Expresión de genes foráneos en levadura: una revisión

INTRODUCTION

La levadura Saccharomyces cerevisiae tiene varias propiedades que se han establecido como una herramienta importante en la expresión de proteínas extrañas a la investigación, industriales o de uso médico. Como un organismo alimentario, es altamente aceptable para la producción de proteínas farmacéuticas. En contraste, Escherichia coli tiene pirógenos de la pared celular tóxicos y células de mamífero puede contener ADN oncogénico o viral, de modo que los productos procedentes de estos organismos deben ser probados más extensamente. La levadura se puede cultivar rápidamente en medios simples y a alta densidad celular, y su genética son más avanzadas que cualquier otra eucariota, de manera que se puede manipular casi tan fácilmente como E. coli. Como un eucariota, la levadura es un organismo huésped adecuado para la producción de alto nivel de secretada, así como proteínas citosólicas solubles.La mayoría de los vectores de expresión de levadura se han basado en el plásmido de copias múltiples 2p y contener secuencias para la propagación en E. coli y en la levadura, así como un promotor de levadura y el terminador de la transcripción eficiente del gen extraño (Figura 1). La reciente expansión rápida en la levadura de la genética molecular ha dado lugar a un gran aumento en nuestra comprensión de estos componentes, y como resultado ahora hay una desconcertante variedad de sistemas y métodos para la propagación de ADN extraño en la levadura promotor. En muchos casos se han empleado nuevos enfoques ingeniosos, por ejemplo, en el aumento de la fuerza de los promotores nativos o la estabilidad de los vectores de expresión. Haremos lo posible para revisar las opciones disponibles en la actualidad y cómo se relacionan con diferentes necesidades.La inserción de un gen extraño en un vector de expresión no garantiza un alto nivel de la proteína extraña; la expresión génica es un proceso de múltiples pasos complejos y pueden surgir problemas en numerosas etapas, a partir de la transcripción a través de la estabilidad de proteínas. En el pasado, la expresión del gen heterólogo a menudo ha sido tratada empíricamente-un número de organismos huésped podría ser probado para la expresión exitosa y bajos rendimientos o fallos se pasó por encima. Con frecuencia, se habían hecho conclusiones inapropiadas, por ejemplo, aproximadamente relativas fortalezas promotor, simplemente a partir del conocimiento del vector de entrada y la final nivel de estado estacionario de la proteína extraña. Sin embargo ahora hay una considerable experiencia acumulada en la expresión de genes foráneos en la levadura. En muchos casos, esto ha llevado a la identificación de un problema particular en una etapa específica en la cadena de eventos, y a continuación, a menudo a su solución. Entre los eucariotas levadura ofrece posibilidades sin precedentes para la resolución de tales problemas a causa de la potencia de la genética clásica y molecular combinados. Hemos tratado de dibujar junto ejemplos de esto en la literatura, y de nuestra propia experiencia. Estos deben ser útiles para predecir y resolver problemas con nuevos genes, y debe ser aplicable, en muchos casos, a otros sistemas de expresión, procariota y eucariota.La secreción de proteínas extrañas que son secretadas de forma natural es a menudo necesaria para su correcto plegamiento, y es altamente ventajoso debido a la pureza inicial del producto en el medio de cultivo substancialmente libre de proteína. Aunque ha habido varios éxitos comerciales que utilizan la levadura, la zona se ha presentado con frecuencia problemas, sobre todo para las grandes proteínas. A pesar de una mayor comprensión de los procesos de secreción, el mayor éxito en la mejora de los rendimientos en los últimos años ha estado con un enfoque clásico mutagénesis aleatoria.

Un número de otras levaduras se han convertido en importantes organismos huésped para la expresión de gen extraño debido a las ventajas en la fuerza del promotor, la eficiencia de la secreción, o la facilidad de crecimiento a alta densidad celular. En el futuro algunos de estos a menudo se utilizan en lugar de S. cerevisiae. Por ello, hemos dedicado una sección importante a discutir otras levaduras Pichia pastoris, en particular en los que hay muchos ejemplos de expresión de alto nivel.Un área que a menudo es ignorado por los biólogos moleculares, sino que debe ser considerado desde el principio en el diseño vectorial es la fisiología de expresión de genes foráneos. Esto incluye la fisiología del crecimiento de alta densidad celular y la inducción del promotor, así como el efecto de expresar una proteína extraña sobre el metabolismo de la célula huésped. Nos hemos reunido ejemplos de la toxicidad de proteínas extrañas y su efecto en la causa de selección de variantes que expresan ofgenetic rendimientos más bajos, en muchos casos, estos efectos pueden ser controlados. Por último, vamos a discutir las consideraciones implicadas en la ampliación y optimización fermentador industrial a través de ejemplos con diferentes sistemas promotores de S. cerevisiae y Kluyveromyces lactis y con P.pustoris.

TRANSFORMACIÓN Y SELECCIÓN MARCADORESTransformación.Los primeros métodos para la transformación de S. cerevisiae involucrados eliminación enzimática de la pared celular para producir esferoplastos que podría tomar el ADN en el tratamiento con calcio y polietilenglicol. Los transformantes se sembraron en una parte superior de agar selectivo, isotónica para la regeneración de la pared celular. Un método más conveniente se desarrolló más tarde en el que las células de levadura intactas se hicieron competentes por tratamiento con iones de litio '*' Este método es ahora ampliamente utilizado a pesar del hecho de que da frecuencias más bajas;.. Una variación utilizando DMSO aumenta la frecuencia de 25-f0ld '~ Más recientemente, un tercer enfoque, la electroporación, se ha usado, y un método altamente eficiente ha sido reportado por Meilhoc et.El proceso de transformación parece ser algo mutagénica, tanto para el anfitrión y para el introducido DNA.72 Sin embargo la frecuencia de la mutación es lo suficientemente baja que no debe ser una preocupación importante aquí. También, Danhash et al.83 han informado de que la transformación induce un fenotipo hereditario de bajo crecimiento en S. cerevisiae.Un factor importante a considerar en la expresión de genes extraños es la amplia variación frecuente en la productividad de los diferentes transformantes cuando se utilizan vectores de 2p. Esto parece ser debido a una variación estable inexplicable en el número de copias del plásmido entre los diferentes transformantes ^. ^ ^ "^ ^ ^ Es evidente, por lo tanto es importante analizar un número de transformantes cuando optimizar la expresión.

Marcadores de selección auxotróficas

Marcadores de selección auxotróficasLas primera y más comúnmente utilizado marcadores para la selección de transformantes fueron LEU2, TRPI, URA3, HIS3 y se utiliza en las cepas mutantes correspondientes que se auxótrofo para leucina, triptófano, uracilo e histidina, respectivamente (Tabla 1). Estas cepas están ampliamente disponibles, y algunos contienen no reversible alelos mutantes construidos para dar bajas tasas de fondo en las transformaciones. Selección Continuación requiere el uso de medios de crecimiento que carecen de los nutrientes mínimos relevante. Vale la pena señalar que TRPI y URA3 vectores se pueden seleccionar en la presencia de hidrolizados de proteína de ácidos (que carecen de triptófano y uracilo, por ejemplo, casamino ácidos) que a menudo se añade a los medios de comunicación semidefinida con el fin de mejorar las tasas de crecimiento.Una variante de uso frecuente de LEU2, LEU2-d, 24 tiene un promotor truncado y se expresó mal, de modo que su selección da lugar a números de copias de plásmidos muy alto. "'Selección directa de transformantes con este marcador es ineficiente y requiere el sphaeroplast método, a pesar de los bajos niveles se pueden obtener usando el método de litio, si las células se incuban durante la noche en medio no selectivo antes de la selección. los vectores que contienen tanto LEU2-d y otro marcador, por ejemplo, URA3, se puede mantener en cualquiera de las copias de alta o baja número dependiendo de la selección utilizado. Loison et al.237 utiliza un vector de expresión que contiene estos marcadores para el antígeno P28 esquistosomiasis-I y producto obtenido en el 3% de la proteína celular total (TCP) en un medio deficiente en uracilo O 25% en leucina-medio deficiente. Loison et también construyó un promotor-defectuoso alelo URA3, URA3-d, que da alto número de copias en un medio deficiente en uracilo.URA3 y LYS2 son particularmente versátil en el que también hay métodos para contra-selección del marcador. Por lo tanto uru3 las células pueden ser seleccionados por su resistencia a la antimetabolito de ácido 5-fluoro-orótico tóxico, 37 y LYS2 las células se pueden seleccionar para la resistencia al ácido un-aminoadípico. Estos métodos se pueden utilizar ya sea para seleccionar mutaciones en las cepas prototróficas o para seleccionar para la pérdida de plásmido en los transformantes.

