mientras otros atraviesan fácilmente la barrera dérmica y la absorción es prácticamente total. La toxicidad aguda por vía dérmica se evalúa mediante la determinación experimental de la DL50: dosis letal media, es decir, la dosis (mg/kg de peso del animal) que causa la muerte del 50 % de los animales a los que se les ha administrado por aplicación sobre la piel [14]. Tabla 1. Usos de algunos pesticidas organofosforados.

Nombre común Nombre comercial Usos Diclorvos Lainsec, Vapona Insecticida usado para

controlar insectos principalmente en áreas de almacenaje y en graneros.

Mevinphos Phosdrin Es utilizado para el combate de plagas agrícolas.

Demetón-s-metil Systox Utilizado para combatir ácaros, como la araña roja o el pulgón lanígero.

Coumaphos Asuntol Uso pecuario es un excelente garrapaticida

Phorate· Thimet Uso agrícola Metil Paratión Folidol-M, Metacide Es utilizado para la

protección de los cultivos contra insectos chupadores y masticadores.

Diazinón Fentoato Basudin, Diacide, Diazil Cidial,Taonone

Es utilizado para el control de muchas plagas del suelo pero no es tan efectivo sobre los crisomélidos con la excepción de la conchuela (Epilachna). Es altamente tóxico a las abejas.

Disulfotón Basudin Usado como pesticida para controlar una variedad de pestes dañinas que atacan sembrados y cosechas de hortalizas.

Clorpirifos Dursban, Lorsban En agricultura, se usa para controlar garrapatas en ganado y en forma de rocío para el control de plagas de cosechas.

2.2.6.3 Señales y Síntomas de Envenenamiento Los síntomas del envenenamiento agudo por organofosforados aparecen durante la exposición a ellos, en pocos minutos u horas, dependiendo del método de contacto. La

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exposición por inhalación resulta en la aparición más rápida de síntomas tóxicos, seguida por la ruta gastrointestinal y finalmente por la ruta dérmica. Todos los síntomas y señales son colinérgicos en naturaleza y afectan los receptores muscarínicos, nicotínicos y del sistema nervioso central. Los síntomas críticos en el tratamiento son los síntomas respiratorios [13]. El alto grado de toxicidad de los compuestos organofosforados en los mamíferos, se debe a la fosforilación del ingrediente activo y la consecuente inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (AChE), que favorece la desactivación de la acetilcolina en el sistema nervioso. La inhibición de la AChE en sangre, cerebro y otros tejidos causa una excesiva estimulación de los receptores muscarínicos y nicotínicos del sistema nervioso y, como consecuencia de la acumulación de la acetilcolina a nivel de sinapsis colinérgica, causa varios efectos farmacológicos que culminan con la muerte por paro respiratorio [6]. En la tabla 2 se presenta una lista de los pesticidas organofosforados (Catalogo #32277 Restek,), con su estructura química, respectiva categoría toxicológica y solubilidad en agua. Estos fueron empleados para el análisis en los puntos de muestreo seleccionados de la cuenca del Río Otún. [17,18]

Tabla 2. Pesticidas organofosforados de la mezcla RESTEK catalogo Nº 32277

Nombre del Pesticida

# CAS Estructura

Categoría toxicológica

Solubilidad en agua

(mg /L)

Diclorvos (DDVP)

62-73-7

I

10000 (20 ºC)

Mevinphos (Phosdrín)

7786-34-7

I 600000

(20 ºC)

Demeton-O

867-27-6

I

33 (20 ºC)

Ethoprophos

13194-48-4

I

700 (20 ºC)

Naled

300-76-5

I

2000 (20 ºC)

25

Phorate

298-02-2

I

50 (25 ºC)

Demeton-S

126-75-0

I

20 (20 ºC)

Diazinon

333-41-5

II

40 (25 ºC)

Disulfoton

298-04-4

I

25 (23 ºC)

Methyl parathion

298-00-0

I

55-60 (25 ºC)

Fenchlorphos (Ronnel)

299-843

I

44 (20 ºC)

Fenthion

55-38-9

II

2

( 20º C)

Chlorpyrifos (Dursban)

2921-88-2

II

2

(25 ºC)

Tricholoronat

327-98-0

I

50 (20 ºC)

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I- Extremadamente tóxico II- Altamente tóxico III- Medianamente tóxico IV- Ligeramente tóxico

Merphos

150-50-5

III

2.3 (20 ºC)

Stirofos (Tetrachlorvi

nphos)

961-11-5

I

11 (20 ºC)

Tokuthion (Prothiofos)

34643-46-4

II

0.07 (20º C)

Fensulfothion

115-90-2

I

1540 (20º C)

Bolstar ( Sulprofos)

35400-43-2

II

0.31

(20º C)

Azinphos methyl

(Guthion)

86-50-0

I

30 (25º C)

Coumaphos

56-72-4

I

1.5

(20º C)

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2.3 Métodos analíticos empleados para la determinación de pesticidas. Los plaguicidas suelen encontrarse a niveles traza en multitud de muestras, tanto biológicas como medioambientales, por lo que se requiere metodologías muy sensibles y selectivas para su determinación. El proceso de análisis es a menudo complicado y consta de varias etapas, siendo generalmente la última de ellas una determinación cromatográfica, gaseosa o líquida, con un detector adecuado. La efectividad de este análisis no depende únicamente del instrumento cromatográfico de medida, sino que es el resultado de todas las operaciones intermedias a las que se somete la muestra [18]. 2.3.1 Cromatografía de gases

En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elusión se produce por el flujo de una fase móvil, un gas inerte. Existen dos tipos de cromatografía gases- sólido (GSC), gas-liquido (GLC). La cromatografía gas liquido tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases (GC), a pesar de que este hecho deja a un lado la cromatografía gas-sólido como si no se tratase de un verdadero tipo de cromatografía [19].

2.3.1.1 Instrumentos para la cromatografía gas- líquido

Actualmente, más de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos distintos para la cromatografía de gases, con un coste que varia desde unos 15000 hasta 40000 dólares. En las ultimas dos décadas, los instrumentos de cromatografía que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras. En los años setenta, se hicieron habituales los integrados electrónicos y los equipos de procesado de datos basados en un ordenador. Los años ochenta introdujeron la utilización de ordenadores para el control automático de la mayoría de los parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la inyección de la muestra; el desarrollo de instrumentos de un muy alto rendimiento a un coste moderado; y tal vez lo mas importante, el desarrollo de las columnas abiertas que son capaces de separar una multitud de analitos en un tiempo relativamente corto. Los componentes básicos de un instrumento de cromatografía de gases se muestran en la figura 2.A continuación se da una descripción de estos. [19]. 2.3.1.2 Gas portador Entre los gases portadores, que deben ser químicamente inertes, se encuentran el Helio, el Nitrógeno y el Hidrogeno. Como se indicara posteriormente la elección de los gases está con frecuencia determinada por el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. Además, el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas [19].

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Figura 2. Representación esquemática de un cromatógrafo de gases. 2.3.1.3 Sistema de inyección de la muestra La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un (tapón) de vapor; la inyección lenta de muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una pobre resolución. El método mas común de inyección de muestras implica el uso de una microjeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o (Septum) de goma de silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara de muestra normalmente esta unos 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra). El tamaño de la muestra varía desde unas pocas décimas de microlitro a 20 µL las columnas capilares exigen muestras mucho menores (aproximadamente 1X10-3 µL); en estos casos se emplea un sistema divisor de la muestra que permite pasar a la cabeza de la columna solamente una pequeña fracción de la muestra, desechándose el resto [19]. 2.3.1.4 Configuración de la columna y del horno para la columna En cromatografía de gases se usan dos tipos de generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la mayor parte de cromatografía de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la actualidad esta situación esta cambiando rápidamente, y parece probable que en un futuro próximo, excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno serán sustituidas por las columnas abiertas, mas eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50m de longitud, o más. Están construidas con acero inoxidable, vidrio sílice fundida o teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un horno termostatizado, normalmente se configuran como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La temperatura de la columna es una variable importante, para un trabajo preciso se lleva a décimas de grado, por ello la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la

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practica con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elusión razonables (2 a 30 min) [19]. 2.3.1.5 Sistema de detección Durante el desarrollo de la cromatografía de gases se han investigado y utilizado docenas de detectores. En este caso el dispositivo espectrométrico sirve no solo para detectar la aparición de los picos de los analitos al final de la columna, sino también para identificarlos [19]. El detector ideal tiene las siguientes características: 1. Adecuada sensibilidad. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad. 3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios ordenes de magnitud. 4. Intervalos de temperatura de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 ºC. 5. Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. 7. Respuesta semejante para los solutos o por el contrario. 8. No destructivo para la muestra. El detector de ionización de llama (FID) es el detector mas extensamente utilizado, y por lo general, uno de los mas aplicables en cromatografía de gases [19]. 2.3.1.6 Análisis cualitativo Los cromatógramas de gases se utilizan a menudo como criterio de pureza de compuestos orgánicos. Los contaminantes si están presentes, se manifiestan por la aparición de picos adicionales; las áreas de estos picos proporcionan una estimación aproximada del grado de contaminación. La técnica también es útil para evaluar la efectividad de los procedimientos de purificación. No obstante, la cromatografía de gases es un medio excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrón. Tras la adición del compuesto conocido a la muestra, el cromatógrama no debe presentar ningún pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos ya existentes [19]. 2.3.1.7 Análisis cuantitativo La señal del detector de una columna cromatográfica gas-liquido se ha utilizado generalmente para análisis cuantitativos y semi-cuantitativos. En condiciones cuidadosamente controladas se puede alcanzar una exactitud (relativa) del 1 por 100.

