Explicacion TP III Amilasa
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Química Biológica Trabajo Práctico III 1
Trabajo Práctico Nº III:
ENZIMAS: ENSAYO CUALITATIVO
Objetivos:
P Caracterizar la actividad enzimática de la -amilasa salival de forma
cualitativa.
P Determinar las propiedades de esta enzima, analizando la acción que
ejercen distintas concentraciones de la amilasa salival sobre el almidón,
así como la influencia del tiempo y la temperatura sobre la actividad
enzimática.
P Reconocer la función de la enzima en el metabolismo de hidratos de
carbono en animales monogástricos y su utilidad clínica en el diagnóstico
clínico veterinario.
Química Biológica Trabajo Práctico III 2
¿Cómo se mide la actividad de una enzima?
Sustrato/s Producto/s
detectando la aparición del producto
detectando la desaparición del sustrato.
•Técnicas colorimétricas cualitativas
(comparando visualmente el color desarrollado)
•Técnicas cuantitativas
(midiendo la absorbancia de la luz a determinada longitud de onda)
enzima
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Determinar cuáles son las condiciones óptimas para suactividad: tiempo, concentración de enzima, pH, temperatura, concentración de cofactores, inhibición o activación
¿Qué significa ...
Caracterizar la actividad de una enzima ?
-Amilasa
(endoamilasa)
Química Biológica Trabajo Práctico III 4
Características generales de las amilasas
Familia de enzimas hidrolíticas : • -amilasa uniones α-1,4 (endoamilasa)
Isoenzimas: Isoamilasa S de glándulas salivales, Isoamilasa P del páncreas
• -amilasa uniones α-1,4 (exoamilasa), libera unidades de maltosa
• Glucoamilasa uniones α-1,4 (exoamilasa), libera -glucosa
Sustrato/s Producto/senzima
• amilosa (10-20%)
• amilopectina (80-90%)
Almidón Glucosa
Dextrinas
Maltosa
O
CH2OH
HOH
HH
OH
OH
H
H
OH
-glucosidasa
-amilasa-amilasa
Dextrinasa límite
Dextrinasa límite
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DEXTRINA
LÍMITE:
Las dextrinas límite
contienen unidades de
glucosa unidas por enlaces
1-4 y 1-6.
No pueden ser hidrolizadas
por las -amilasas.
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Significancias clínicas
En el caso del hombre y el cerdo, la amilasa se produce principalmente en el páncreas y en cantidad mucho menor en las glándulas salivales. Exceptuando al cerdo, el resto de los animales domésticos, producen únicamente amilasa de origen pancreático.
La detección de niveles aumentados en suero sanguíneopermite sospechar una disfunción del páncreas y/o de la glándula parótida. Sin embargo, como por sí sola no permite hacer una diferenciación, se debe recurrir a exámenes complementarios.
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Amilosa
Amilopectina
enlaces glucosídicos.
enlace -1,6
enlace -1,4
enlace -1,4
+ I2 azul
+ I2 rojo
almidón
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Fundamento del TP
Análisis cualitativo para medir la actividad de la -amilasa
test colorimétricocon Lugol
A través de
presencia de
almidón
revela
desaparición del sustratoSe analiza
El almidón en presencia de una solución de iodo
presenta una coloración azulada.
“efecto acromático”
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Variables que se analizarán sobre la actividad de la
enzima -amilasa salival:
•concentración de enzima [E],
•tiempo de reacción,
•temperatura (T°).
En el TP
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Desarrollo del TP
Recolección de saliva baño de hielo y pH
Experimento 1. Dilución óptima de la concentración de enzima y
tiempo de referencia
a) Obtención de la Enzima: Diluir la saliva en un tubo de ensayo, 1:10
(1 mL saliva + 9 mL agua destilada). Mezclar sin agitar y medir pH.
b) Determinación de la actividad enzimática:
1. Colocar el sustrato en un baño térmico a 37°C durante 2 min.
2. Agregarle 1 mL de la saliva diluida (enzima), tapar con tapón de
goma y mezclar por inversión. Tubo S+E
cuál?
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Tubo Tubos con lugol Test colorimétrico Color azul
Agua dest. Lugol Tubo (S+E) (+, ++, etc.)
1-control 5 ml 3 gotas --- tiempo
2 5 ml 3 gotas 3 gotas 0
3 5 ml 3 gotas 3 gotas 1 min
4 5 ml 3 gotas 3 gotas 2 min
5 5 ml 3 gotas 3 gotas 3 min
6 5 ml 3 gotas 3 gotas 4 min
7 5 ml 3 gotas 3 gotas 5 min
8 5 ml 3 gotas 3 gotas 6 min
9 5 ml 3 gotas 3 gotas 7 min
10 5 ml 3 gotas
Mez
clar
con a
git
. vort
ex
3 gotas 8 min
Mez
clar
con a
git
. vort
ex
No lleva enzimaSe enfrentan
al Lugol
Registrar el tubo en el cual NO se produce color azul (corresponde al tiempo
en que no hay más almidón disponible para la enzima)
“efecto acromático”
sin
Química Biológica Trabajo Práctico III 14
A tiempo 0 agregar 1 mL dilución saliva (enzima), mezclar y cada 60 seg sacar 3 gotas y realizar test colorimétrico
AMILASAS: Hidrólisis del almidón
El almidón en presencia de una solución de iodo (Lugol) presenta unacoloración azulada Se analiza desaparición del sustrato “efectoacromático”.
Ensayo Cualitativo por Desaparición de Sustrato
pag 15
Almidón + Saliva 37 °C + Lugol
Almidón 37 °C + Lugol
“efecto acromático”
Química Biológica Trabajo Práctico III 16
Si el tiempo del efecto acromático está entre 3 y 8 min ok.
Si el tiempo es > 8 min diluir menos la saliva
Si el tiempo es < 3 min diluir más la saliva
Experimento 2. Efecto del pre-tratamiento de la enzima con calor(100°C)
Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de la saliva a la diluciónóptima e incubarlo 10 min en un baño de agua a 100°C.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Medir la actividad enzimática como se detalló anteriormente
- Determinar el tiempo necesario para que se produzca el efecto acromático.
- Comparar con el tiempo de referencia.
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Experimento 3. Efecto de la temperatura sobre la actividadenzimática
- Medir la actividad enzimática como antes, empleando 1 mL de lasaliva a la dilución óptima pero incubando a temperaturas
- a) 0°C (baño de agua y hielo) ,
- b) temperatura ambiente,
- c) 70°C.
- Determinar en cada caso el tiempo necesario para que se produzca el efecto
acromático.
- Comparar con el tiempo de referencia.
Sustrato: almidón 1 %
Baño a 0 °C
Sustrato: almidón 1 %
a T° amb
Sustrato: almidón 1 %
Baño a 70°C