Figura 1. 2µ vectores de expresión basados en S. cerevisiae para basan en promotores galactoseinducible. (a) pWYG4 tiene 2p elementos ORI-STB, el promotor GALI, y 2p D gen terminator, un sitio de clonación NcoI que contiene elATG se utiliza para insertar genes extraños. (b) pWYG7L tiene intacta 2µ ORI, STB, REPI y REPZ, el GAL7promoter y utiliza theFLPterminator; extranjero genes se insertan en el polienlazador con sus extremos 5 'en el BmHI o NcoI sitio.

Marcadores seleccionables dominantesMarcadores dominantes son útiles ya que aumentan la variedad de cepas huésped que pueden ser probados para incluir prototrófica y cepas industriales de S. cerevisiae, y se puede utilizar para la selección en medio rico. Como la mayoría de las cepas son sensibles al antibiótico aminoglucósido G418, el marcador de resistencia a G418, codificada por el transposón Tn903 de E. coli, se puede utilizar, aunque es ineficaz en la selección directa de transformantes transformants.frequencies están previstas aceptables se incuban durante la noche en no a medio selectivo antes de la extensión en placas en G418agar. El uso de glicerol en lugar de glucosa como fuente de carbono durante la selección reduce el número de colonias no transformadas mutantes resistentes a G418 que surgen. "Se necesitan múltiples copias de el marcador de resistencia a G418 Tn903 para conferir resistencia en células de levadura a menos que se utiliza un promotor de levadura, en cuyo caso es activo en una sola copia. Puede ser prudente para omitir la selección con antibióticos que afectan a ribosomas, tales como G418, durante la inducción de vectores de expresión debido a la posibilidad de aumento de la incorporación errónea de aminoácidos. Otros marcadores de resistencia a antibióticos que han sido utilizados con éxito en la levadura son BI5O higromicina y la resistencia al cloranfenicol.Cobre-resistencia en la levadura es conferida por múltiples copias del gen CUP1 y por lo tanto puede ser utilizado como un marcador dominante en las cepas sensibles (CUPIS). Se ha

demostrado ser útil en vectores multicopia, en particular con las cepas industriales. Otros dos marcadores que pueden ser utilizados para el vector de número de copias de la amplificación por el aumento de selección de medicamentos son los virus del herpes simple gen de la timidina quinasa y la dihidrofolato reductasa.AutoselecciónUna serie de "sistemas de autoselección" se han ideado para garantizar que la selección del plásmido se mantiene, independientemente de las condiciones de cultivo. Bussey y Meaden "mostraron que la expresión de un ADNc que codifica la toxina asesina de levadura y el gen de la inmunidad se podrían utilizar para la auto-selección de transformantes de levaduras de laboratorio o industriales desde plásmido libre de células se matan por las células que contienen el plásmido. otro sistema se ha utilizado el pombe gen de triosa fosfato isomerasa de Schizosaccharomyces para estabilizar plásmidos en las células que carecen del gen de S.cerevisiae activa, durante el crecimiento en glucosa.Loison et al. Utilizado ura3 piel 1 cepas como anfitriones de plásmidos que contienen el gen URA3. Estos son no viable ya que se bloquean tanto en la de novo y vías de salvamento para la síntesis de uridina 5'-monofosfato; mantenimiento de un plásmido URA3 es ese caso, obligatoria para la viabilidad incluso en uracilo que contienen los medios de comunicación. Puesto que el doble mutante sin plásmido es no viable, el transformante se obtuvo por acoplamiento de un 1 cepa de piel con una cepa ura3 que contiene el plásmido URA3, y seleccionando el plásmido que contiene ura3 de piel 1 progenie. Posteriormente, Loison et 1. fueron capaces de aislar directamente espontáneos de piel 1 mutantes ura3 a partir de células transformadas con un plásmido URA3 mediante la selección para la resistencia a 100 pg / ml de 5-fluorouracilo y luego cribado de colonias resistentes para la resistencia a 300 pg/ml5-fluorouridine.We han encontrado que es posible generar URA3 transformantes estables por una sola selección directa en 1,3 mg / ml (10 mM) 5-fluorouracilo al que únicamente las pieles 1 mutantes deben ser resistentes. fig 2.Vectores episomalesReplicones extracromosómicos se basan ya sea en plásmidos de levadura containin replicación autónoma secuencias (ARS) que funcionan como orígenes de replicación, o en el círculo 2p nativa de Saccharomyces ".Una enumeración conteniendo tanto episomal y la integración de vectores ha sido elaborado por los padres.Vectores ARSARS vectors están presentes en múltiples copias por célula (1 a 20), pero aremitotically altamente inestable, libre de plásmidos células de la acumulación a una velocidad de hasta 20% por generación sin selección, debido a la ineficiente la transmisión a las células hijas durante la division.celularesIncluso cuando se cultivan bajo selección de la proporción de las células que contienen el plásmido pueden ser muy bajo, dando una número de copias media correspondientemente baja. ARS vectores se pueden estabilizar mediante la adición de la levadura secuencias centroméricas (CEN), pero el número de copias se reduce luego a 1 o 2 por célula. "En la práctica ARS Vectores casi nunca se usan para el gen extraño expresión y ARSICEN vectores sólo se utilizan donde se desea bajo nivel de expresión.2µ vectores basadosCon mucho, los vectores de expresión más utilizados se basan vectores lanzadera de E. coli-levadura en 2µ 2µ es un 6,3 kb plásmido presente en la mayoría de las cepas de Saccharomyces en alrededor de 100 copias por haploides genoma (figura 3). El plásmido codifica cuatro genes: FLP (o A), Sust. (o B), REP2 (o C) y D. Además, 2p contiene un origen de replicación (ORI, que se comporta como un típico ARS elemento), el locus STB (necesarias en cis para la estabilización), y dos 599 bp secuencias repetidas invertidas. FLP codifica una recombinasa específica de sitio que promueve

Figura 2. Estabilidad de un vector URA3 en las cepas de tipo salvaje y 5-fluorouracilo-resistente. Un vector de expresión de P-galactosidasa (pWYG4-lac z) se introdujo en la cepa KY 117 y mutantes espontáneos resistentes a 10 mM-5-fluorouracilo fueron de tipo selected.Wild (1) y mutante (2) transformantes se cultivaron durante diez generaciones en medio inductor no selectivo, a continuación, se sembraron en placas no selectivas que contienen XGal y galactosa a ensayo para la expresión de P-galactosidasa. Las colonias blancas, lo que indica la pérdida de plásmidos, no estuvieron presentes en la cepa mutante. Esto indica autoselección del vector en la cepa 5-fluorouracilo-resistente.