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Con la mayoría de las técnicas analíticas, la fiabilidad se relacionan directamente con el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza de la muestra [19]. 2.3.2 Espectrometría de masas El conjunto de técnicas llamadas espectrometría de masas es uno de los más versátiles e importantes instrumentos de análisis químico. Su versatilidad se debe en parte al amplio abanico de posibilidades de cada una de las tres secciones de un espectrómetro de masas Las tres partes básicas son la fuente de ionización, el analizador y el transductor/detector, como se muestra en la figura 3. Con pocas excepciones, un espectrómetro completo se mantiene a una presión de entre 1X10-3 y 1X10-7 torr (1torr=133Pa=1 mmHg). Una (presión alta) en un espectrómetro de masas en torno a 1X10-3. En la figura 3, se aprecia que las moléculas de la muestra se desplazan desde la izquierda, por donde se introduce la muestra en el aparato, hacia la derecha. la muestra puede introducirse tanto en fase gaseosa como en fase liquido o sólida. (Siempre que se evapore a los líquidos y se sublime a los sólidos.) La muestra gaseosa se ioniza entre dos placas cargadas. Se aceleran los iones mediante un potencial de pocos kilovoltios, y se focalizan utilizando campos eléctricos o rendijas. La zona donde se introducen las moléculas, se evaporan, se ionizan y se aceleran se llama fuente de ionización. En la fuente de ionización se muestran tres tipos de iones con masas diferentes, indicados mediante círculos triángulos y cuadrados. Los iones acelerados pasan desde la fuente de ionización a un analizador de masas. En donde se separan los iones de distintas masa, de modo que diferentes tipos de iones llegan al transductor a diferentes tiempos esta pequeña corriente de iones se amplifica, mediante el transductor, normalmente un multiplicador de electrones [20].

Figura 3. Partes básicas de un espectrómetro de masas 2.3.2.1 Impacto electrónico (IE) Para este método de ionización, el “reactivo” que producen los productos iónicos es un haz de electrones enérgicos. Estos son calentados en un filamento incandescente, y viajan a través de la cámara de iones hasta un ánodo (trampa de iones) en el lado opuesto. El flujo de moléculas vaporizadas de la muestra a una presión de aproximadamente 1X10-3 Pa (1X10-5 torr.) que entra a la fuente interactúa con el flujo de iones para formar una variedad de productos, incluyendo los iones positivos. Con el IE se pueden introducir muestras de moléculas largas usando la técnica de haz de partículas [21].

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2.3.2.2 Ion molecular El Ion molecular, M+. , provee la más importante información del espectro de masa. Desafortunadamente, para algunos tipos de compuestos el ión molecular no es lo suficientemente estable para ser encontrado con apreciable abundancia en el espectro IE. Para estos casos la espectrometría de masas proporciona la técnica de ionización química. Los siguientes son requerimientos necesarios pero no suficientes para el ión molecular en un espectro de masas: debe ser el ión con mayor masa en el espectro; debe ser una especie radical, que contenga un electrón desapareado; debe ser capaz de producir los iones importantes en la región de masas alta del espectro por pérdidas de especies neutras lógicas [21]. 2.3.3. Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (CG/EM). Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografía de gases que pueden acoplarse directamente con distintos tipos de espectrómetros de masas de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente bajo para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de masas. Sin embargo en el caso de las columnas rellenas así como en las columnas mega capilares ha de emplearse un separador de chorro. En la figura 4 se puede observar un esquema de un cromatógrafo de gases de columna abierta/espectrómetro de masas [19].

Figura 4. Esquema de un cromatógrafo de gases de columna abierta/espectrómetro de masas La CG es la principal técnica analítica para la separación de compuestos volátiles, por su rápido análisis, resolución, fácil operación y excelentes resultados cuantitativos. Desafortunadamente la CG no puede confirmar la identidad o estructura de cada pico; los tiempos de retención son característicos de cada compuesto pero no son únicos [22]. Tanto el sistema cromatográfico como el espectroscópico están calentados (200-300 °C), ambos trabajan con compuestos en estado gaseoso y ambos requieren pequeños tamaños de muestra (micro o nanogramos). CG y EM son muy compatibles.

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El único problema es que la presión atmosférica en la salida del CG debe ser reducida a un vacío de de 1X10-5 a 1X10-6 torr para la entrada al EM [22]. Las moléculas del analito deben ser primero ionizadas para ser atraídas (o repelidas) por un apropiado campo magnético o eléctrico. Existen numerosas técnicas de ionización, pero impacto electrónico (lE) es el más antiguo, común y simple. La fuente de ionización es calentada y bajo vacío la mayoría de las muestras son fácilmente vaporizadas e ionizadas [22]. Los electrones de alta energía golpean las moléculas neutras del analito, causando la ionización (usualmente pierde un electrón) y fragmentación. Esta técnica de ionización produce en su mayoría exclusivamente iones positivos:

M +e- M+. + 2e- Después de la ionización, las partículas cargadas son repelidas y atraídas por lentes cargados en el analizador de masa. Aquí las especies iónicas son separadas por su razón masa-carga (m/z) por cualquiera de los dos campos magnético o eléctrico [22]. Los analizadores de masa típicos para CG/EM son cuadrupolos o trampa de iones. El primero consiste en cuatro varas hiperbólicas perpendiculares a cada una. Tiene la ventaja de ser sencillo, pequeño, de costo moderado y rápido análisis lo que lo hace ideal a los sistemas CG/EM, presenta restricciones cerca de los 2.000 Daltons [22]. El de trampa de iones es también simple en diseño, costo moderados y de análisis rápidos para CG/EM. El espectro generado, difiere a menudo del espectro clásico creado en uno de cuadrupolo y algunos iones sufren disociación o colisiones ión-molécula adentro de la trampa de iones. El espectro de masa es simplemente un plano de la abundancia de los iones en función del (m/z). Bajo condiciones controladas, las razones de abundancia y (m/z) específico que presentan las especies son únicos para cada compuesto. Estos pueden ser utilizados para determinar el peso molecular y la estructura química de cada compuesto. CG-EM combina las ventajas de ambas técnicas: el alto poder de resolución y la velocidad de análisis de CG, mientras la EM provee tanto identificación positiva como análisis cuantitativos por debajo de las ppb. La presentación de datos puede ser de dos maneras; o como un total análisis (Scan, TIC-Total Ion Current) o como un numero pequeño individual de iones (SIM-Selected Ion Monitoring) característicos de un compuesto. Un cromatógrama de Ion total (TIC) es usado para identificar compuestos desconocidos. Un rango específico de masas es escaneado. Todos los picos son reportados así qué los espectros de masas pueden ser recuperados del computador y ser usados para identificar cada pico. La computadora compara rápidamente cada espectro de masa desconocido con cerca de 150.000 espectros de referencia. La adquisición de datos necesario para examinar todos los iones en el rango seleccionado es lento, la sensibilidad es limitada, y usualmente no es optima [22]. En SIM solo un pequeño número de iones (habitualmente 6) son monitoreados. Aquí la adquisición de datos es mas rápida durante el tiempo de vida del pico, por lo tanto la

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cuantificación es mejor y la sensibilidad aumenta considerablemente. SIM no puede usarse para análisis cualitativo (no todas las masas son escaneadas), pero es el mejor modo para el análisis de compuestos designados, a menudo por debajo del nivel de los ppb [22]. Para la calibración por método cromatográfico fue necesario determinar algunos parámetros de calidad, los cuales son nombrados a continuación 2.4 Calibración Calibrar un método de análisis consiste en verificar y documentar, que este conduzca con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos [23]. 2.4.1. Exactitud La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado. No deben confundirse exactitud y precisión. La precisión está relacionada con la dispersión de un a serie de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo cerca que esta del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión. La exactitud se expresara como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdaderos junto a los intervalos de confianza [23]. 2.4.2 La linealidad Es la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que sea posible se buscará respuesta del tipo lineal que facilitará su trazado, interpolación e interpretación. Por ejemplo en algunos procedimientos como en los inmunoensayos la respuesta del método no suele ser lineal pero si proporcional a la concentración. En estos casos son validos otros ajustes matemáticos [23]. 2.4.3 El rango lineal Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito. Aunque el proceso lógico consistiría en evaluar cuales son los límites de concentración en los que el método analítico pierde su linealidad normalmente se toma como punto de partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el conocimiento analítico de la técnica empleada y principalmente en el uso de las especificaciones. Para evaluar l linealidad existen unos criterios mínimos aplicables a cualquier procedimiento.

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• Dentro del rango establecido se recomienda estudiar al menos 4 niveles de concentración.

• Para realizar los análisis se recomienda hacer pesadas independientes, ya que así se elimina el posible error sistemático que se podría arrastrar partiendo de una pesada y realizando diluciones [23].

2.4.4 Precisión La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las condiciones prescritas. Usualmente se expresa en términos de la desviación estándar (SD). Otra forma de expresar la precisión es la desviación estándar relativa (RSD) o coeficiente de variación (CV). El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo [23]. 2.4.5 Límite de cuantificación Se entiende por límite de cuantificación de un método, a la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud. El limite de cuantificación es un termino cuantitativo, mientras que el límite de detección es sólo cualitativo, encontrándose entre ambos términos un rango de concentraciones en el que si bien no puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos. [23]. 2.4.6 Limite de detección La mayoría de criterios coinciden en que el límite de detección se define como la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales. El límite de detección es un término solo cualitativo. No debe confundirse con otro al que normalmente se asocia, la sensibilidad, ya que esta es la capacidad de un método de análisis para discriminar pequeñas diferencias en concentración o masa del analito. Una alta sensibilidad del método analítico no siempre permite suponer inferiores limites de detecciones, ya que lo definiría este limite es la relación entre el ruido y la señal debida al analito [23]. El método empleado para la determinación de los límites de cuantificación y límites de detección se basó en la relación señal/ruido, el cual es el más empleado para métodos instrumentales cromatográficos. El LC se calculó para la concentración de analito que proporcione una señal 10 veces superior (En ocasiones se admite hasta un valor de 20) a la señal producida por el ruido de fondo (blanco), el LD es igual a la concentración de analito que proporcione una señal 3 veces superior a este [23].

