Expresión de proteínas recombinantesen levaduras

Mercedes GoinLaboratorio Denver Farma

Área Biotecnología

Elección del sistema de expresión

Complejidad de la molécula: estructura terciaria y

cuaternaria, modificaciones postraduccionales

Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico

Cantidad de producto

Economía

Aspectos regulatorios

Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores.

Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).

En general las proteínas tendrán metionina N-terminal.

Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión.

No produce eventos postraduccionales.

Endotoxinas

BACTERIAS

Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores.

Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).

Introduce modificaciones postraduccionales.

La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas”

La proteólisis suele ser un problema.

LEVADURAS

CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Los cultivos en grandes escalas son difíciles de

realizar y muy costosos.

Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1

g/L).

Se producen modificaciones postraduccionales.

Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de

expresión posible.

PLANTAS

Se producen modificaciones postraduccionales

Expresión localizada en diferentes órganos

Expresión en estadíos específicos del crecimiento

Crecimiento en campo barato

La glicosilación es distinta que la de mamíferos

Eficiencias bajas de transformación y expresión

Seguridad controvertida

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN

LEVADURAS

Levaduras

E. coli

Cel. Eucariotas superiores

Producción de proteínas biofarmaceúticas

Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.

Saccharomyces cerevisiae

Vectores de Saccharomyces cerevisiae

2,8-0,2 %10425-200ORI/STB/REP

/FLP

Basados en 2µ (YEp)

1 %1041-2ARS/CENCentroméricos (YCp)

20 %1041-20ARSReplicadores (YRp)

Episomales

Establend100-200ADNrADNr

Estable101ADN homólogoReemplazo

0,1 %102≥ 1ADN homólogoYIp

Integrativos

Inestabilidad mitótica (b)

Frec. trans-formación (a)

Nº de copias /célula

Secuencias de levadura

Vector

(a) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos(b) Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.

Integración cromosómica de ADN por recombinación homóloga

Vectores de Saccharomyces cerevisiae

2,8-0,2 %10425-200ORI/STB/REP

/FLP

Basados en 2µ (YEp)

1 %1041-2ARS/CENCentroméricos (YCp)

20 %1041-20ARSReplicadores (YRp)

Episomales

Establend100-200ADNrADNr

Estable101ADN homólogoReemplazo

0,1 %102≥ 1ADN homólogoYIp

Integrativos

Inestabilidad mitótica (b)

Frec. trans-formación (a)

Nº de copias /célula

Secuencias de levadura

Vector

(a) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos(b) Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.

Marcadores de selección

1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en

cepas auxotróficas.

Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas

para leucina, triptofano, uracilo e histidina

2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de

cepas.

Ej: Tn903kanr: selección con G418

DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida

Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol

Promotores y terminadores transcripcionales

Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables

Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa

GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa

ADH: alcohol deshidrogenasa

Son inducidos varias veces por glucosa

Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.

Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa

Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL

Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2µ

Secreción de proteínas en Saccharomycescerevisiae

¿Para qué?

Plegamiento correcto

Evitar efectos tóxicos

Facilita la purificación

Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbico

propio de levaduras

MFα1: feromona

SUC2: invertasa

PHO5: fosfatasa ácida

Construcción del gen para expresar en levaduras

• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción

• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentementeAAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción

• 3- Uso de codones propios del sistema

• 4- Usar ADNc

• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.

• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado

•La mayoría son promotores constitutivos.

•Falta de promotores fuertes. El producto representa

1-5% del total de las proteínas producidas.

•Inestabilidad plasmídica.

•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.

Problemas asociados a la producción en S. c.

Casi todos los productos derivados de levaduras

que están en el mercado son producidos en

Saccharomyces cereviciae

2009: la FDA apueba la 1era proteína

biofarmaceútica producida en una levadura

distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína

producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.

LEVADURAS METILOTRÓFICAS

• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C

• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente

escalable a grandes volúmenes de producción

• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas

con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar

rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles

celulares.

• Sistema actualmente muy difundido

Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Candida boidinii

Pichia methanolica

Pichia pastoris

Pichia pastoris

•Son las primeras enzimas del camino metabólico de

metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.

•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de

homología

•AOX esta constituída por un octámero de subunidades

idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.

ALCOHOL OXIDASA

PEROXISOMA CITOSOL

CH3OH

O2 AOX GSH FDH

H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2

CATALASA FLDH NAD NAD

1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2

Xu5P

GAP DHA

1/3 GAP constituyentes

DHA DHAP celulares

ATP

ADP FBP F6P

GAP P2

CH3OH

•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células

compensan esta baja actividad catalítica sintetizando

grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras

metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,

mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de

las proteínas celulares solubles.

•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.

Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil

Inductor: Metanol

Represor: glucosa, glicerol, etanol

Peroxisomas

Vectores de expresión para Pichia pastoris

Inducción con metanol

Cepa a transformarHis-: GS115

Inducción con glucosa o glicerol

Reemplazo génico

Integración del ADN en genoma

Inserción génica

Recombinación homóloga

Inserción génica en AOX

Reemplazo génico

Vectores de expresión para Pichia pastoris

Inducción con metanol

Cepa a transformarHis-: GS115

Medio MD Medio MM

Muts

Muts

Mut +

Selección de cepas recombinantes

His+Mut+ e His+Muts

Confirmación por PCR y Southern blot

Selección de cepas recombinantesHis+Mut+ e His+Muts

MD MM

Caracterización del producto de expresión

SDS PAGE +/- DTT Western blot

Caracterización de la cepa productora

PCR: presencia y estabilidad del gen

Southern blot: Mut+/Muts

Dot Blot: Nº de copias del gen

PCR cuantitativa: Nº de copias del gen

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos

GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS

1- N- GLICOSILACIÓN

2- O- GLICOSILACIÓN

Glicosilación de proteínas

• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi

donde los hidratos de carbono sufren modificacines

• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la

misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También

ocurre O-Glicosilación.

• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150

manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones

terminales α 1-3 glicano

N- GLICOSILACIÓN

“Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier

aa menos Prolina

Asn

Ser/Treo

α - manosa

α – 1,2 manosa

O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS

Sequon? Abundancia inusual de ser/treoProlinas cerca de ser/thraa cargados cerca de ser/treo

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos

Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos

Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras

Tunicamicina

Cepas mutantes

Enzimas para desglicosilar

No usar la vía de secreción

Mutagénesis dirigida

Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas

La productividad de un sistema recombinante estádeterminada por muchos factores genéticos y fisiológicos.

Posibles cuellos de botella:

♣ Uso de codones

♣ Número de copias del gen

♣ Transcripción eficiente usando promotores fuertes

♣ Señales de traducción

♣ Translocación determinada por el péptido señal

♣ Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi

♣ Secreción

♣ Proteólisis

Cambio de escala

2.5 l Fermenters, with 1.5 l working

volume

50 mlShake-flask

cultures20 l Fermenters, with 15 l working

volume

400 l Fermenters, with 300 l working

volume

COSECHA CENTRIFUGACIÓN

¿Qué construcción?

¿Qué promotor?

¿Qué precursor?

¿Qué péptido señal?

Selección del clon Nivel de expresión proteica

Fenotipo Mut

Nº de copias del gen