Figura 3. Las dos formas del plásmido 2µ. Cis-elementos se muestran como cajas y genes llenas de cajas abiertas, regiones repetidas invertidas están alineados; véase el texto para una descripción detallada.

mover de un tirón sobre los objetivos de recombinación FLP (FRT) dentro de las repeticiones invertidas, por lo que las células contienen dos formas de 2µ, A y B.A pesar del hecho de que no le confiera el fenotipo conocido y de hecho puede ser ligeramente desfavorable para la celula huesped 2µ se hereda de forma estable, libre de plásmidos células surgen a razón de 1 en lo 4 por generación. Esto se logra mediante dos mecanismos: (1) por parte la superación del

fuerte sesgo materna en el plásmido transmisión, y (2) por amplificación para corregir las fluctuaciones en el número de copias causadas por ineficiente transmisión.Segregación eficiente depende de que el STB locus en cis y los 1y REP2 productos génicos REP.La amplificación supera la regulación de acogida que restringe cada origen de replicación a una iniciación por ciclo celular, sino que parece depender de la repetición invertida secuencias y el producto del gen FLP. según el modelo propuesto por Futcher, FLP promueve recombinación entre replicado y no replicado ADN que se produzca la inversión y dos replicación horquillas pueden seguirse unos a otros alrededor del círculo. Replicación termina después de una segunda recombinación, y recombinación adicional genera 2µ múltiple monómeros.

Los vectores 2p 2p simples contienen la ORI-STB, un marcador seleccionable de levadura, y el plásmido bacteriano secuencias (por ejemplo pWYG4, Figura l), y se utilizan en una 2p + cepa de acogida que suministra rEPL y REP2 proteínas. Vectores de expresión ORI-STB son los más cómodo de usar de forma rutinaria en el laboratorio debido a su pequeño tamaño y facilidad de manipulación. Son diez veces más estables que los plásmidos ARS, perderse en 1 a 3% de las células por generación en no selectivo condiciones, y están presentes en 10 a 40 copias por célula. En las células 2p libres de tales plásmidos se comportan como vectores del ARS. Vectores ORI-STB de uso común contener un fragmento EcoRI de 2,2 kb o un 2,1 kb Hind111 fragmento de la forma B de 2p, cada uno con unrepetición invertida. Con el fin de limitar la recombinación con 2p, la repetición invertida puede ser retirado, pero Es importante no quitar adyacente STB-distal secuencias, ya que estos parecen tener un importante papel en la protección del STB transcripcional inactivation.Cabe señalar que los vectores lanzadera que contienerepeticiones invertidas van a existir como una variedad de recombinantes con la adición 2p.In nativa, hay parece haber cierta competencia entre exógena Vectores de 2p y 2p nativa de tal manera que el número de copias de tanto está deprimido(oprime).Vectores lanzadera 2p basados más complejos contienen los genes REP1 y REP2 además de ORI-STB y por lo tanto pueden ser utilizados en cepas huésped 2p-libres. Es más complicado que los vectores ORI-STB, pero más estable y más adecuado para la ampliación. Muchos ejemplos de este tipo de vector se interrumpen en D (por ejemplo, pJDB248), y algunos en el FLP (por ejemplo, pJDB219) de manera que no pueden dar la vuelta o amplifican en células 2p-libres. Sin embargo FLP plásmidos pueden llegar alto número de copias en las células 2p libres, presumiblemente a través asimétrica segregación. En 2p + cepas que pueden amplificar de forma independiente si tienen dos repeticiones invertidas, orfollowing integración en 2p si tienen sólo uno repita. Recientemente, se han desarrollado vectores que tienen todas las regiones funcionales de 2p intactos, mediante la inserción del ADN extraño en el único sitio SnaBI entre ORI y STB. Estos son altamente estable, pero aún 20 - a 80 veces menos estables que 2p nativa, posiblemente debido a la transcripción de bajo nivel a través del STB. En futuras vectores similares deben encontrar amplio uso en la expresión de genes foráneos.Vectores libres del ADN bacteriano puede ser ventajoso en la expresión del gen extraño en relación con las autoridades reguladoras de alimentos y medicamentos. Ellos se pueden hacer en una de dos maneras: (1) por la integración targetted de un casete de expresión en 2p nativa, o (2) mediante el uso de un vector lanzadera que puede eliminar las secuencias bacterianas in vivo mediante la recombinación por escisión. Usando el último enfoque, Chinery y «vectores de desintegración 'Hinhcliffe.constructed que utiliza la FLP / FRT sistema a ADN bacteriano especial insertado en el sitio XbaI de una de las repeticiones invertidas. Insertos Vectorwith en el sitio PstI único en D o en el sitio SnaBI entre el STB y ORI eran extremadamente estables, a pesar de que no está claro si la estabilidad se mantiene tras la inserción de un casete de expresión de alto nivel.Un número de vectores de número-alta-ultra-copia (por ejemplo, pWYG7L, Figura 1) se basa en pJDB219 que contiene toda la forma 2p B clonado en el plásmido pMB9 bacterianas con interrupción de FLP. El marcador seleccionable es LEU2-d cuyo uso resulta en un número muy alto número de copias (200 a 400 copias por genoma haploide), la fracción de células con el número de copias del plásmido se seleccionan constantemente más alta, lo que resulta en una menor tasa de crecimiento. Crecimiento selectivo o el uso de otros marcadores da un número de copias más normal de alrededor de 50 por célula. pJDB219 se utiliza mejor en las células 2p-libres ya que puede sufrir recombinación mediada por FLP con 2p residente, lo que lleva a la pérdida del ADN extraño, pero la retención del marcador LEU2-d. En las células 2p libres pJDB219 es muy estable debido a su elevado número y la cooperación, por lo que es adecuado para el cultivo a gran escala. Versiones FLP de pJDB219, por ejemplo, pxy, tienen una mayor estabilidad en medio no selectivo.

Dado que toda la secuencia de pMB9 no ha sido determinada, puede ser más conveniente utilizar una variante de pJDB219 basado en pBR322, por ejemplo, pC1 / 1.Los vectores pueden tener un número de copias muy elevado incluso en condiciones no selectivas si se suministra recombinasa FLP adicional. Por ejemplo, la inducción de FLP de una sola copia integrada del gen bajo el control del promotor GAL1 conduce a un cambio en el número de copias del plásmido de <50 a 200-400. Alternativamente, la alta copia de auto-selectiva URA3-d marcador se puede utilizar en una cepa huésped de piel 1.Vectores número de copias ReguladosLa expresión de genes extraños, pudiendo ser regulada mediante la inducción de un aumento en el número de copias del vector. Se han descrito dos tipos de vectores episomales de levadura con número de copia regulada: (1) vectores con centrómeros regulables, y (2) 2p vectores en células con FLP inducible (véase más arriba). El primer tipo depende de la observación de que los elementos CEN pueden ser inactivados por la transcripción. Chlebowicz-Sledziewska y Sledziewski construyeron vectores que contienen la glucosa promotor ADH2 reprimible adyacente a CEN3 y, o bien una ARS o 2p STB-ORI. En el número de copias de vectores de ARS se podría aumentar de 1-2 a 5-10 por un interruptor de la glucosa a etanol como fuente de carbono. En el número de copias de vectores ORI-STB podría aumentar de 1-2 a aproximadamente 100 y el vector fue muy estable. Tales vectores se podrían usar para aumentar el grado de regulación en la expresión de proteínas tóxicas.Los vectores de integración (vectores YIP)La integración cromosómica ofrece una alternativa más estable con el mantenimiento episomal de ADN extraño. En la integración de Saccharomyces se produce normalmente por recombinación homóloga. Los vectores de integración (YIP) contienen ADN cromosómico de levadura para la integración de destino, así como un marcador seleccionable y un replicón bacteriano. Los vectores se digirieron por lo general en un único sitio de restricción en el ADN homóloga ya que esto promueve la transformación de alta eficiencia y la integración objetivos. Tales resultados individuales de cruce de integración en una duplicación de la secuencia diana cromosómica, por lo que el vector pueda posteriormente "estallar out 'por recombinación por escisión. Sin embargo, los integrantes son bastante estables, la tasa típica de pérdida de vector de ser <1% por generación en ausencia de selección.Para la integración del vector conveniencia pueden ser dirigidos para el alelo mutante cromosómico del marcador de selección utilizado. Sin embargo, continua la selección de los transformantes resultantes es ineficaz, ya que la duplicación de ADN se puede escindir y un marcador de tipo salvaje retenido. Por el contrario, la selección continua es eficaz donde la integración está dirigida en otro lugar.Cuando se utilizan altas concentraciones de ADN de los vectores de integración en las transformaciones, inserciones en tándem multicopia pueden dar como resultado, presumiblemente debido a eventos de recombinación repetidos. Integrantes de múltiples copias son relativamente estables y se han utilizado, por ejemplo, en los estudios de dosis génica.TransposiciónUn tipo alternativo de integración, transposición, hace uso de la doble recombinación homóloga para sustituir el ADN cromosómico de levadura, dando como resultado una estructura estable y sin duplicaciones. Cuando se requiere un transformante estable de copia única este es el método de elección. Vectores de transposición contienen el ADN exógeno y marcador de selección flanqueado por ADN de levadura homóloga a 5 'y 3' regiones del ADN cromosómico que se sustituye. Antes de la transformación el vector se digiere con enzimas de restricción que liberan el fragmento transplacing con 5 'y 3' homóloga. La frecuencia de transformación es baja de manera

