1

Extracción de aceite esencial de Myrtus communis L. y estudio

de su actividad antimicrobiana

Gonzales Bocángel, Patrick1; Mansilla Tafur, Adriana2; Rengifo Urbietta, Liliana3;

Arévalo Ortiz, Fermín MSc. 4

120101390@lamolina.edu.pe, 220100094@lamolina.edu.pe, 320100101@lamolina.edu.pe,

4fharevalo@lamolina.edu.pe

RESUMEN

Se extrajo el aceite esencial de Myrtus communis L. “Arrayán”, utilizando: Destilación por

arrastre de vapor para muestra fresca; e Hidrodestilación con el equipo Clevenger para

muestra seca, obteniéndose que este último proceso es más eficiente. La actividad

antimicrobiana fue evaluada contra 3 tipos de bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram

+), Escherichia coli y Pseudomonas poae (Gram -); y 2 tipos de hongos: Aspergillus niger

y Penicillum variabile. Siendo B. amyloliquefaciens el único que mostró sensibilidad al

aceite, con un diámetro de inhibición entre 13-23 mm. Estos resultados difieren de otros

estudios donde se señala que M. communis es un efectivo agente antimicrobiano, lo cual

pudiera deberse a que las muestras son de diferentes regiones geográficas, variando la

composición del aceite.

ABSTRACT

Essential oil of Myrtus communis L. "Arrayan" was extracted by two methods: Steam

distillation for fresh samples; and Hydrodistillation with the Clevenger´s equipment for dry

samples, resulting in the latter process more efficiency. The antimicrobial activity was

evaluated against three types of bacteria: Bacillus amyloliquefaciens (gram +), Escherichia

coli and Pseudomonas poae (Gram -); and 2 types of fungi: Aspergillus niger and

Penicillium variabile. B. amyloliquefaciens was the only strain that was susceptible to the

oil, with an inhibition halos of 13-23 mm. These results differ from other studies which

states that M. communis is an effective antimicrobial agent, mainly because the samples

were taken from different geographical regions with other oil´s composition.

2

INTRODUCCIÓN

En general, los Aceites Esenciales se definen como mezclas de componentes volátiles,

productos del metabolismo secundario de las plantas. Se encuentran muy difundidos en el

reino vegetal, de las 295 familias de plantas, de 60 a 80 producen aceites esenciales. Las

principales plantas que contienen aceites esenciales, se encuentran en familias como:

compuestas, labiadas, lauráceas, mirtáceas, rosáceas, rutáceas, umbelíferas, pináceas. Los

aceites esenciales son de aspecto oleoso, altamente volátiles, solubles en aceites, alcohol,

éter de petróleo, tetracloruro de carbono y demás solventes orgánicos; insolubles en agua

aunque le transmiten su perfume; son inflamables, responsables del aroma de las plantas,

colores y sabores, a veces dulces o amargos, con densidad generalmente inferior a la del

agua. Están compuestos en su mayor parte por hidrocarburos de la serie polimetilénica del

grupo de los terpenos que se encuentran con otros compuestos, casi siempre oxigenados.

Están contenidos en semillas, glándulas, pelos glandulares, sacos, o venas de diversas

piezas de la planta. La mayoría de plantas contienen de 0,01 a 10% de contenido de aceite

esencial. La cantidad media que se encuentra en la mayoría de las plantas aromáticas es

alrededor de 1 a 2%. En la naturaleza los aceites esenciales desempeñan un papel

importante en la defensa y protección de las plantas (1). Se evaporan por exposición al aire a

temperatura y presión ambiente. No deben utilizarse puros o por aplicación directa en ojos,

nariz, conducto auditivo, zonas genitales. Suelen tener un precio elevado (1, 2).

Los aceites esenciales tienen un gran impacto en las industrias de alimentos, cosméticas,

farmacéuticas y agrícolas. Actualmente es una industria en constante desarrollo y

crecimiento en diferentes países (1).

Dada las múltiples cualidades del aceite esencial del arrayán como lo son: balsámico,

antimicrobiano y antiséptico, con propiedades sedativas, es excelente para combatir el acné,

la piel untuosa, para prevenir y combatir estrías y la caída de cabello (3). Se plantearon dos

objetivos para este presente estudio. Primero, extraer el aceite esencial de hojas frescas y

secas de Myrtus communis “Arrayán” mediante equipo de arrastre por vapor y equipo

Clevenger.

3

Figura 1. Flor de M. communis

Segundo, determinar la actividad antimicrobiana del aceite extraído frente a 3 tipos de

bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram +), Escherichia coli y Pseudomonas poae

(Gram -); y 2 tipos de hongos: Aspergillus niger y Penicillum variabile.