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2.5 Métodos de extracción 2.5.1 Extracción líquido-líquido El método empleado para la determinación de los pesticidas organofosforados en agua es la extracción líquido- líquido este se basa en la distinta distribución de los componentes de la muestra entre dos disolventes inmiscibles, donde matriz y analito tienen diferente solubilidad en cada uno de ellos. Cuando se alcanza el equilibrio, la concentración de analito en cada disolvente viene determinada por el coeficiente de distribución.

A (agua) A (disolvente)

Kd = [A]disolvente / [A]agua Valores elevados del coeficiente de distribución permiten una extracción con disolventes cuantitativa del analito presente en agua. Habitualmente, se suelen realizar entre dos y tres extracciones consecutivas para asegurar una extracción cuantitativa del analito. El equilibrio químico que rige el proceso de partición de un analito entre dos disolventes, puede modificarse de varios modos: modificando el pH, formando pares iónicos, formando complejos con iones metálicos o añadiendo sales neutras a la fase acuosa para reducir la solubilidad del analito [18]. Las ventajas que presenta esta metodología son: 1. El amplio rango de disolventes distintos y mezclas de ellos que pueden ser empleados, permite una gran versatilidad a esta técnica. 2. Es un método muy simple que no requiere el uso ni de instrumentaciones complejas, ni de consumibles costosos, a excepción de los disolventes empleados. Los principales inconvenientes que presenta la extracción líquido- líquido son: 1. El empleo de grandes volúmenes de disolvente requiere una posterior evaporación de los mismos para concentrar los extractos, lo que añade una etapa más al proceso analítico y que a menudo es bastante costosa en tiempo. Además se requiere el uso de disolventes de elevada pureza para evitar contaminaciones. 2. En muestras que contienen grasas, se producen emulsiones en ocasiones difíciles de romper. Por lo que a veces es necesario, centrifugar, filtrar a través de lana de vidrio, enfriar, añadir sales o añadir pequeñas cantidades de otros disolventes. 3. La capacidad de extracción puede verse modificada dependiendo del tipo de muestra, por lo que existe una gran variabilidad [18]. Para la determinación de los pesticidas organofosforados en los sedimentos fue empleado un método de extracción sólido- líquido

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2.6 Métodos de extracción líquido-sólido. El empleo directo de disolventes para la extracción de analitos de muestras medioambientales es uno de los métodos de extracción más antiguos y usados en química analítica. Podemos clasificar estos métodos en dos grupos: aquellos que necesitan un aporte de calor (Soxhlet) y aquellos que no necesitan calor, pero necesitan algún tipo de agitación (agitación o sonicación). El empleado para la extracción de pesticidas organofosforados en sedimentos fue el método de agitación; esta es la extracción más simple, que consiste en introducir muestra y disolvente en un recipiente adecuado y agitar durante un determinado tiempo. Existe una gran variedad de agitadores comerciales, que permiten distintas formas de agitación circular, como el agitador vortex. Por lo general después de esta agitación se necesita separar la muestra del disolvente a través de una etapa de filtración o centrifugación, dependiendo de la muestra se puede conseguir la separación del extracto insoluble por una simple decantación. Una modalidad en este tipo de extracción es la extracción por ultrasonidos o sonicación, que emplea ondas sonoras para producir la agitación de la muestra en el disolvente. Para ello, se puede emplear tanto una sonda como un baño generador de ultrasonidos, repitiendo el proceso dos o tres veces más [18]. 2.7 Interferencias en el análisis de pesticidas. Las interferencias puede ser causadas por contaminantes presentes en los disolventes, reactivos, cristalería, u otra muestra de procesamiento que pueden conducir a la elevación de la línea base de los cromatogramas. Se sugiere realizar los siguientes procedimientos para evitar interferencias: - Todo el material de vidrio debe ser escrupulosamente lavado, después de su uso debe ser lavado a fondo con el último disolvente utilizado, seguido por el lavado con agua caliente, detergente y enjuague a fondo. Se debe dejar escurrir y secar en un horno a 400º C de 15 a 30 minutos. Cuando se trabaje con material volumétrico debe realizarse un exhaustivo lavado con acetona y hexano, calidad para pesticidas, para sustituir la calefacción. Después del secado, el material de vidrio debe mantenerse en un medio ambiente limpio para evitar cualquier acumulación de polvo u otros contaminantes. - El uso de reactivos y disolventes de alta pureza ayuda a minimizar las interferencias. Puede ser requerido la purificación de disolventes por destilación en los sistemas de vidrio. Las interferencias también pueden ser causadas por contaminantes que son de la muestra. El alcance de interferencias por la matriz puede variar considerablemente de una fuente a otra, dependiendo de la naturaleza y la diversidad la muestra. El uso de un detector fotométrico de llama en modo fósforo ayuda a minimizar las interferencias de los materiales que no contienen fósforo. (EPA Method 622).

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3. SECCIÓN EXPERIMENTAL. 3.1 EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA DE EXTRACCIÓN 3.1.1 Extracción líquido-líquido. Se realizaron dos metodologías de extracción siguiendo recomendaciones del Standard Métodos (ORGANOCHLORINE PESTICIDES (6630)/Liquid-Liquid Extraction GC Method I) [24]. Que puede ser empleado para el análisis de pesticidas organofosforados, y empleando una extracción líquido-líquido por etapas, método también empleado para la extracción de pesticidas [3]. Se basó en un método que propone emplear solventes polares para la determinación de pesticidas que puedan presentar alta humedad y en un método en el que emplean como solvente orgánico acetonitrilo para la extracción de 180 pesticidas residuales en comidas donde se obtuvieron porcentajes de recuperación entre el 70 y el 110 % [25,26]. 3.1.1.2 Extracción líquido-líquido continuo empleando concentrador Kuderna-Danish. Se realizó la extracción basándose en el procedimiento indicado por el Standard Métodos y adaptando las condiciones para los equipos disponibles en el laboratorio. Se tomaron 750 mL de agua desionizada contaminada con 1mL del patrón de la mezcla de pesticidas organofosforados marca RESTEK catalogo Nº 32277 de una concentración de 2 µg/mL y 500mL de diclorometano. En el cilindro de extracción se adicionaron primero 300 mL de diclorometano y luego los 750 mL del agua contaminada. Los 200 mL de diclorometano restantes se adicionaron al balón. Posteriormente se somete a calentamiento a una temperatura superior en 5 ºC a la temperatura de ebullición del diclorometano. (En la figura 5 se observa el montaje para el extractor líquido- líquido continuo). Luego de 24 horas que es el tiempo que dura el proceso de extracción continua, la fase orgánica se llevó al concentrador de Kuderna-Danish (Figura 6) hasta obtener un volumen final de muestra de 1 mL, este proceso dura aproximadamente 24 horas 3.1.1.3 Extracción líquido-líquido por etapas con acetonitrilo. Se tomaron 100 mL de agua desionizada contaminada con 1mL del patrón de la mezcla de pesticidas organofosforados marca RESTEK catalogo Nº 32277 de una concentración de 2 µg/mL, a esta se le adicionó 0.1 moles de Cloruro de sodio (NaCl), fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) y fosfato de potasio dibásico (K2HPO4). Esta solución fue llevada a un balón de separación donde se extrajo con 75 mL de acetonitrilo grado HPLC por 15 minutos y posteriormente se dejó reposar 20 minutos para la separación. La capa acuosa fue extraída nuevamente con 75 mL de acetonitrilo realizando el mismo procedimiento anterior.

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Las dos capas orgánicas se juntaron y se adicionó sulfato se sodio anhidro, esto con el fin de secar el agua que pudiera haber quedado después de la extracción. El extracto orgánico se llevó a un balón de rotavaporación para concentrarlo hasta un volumen de 1 mL, se adicionó 10 mL de acetona y se concentró hasta 1 mL posteriormente se adicionó 5 mL de acetona y se llevó hasta sequedad, el residuo se disolvió en 1.5 mL de una mezcla acetona-hexano 1:1, este se agito, se dejó reposar y se llevó a exactamente 1 mL en un vial. (En la figura 7 se observa el diagrama de extracción líquido- líquido por etapas con acetonitrilo).

Figura 5. Extractor líquido-líquido continuo. Figura 6. Concentrador de Kuderna - Danish

3.2 CALIBRACIÓN DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS. El análisis cromatográfico se realizo en un cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas GSMS- QP2010 marca Shimadzu con automuestreador operando con el modo de impacto electrónico (IE). Las características de la columna empleada fueron: 30 m de largo, 0.25 mm DI, 0.25 µm de película Rtx-CL Pesticidas Restek. El software empleado fue el GCMS Solutions 2.5. El cromatógrafo de gases se programó a una temperatura inicial de 50 ºC por un minuto, seguido de un aumento de temperatura a 125 ºC con una rata de 25 ºC/min y finalmente se lleva hasta 320 ºC con una rata de 10 ºC/min. y se mantiene a esta temperatura por 10 minutos.

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Tomar 100 mL de muestra.

Adicionar 0.1 moles de:NaClKH2PO4K2HPO4

Llevar a embudo de separación

Adicionar 75 mL de acetonitrilo

Agitar por 10 minutos

Fase acuosa Fase acetonitrilo

Dejar reposar por 10 minutos y separar

Extraer nuevamente fase acuosa por 10 minutos

Dejar reposar por 10 minutos y separar

Juntar las dos fases de acetonitrilo

Adicionar Na2SO4 anhidro

Llevar al balón de rotavaporación

Concentrar hasta 1 mL

Adicionar 10 mL de acetona y concentrar hasta 1 mL

Adicionar 5 mL de acetona y concentrar a sequedad.

Disolver el residuo con 1.5 mL de acetona hexano 1:1

Llevar a exactamente 1 mL

Agitar y reposar

Figura 7. Diagrama de extracción líquido- líquido por etapas con acetonitilo.