que el método sphaeroplast se utiliza por lo general, y la estructura cromosómica de los transformantes se debe comprobar fenotípicamente y por análisis de transferencia Southern.Integración en reiteró ADNUn número de estrategias basadas en la integración en reiteró ADN cromosómico se han utilizado para generar estables integrantes multicopia. En la actualidad los mejores resultados en términos de número de copias y la expresión parece estar utilizando la integración en el clúster de ADN ribosómico (ADNr). El cluster de ADNr se compone de alrededor de 140 repeticiones en tándem de una unidad de 9,1 kb en el cromosoma XII. Lopes et. han construido un vector de integración, pMIRY2, que contiene una porción de la unidad de ADNr y el marcador LEU2-d. La transformación con pMIRY2 digerido en SmaI o HpaI dio transformantes Leu 'con 100-200 copias integradas en un espaciador no transcrito del locus ADNr. El uso de los marcadores promotor defectuosos LEU2-d u otro era importante para el aislamiento de los integrantes alto número de copias. Los transformantes fueron altamente estables, 80-100% de las copias integradas siendo retenidas después de 70 generaciones, y los niveles de proteína extraña producidos utilizando el promotor PGK fueron tan altos como de vectores 2µ. Este enfoque también se podría utilizar como una alternativa a los vectores episomales en especies en las que se ha encontrado ninguno.Otra reiterada ADN que puede ser utilizado como una diana para la integración es la Ty elemento transponible que está presente en 30 copias por genoma 4O-en la mayoría de las cepas de Saccharomyces. Kingsman y. se describe el uso de un vector de transposición targetted para reemplazar Ty, cuyo número de copias podría ser amplificada usando el marcador de selección LEU2-d. Los niveles de interferón producidos a partir de dichos transformantes amplificados eran varias veces más alto que a partir de una sola copia ARS / CEN vectores pero casi diez veces menor que con los vectores de 2p. Jacobs et. . Utilizando vectores similares con el fin de co-expresar las diferentes formas de hepatitis B antígeno de superficie (HBsAg). Se obtuvieron transformantes que contienen de una a varias copias del vector sin la necesidad de amplificación. Los transformantes de múltiples copias consistieron principalmente en el ADN transplacing en un solo locus Ty 1 y surgieron por un mecanismo inexplicable. Con el fin de co-expresar las diferentes formas de HBsAg en la relación deseada, una y una cepas se transformaron con cada vector, integrantes multicopia seleccionados, y diploides hechas. Diploides estables con un total de 10 copias fueron hechas, pero los niveles de expresión que parecía ser baja. más recientemente Shuster. han utilizado que se integran por sola cruzado en 6 elementos, que existen ya sea solo o como parte de Ty en todo el genoma de S. cerevisiae. Ellos construyeron un vector que expresa el gen lacZ de E. coli con los marcadores LEU2 y CUP1. Transformantes Leu 'fueron seleccionados después de la transformación con el vector digerido por XhoI, que corta en el elemento 6 en el fragmento marcador LEU2. Estos fueron seleccionados para el cobre-resistencia para aislar integrantes multicopia que rindieron hasta diez veces el nivel j3-galactosidasa de las cepas de una sola copia. La integración en 6, junto con el cruce de integrantes haploides, se ha usado para generar una cepa 20-copia para la secreción eficiente de factor de crecimiento nervioso.Vectores TransposiciónUn enfoque diferente para la integración de copias múltiples es el uso de vectores de transposición de Ty análogos a los vectores retrovirales para células de mamífero. Ty transpone a través de una transcripción de longitud completa que está encapsidado en partículas similares a virus y transcribe de forma inversa a ADN, que puede entonces integrar en múltiples sitios. En los vectores de transposición de un promotor regulado, por ejemplo, Gall, se utiliza en lugar de la 6 Ty promotor para generar una transcripción que abarca el gen extraño y un marcador seleccionable. Señales de terminación de la transcripción deben ser retirados a partir del gen marcador de la transcripción de longitud completa para ser producido. Toda la unidad se coloca en un vector

episomal para la transformación inicial, pero puede perderse después de la inducción de la transposición. Boeke y. obtenido número de integrantes relativamente bajos de copias (1-10) por este método, pero puede resultar factible utilizar el gen LEU2-d para la amplificación. Aunque este método no está completamente desarrollado que podría ser útil en una variedad de levaduras, Ty desde codifica todas las funciones necesarias para la transposición.PROMOTORES transcripciónal y de TERMINATORSPromotores extranjeros frente a levadurasLa expresión de genes foráneos en la levadura se examinó tan pronto como llegaron a estar disponibles los procedimientos de transformación. El primer estudio fue del gen b-globina de conejo que fue encontrado para dar lugar a transcritos anormales en el que los intrones no estaban empalmados. En unos pocos casos se inició correctamente la transcripción extranjera, por ejemplo, con zeína, pero en promotores transcripcionales extranjeras generales se encontró que han iniciación aberrante, por ejemplo, Drosophila ade8 o eran totalmente inactivo, por ejemplo, virus del herpes simple timidina quinasa. Por lo tanto para la transcripción eficiente de genes extraños encontró el uso de promotores de levadura con ADNc wassoon a ser esencial. El primer ejemplo publicado fue el uso de un fragmento de 1500 pb 5 'del gen para la expresión intracelular ADHL eficiente de los leucocitos a-interferón.Promotores de ARNm de levadura consisten en al menos tres elementos que regulan la eficacia y la precisión de la iniciación de la transcripción: secuencias de activación aguas arriba (UAS), elementos TATA y elementos de iniciador. Muchos también contienen elementos que intervienen en la represión de la transcripción. UAS, que tienen algunas similitudes con potenciadores de mamíferos, determina la actividad y la regulación del promotor a través de la unión específica a activadores de la transcripción (por ejemplo, GAL4 y GCN4), y actuar a distancias variables 5 'al sitio de iniciación. Algunos UAS han sido asignados a las regiones cortas de ADN, por ejemplo, la vesícula UAS GAL10 a una región intergénica 108 pb que contiene cuatro secuencias cortas de simetría díada. Estas secuencias (17-21 pb) son necesarias y suficientes para la unión de GAL4 de la trans-activador y de la galactosa-regulación, y actúan de forma sinérgica. UAS de algunos genes expresados constitutivamente contienen tractos de poli (dA-dT) que probablemente activan la transcripción al afectar la estructura nucleosoma. TATA elementos (consenso TATAA) se encuentran 40 a 120 pb aguas arriba del sitio de inicio, en contraste con la distancia más rígida de 25 a 30 pb en eucariotas superiores, y proporcionar una ventana dentro de la cual puede producirse la iniciación. El elemento iniciador, que está mal definido, dirige la iniciación de ARNm en los sitios estrechamente adyacentes. Promotores de levadura pueden ser altamente compleja, que se extiende más de 500 pb, que contiene múltiples UASs y sitios reguladores negativos, y múltiples elementos TATA asociados con diferentes sitios de iniciación.La mayoría de los promotores se regulan en cierta medida, pero los más poderosos, los promotores glicolíticos están mal reguladas. Esto los hace indeseable para uso en el cultivo a gran escala, en donde hay más oportunidades para la selección de las células no expresan, y no adecuados para la expresión de proteínas tóxicas. En tales casos, es preferible usar un promotor estrechamente regulado de manera que la etapa de crecimiento se puede separar de la fase de expresión. A pesar de una severa limitación de la eficiencia con múltiples copias, GaLI ha sido el promotor regulado más utilizado. Sin embargo,ahora hay una gran variedad de promotores nativos u obra de ingeniería (Tabla 3); la elección correcta es crítico para cualquier aplicación, especialmente cuando es un proceso a ser mayor escala.Promotores glucolíticosLos primeros promotores utilizados eran abundantes de genes que codifican enzimas glicolíticas, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa I (ADHL), fosfoglicerato quinasa (PGK) deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAP). Estos fueron en primera idea a ser constitutiva, pero más tarde se