MARCO TEÓRICO

I. Myrtus communis L.

DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Myrtus L. es un pequeño género perteneciente a la familia Myrtaceae, que incluye

alrededor de 100 géneros y 3.000 especies que crecen en las regiones templadas, tropicales

y subtropicales. M. communis es la única especie Myrtaceae nativas de Europa (Fig. 1). Es

un arbusto de hoja perenne que crece hasta una altura de

aproximadamente 5,1 m. El mirto común tiene un tallo

erguido, 2,4-3 m de altura, sus ramas forman una cabeza

llena cerrada, densamente cubierta por hojas perennes. El

tallo de la planta es ramificado y las hojas verde oscuro

dispuestas de forma opuestas son ovadas lanceoladas, 2-5

cm de largo, coriáceas, glabras, puntual-glandular y

enteras. Cuando son aplastadas, tienen un delicado olor

aromático; glándulas ausentes en la lámina. Las flores

blancas en forma de estrella que tienen cinco pétalos,

cinco sépalos y una masa de estambres insertados,

aparecen de Junio a septiembre. Después del verano, bayas, de globosas a elipsoidales, que

son de color negro azulado (o raramente blanco amarillento) en la maduración, aparecen

alrededor de noviembre (4). Tienen un diámetro menor a 1.2 cm.

Las flores son polinizadas por insectos y tienen una estrategia especializada de dispersión

de semillas por aves, mamíferos y hormigas. Las semillas de M. communis no tienen

aparente latencia. Como consecuencia de ello, la germinación puede ocurrir poco después

de la dispersión y su estrategia de establecimiento rápido podría permitir a las plántulas

4

aprovechar el otoño y las lluvias de invierno durante los cruciales primeros estadios de

crecimiento. Estas características se pueden considerar ventajoso con el fin de maximizar el

éxito reproductivo, con el establecimiento de plántulas y la supervivencia en los ambientes

Mediterráneos (5,6).

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Es nativa del sur de Europa, norte de África y Asia occidental. Se distribuye en América del

Sur, del Norte Himalaya occidental y Australia y muy extendida en la región mediterránea

donde crece de modo silvestre y también de forma cultivada. Es la única especie del género

que se encuentra en el hemisferio norte (5). Crece sobre cualquier suelo desde rocoso hasta

tepetatoso. A cualquier altitud, pero se distribuye más frecuentemente sobre los 700 y 1500

msnm.

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Rosidae

Orden: Myrtales

Familia: Myrtaceae

Subfamilia: Myrtoideae

Tribu: Myrteae

Género: Myrtus

Especie: Myrtus communis L.

NOMBRE COMÚN

Arraigán, arraiján, arrayán, arrayán blanco, harrajian, mata gallinas, mirta, mirtilo, mirto

común, mortera, murta, murtal, murtera, murtiñera, murto, murtrón, myrta.

5

USOS Y ANTECEDENTES

El Mirto o Arrayán, por su composición y propiedades, es similar al Eucalipto, pues ambas

especies pertenecen a la misma familia botánica, Myrtaceae. Se utiliza popularmente para

infecciones pulmonares y bronquiales, urinarias (cistitis) e intestinales (diarreas,

disenterías).También contiene taninos que le confieren un carácter astringente.

Además, las bayas se utilizan como antiséptico, astringente, carminativo, analgésico, tónico

para el cabello, hemostático, antiemético, cardiotónico, diurético, anti-inflamatorio, tónico

para el cerebro, nefroprotector, antidiabético. Diversas acciones farmacológicas de las hojas

son astringente, antiséptico, hipoglucemiante, laxante, analgésico, tónico y estimulante del

cabello. Se ha reportado propiedades antibacterianas de la raíz (3).

Según señala Sumbul et al, 2011 (3), la decocción de la fruta se utiliza para bañar a los

recién nacidos con la piel enrojecida, mientras que la decocción de hojas se utiliza todavía

para lavado vaginales, enemas y contra enfermedades respiratorias. El aceite obtenido de

las bayas fortalece y promueve el crecimiento del cabello.

Muchos aceites esenciales y sus componentes han sido recientemente calificados como

antioxidantes naturales, como es el caso del Mirto (3,7-8). Estos compuestos tienen un papel

importante en la prevención de una variedad de enfermedades relacionadas con el estilo de

vida y el envejecimiento debido a que estos están estrechamente relacionados con especies

reactivas del oxígeno (ROS) y la peroxidación lipídica (8).

Mimica-Dukić et al, 2010 (7) concluyó el aceite esencial de Mirto mostró un potencial

considerable antimutagénico, que fue probablemente debido a la actividad antioxidante de

sus componentes. Se demostró a través del método TLC-DPPH que el 1,8-cineole y metil

eugenol son los compuestos más responsables de la actividad de captación de radicales de

todo el aceite. También indica que los compuestos fenólicos presentes en los extractos de

metanol o etanol de hojas de mirto, contribuyen adicionalmente a la actividad global

antioxidante y anti-mutagénica.

Además, M. communis presentó capacidad para inducir la muerte celular de las diferentes

líneas celulares de cáncer con características de apoptosis. Gracias a la activación de la

6

caspasa-3, -8 y -9, la escisión de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), la liberación de

los nucleosomas en el citosol, y la fragmentación del ADN. Esto causó la pérdida del

potencial de membrana mitocondrial en las células MM6 y llevó a la liberación de

citocromo c de la mitocondria (9).

Por otro lado, varios estudios han comprobado la actividad antimicrobiana del Arrayán.