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3.2.1 Estándar Para la elaboración de la curva de calibración de los pesticidas organofosforados que se analizaron empleando cromatografía de gases y espectrometría de masas se compró un estándar con una mezcla de pesticidas marca RESTEK, con código de catálogo Nº 32277, Lot Nº A058755 (En el anexo 2 se muestra el certificado de análisis del estándar), el cual tiene una concentración de 200 µg/mL. El estándar contiene 21 pesticidas organofosforados, indicados en la tabla 3 con su concentración. Tabla 3. Composición de la mezcla de pesticidas marca RESTEK catalogo Nº 32277

Pesticida # CAS Concentración (peso/volumen)

Diclorvos (DDVP) 62-73-7 200,000 µg/mL Mevinphos (Phosdrín) 7786-34-7 200,160 µg/mL Demeton O & S 8065-48-3 200,220 µg/mL Ethoprophos 13194-48-4 200,000 µg/mL Naled 300-76-5 200,160 µg/mL Phorate 298-02-2 199,975 µg/mL Diazinon 333-41-5 200,000 µg/mL Disulfoton 298-04-4 200,305 µg/mL Methyl parathion 298-00-0 200,000 µg/mL Fenchlorphos (Ronnel) 299-843 200,000 µg/mL Fenthion 55-38-9 199,820 µg/mL Chlorpyrifos (Dursban) 2921-88-2 200,000 µg/mL Tricholoronat 327-98-0 200,000 µg/mL Merphos 150-50-5 199,820 µg/mL Stirofos (Tetrachlorvinphos) 961-11-5 200,000 µg/mL Tokuthion (Prothiofos) 34643-46-4 200,160 µg/mL Fensulfothion 115-90-2 200,000 µg/mL Bolstar ( Sulprofos) 35400-43-2 199,750 µg/mL Azinphos methyl (Guthion) 86-50-0 199,750 µg/mL Coumaphos 56-72-4 199,920 µg/mL

3.2.2 Scan. Se llevó a cabo un análisis total de iones (scan) por el método de impacto electrónico (IE). Este se realizo para el patrón de 2 µg/mL del estándar marca RESTEK catalogo Nº 32277, con el objetivo de identificar los compuestos presentes en la mezcla y su orden de elusión, debido a que las condiciones del cromatógrafo, columna y detector cambiaron con respecto a como fue analizado el estándar para el certificado de análisis 3.2.2.1 Condiciones para la realización del scan por IE Temperatura del inyector: 280 º C Volumen de inyección: 2 µL

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Modo de inyección: splittless Tiempo de muestreo: 1 minuto. Presión: 54.2 KPa Flujo total: 6.0 mL/min. Flujo en la columna: 1.0 mL/min. Velocidad lineal del gas: 36.3 cm/seg. Flujo de purga: 1.0 mL/ min Razón de split: 4.0 En la figura 8 se puede observar la rampa de calentamiento del horno para el análisis cromatográfico

Figura 8. Programación del horno para el análisis cromatográfico por impacto electrónico. Temperatura de la fuente: 260 ºC Temperatura de la interfase:280 ºC Ganancia del detector: 1.00 kV Tiempo para el corte del solvente: 5 min Para el espectrómetro de masas: Tiempo de inicio: 6 min. Tiempo final: 30 min. Modo ACQ: scan Velocidad del scan: 833 m/z inicial: 50.00 m/z final: 450.00 3.2.4 Elaboración de curva de calibración A partir del estándar marca RESTEK catalogo Nº 32277 se realizaron diluciones con una mezcla de acetona-hexano 1:1, partiendo de una concentración inicial de 2 µg/mL y realizando diluciones seriadas. Las concentraciones de los patrones de la curva de calibración van desde 0.2µg/mL hasta 0.01 µg/mL incluyendo el valor máximo permitido para pesticidas organofosforados (cada uno) que es de 0.05 µg/mL según el artículo 45 de la resolución No. 1594 de 1984 expedido por el ministerio de salud.

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3.3 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE AGUA. Después de estandarizar la técnica de extracción líquido - líquido se llevó acabo el análisis de las muestras reales por cromatografía de gases y espectrometría de masas de igual manera como fueron analizados los patrones. 3.3.1 Muestreo. Las muestras de agua se recolectaron en cada una de las estaciones de muestreo, que fueron definidas según los puntos de control estandarizados por Aguas y Aguas de Pereira y en una reunión sostenida con los Ingenieros Nancy Henao, y Adalberto Arroyave vinculados a dicha entidad, se tuvo en cuenta las necesidades ambientales, la experiencia de la institución en el sector y la factibilidad económica. Se realizó un muestreo puntual siguiendo las recomendaciones del Standard Methods, las muestras se recolectaron en envases ámbar con capacidad para un litro. En campo a las muestras de agua se les midió la temperatura y el potencial de hidrogeno (pH), 3.3.2 Conservación de las muestras. Las muestras fueron transportadas rápidamente al laboratorio de aguas y alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira en neveras para mantenerse refrigeradas. El análisis de las muestras se realizó en un plazo inferior a 7 días después de su recolección. Los extractos se conservaron refrigerados a 4 ºC y se analizaron por cromatografía de gases y espectrometría de masas en un plazo no superior a los 40 días después de la extracción [24]. 3.3.3 Descripción de los puntos de muestreo. En el anexo 1 se encuentra un mapa detallado de la cuenca del río Otún que contiene la localización de los puntos de muestreo [10]. 3.3.3.1 El Cedral. Esta es la primera de las estaciones de muestreo ubicadas en el río Otún. Las características organolépticas del agua (color, olor, sabor, sustancias flotantes) en este punto son aceptables en razón a la localización de la estación en una zona de protección, está ubicada al interior del Parque Regional Natural Ucumarí. El ancho del río en este punto es de aproximadamente 8 metros (Figura 9) en esta estación se observa buena calidad de agua, reflejada en su transparencia, y baja temperatura [10].

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Figura 9. Estación de muestreo el cedral. 3.3.3.2 Antes del río Barbo En esta estación se puede observar un agua cristalina y sus características organolépticas siguen siendo buenas, no se observan partículas flotantes ni rastros de contaminación. En la figura 10 se puede observar que en esta estación se aprecia claramente un ecosistema natural de flora y fauna silvestre, el lecho en este punto es de tipo rocoso-pedregoso [10].

Figura 10. Estación de muestreo antes del río Barbo 3.3.3.3 Después del río Barbo Esta estación, como su nombre lo indica, se encuentra ubicada después de la desembocadura del río Barbo, el afluente más importante del río Otún al inicio de su cuenca media. La estación está enclavada en el Santuario de Flora y Fauna Otún-Quimbaya hecho que, en teoría, garantiza la productividad hídrica de la cuenca del río Otún. Además, varios predios en esta zona han sido adquiridos por la Empresa de Acueducto y Alcantarillado de Pereira para asegurar la conservación de la cobertura boscosa actual.

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La apariencia del agua es cristalina y el caudal aumenta considerablemente a causa de la entrada del río Barbo [10]. En la figura 11 se puede apreciar esta estación de muestreo.

Figura 11. Estación de muestreo después del río Barbo 3.3.3.4 Después del río San Juan Esta estación, se encuentra ubicada después de la desembocadura del río San Juan, la apariencia del agua se sigue observando buena (figura 12) y no se observan residuos en la superficie [10].

Figura 12. Estación de muestreo después del río San Juan 3.3.3.5 La Bananera Esta estación está ubicada en el puente que pasa sobre el río Otún, en la vereda del mismo nombre. En esta estación, también se encuentra ubicada una estación hidrométrica (limnígrafo) propiedad del IDEAM, mediante la cual esta entidad monitorea los cambios en el nivel del río. La apariencia del agua en este punto también es muy agradable, sin vestigios aparentes de contaminación doméstica, aún cuando aguas

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arriba se encuentra el corregimiento de La Florida, que tiene una población de más de 700 personas [10]. En la figura 13 se observa la estación de muestreo.

Figura 13. Estación de muestreo la Bananera 3.3.3.6 Bocatoma Esta es la estación correspondiente a la bocatoma de la Empresa de Acueducto y Alcantarillado de Pereira para el abastecimiento de agua potable de la ciudad (figura 14). Está ubicada en la vereda El Provenir, en la vía hacia el corregimiento de La Florida. Las características organolépticas del agua en esta zona dan cuenta, aún, de buena calidad [10].

Figura 14. Estación de muestreo Bocatoma 3.3.3.7 Después de Quebrada Dosquebradas. El impacto, sobre el río Otún, del ingreso de la quebrada Dosquebradas se ha monitoreado en esta estación a través de varios años. Se encuentra en el barrio El Triunfo y, a esta altura, el río presenta signos visibles de contaminación (figura 15), en forma de

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densas capas de espuma y alta turbiedad (las cuales proceden, en su mayor parte, de la quebrada Dosquebradas). El río es muy torrentoso, por la irregularidad del cauce y por el estrechamiento de la corriente, pues aquí el río tiene un ancho que apenas sobrepasa los 18metros. En las orillas del río, se concentran lodos de color gris oscuro, con olor putrefacto y el agua que fluye se torna muy turbia [10].

Figura 15. Estación de muestreo después de quebrada Dosquebradas 3.3.4 Extracción líquido- sólido En los dos últimos muestreos realizados se realizó la toma de sedimentos en algunos de los puntos establecidos en el Río Otún dependiendo de la presencia o ausencia de estos en el lugar seleccionado. En los últimos años se han realizado procedimientos para mejorar las extracciones como por ejemplo la extracción asistida por microondas, la extracción de fluidos a presión y la extracción con disolventes empleando ultrasonido. En estos análisis se requiere una menor cantidad de disolvente y se reduce su tiempo de extracción [27]. La metodología empleada para la determinación de los pesticidas organofosforados en sedimentos de la cuenca del Río Otún, la cual se puede observar en la figura 16 siguió un proceso extracción sólido líquido por ultrasonido basándose en el proceso de extracción para pesticidas en productos naturales empleado por el laboratorio de Calidad en Productos Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira, donde el proceso de preparación de las muestras se realiza por el método multiresiduo de plaguicidas que se ajusta al ''Oficial Method of Ministry of Health, Labour and Welfare'' de Japón, el cual es utilizado por ''Yokohama Quarantine Station'', equivalente al US-FDA [28].