encontró que ser inducida por la adición de glucosa, por ejemplo, expresión de un-interferón usando el promotor PGK se indujo 20 - a 30 veces mediante la adición de glucosa a un cultivo crecido en el acetato como carbono -. glucolíticos fuente de promotores son los más poderosos de S.cerevisiue, por ejemplo ARNm de PGK se acumula a 5 % del total. A pesar de su relación de inducción pobre, los vectores de ADHI, PGK y GAP se han utilizado ampliamente en el laboratorio, y en algunos casos industrialmente.El promotor PGK ha sido estudiada con cierto detalle: se extiende más de 500 pb, contiene un complejo de UAS en -473 a-422 con respecto al sitio de iniciación, un elemento regulador de choque de calor, y otras características que contribuyen a la iniciación precisa y eficiente. Por el contrario, se sabe menos acerca de otros promotores glucolíticas, como GAP. Hay tres genes GAP, de los cuales GAP491 o TDH3 es el más altamente expresado y cuyo promotor ha sido utilizado con éxito para expresar un número de protein.The promotor de longitud completa se extiende sobre aprox. 700 pb, pero ha habido una serie de informes de los fragmentos más pequeños que tienen actividad promotora completa, por ejemplo, un fragmento de 198 pb. Sin embargo, parece que la actividad de los promotores GAP491 más cortas depende de secuencia de vector bacteriano.

Promotores de galactosa-reguladosLos más potentes promotores fuertemente regulados-de S. cerevisiae son los de los genes de la galactosa-regulado GALI, GAL7, y Galio, que participan en el metabolismo de la galactosa. La galactosa-regulación en la levadura está muy bien estudiado y se ha convertido en un modelo de sistema clave para la regulación de la transcripción eucariótica (revisado en la referencia 201). Muchos genes están involucrados en la regulación de los promotores GAL, pero la interacción central es entre el trans-activador codificado por GALI, el represor codificado por GAL80, y la UAS GAL (Figura 4). La unión de la proteína GAL4 a la UAS es necesaria para la inducción; GAL80 se une la proteína GAL4 y actúa como un represor a menos que se añade la galactosa. Las regiones de la proteína GAL4 que se unen GAL80 y la UAS se han definido, como tienen las características estructurales de los diferentes promotores GAL.

GALI, GAL7 y mRNAs Galio son inducidos rápidamente> 1000 veces aprox. 1% del total de ARNm en la adición de galactosa. Los promotores están fuertemente reprimidas por la glucosa, por lo que en glucosa en cultivos crecidos inducción máxima sólo se puede lograr siguiente agotamiento de la glucosa. Inducciones galactosa pueden llevarse a cabo en una de tres maneras: (1) por el crecimiento de el cultivo en un ('neutral') azúcar no reprimir, noninducing, cuando muy rápida inducción sigue adición de galactosa, (2) por el crecimiento de la cultura en la medio de glucosa, pero la eliminación de la glucosa por centrifugación y lavado de las células antes de la resuspensión en medio de galactosa (esto conduce a un retraso de 3 a 5 h en la inducción '), y (3) haciendo crecer las células en medio que contiene tanto glucosa y galactosa, cuando la glucosa se metaboliza preferentemente antes de que pueda producirse la inducción con galactosa. Los dos primeros métodos se utilizan con frecuencia para pequeña escala, pero no son prácticos en inducciones a gran escala. Cabe señalar que muchas cepas de uso común tienen mutaciones en el gen de permeasa de galactosa (GAL2) y no son inducibles.

La Figura 4. Galactosa regulación en la levadura. Los genes implicados en la regulación y el metabolismo y su localización cromosómica se muestran. La estimulación se indica con líneas gruesas con las flechas y la inhibición por líneas con barras.

El gran fondo de conocimientos de la regulación de galactosa ofrece la posibilidad de manipular el sistema en un número de maneras con el fin de mejorar sus características para la producción de proteínas. Tres tipos de manipulaciones que se han llevado a cabo son los siguientes: (1) la sobre-expresión de trans-activador; (2) el uso de mutaciones en la vía de la galactosa-reguladora o de la glucosa-represión, y (3) la construcción de quimérico promotores galactosa-regulados.Proteína GAL4 está presente en una o dos moléculas por célula y, por otra parte, GAL80 represores en exceso de esta y es inducible por galactosa. Por lo tanto, incluso con los promotores de una sola copia, la transcripción GAL está limitada por la escasez de la proteína GAL4, aunque otros factores también supone una limitación con multi-copia promotor. Con vectores de expresión de múltiples copias de GAL4 limitación se ve agravada, por ejemplo la expresión pgalactosidase partir de un vector GAL-lacZ aumenta sólo dos veces en ir desde una sola copia de un vector 2p. Tanto con vectores individuales y multi-copia, de dos a tres aumentos de plegado se pueden obtener en GAL80 cepas, pero la expresión se convierte entonces en constitutiva. La sobreexpresión de la GAL4, ya sea mediante la inserción del gen en el vector de expresión de múltiples copias, o mediante el uso de un vector de expresión de la integración de ADHIGAL4 de copia única, aumenta los niveles de productos 2 - a 3 veces, pero de nuevo en el arroz de perder regulación estricta. Schultz et. utilizado an-GAL4 Galio integrado de vectores de expresión con el fin de producir en exceso la proteína GAL4 de manera galactosa-regulado. La transcripción a partir del vector de expresión diana, que codifica el virus de Epstein-Barr (VEB) gp350, se aumentó 5 veces. Hemos probado un sistema similar que utiliza un vector de ADH2, GAL4 expresión integrada con el fin de producir en exceso la proteína GAL4. Este sistema altera la regulación de los vectores de expresión GAL para que se induzcan por la glucosa-agotamiento. El uso de un gen constitutivo GAL4, es decir, uno que no interactúa con GAL80 represor, que era posible aumentar los niveles de P-galactosidasa producidos a partir de un vector Gall multi-copia por 2 - a 4 veces (MARAND JJC, resultados no publicados).Con el fin de facilitar la inducción de la galactosa-glucosa-cultivadas cultivos, se ha examinado el uso de mutantes defectuosos en global o específica GAL-glucosa-represión. En Regl-1 mutantes eficiente galactosa-inducción se produce con galactosa a proporciones de glucosa de 5: 1 0.248 Hovland y usa un procedimiento de selección novedoso para aislar mutantes resistentes a la glucosa, y se encontró un mutante reg1 (regl-501) en el que se produjo la inducción eficiente incluso con galactosa / glucosa relaciones de 1/100. Una cepa biliar Regl-501 se hizo que no puede

