INDICECINÉTICA ENZIMÁTICA.................................................................................................................2

I. INTRODUCCION.-..................................................................................................................2

II. MARCO TEORICO.-................................................................................................................2

2.1. ENZIMA.-......................................................................................................................2

2.2. LOS FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA SON:.................................2

2.2.1. Concentración de enzima.....................................................................................2

2.2.2. Concentración de sustrato....................................................................................3

2.2.3. pH.........................................................................................................................3

2.2.4. Temperatura.........................................................................................................3

2.3. ENZIMAS COMO CATALIZADORES.-................................¡Error! Marcador no definido.

2.4. GRAFICA DE REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER-BURK.-.............................................6

2.5. GRÁFICA EADIE-HOFSTEE.-...........................................................................................6

2.6. GRAFICA HANES-WOOLF.-...........................................................................................8

III. BIBLIOGRAFIA.-.................................................................................................................9

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CINÉTICA ENZIMÁTICA

I. INTRODUCCION.-

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, éstas muestran (además del fenómeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima.

Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo, si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye según avanza la reacción. Una simplificación en los experimentos cinéticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminución de sustrato será mínima y ésta podrá considerarse, por tanto, casi constante.

II. MARCO TEORICO.-

II.1.ENZIMA.-

Las enzimas son proteínas (RNA) que catalizan reacciones químicas en las células.

Cada enzima es altamente específica para la reacción que cataliza.

Esta especificidad está determinada por el centro activo de la enzima (en donde se hallan los grupos químicos responsables de la catálisis).

Muchas enzimas necesitan co-factores (co-reactivos, co-sustratos) para cumplir su función catalítica. Son Proteínas de alto peso molecular (macromoléculas, 104 a 106 g/mol, 102 a 104 aminoácidos) Su actividad depende de la integridad de su conformación proteica.

Metales pueden formar parte de su centro activo, o de otra parte de la enzima (co-factor).

Los reactivos de las reacciones catalizadas por enzimas se denominan sustratos.

Los enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.El sitio activo es lugar de unión del sustrato a la enzima y donde se lleva a cabo la catálisis. La especificidad del sustrato depende del tamaño, estructura, cargas, polaridad carácter hidrófobo.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de las enzimas

II.2.LOS FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA SON:

II.2.1. Concentración de enzima

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Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite.

II.2.2. Concentración de sustrato

A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción.

II.2.3. pH

La mayoría de las enzimas tienen un pHcaracterístico al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

II.2.4. Temperatura.

Al igual que sucede con la mayoría de las reacciones químicas, las reacciones enzimáticas incrementan su velocidad con la temperatura.

La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.

El pico de la gráfica al representar la actividad catalítica respecto a la

temperatura se debe a que las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por acción del calor y se inactivan a partir de cierto punto.

A partir de los 55-60 ºC la mayor parte de las enzimas se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas siguen siendo

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activas a temperaturas superiores a los 85 ºC.

II.3.MODELO DE MICHAELIS-MENTEN

Las enzimas aumentan las velocidades de las reacciones químicas sin ser alteradas en el proceso de conversión de reactivos a productos esta conducta define, precisamente, a un catalizador Las enzimas aumentan las velocidades de reacción disminuyendo la cantidad de energía requerida para formar un complejo reactivo, activado, competente para formar productos esto ocurre por medio de la formación de un complejo entre la enzima y el sustrato (ES).

La Figura muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción catalizada por un enzima.

Figura 01: Cinética enzimática. Modelo de Michaelis-Menten.

La velocidad de una reacción catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por “U” (unidad de actividad enzimática) y corresponde a los µmoles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los µmoles de producto formado en 1 min.

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U ≡ µmol S/min ≡ µmol P/min

La curva que expresa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayoría de las enzimas; se trata de una hipérbola rectangular, cuya expresión algebraica viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten, donde muestra la relación entre la velocidad inicial (Vo) y la concentración de sustrato, S.

Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente.

La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace independiente de la concentración de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor máximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que tengamos.

La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato.

A partir de la ecuación de Michaelis-Mente podemos explicar matemáticamente las tres fases de la curva de la figura 1.