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Agitar por 10 min

Pesar 10 g de muestra

Adicionar 20 mL aguaDejar reposar por 15 minAdicionar 50 mL de acetonitriloHomogenizar 20 min en ultrasonido

Filtrar al vacio Residuo

Filtrado

Adicionar 20 mL acetonitriloHomogenizar 15 min en agitador

Filtrar al vacio Residuo

FiltradoCombinar los filtrados

Aforar a 100 mL

Adicionar 20 mL del filtrado

Adicionar 20 mL de NaCl 28% en buffer Fosfato 1 M, pH 7.0

Fase acuosa Fase acetonitrilo

Eluir con 5 mL de acetonitriloColumna cromatográfica ODS (RP-18) 1.0 gAcondicionada con 10 mL de acetonitrilo.

Secar sobre Na2SO4 anhidro

Concentrar a 1 mLAdicionar 10 mL de acetona y concentrar a 1 mL

Adicionar 5 mL de acetona y concentrar a sequedad

Disolver el residuo en 1.5 mL de acetona hexano 1:1, agitar y reposar

Ajustar el volumen exactamente a 1 mL

Figura 16. Diagrama de extracción sólido- líquido con acetonitilo para sedimentos.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIONES.

4.1 SCAN. La realización del scan por el método de impacto electrónico IE se hizo con el patrón de 2 µg/mL, donde se pudieron identificar 21 picos pertenecientes al estándar de pesticidas marca RESTEK, con código de catálogo Nº 32277, Lot Nº A058755. En la figura 17 se muestra el cromatograma obtenido por el scan.

Figura 17. Cromatograma total obtenido del patrón de 2 µg/mL por el método de IE Los picos del anterior cromatograma fueron identificados por un scan total, por comparación a sus espectros de masas con la base de datos del espectrómetro de masas Wiley 7º edición 2003 y comparando con la información del certificado de análisis del estándar. En la tabla 4 se observan los nombres de los picos que eluyeron. Para la cuantificación de la mezcla de pesticidas se seleccionan los iones más representativos que permitan la identificación de cada compuesto por el monitoreo de iones selectivos (SIM), estos valores también se encuentra registrados en la tabla 4. Los 21 picos pertenecientes al estándar se identificaron claramente en el scan realizado, para los pesticidas Naled y Azinphos Methyl no se definieron iones selectivos porque los dos presentan demasiadas fragmentaciones y no se encontró un ión representativo para su identificación, el Naled como se puede observar en la figura 17 presenta una señal muy pequeña y el Azinphos Methyl presenta una señal de acoplamiento con una posible contaminación lo que dificulta su comparación en el equipo. En la figura 18 como ejemplo se puede observar el espectro de masas obtenido para uno de los pesticidas del estándar (methyl parathion). En el anexo 3 se presentan los espectros de masas obtenidos para todos pesticidas presentes en el estándar.

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Tabla 4. Compuestos identificados por el scan por impacto electrónico.

Nº pico

Tiempo de

retención Nombre Iones selectivos (m/z) Cuantificar Ref Ref Ref

1 7.866 Dichlorvos 109 (100%) 79(37.9%) 185(21.5%) 2 9.968 Mevinphos 127 (100%) 192(22.5%) 164(11.7%) 3 12.179 Demeton-S 171 (100%) 88(613.8%) 115(110%) 4 12.497 Ethoprophos 158 (100%) 126(53.5%) 139(60.8%) 200(52.8%) 5 12.815 Naled - - - - 6 13.185 Phorate 260 (100%) 75(1034.8%) 121(255.6%) 7 13.523 Demeton-O 170 (100%) 88(1031.5) 114 (122.4%) 126(118.7%) 8 14.096 Diazinon 179 (100%) 137(115.9%) 152(61.4%) 304(50.8%) 9 14.444 Disulfoton 186 (100%) 88(955.8%) 274(6.28%) 142(230%)

10 15.397 Methyl parathion 263 (100%) 125(186%) 11 15.592 Ronnel 285 (100%) 125(63.3%) 287(113.9%) 289(19.09%) 12 16.154 Chlorpyrifos 314 (100%) 197(147.7%) 258(47.4%) 286(68.1%) 13 16.252 Fenthion 287 (100%) 169(21.9%) 14 16.542 Trichloronat 297 (100%) 269(99.7%) 271(73.9%) 299(87%) 15 17.038 Merphos 209 (100%) 153(71.8%) 298(40.9%) 16 17.560 Tetrachlorvinphos 329 (100%) 331(347%) 333(28.8%)

17 18.015 Tokuthion (Prothiofos) 267 (100%) 113(103.1%) 309(83.9%) 269(48.4%)

18 18.884 Fensulfothion 293 (100%) 141(56.7%) 308(56.7%) 19 19.288 Bolstar (Sulprofos) 322 (100%) 140(108.4%) 156(101.7%) 139(98.9%) 20 21.550 Azinphos Methyl - - - - 21 22.606 Coumaphos 362 (100%) 364(40.3%) 226 (234.4%) 210(75.2%)

Figura 18. Espectro de masas obtenido para el pesticida organofosforado methyl parathion En la figura 18 se observa el espectro de masas del pesticida methyl parathion, en este se observa que los iones seleccionados para la cuantificación del compuesto con el modo SIM el 263 y el 125.

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En este espectro de masas, el ión molecular se asignó a m/z 263. El pico base m/z 109 correspondió al grupo fosfato (+PO(OMe)2). Otros fragmentos observados son: m/z 125 (+PS(OMe)2)m/z, m/z 93 (+P(OMe)2), y m/z 79 (+POS) [29]. En la figura 19 se puede observar un posible diagrama de fragmentación para este pesticida.

O2N O P

S

OCH3

OCH3

e- 2e-

O2N O PS

OCH3

OCH3

P

S

OCH3

OCH3

P

S

OCH3

OCH3

P

O2N O POCH3

OCH3S

O2N

mz 125

PO

SOHCH3

OCH3

POOCH3

OCH3

mz 125

S

POOCH3

OCH3

mz 109

O CH3

OCH3

S

O2N O P O CH3

OCH3

S

O2N O

P O CH3

OCH3

S

mz 125

P O CH3

OCH3

P O CH3

OCH3

mz 93

O P O CH3

S

OC H

H

H

O2N

O P O CH3

S

OC HH

O2N

OO2N

P O CH3

S

O

CH2

CO

H H

P O CH3

S

CH3

PO

S

mz 79

O2N O

Figura 19. Posible diagrama de fragmentación para el pesticida methyl parathion.

51

4.2 CALIBRACIÓN Para la calibración del método cromatográfico se realizaron diluciones sucesivas a partir del estándar. Las concentraciones de los patrones de la curva de calibración van desde 0.2µg/mL hasta 0.01 µg/mL Los valores para la elaboración de la curva de calibración del estándar de pesticidas se presentan en la tabla 5.

Nivel Concentración

[µg/mL] 1 0,2 µg/mL 2 0,1 µg/mL 6 0,05 µg/mL 4 0,02 µg/mL 5 0,01 µg/mL

Tabla 5. Patrones para la curva de calibración de pesticidas organofosforados marca RESTEK catalogo Nº 32277 Por el método de impacto electrónico se elaboraron las curvas de calibración para los pesticidas pertenecientes al estándar. Esta curva de calibración no se logró realizar para los pesticidas Naled y Azinphos Methyl ya que estos no presentaron un buen factor de respuesta y no se logró obtener linealidad con los patrones de la curva. Las curvas de calibración que se lograron para los 19 pesticidas se pueden observar en la figura 20.

MEVINPHOSy = 110745x

R2 = 0,9997

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

DICHLORVOSy = 135422x

R2 = 0,9987

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

52

DEMETON-Sy = 12040x

R2 = 0,9996

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

PHORATE y = 31165x

R2 = 0,9999

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

DIAZINONy = 118358x

R2 = 0,9972

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

DEMETON-O y = 9659x

R2 = 0,9962

0

500

1000

1500

2000

2500

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm))

Áre

a

ETHOPROPHOS y = 63837x

R2 = 0,9952

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

DISULFOTONy = 22104x

R2 = 0,9985

0

1000

2000

3000

4000

5000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

53

METHYL PARATHION y = 33242x

R2 = 0,995

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

TRICHLORONATy = 87765x

R2 = 0,9999

0

5000

10000

15000

20000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

FENTHION y = 225888x

R2 = 0,9996

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

CHLORPYRIFOS y = 45916x

R2 = 0,9965

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

MERPHOS y = 119508x

R2 = 0,9974

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

RONNELy = 138469x

R2 = 0,9981

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

54

FENSULFOTHIONy = 41029x

R2 = 0,9992

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

a

COUMAPHOSy = 14363x

R2 = 0,998

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

Figura 20. Curvas de calibración para los compuestos presentes en la mezcla del estándar.