metabolizar la galactosa para que los niveles muy bajos de galactosa (por ejemplo, 0,2%) podría ser utilizado, en presencia de exceso de glucosa, para la inducción eficiente.En un intento de combinar la alta actividad de los promotores glicolíticos con la estricta regulación de los promotores GAL, promotores híbridos se han construido donde un UAS glucolítica se sustituye por un UAS GAL. Sin embargo, los resultados publicados no sugieren que estos híbridos son más eficientes que los promotores GAL. Bitter y Egan han descrito el uso de una UAS híbrido GAPIGAL para la expresión de y el interferón, que es tóxico para las células de levadura. La inserción de un fragmento de UAS GALI-GAL10 55 pb entre el GAP UAS y el elemento TATA galactoseregulation confiere al promotor. Niveles de producto fueron significativamente mayores que con el promotor GAP natal, en gran parte debido a un aumento espectacular del número de copias del vector, del 1 al 20 a 50 por célula. Asimilar tipo de promotor híbrido (PAL) se ha construido, mediante la sustitución de la UAS PGK con una chica UAS, y se utiliza para la producción regulada de ainterferon y albúmina de suero humano. Sin embargo, no hay comparación de la eficiencia de los promotores GAL y PAL ha sido publicada; sería de esperar que todos los promotores híbridos UAS GAL-fueran severamente limitados por la proteína GAL4.Promotores fosfato reguladosEl promotor del gen de la fosfatasa ácida, PH05, está regulada por la concentración de fosfato inorgánico y se ha utilizado ampliamente para la expresión génica extranjera. En el correo de los primeros estudios, se utilizó un fragmento de ADN de 1,4 kb PH05 para impulsar la producción de un interferón, que fue inducida de 200 veces por el cambio a medio de bajo fosfato. Más recientemente, las características estructurales y la regulación deel promotor PH05 se han estudiado en detalle (revisado en la referencia 394). El promotor, que abarca alrededor de 400 pares de bases de ADN, contiene dos UAS que son necesarias y suficientes para la regulación. Estos contienen secuencias de 19 pb díada que se unen la PH04 trans-activador.Dado que el promotor PH05 no es muy fuerte, se han hecho intentos de utilizar los PH05 UAS para conferir regulación de promotores glucolíticas. . Hinnen et 0,1 construyó una serie de GAP / PH05 UAS híbridos y los probó en vectores de expresión para eglin C. Algunos promotores híbridos rindieron hasta el doble de la cantidad de producto como GAP, pero la relación de inducción fue de 2 - a 5 veces en comparación a 40 veces para PHOS. Dado que no se disponía de los datos de número de copias no se pueden sacar conclusiones sobre la fuerza del promotor relativa.Kramer et.constructed una cepa huésped sensible a la temperatura en el PH04 trans-activador y defectuoso en la PH080 represor (Pho4> PHO80) para lograr la inducción de fosfato independiente de la PH05 promotor regulado por la temperatura. En la reducción de la temperatura desde 35 ° C a 23 ° C se logró una inducción de 50 veces de un-interferón, pero el nivel absoluto era sólo una décima parte que en las células inducidas de tipo salvaje.Promotores represor de glucosa o glucosa – promotores represibles.La glucosa-represión es un sistema global de regulación de la expresión de un número de genes, incluyendo los genes de fermentación de azúcar, por la disponibilidad de la glucosa. Las levaduras utilizan preferentemente los azúcares tales como la glucosa que entran en la vía glucolítica directamente. Los genes implicados en sacarosa o metabolismo de la galactosa se transcripcionalmente reprimidos por glucosa. Los ejemplos típicos de promotores regulados principalmente por la glucosa-represión son los de la ADH2, los genes del SUC2 y CycL, que codifica la alcohol deshidrogenasa II, invertasa y el iso-1-citocromo c, respectivamente.El promotor de ADH2 es a la vez potente y bien regulada y se ha utilizado para la expresión de genes foráneos. Puesto que se reprime más de 100 veces por la glucosa, que puede ser utilizado para la expresión eficiente de proteínas tóxicas, por ejemplo, similar a la insulina factor de crecimiento I (IGF-I). El análisis de deleción ha identificado una región de 260 pb 5 'del sitio de

iniciación que contiene dos UAS suficientes para la actividad promotora completa y la regulación. UAS1 es una repetición invertida de 22 pb que se une la ADRL trans-activador. "'Hemos utilizado la región de 260 pb, que se monta fácilmente a partir de oligonucleótidos sintéticos, en vectores de expresión eficientes (MAR y JJC, resultados no publicados). Con el fin de mantener la represión de ADH2, las células deben ser cultivadas en exceso de glucosa (por ejemplo, 8%) hasta la inducción, que se efectúa mediante el cambio a un medio fresco que contiene una fuente de carbono no fermentable, por ejemplo, etanol, glicerol, rafinosa, etc Alternativamente, ADH2can ser inducida mediante el cultivo inicialmente en una menor concentración de glucosa (por ejemplo, 1%) que se va agotando gradualmente. Sistemas de represor de glucosa tienen una desventaja potencialmente seria en las fermentaciones industriales: es difícil mantener glucoserepression ajustado bajo condiciones de limitación de glucosa, que son necesarios para lograr una alta densidad celular.Irani et al.ls7 mostró que los factores transcripcionales, incluyendo la ADR1 trans-activador, se convirtieron limitante para ADH2 de la transcripción a partir de plásmidos de múltiples copias. La sobreexpresión de la ADR1 conduce a la pérdida de la regulación, pero ADH2-regulado sobreexpresión de ADR1, de un vector de la integración de una sola copia, se ha utilizado para aumentar la eficiencia de los sistemas de expresión ADH2 sin pérdida de reg ~ lation.I ~ n ~ th 'es forma en que ha sido posible aumentar la expresión de la P-galactosidasa a partir de una sola copia de ADH2-ZacZ vector por 4 - a 10 veces. El sistema por lo general resulta en aproximadamente un aumento de 3 veces en el rendimiento de las proteínas intracelulares y se utiliza para la producción comercial (J. Shuster, comunicación personal).Promotores glucolíticas / ADH2 híbridos se han construido mediante el trasplante de las UAS de ADH2 GAP en proximales secuencias promotoras. Cousens et aZ.78 fusiona los ADH2 UAS que contienen el 22 pb díada 320 pb aguas arriba del elemento GAP TATA, y fueron capaces de lograr una producción estrictamente regulados de la superóxido dismutasa (SOD), proinsulina fusión de> 15% tcp Sin embargo, no hay comparación crítica de la fuerza de la ADH2, BPA, y promotores híbridos ha sido publicado.Otros sistemas de promotores regulados.Algunos otros sistemas promotores regulados son dignas de comentario aquí: estos son de interés debido a su inducción es independiente de los nutrientes de cultivo y por lo tanto puede ser controlado sin perturbar de otro modo la cultura.Un sistema de temperatura regulada sobre la base de acoplamiento de control de tipo ha sido utilizado por un número de grupos. Las mutaciones en los genes SIR de-reprimen los loci de tipo de apareamiento silenciosas, de modo que una o genes específicos de un no se expresan. La represión del promotor MFAL está mediada por el represor MATa2 que se une una secuencia de operador 31 pb. Brake et al.42primero informó el uso de una cepa MATasir3 "para la secreción de hEGF usando el factor a (MFAL) promotor. Con mutación de la no permisiva (35 º C.) a la (25oC) temperatura permisiva dado lugar a una inducción en secretada hEGF de 10 ng / l de 4 mg / l. el operador a2 se ha transferido a la fuerte ADHZ y TPZ (triosa fosfato isomerasa) promotores y demostrado que confieren temperatura de regulación en una cepa MATa sir 3. Sledziewski et insertar hasta cuatro operadores entre los elementos UAS y TATA del promotor TPZ y fueron capaces de obtener una regulación estricta (> inducción SO-pliegue de la P-galactosidasa) y la actividad completa. Inexplicablemente, los promotores ADHZ híbridos no eran estrictamente regulados por temperatura.El sistema parece susceptible de ajuste fino mediante el uso de temperaturas de inducción intermedios. Un sistema similar se ha desarrollado mediante la inserción de dos operadores a2 en el promotor PGK, el logro de una relación de inducción> loo-veces sin ninguna reducción en la actividad.