Así:

A baja [S], es decir si Km >>> [S], el término Km+[S] podemos aproximarlo a la Km, quedando un expresión del tipo:

V=K ´ [S ]

Esta es una cinética de primer orden, que se caracteriza por una variación lineal de la V respecto al tiempo, como tiene lugar en la primera fase.

A altas [ S], es decir, Km<<<<[S], despreciaríamos Km frente a [S], con lo que V = Vmax (que sería constante); la cinética es de orden cero y se habría alcanzado la saturación por sustrato, como ocurre en la fase final.

El tramo intermedio, en el que la [S] ≈ Km correspondiente a una cinética de orden mixto y se ajusta a la ecuación de Michaelis.

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En muchos casos es de vital importancia conocer estos parámetros cinéticos. En principio, podrían obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis Menten, para lo cual sería preciso primero obtener el valor de la Vmax y después, teniendo en cuenta que la Km es la concentración a la cual la velocidad es la mitad de la velocidad máxima, podríamos obtener su valor. Pero existen métodos gráficos más fiables que facilitan el cálculo preciso de la Km y la Vmax.

II.4.GRAFICA DE REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER-BURK.-

Una de las expresiones más utilizadas es la representación de Lineweaver-Burk (Figura 2). En esta forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la velocidad frente a la inversa de la concentración (de ahí que también la representación sea conocida como de dobles inversos), así se obtiene una recta cuya intersección con el eje X es –1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Figura 02.- representación de Lineweaver-Burk

De esta forma, y una vez hecha la representación, podemos extrapolar el valor de X para Y=0, o el de Y, cuando X=0, y obtener haciendo el inverso de los valores (y teniendo en cuenta el signo) el valor de Km y Vmax.

La obtención de la Km y la Vmax de una enzima, es importante no sólo porque son parámetros que la identifican, sino también por motivos que, en ocasiones, pueden ser de vital importancia.

II.5.GRÁFICA EADIE-HOFSTEE.-

Eadie-Hofstee propusieron otro método para graficar los datos cinéticos, éste método consiste en multiplicar ambos lados de la ecuación del recíproco por v0Vmax

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Rearreglando:

SIGNIFICADO DE KM

KM Es un parámetro de afinidad con el sustrato. Mientras mayor sea KM la unión es más débil.

Representa la concentración de sustrato a la cual la mitad de los

sitios activos de la enzima están ocupados por moléculas de sustrato.

El valor de KM varía considerablemente de una enzima a otra.

KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH, fuerza iónica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema enzima-sustrato en particular.

Para la mayoría de las enzimas, KM está entre 10-1 M y 10-7 M

SIGNIFICADO DE VMAX Y K2

Como su nombre lo indica, Vmax representa la máxima velocidad que puede alcanzarse.

De acuerdo con la ecuación, Vmax = k2[E]0, si se conoce la concentración de enzima, se puede determinar también la constante k2.

k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de tiempo-1. En cinética enzimática k2 se conoce también como número de recambio de la enzima ó constante catalítica, kcat.

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El número de recambio de una enzima se define como el número máximo de moléculas (o moles) de sustrato que se converten a producto por unidad de tiempo. La mayoría de las enzimas tienen números de recambio entre 1 y 105 s-1 en condiciones fisiológicas.

II.6.GRAFICA HANES-WOOLF.-

En bioquímica, el diagrama Hanes–Woolf se emplea como herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima. En él se representa la relación concentración de sustrato/velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato [S]. Es una de las formas de linealizar la ecuación de Michaelis-Menten.

Donde:

V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaeli -Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato.

La ecuación se puede obtener a partir de la de Michaelis siguiendo los siguientes pasos:

Invirtiendo y multiplicando por [S]:

Redondeando:

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III.BIBLIOGRAFIA.-

Bioquímica. (2004). Devlin, T. M. 4ª edición. Reverté, Barcelona.

Bioquímica 3ª Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.

Bioquímica Médica. (2009) Pacheco Leal D. Limusa.

Bioquímica de los procesos metabólicos 2ª Edición (2006) V. Melo, O Cuamatzi. Reverté.

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