TETRACHLORVINPHOS y = 35257x

R2 = 0,9999

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración (ppm)

Áre

aTOKUTHION (PROTHIOFOS) y = 94181x

R2 = 0,9956

0

5000

10000

15000

20000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

aBOSLTAR (SULPROFOS) y = 94736x

R2 = 0,9992

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Concentración. (ppm)

Áre

a

55

4.3 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Para cada una de las curvas de calibración obtenidas se determinó unos criterios cuantitativos de funcionamiento del equipo, estos se expresan en términos numéricos y se denominan parámetros de calidad; necesarios para la validación del método cromatográfico, la realización de esto es de gran importancia porque contempla la satisfacción de las necesidades del cliente cuando se preste una venta de servicios y la adecuación para realizar los ensayos previstos. Los parámetros calculados son los siguientes: R2: coeficiente de correlación SD: desviación estándar RSD: desviación estándar relativa LD: límite de detección LC: límite de cuantificación El equipo por medio del software que maneja el cromatógrafo nos suministra los valores de los parámetros R2, SD y RSD. Los valores de LD y LC se calcularon a partir de la relación señal/ruido; el cual es el más empleado para métodos instrumentales cromatográficos. El LC se calculó para la concentración que proporcione una señal 10 veces superior a la señal producida por el ruido de fondo (blanco), el LD es igual a la concentración de analito que proporcione una señal 3 veces superior a este. En la tabla 6 se registran los valores calculados para estas medidas [19]. Las curvas de calibración obtenidas para cada uno de los compuestos, exhiben un comportamiento lineal, de acuerdo con los coeficientes de correlación obtenidos en la tabla 7 (R2>0.99). El promedio para los coeficientes de correlación R2 es de 0.9981, este valor se acerca mucho a 1 el cual es el valor ideal, lo que indica que en general las curvas de calibración se aproximan a una línea recta. Comparando la linealidad calculada para el método con resultados obtenidos en diversas investigaciones para pesticidas en aguas [30], que obtuvieron coeficientes de correlación mayores a 0.99, y con estudios de condiciones para la determinación de insecticidas organofosforados en aguas [31] donde los coeficientes de correlación oscilan entre 0,985 y 0,999. Se puede observar que los resultados obtenidos son muy similares dentro de los valores reportados. La sensibilidad para cada pesticida se tomó como la pendiente de la curva de calibrado, el promedio obtenido para estas es de 75457.05. Como puede observarse en la tabla 6 el instrumento presentó una alta sensibilidad para los 19 pesticidas obteniendo altos valores en las pendientes, esto nos indica una buena sensibilidad en la técnica.

56

Tabla 6. Datos estadísticos para la calibración por IE

Nombre pesticida R2 Sensibilidad SD(ppm)

RSD (%)

LD (ppm)

LC (ppm)

Dichlorvos 0.9987 135422 1.273E+04 9.553 3.103E-03 1.034E-02 Mevinphos 0.9997 110745 7.853E+03 7.065 1.600E-03 5.400E-03 Demeton-S 0.9996 12040 8.560E+02 6.813 8.571E-03 2.857E-02 Ethoprophos 0.9952 63837 6.653E+03 10.240 6.666E-03 2.220E-02 Phorate 0.9999 31165 2.028E+03 6.383 1.500E-03 5.200E-03 Demeton-O 0.9962 9659 4.690E+02 4.843 1.666E-02 5.550E-02 Diazinon 0.9972 118358 6.687E+03 5.464 1.818E-03 6.061E-03 Disulfoton 0.9985 22104 7.400E+04 3.249 7.058E-03 2.353E-02 Methyl parathion 0.9950 33242 3.694E+03 12.09 1.330E-02 4.440E-02 Ronnel 0.9981 138469 1.428E+04 9.919 3.500E-03 1.190E-02 Chlorpyrifos 0.9965 45916 4.020E+03 9.045 2.790E-03 9.302E-03 Fenthion 0.9996 225888 4.486E+03 1.976 1.333E-03 4.444E-03 Trichloronat 0.9999 87765 1.009E+03 1.152 8.000E-03 2.660E-02 Merphos 0.9974 119508 2.673E+04 20.639 7.800E-03 2.630E-02 Tetrachlorvinphos 0.9999 35257 1.501E+04 4.191 7.500E-03 2.500E-02 Tokuthion (Prothiofos) 0.9956 94181 8.623E+03

9.611

8.500E-03 2.850E-02

Fensulfothion 0.9992 41029 1.459E+03 3.443 6.977E-03 2.325E-02 Bolstar (Sulprofos) 0.9992 94736 7.241E+03

7.432

2.608E-03 8.696E-02

Coumaphos 0.9980 14363 8.660E+02 6.202 5.217E-03 1.739E-02 Los parámetros de calidad empleados para determinar la precisión del método cromatográfico son la desviación estándar (SD) o la desviación estándar relativa (%RSD). El promedio de RSD para las curvas de calibración es de 7.332%, siendo el mayor para el Merphos % con un valor de 20.639 % y el menor para el Trichloronat con un valor de 1.152 %. El promedio de RSD obtenido para las curvas de calibrado es inferior al 10% este valor es aceptable por cumplir lo establecido por la EPA (%RSD<16%) para el análisis de trazas en muestras complejas [32]. Comparando los valores de RSD obtenidos con otros trabajos como el realizado para el estudio de la contaminación por pesticidas en aguas de Almería, España [30] donde la precisión del método cromatográfico, medida como desviación estándar relativa, fue menor del 20 % para todos los compuestos analizados y el estudio realizado en el río Ebro, España [33], en el que se obtuvieron RSD inferiores al 22% para todos los casos de pesticidas, se puede confirmar que la calibración de la técnica cromatográfica cuenta con un RSD comparable con otras publicaciones con resultados dentro del mismo rango que reflejan su precisión. En la obtención de los límites de detección LD el mayor valor fue para el Demeton-O con 0.0166 ppm y el menor límite de detección obtenido fue para el Fenthion con 0.0013 ppm, los valores obtenidos se consideran buenos porque permiten la detección de una baja concentración de la mezcla de pesticidas en las muestras de agua además antes de

57

su análisis por cromatografía de gases y espectrometría de masas las muestras se extraen [3,24] y posteriormente el extracto es concentrado aproximadamente 1000 veces para el método de extracción líquido-líquido continuo y 100 veces para el método de extracción líquido-líquido por etapas. Comparando los valores obtenidos para los límites de detección con el estudio realizado para determinación de pesticidas en la laguna de Sonso, Valle del Cauca donde los valores obtenidos para los límites de detección están en un rango de 0.028 a 0.058ppm se observa que los resultados calculados en la presente investigación superan los obtenidos por estos investigadores [34]. Para el límite de cuantificación LC el mayor dato obtenido fue para el Demeton-O con 0.0550 ppm y el menor fue para el Fenthion con 0.00133 ppm, estos valores obtenidos también se consideran buenos porque como ya se mencionó las muestras antes de ser analizadas son sometidas a una concentración para mejorar su detección en el equipo. 4.4 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EVALUADOS. 4.4.1Extracción líquido-líquido continua empleando concentrador Kuderna-Danish. En la tabla 7 se observan los porcentajes de recuperación obtenidos por este método de extracción Tabla 7. Porcentajes de recuperación para el método de extracción líquido–líquido continua con diclorometano empleando concentrador Kuderna-Danish.

Nombre del pesticida. % de Recuperación Dichlorvos 89,53 Mevinphos 90,01 Ethoprophos 83,10 Diazinon 62,71 Methyl parathion 80,33 Ronnel 43,60 Chlorpyrifos 70,97 Trichloronat 35,26 Tetrachlorvinphos 98,65 Tokuthion (Prothiofos) 37,46 Fensulfothion 50,57 Bolstar (Sulprofos) 53,62 Coumaphos 46,91

Como puede observarse en la tabla 6 los porcentajes de recuperación obtenidos con este método no son los esperados tomando como referencia los parámetros establecidos por la EPA, que señalan que el valor mínimo de recuperación aceptado es de un 70% y el valor máximo es de 130% [35]. El mayor porcentaje obtenido fue para el mevinphos con un valor de 90.01% y el menor porcentaje obtenido fue para el Trichloronat con un valor de 35,26%. Para los pesticidas

58

Demeton-S, Phorate, Demeton-O, Disulfoton y Merphos no se logró obtener ningún porcentaje de recuperación. De acuerdo a los resultados obtenidos se propuso otra metodología de extracción con un solvente de mayor polaridad (Acetonitrilo) realizando una extracción líquido-líquido por etapas basándose en recomendaciones de algunos autores [25,26]. 4.4.2 Extracción líquido-líquido por etapas con acetonitrilo. En la tabla 8 se observan los porcentajes de recuperación obtenidos con este método de extracción. Se observa que se obtienen resultados más aproximados a lo que se quiere ya que 13 de los 19 pesticidas se encuentran dentro del rango establecido por la EPA que es de 70-130 % de recuperación. Obteniéndose para el pesticida Tetrachlorvinphos el mayor porcentaje con el valor de 135.98% sobrepasando en un 5.8 % el valor máximo aceptado por la EPA. Estos resultados tan elevados, pueden ser atribuidos a interferencias en la matriz. [36]. Tabla 8. Porcentajes de recuperación para el método de extracción líquido –líquido por etapas con acetonitrilo.

El menor porcentaje de recuperación obtenido fue para el pesticida Merphos con un valor de 3,78%, este presentó un porcentaje de recuperación muy bajo, se encontró que en un método empleado por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica EPA (METHOD 507) sólo se realiza la identificación cualitativa de este compuesto porque no se ha logrado el control de precisión para realizar su determinación cuantitativamente.