Un nuevo tipo de sistema promotor utiliza la capacidad de los receptores de hormonas esteroides de mamíferos para funcionar como activadores de la transcripción en la levadura. Schena etl.constructed un vector de expresión CZ CDy bajo el control de tres elementos en tándem de 26 pb de respuesta a glucocorticoides fusionados aguas arriba del promotor. En células de levadura también que expresan el receptor de glucocorticoides, un gen reportero CAT podría ser inducido 50 - a 100 veces a niveles altos mediante la adición de desoxicorticosterona (DOC). El grado de inducción fue valorable más de 1 nM a 10 Mm-DOC y fue muy rápida (t,, de 7 a 9 minutos). Un sistema similar se ha desarrollado el uso de un promotor PGK híbrido que contiene elementos de respuesta a andrógenos. Un ddition de cantidades crecientes de dihidrotestosterona inducidas cantidades crecientes de reportero 13-galactosidasa durante un intervalo de varios cientos de veces, y la gama podría extenderse a 1400 veces, variando el número de copias de los genes del receptor o reportero. En conclusión, los sistemas de esteroide-regulados parecen ser potente y bien-controlado, y podrían utilizarse en levaduras que carecen de promotores con estas cualidades (por ejemplo K.Zactis y Spombe).El promotor del gen CUPL, codificación metalotioneína de cobre, se ha usado en la expresión vectors.IL3T su promotor está estrechamente regulada y independiente de los parámetros del cultivo. La concentración de iones Cu2 + para la inducción depende de la de cobre y la resistencia de la cepa huésped de 0.0 mM de 1 (sin gen CUPL) a 0,5 mM (> 6 copias).Selección de nuevos promotores de levaduraUn número de métodos de selección o cribado tiene ha utilizado con el fin de identificar nuevos promotores a partir de una biblioteca genómica. Los procedimientos de selección pueden ser ideados para los promotores regulados, por ejemplo, el represor de glucosa promotores de los genes GUT2 y ALCS que codifican la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato y vacuolar endroprotease B, respectivamente.Sistemas de promotores extranjerosPromotores extranjeros no reconocidas por la levadura RNA la polimerasa puede, en principio, ser utilizado siempre que el cognado ARN polimerasa es co-expresada. la bacteriófago T7 ARN polimerasa es altamente activa y ha sido utilizado en un número de procariótico y organismos eucariotas. T7 ARN polimerasa, idealmente con una señal targetting nuclear adicional, puede ser expresada a partir de un promotor GAL1 y puede de manera eficiente transcribir ADN en la célula de levadura. Sin embargo, el T7- inducida lacZ ARNm no se traduce en la levadura, debido ya sea a la ausencia de 5 'tapas y / o de poliadenilación, o a una horquilla estable formado en el 5 'En región. Células animales un problema similar se ha resuelto mediante el líder del virus de la encéfalo miocarditis para promover traducción independiente de caperuza, IO8 pero esto parece estar inactivo en la levadura (CAS, resultados no publicados). si el problema de traducción se resolvieron una levadura T7 sistema sería muy potente, ya que GALI-impulsado expresión de la polimerasa actuaría como un etapa de amplificación.Levaduras terminadorasLevadura terminadores de la transcripción son generalmente presentar en vectores de expresión para el ARNm eficiente 3 ' terminar la formación. Terminadores de procariota o los genes eucariotas superiores no son normalmente activo en levadura, aunque hay excepciones, como elDrosophila gen ade8. Terminación eficiente es probablemente necesaria para la expresión máxima: eliminación de las secuencias de 'terminación' 3 'del gen CYC1 resultó en una mayor ARNm y una reducción dramática en el nivel de mRNA.Terminación de la transcripción de los ARNm de levadura es comprendida menos que en las bacterias y en eucariotas superiores. Transcripción bacteriana termina en el extremo 3 madura 'del ARNm. En mayor formación del extremo eucariotas mRNA 3 'implica de escisión y poliadenilación, aguas abajo de la señal AAUAAA, de mRNAs precursores que se extienden varios

cientos de nucleótidos más allá de la codificación región. Contrariamente a las ideas anteriores, parece que la levadura ARNm siguen el mismo patrón de terminación, el procesamiento y la poliadenilación del pre-ARNm como una mayor eucariota. Sin embargo, en estos procesos son la levadura estrechamente unida y se producen a una distancia más corta, cerca del extremo 3 'del gen.Han sido implicados Un número de secuencias de consenso como parte del ARNm 'terminador', especialmente la secuencia tripartita TAG .. (T-ricos) .. TA (T) GT .. (AT-ricos) .. TTT y TTTTTATA. El comúnmente tripartito motivo encontrado muestra mala conservación y es tolerante de las grandes alteraciones de la secuencia, lo que sugiere que una característica general, tales como altaAT-contenido puede ser crítico. Sin embargo, esto no puede ser suficiente, ya que los terminadores son con frecuencia ausentes en el ADN rica en AT, y puede ser unidireccional,lo que implica alguna secuencia especificidad.Más reciente la evidencia sugiere que una variedad de diferentes señales, unidireccionales y bidireccionales, se utilizan en levadura.Terminadores de un número de genes han sido utilizado en vectores de expresión, por ejemplo, TRP1, 'ADH1, GAP MFL, etc Con el fin de simplificar vectorial la construcción, un terminador de 2 p puede ser utilizado, por ejemplo la FLP'73 (pWYG7L, Figura 1) o D gen terminador.

FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESION INTRACELULAR.INICIACION DE TRANSCRIPCION.La expresión génica se regula con más frecuencia en el nivel de la transcripción, y en general se supone que el nivel de ARNm de estado estacionario es una primaria determinante del rendimiento final de una proteína extraña. El nivel de ARNm se determina tanto por la tasa de iniciación y la tasa de rotación.En la mayoría de los casos el rendimiento de una proteína extraña expresado usando un promotor de levadura ha sido mucho más bajo que el rendimiento de la proteína homóloga usando el mismo promotor. Usando el promotor PGK en un vector multicopia varias proteínas se acumulande 1 a 2% t.c.p., mientras que con todo el PGK gen fosfato- glicerina quinasa se acumula a másEstos niveles reflejan en gran medida la menores cantidades de los PGK transcriptos contra extranjeros para un máximo de 20 genes, aunque parece que hay ser una excepción. 'Se sugirió que la reducción niveles se debieron a t 1/2 corto o las transcripciones extranjeras, pero Mellor et mostró que un-interferón ARNm no era inestable, pero se inició en una menor tasa seis veces. La adición de aguas abajo PGK secuencias restaurar el nivel de mRNA a la de PGK ARNm, lo que sugiere la presencia de un aguas abajo secuencia de activación (DAS), localizado a la primera79 codones, requeridos para la transcripción máxima.También se ha encontrado evidencia indirecta para un DAS con el gen de la piruvato quinasa (PYK). accesorio del gen ZacZ a la PYK promoter resultado en una caída de 30 veces en la molaridad ARNm, mientras que su t1/2 disminución de sólo dos veces, en consonancia con una de 15 veces caída en la tasa de iniciación. Los PYKDAS supuestos es activa en los vectores individuales y múltiples copias, ha sido localizado en el nt 500 y 800 con respecto a la iniciación ATG, y parece ser capaz de reemplazar funcionalmente la PGK DAS (A. Brown, comunicación personal). La evidencia de áreas de salud también se ha encontrado en el gen de la lipoamida deshidrogenasa, 414a ND en Ty2 ADN.