Nombre del pesticida. % de Recuperación Dichlorvos 25,77 Mevinphos 58,24 Demeton-S 40,16 Ethoprophos 72,30 Phorate 58,52 Demeton-O 86,54 Diazinon 89,26 Disulfoton 74,19 Methyl parathion 124,35 Ronnel 94,77 Chlorpyrifos 106,53 Fenthion 100,48 Trichloronat 88,55 Merphos 3,78 Tetrachlorvinphos 135,98 Tokuthion (Prothiofos) 96,18 Fensulfothion 108,27 Bolstar (Sulprofos) 101,04 Coumaphos 107,73

59

Se puede observar que el método de extracción líquido-líquido por etapas y el solvente empleado fueron eficientes para los pesticidas Ethoprophos, Demeton-O, Diazinon, Disulfoton, Methyl parathion, Ronnel, Chlorpyrifos, Fenthion, Trichloronat, Tokuthion (Prothiofos), Fensulfothion, Bolstar (Sulprofos), Coumaphos los cuales superaron el 70% de recuperación; por lo contrario no fueron eficientes para los pesticidas Dichlorvos, Mevinphos, Demeton-S, Phorate, Merphos donde este porcentaje fue menor al 70% y para el Tetrachlorvinphos donde el porcentaje obtenido superó el valor máximo aceptado del 130%. Para los pesticidas Dichlorvos, Mevinphos, Demeton-S, Phorate, y Tetrachlorvinphos se tendría que evaluar otro tipo de solventes que permitan un mayor porcentaje de recuperación. En los resultados obtenidos en la extracción líquido-líquido continuo empleando concentrador Kuderna-Danish y diclorometano como solvente orgánico los pesticidas Dichlorvos, Mevinphos, y Tetrachlorvinphos presentaron porcentajes de recuperación en el rango del 70% y el 130% mostrando que para estos pesticidas es más efectiva una extracción continua con un solvente de menor polaridad. Este método presenta buenos porcentajes de recuperación además permite el rápido análisis de las muestras siendo rentable para un laboratorio. Si se comparan los resultados de los porcentajes de recuperación obtenidos con el método de extracción líquido-líquido por etapas con acetonitrilo, con otras investigaciones realizadazas para el análisis de pesticidas en ríos [3], se puede afirmar que el procedimiento de extracción es satisfactorio para los 13 pesticidas que presentaron porcentajes de recuperación en el rango del 70% y el 130%. Pues se obtienen resultados similares a este estudio que obtuvo porcentajes de recuperación entre 93.3% y 112.7%. Se utilizó diclorometano acetato de etilo (50:50) como solventes para la extracción líquido-líquido por etapas.

60

4.5 MUESTREO 4.5.1 Mediciones en los puntos de muestreo. En total se realizaron 6 muestreos en un periodo comprendido entre el 6 de diciembre del 2007 y el 30 de julio del 2008, los valores de temperatura y de potencial de hidrogeno (pH) medidos en campo se indican a continuación en las figuras 21 y 22.

Gráfica del pH frente a los puntos de muestreo de la cuenca del río Otún

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

8,50

El c

edra

l

Ant

es d

el r

íoB

arbo

Des

pués

del

río

Bar

bo

Ant

es d

el r

íoS

an J

uan

Ban

aner

a

Boc

atom

a

Des

púes

de

queb

rada

Dos

queb

rada

s

Puntos de muestreo

pH

Promedio depH

Valor máximode pH

Valor mínimode pH

Figura 21. Gráfica del pH frente a los puntos de muestreo seleccionados de la cuenca del río Otún. En la figura 21 se puede observar el comportamiento del pH frente a los puntos de muestreo seleccionados en la cuenca del río Otún. Se obtuvieron valores dentro de un rango de 6.49 y 7.84 unidades de pH y no se observan cambios bruscos en los valores determinados. Es importante mencionar que el pH afecta la estabilidad de los pesticidas organofosforados en el agua; a pH fuertemente alcalinos estos se descomponen, lo que puede ser utilizado en plantas de tratamiento de aguas para destruirlos [14]. Los pH encontrados en el momento del muestreo en las aguas del río Otún no presentan un alto grado de alcalinidad sin embargo los pesticidas organofosforados son mas estables a pH neutro y ácido, y es posible que exista hidrólisis o degradación de estos.

61

Gráfica de la temperatura frente a los puntos de muestreo de la cuenca del río Otún

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

El c

edra

l

Ant

es d

el r

íoB

arb

o

Des

pué

s de

l río

Bar

bo

Ant

es d

el r

íoS

an J

uan

Ban

aner

a

Boc

atom

a

Des

púes

de

queb

rada

Dos

queb

rad

as

Puntos de muestreo

Tem

pera

tura

( º

C) Promedio de

temperaturas

Valor máximodetemperatura

Valor mínimodetemperatura

Figura 22. Gráfica de la temperatura frente a los puntos de muestreo seleccionados de la cuenca del río Otún. En la figura 22 se puede observar el comportamiento de la temperatura frente a los puntos de muestreo seleccionados en la cuenca del río Otún; esta va aumentando con relación a la disminución de la altura sobre el nivel del mar de los puntos de muestreo de una manera razonable. Los valores obtenidos están dentro de un rango de 13.0 ºC y 23.1 ºC. Los pesticidas organofosforados presentan una alta volatilidad convirtiendo a la temperatura en un factor que altera las concentraciones de estos en las aguas. 4.5.2 Determinaciones y resultados fisicoquímicos de algunas estaciones de muestreo. Se realizó un seguimiento de los parámetros fisicoquímicos de algunas estaciones de muestreo en la cuenca del río Otún suministrados por el laboratorio de control de calidad de la empresa de acueducto y alcantarillado de Pereira con el fin de conocer los parámetros determinados por la entidad en los puntos de muestreo. El análisis de pesticidas organofosforados no es realizado en estos informes suministrados es por esta razón que la información recopilada en este trabajo es de gran importancia para la evaluación del grado de contaminación de la cuenca del río Otún por parte de estos pesticidas. En la tabla 9 se observa el promedio obtenido para los diferentes parámetros determinados.

62

Tabla 9. Parámetros fisicoquímicos determinados en algunas estaciones del río Otún Con los parámetros suministrados por el laboratorio de control de calidad de aguas y aguas se puede observar que las aguas superficiales del río Otún se encuentran en buen estado por lo tanto son de buena calidad, porque ninguno de los parámetros determinados supera los valores admisibles registrados en el decreto 1594 del 84, o que pueda influir sobre los pesticidas organofosforados. 4.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS REALES Para la determinación de pesticidas organofosforados en las muestras de agua recolectadas en las diferentes estaciones de muestreo se empleo la extracción líquido- líquido por etapas con acetonitrilo, estas se analizaron de igual manera que las muestras empleadas para la determinación de los porcentajes de recuperación para cada pesticida. Posteriormente de la extracción fueron analizadas por cromatografía de gases y espectrometría de masas por impacto electrónico con en el modo de monitoreo de iones selectivos (SIM).

Parámetro

Valor admisible decreto 1594/84 el cedral

la bananera

Temperatura ºC < 40 º C 19,5 21 Turbiedad (U.N.T) - 6,71 - Color aparente (U.P.C)) - 51,5 - pH (Unidades de pH) 5,0 - 9,0 6,82 6,99 Acidez (mg/L CaCO3) - 4,5 4,5 Alcalinidad total (mg/L CaCO3 ) - 41 82 Dureza total (mg/L CaCO3) - 70,25 - Sabor/olor - aceptable - Magnesio (mg/L Mg) - 4,87 - Calcio(mg/L Ca) - 20,34 - Conductividad a 25 º C (ms/cm) - 207,1 - Sólidos totales (mg/L) - 115 - Sólidos suspendidos (mg/L)Remo>50% en carga - 190 Grasas (mg/L) 100 - 33 Fosfatos (mg/L PO4) - 1,16 15 Aluminio (mg/L Al) - 0,0568 - Cloruros (mg/L Cl) 250 3,28 - Cobre (mg/L Cu) 3 - - Sulfatos (mg/L SO4) 400 49 - Cromo total ( mg/L Cr) 0,5 - - Detergentes (mg/L SAAM) 0,5 0,0112 0,19 Nitratos (mg/L NO3) 10 0,55 9,2 Nitritos (mg/L NO2) 0,1 0,012 0,96 Hierro total (mg/L Fe) - 0,401 - D.Q.O total (mg/L O2) - 3,5 208

63

4.6.1 Determinación de los pesticidas en las muestras de agua recolectadas. En la tabla 10 se puede observar los resultados obtenidos en el total de los muestreos realizados en la cuenca del Río Otún para la determinación de los pesticidas organofosforados pertenecientes a la mezcla RESTEK. Tabla 10. Resultados obtenidos en el total de los muestreos realizados en la cuenca del Río Otún.

*Concentraciones halladas en el muestreo realizado el 1 de julio del 2008 P1. El cedral P2. Antes del río Barbo P3. Después del río Barbo P4. Antes del río San Juan P5. Bananera

Nombre pesticida Concentración encontrada (ppm)

Concentración permitida

(ppm)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 Diclorvos (DDVP) ND ND ND ND ND ND ND 0,05

Mevinphos (Phosdrín)

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05

DemetonO & S ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Ethoprophos ND ND ND ND ND ND ND 0,05

Phorate ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Diazinon ND ND ND ND ND ND ND 0,05

Disulfoton ND ND ND ND ND ND ND 0,05

Methyl parathion ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05

Fenchlorphos (Ronnel)

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05

Fenthion ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Chlorpyrifos (Dursban) ND 0.003* 0.004* 0.008* 0.009* 0.008* 0.010*

0,05

Tricholoronat ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Merphos ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Stirofos

(Tetrachlorvinphos) ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05

Tokuthion (Prothiofos)

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05

Fensulfothion ND ND ND ND ND ND ND 0,05 Bolstar

( Sulprofos) ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,05 Coumaphos ND ND ND ND ND ND ND 0,05

64

P6. Bocatoma P7. Después de quebrada Dosquebradas Los valores de concentraciones registrados en la tabla 10 corresponden a la concentración real encontrada en la muestra de agua del río Otún, ésta se calculó empleando la fórmula 1:

Cr = Ce * Fc (Fórmula 1, para determinar la concentración real de pesticida en el río) Donde: Cr = concentración del pesticida en el río Otún Ce = concentración obtenida del pesticida en el equipo Fc = factor de concentración, este se calcula teniendo en cuenta la relación entre el volumen final al cual se concentró la muestra sobre el volumen inicial del cual se partió. Con los resultados obtenidos en la tabla 10 se puede observar que en las aguas superficiales de las zonas de muestreo seleccionadas en la cuenca del Río Otún sólo se detecta la presencia del pesticida Chlorpyrifos, en concentraciones menores a las admisibles para aguas superficiales en el articulo 45 del decreto 1594 de 1984, que es de 0.05 ppm para cada pesticida. En la zona evaluada los principales cultivos son de cebolla larga (Allium fistulosum), de café (Coffea) y otros menores como la habichuela o algunas hortalizas. Es de esperarse que en algunas épocas del año los agricultores hagan uso de pesticidas organofosforados para proteger los cultivos de factores que puedan afectar su desarrollo. Posiblemente estos pesticidas llegan a las aguas de la cuenca del río Otún por lixiviado de los suelos, por escorrentías cuando son poco absorbidos y cuando los agricultores lavan los equipos de fumigación cerca de este. Con los resultados obtenidos en las muestras de agua se puede evidenciar que el pesticida clorpirifos es utilizado en el sector evaluado. Este pesticida a pesar de que presenta poca solubilidad en el agua (2mg/L) puede encontrarse en la cuenca del río Otún en algunas épocas implicando afectación a la calidad del agua. Los valores registrados en la tabla 10 muestran buena calidad con respecto a este parámetro de las aguas del Río Otún porque los valores detectados no superan los exigidos en la legislación Colombiana, lo cual refleja la buena labor realizada por la empresa de acueducto y alcantarillado Aguas y Aguas de Pereira para la preservación del recurso hídrico de la zona evaluada. Para este análisis que evaluó el grado de contaminación por pesticidas organofosforados en la cuenca del Río Otún no se logró realizar un análisis estadístico de varianza para experimentos con un solo factor [37]. La razón de esto es que en el experimento no se obtuvieron los suficientes datos numéricos (concentraciones de pesticidas en los puntos de muestreo) para poder determinar si los puntos de muestreo influyen o no en las mediciones realizadas.

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4.6.3 Determinación de los pesticidas en las muestras de sedimentos. El análisis de sedimentos es muy empleado para la determinación de compuestos orgánicos persistentes que presenten potencialmente efectos nocivos para el medio ambiente como por ejemplo los pesticidas organoclorados. Estos son lipofílicos, persisten en diferentes medios y algunos pueden ser transportados a través de largas distancias a regiones donde no han sido utilizados. Estas sustancias tóxicas se depositan en los sedimentos debido a su baja solubilidad y a la asociación con las partículas suspendidas [35]. En la tabla 11 se puede observar los resultados obtenidos en el muestreo realizado para sedimentos en la cuenca del Río Otún para la determinación de los pesticidas organofosforados pertenecientes a la mezcla RESTEK, con código de catálogo Nº 32277, este se realizó sólo en tres estaciones porque en estas era donde había presencia de dichos sedimentos. Tabla 11 Resultados obtenidos en el muestreo realizado para sedimentos.

Nombre pesticida Concentración encontrada (ppm) Después del río

Barbo Después del río San Juan

Después de quebrada Dosquebradas

Diclorvos (DDVP) ND ND ND Mevinphos (Phosdrín) ND ND ND

DemetonO & S ND ND ND Ethoprophos ND ND ND

Phorate ND ND ND Diazinon ND ND ND

Disulfoton ND ND ND Methyl parathion ND ND ND

Fenchlorphos (Ronnel) ND ND ND Fenthion ND ND ND

Chlorpyrifos (Dursban) ND 0.002* 0.006* Tricholoronat ND ND ND

Merphos ND ND ND Stirofos (Tetrachlorvinphos) ND ND ND

Tokuthion (Prothiofos) ND ND ND Fensulfothion ND ND ND

Bolstar ( Sulprofos)

ND

ND

ND

Coumaphos ND ND ND *Concentraciones halladas en el muestreo realizado el 1 de julio del 2008 Como puede observarse en la tabla 11 en las muestras de sedimentos sólo se detectó la presencia del pesticida Chlorpyrifos en dos de las tres estaciones de muestreo evaluadas y en concentraciones menores a la permitida en aguas superficiales.

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El Chlorpyrifos es empleado para uso Agrícola, urbano, industrial, pecuario, doméstico y en jardinería. Es moderadamente persistente en suelos dependiendo del tipo de este, el clima y otras condiciones. Su movilidad en suelo es baja o nula porque se une fuertemente a las partículas, por ello son pocas sus posibilidades de lixiviarse y contaminar las aguas subterráneas. Los mecanismos de eliminación de este compuesto en el suelo incluyen la fotólisis, hidrólisis y biodegradación (vida media de 2 a 81 días), la volatilización también participa en suelos húmedos (vida media de 45 a 163 horas). En el agua la volatilización es su principal ruta de disipación (vida media de 3.5 a 20 días), seguida de la fotólisis en la superficie y la hidrólisis a altas temperaturas y pH básico [16,17]. En los dos muestreos de sedimentos realizados sólo se determinó la presencia de Chlorpyrifos el realizado el día 1 de Julio del 2008 esto muestra la posible degradación de este en los sedimentos ya que los pesticidas organoforforados no presenten una alta resistencia en el medio ambiente como si lo son los pesticidas organoclorados.

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5. CONCLUSIONES Se definieron siete puntos de muestreo estratégicos con ayuda de funcionarios de la empresa de servicios públicos y alcantarillado aguas y aguas de Pereira, los cuales permitieron llevar acabo un monitoreo que tenía como fin evaluar la posible contaminación por pesticidas organofosforados en las aguas superficiales de la cuenca del río Otún. Se logró identificar por el SCAN el total de los pesticidas evaluados en el estudio realizado, No obstante para análisis cuantitativo en los pesticidas Naled y Azinphos methyl no fue posible definir iones representativos para ser analizados por el modo SIM y no se realizó curva de calibración para estos. Se realizó la calibración de la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para 19 de los 21 pesticidas organofosforados de la mezcla marca RESTEK catalogo Nº 32277. Se evaluaron dos métodos de extracción; liquido-liquido continúa utilizando diclorometano y liquido-liquido por etapas empleando como solvente acetonitrilo, para fines de la investigación se optó por este último método obteniendo porcentajes de recuperación superiores al 70% para 14 de los 19 pesticidas evaluados. Los límites de detección LD y límites de cuantificación LC obtenidos para el método cromatográfico permiten determinar concentraciones muy bajas de los pesticidas evaluados, se obtuvieron valores alrededor de 0.006 ppm y 0.021 ppm respectivamente considerándose buenos porque permiten la determinación de los pesticidas organofosforados a nivel de trazas teniendo en cuenta que las muestras antes de ser analizadas son sometidas a un proceso de concentración de un factor de 100 veces para mejorar su detección en el equipo. Se obtuvieron muy buenos resultados coeficientes de correlación R2 en la calibración de la técnica cromatográfica con un promedio de 0.9981, siendo mayores a 0.99 mostrando una buena linealidad que al compararse con estudios realizados para análisis de pesticidas en aguas presenta valores similares a los reportados. Se logró una muy buena precisión del método cromatográfico. El promedio de RSD para las curvas de calibración es de 7.332%, siendo inferior al 10% este valor es aceptable por cumplir lo establecido por la EPA (%RSD<16%) para el análisis de trazas en muestras complejas. Además comparando los valores de RSD obtenidos con otros trabajos donde obtuvieron valores RSD de 20 % y 22% para los pesticidas analizados muestra que los valores de RSD obtenidos son comparables con publicaciones internacionales con resultados similares que reflejan su precisión.

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Se logró llevar acabo la evaluación del grado de contaminación en las aguas del río Otún generada por los pesticidas organofosforados. Obteniendo como resultado que sólo en el quinto muestreo realizado el día 1 de julio de 2008 se detectó el pesticida Chlorpyrifos en las estaciones de muestreo antes del río Barbo, después del río Barbo, después del río San Juan, la Bananera, Bocatoma y después de Quebrada Dosquebradas en concentraciones de 0.003, 0.004, 0.008, 0.009, 0.008 y 0.010 ppm, respectivamente. Estos valores se encuentran dentro del nivel máximo permitido para pesticidas organofosforados estipulado en el artículo 45 del decreto 1594 de 1984. En los puntos de muestreo después del río San Juan y después de la quebrada Dosquebradas el día 1 de julio de 2008 se detectó la concentración de 0.002 y 0.006 ppm del plaguicida Clorphirypos en las muestras de sedimentos. Lo cual contrastado con su poca solubilidad de (2 mg/L) reafirman la detección de este compuesto en los puntos de muestreo y en la matriz agua. Por ende constituye la evidencia del uso de este producto en la cuenca del río Otún y su afectación a la calidad del agua.

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6. RECOMENDACIONES. Se recomienda realizar el monitoreo en los puntos de muestreo, para el análisis de pesticidas en sedimentos y en agua simultáneamente en diferentes épocas del año, ya que para estos sólo se llevaron a cabo dos muestreos y en uno de ellos se detectó la presencia del pesticida chlorpyrifos en concentraciones menores a las permitidas en aguas superficiales (0.05 ppm), encontrándose en dos de las tres estaciones de muestreo evaluadas. Se recomienda para los pesticidas que se obtuvieron bajos porcentajes de recuperación por las metodologías de extracción evaluadas buscar otros solventes o mezcla de estos que permita su análisis. Se recomienda investigar acerca de los metabolitos o compuestos de degradación de los pesticidas organofosforados y desarrollar métodos de análisis y extracción para evaluar su presencia en aguas del río Otún. Se recomienda para estudios posteriores seleccionar como iones de referencia en el modo SIM para los pesticidas Naled y Azinphos methyl los siguientes iones: 109, 265, 322 y 221, 281, 295, 429 respectivamente para poder llevar a cabo la cuantificación de éstos.

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ANEXO 2. Certificado de análisis de la mezcla de pesticidas.

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ANEXO 3. Espectros de masa obtenidos por el método de impacto electrónico para los pesticidas del estándar.

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