Dado que la evidencia ahora puede favorecer la existencia de áreas de salud en ciertos genes, es posible que se encuentran en muchos otros. Puede haber algo circunstancial evidencia de esto, por ejemplo, multi-copia GAL7 da niveles de uridytransferase de> 15%, mientras que las proteínas extrañas rara vez alcanzan este nivel. Lo Hay que destacar que muchos otros factores podrían en cuenta estas diferencias. Si DASs se caracterizan, puede ser posible para incorporarlos en fragmentos del promotor aguas arriba con el fin de crear vectores de expresión más eficientes. Alternativamente, si Dass llegar a ser muy dependiente de la posición, que podría ser colocado dentro de un intrón que sería extirpados antes de la traducción. Si ninguno de estos trabajo Opciones y, a continuación la transcripción máxima sólo será alcanzable usando proteínas de fusión, por ejemplo, para PGK.Vectores de expresión de levadura con frecuencia dan lugar a numerosas transcripciones inesperadas debidas a fortuita promotores en el ADN plásmido bacteriano. esto no se sabe si pueden afectar a genes extraños expresión, pero transcripciones antisentido a través de la gen extraño puede ser eliminado mediante el uso de bidireccional terminadores o por yuxtaposición juiciosa con 2p ADN (por ejemplo, FLP terminador).RNA de elongación.El alargamiento o elongacion de las transcripciones no se piensa normalmente para afectar a la tasa global de la transcripción, pero el rendimiento de larga duración transcripciones podría verse afectada por secuencias fortuitas en genes extraños que causan pausa o terminación. Estas bien podrían actuar en el misma manera como terminadores de levadura natural o bien por una diferentes mecanismos. Hemos encontrado evidencia de esto en una proporción notablemente elevada de los genes que han examinado, especialmente, pero no exclusivamente, en los que tienen inusualmente alta AT-contenido. Aunque no se ampliamente reconocido, este problema podría ser una muy razón común de bajos rendimientos o el fracaso completo de expresión de genes foráneos en la levadura.Hemos enumerado ejemplos de la falta de expresión de los

Genes AT-ricos de la Tabla 4. La presencia de truncado ARNm no se ha demostrado en todos los casos, pero el ejemplo más claro es publicado en la expresión de la rica en AT Clostridium tetani ADN que codifica fragmento de la toxina del tétanos C. ARN se analizó desde el gen nativo y de cada una de tres versiones del gen sintético que contiene progresivamente más ADN, a partir del extremo 5 '(Figura 5). La transcripción longitud aumentó a través de esta serie, con sólo el gen totalmente sintético dar ARNm de longitud completa como se las principales especies. Todas las transcripciones cortos y largometrajes eran discretos, abundante y polyadenylated. El ADN de 1,5 kb de C. tetani se muestra para contener por lo por lo menos seis sitios de poliadenilación fortuitos que eran eliminado mediante el aumento de contenido de GC (del 29% al 47%). Los genes parcialmente sintéticos dieron lugar a la baja niveles de productos de traducción de escorrentía, pero eficientes producción del fragmento C se logró con sólo el gen totalmente sintético. El problema con los genes ricas en AT significa que análisis de los genomas con alto contenido de AT-(por ejemplo, Plasmodium falciparum o Dictyostelium discoideum) por complementación en S. cerevisiae no es posiblemente vale la pena como una estrategia general. Tales estudios podría ser tratado en S. pombe, aunque el trabajo reciente sugiere que las dos levaduras tienen un mecanismo conservado para la formación final mRNA 3 '. Más preocupante aún, hay evidencia de el mismo problema con genes que tienen una media AT-contenido similar a la de levadura (60%). Con el gen env de VIH-I, truncada ARNm se encontró en P. pastoris, pero no de S. cerevisiae. La mutagénesis de una secuencia se asemeja a una poliadenilación consenso de poliadenilación desactiva un importante sitio, pero reveló varios sitios débiles que se eliminaron mediante el aumento de contenido de GC utilizando síntesis química (C.A.S. y R. G. Buckholz, en preparación).La frecuencia de este problema, las que lo haría deseable ser capaz de predecir su ocurrencia, y para resolverlo sin recurrir a la síntesis de genes. Por desgracia, parece ser muy difícil identificar sitios de poliadenilación mediante la búsqueda de consensos secuencias, especialmente en el ADN rica en AT. En el caso de los el fragmento de gen C, uno de los ARNm cortos podrían se han debido a una única secuencia TTTTTATA, pero una serie de motivos tripartitos fueron encontrados en regiones sin sitios de poliadenilación.En la actualidad la única solución es aumentar el contenido de GC de secciones ofensivas de genes por química síntesis. El éxito de las soluciones más generales dependerá de si el problema se debe a verdadera terminación prematura o posttranscriptional desacoplado procesamiento. En el primer caso, una RNA polimerasa extranjera que utiliza diferentes terminación señales, por ejemplo, T7 ARN polimerasa, podría producir ARNm de larga duración. Por desgracia, la T7 sistema no se desarrolla plenamente en la levadura (ver transcripción promotores y terminadores). Si el problema es uno de procesamiento post-transcripcional entonces se puede ser necesario el uso de una expresión extranuclear vector de, por ejemplo, uno basado en los plásmidos ricas en AT lineales de K. lactis que también se pueden propagar en S. cerevisiae, para segregar las transcripciones de la nuclear enzimas de procesamiento.ESTABILIDAD DE RNALa vida media del ARNm de levadura van de 1 a 100 min y por lo tanto puede tener un profundo efecto sobre el nivel de estado estable (revisado en la referencia 47). la cuidadoso estudio de 15 mRNAs escogidos al azar mostró dos poblaciones, una con t más largos, 2s, (40 a 100 min) y uno con t1/2 más cortos (de 6 a 20 min) 0,47 Dentro de cada clase hay una relación inversa entre la longitud del mRNA y la estabilidad. Sin embargo, hay un cierto desacuerdo sobre esta división en dos diferencia entre categorías; estable e inestable ARNm puede ser que estos últimos han desestabilizar elementos, puesto que las secuencias de la URA3 de corta duración ARNm desestabilizar PYKmRNA. Un número de la ARNm inestables se ha encontrado recientemente que

codificar proteínas ribosomales (A. Brown, personal la comunicación); la LAC2 ARNm exterior tiene un t1/2 de 27 min.La inserción de codones de parada prematura en los Urales, URA3 y PGK ARNm se ha demostrado que causa su desestabilización, lo que sugiere que la unión al ribosoma puede contribuir a la estabilidad del ARNm. Sin embargo, el mismo resultado no se observó para un PYK y PYK-LAC2 ARNm, lo que sugiere un complejo relación entre la estabilidad del mRNA y traducción. Santiago et al. Encontrado obvia correlación entre la carga del ribosoma y la estabilidad durante diez mRNAs diferentes.Parece que hay algunos ejemplos de baja mRNA la estabilidad es un factor primario en pobres rendimientos de proteínas extrañas. Debido a la falta de conocimiento de los mecanismos de degradación de mRNA de levadura es imposible para predecir si un ARNm exterior será estable, aunque podríamos esperar ARNm largos sean algo menos estable que las cortas. Secuencias ricas en AU en los extremos 3 'de los ARNm de mamíferos algunos conferir inestabilidad, pero no se sabe si que funcionan en la levadura. Cuando la inestabilidad ARNm es diagnosticado como un problema, rendimiento global podría ser mejorado por (i) el uso de un promotor más potente,(ii) el uso de un promotor con más rápida inducción cinética, o (iii) sintetizar químicamente el gen con codones o borrar los 3 'sin traducir alterados una región con la esperanza de que los determinantes inestabilidad serán eliminados.

Figura 5. Terminación de la

transcripción fortuita en la toxina

tetánica fragmento de ADN C AT-

ricos. (A) Cuatro genes que

codifican el fragmento C se

muestran, con el ADN sintético de

mayor contenido de GC

(sombreada). Se indican los

extremos 3 aproximado 'de las

transcripciones que se generan en

la levadura. (B) de transferencia de

Northern que muestra fragmentos

de ARN C-específicas de estos

genes: sólo TETlS dieron

abundante ARNm de longitud

completa.