Mansouri et al, 2001 (10), evaluó la actividad antibacteriana del extracto crudo de metanol

de Myrtus communis L. contra 10 cepas de laboratorio de microorganismos, incluyendo 6

Gram positivas (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes) y 4 Gram

negativas (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa y Campylobacter

jejuni).

Así mismo, Al-Saimary et al, 2002 (11), utilizaron dos métodos por para evaluar la actividad

antibacteriana de diversas concentraciones de los extractos acuosos de las hojas contra

Pseudomonas aeruginosa en comparación con 6 antibióticos; estos métodos determinan las

zonas de inhibición de crecimiento y la concentración inhibitoria mínima. Los extractos

acuosos dieron un excelente efecto sobre el crecimiento bacteriano y sus efectos se

encuentran dentro de los límites de los efectos antibióticos.

Feisst et al, 2013 (12), identificó Myrtucommulone (MC) y semimyrtucommulone (S-MC)

en las hojas de mirto, los cuales mostraron poseer actividad anti-inflamatoria al suprimir

potentemente la biosíntesis de eicosanoides por la inhibición directa de la ciclooxigenasa-1

y 5-lipoxigenasa in vitro e in vivo. Lo que sugiere su uso terapéutico para el tratamiento de

enfermedades relacionadas con la inflamación y alergia.

COMPOSICIÓN DEL ACEITE ESENCIAL

Hasta hace poco, los aceites esenciales se han estudiado en su mayoría por su sabor y

fragancia para dar sabor a los alimentos, bebidas y otros bienes. Sin embargo, los aceites

esenciales y sus componentes están ganando mayor interés debido a su potencial uso multi-

funcional. Muchos autores han informado de las propiedades antimicrobianas, antifúngicas,

antioxidantes y de captura de radicales de los mismos (13). Así es importante conocer la

composición del aceite esencial de Myrtus communis L.

7

Bajalan et al, 2013 (14), extrajo el aceite esencial utilizando el equipo de Clevenger;

posteriormente se analizó por GC y GC/MS. De acuerdo con este estudio, se identificaron

25 componentes diferentes que representaron el 92.21% del total del aceite; siendo los

principales: el α-Pinene (27.87%), 1,8-cineole (20.15%), ambos monoterpenos oxigenados,

y Linalool (10.26%). Mientras tanto Yadegarinia et al, 2006 (13), obtuvo por análisis de GC

y GC/MS un total de 32 compuestos en el aceite de M. communis, entre los cuales la mayor

cantidad correspondía a: α-Pinene (29.1%), Limonene (21.5%), 1,8-cineole (17.9%) y

Linalool (10.4%). Tabla 1.

Tabla 1 Composición química de aceite esencial de Myrtus communis.

Fuente: Yadegarinia et al, 2006 (13)

8

La diferencia entre los porcentajes de cada componente entre ambas investigaciones se

puede deber a diversas razones. Primero, los nutrientes de diferentes suelos y su

acumulación en las hojas podría resultar en diferente metabolismo y la producción de

diferentes productos biológicos y aceites volátiles. Segundo, el cambio en los genes a través

de las generaciones e hibridaciones, puede resultar en la producción de una variedad de

aceites volátiles. Tercero, la aclimatación de especies al medio ambiente en el que se

cultiva, así como a los diferentes ecotipos de la especie (15).

ANÁLISIS DE MERCADO

El comercio internacional de aceites esenciales está controlado por dos grandes sectores

económicos que acopian la mayor parte de la producción mundial: las grandes empresas de

sabores y fragancias y los grandes acopiadores de materias primas para estas industrias. La

mayoría de estas empresas están establecidas en EEUU, Europa y Japón. De esta forma, se

puede decir que nueve grupos manejan el 80% del mercado de sabores y fragancias a nivel

mundial: IFF (empresa norteamericana que vende unos 1,700 millones de US$), Givaudan

–Roure (grupo Hoffman La Roche, vende unos 1.100 millones), Quest (grupo ICI, unos

800 millones), Haarmann & Reimer (grupo Bayer, unos 850 millones), Firmenich (unos

500 millones), Tastemaker, Takasago, Bush Boak Allen y Dragocco. El resto del mercado

está dividido entre grandes empresas nacionales de mucha menor envergadura que las

citadas y un sin número de pequeñas y medianas empresas (16).

Estados Unidos es el principal mercado de las exportaciones de aceites esenciales de la

región sudamericana, el registro de compras en el año 2007 fue por US$ 463,69 millones,

de los cuales el 24% es decir US$ 111,29 millones provenían de Sudamérica (17).

Aunque cabe resaltar que las importaciones son poco representativas en comparación con el

volumen total de las importaciones mundiales, no obstante se ajustan al comportamiento

creciente de éste mercado (18).

Los principales orígenes de las importaciones de Estados Unidos son India, Argentina,

Francia, Brasil, México y China.

9

Como lo muestra la Tabla 2, en el año 2007 Perú exportó una cantidad total de 483 451,98

kg netos de aceites esenciales por el valor de 12 218 392,46 US$ FOB total, teniendo como

principales destinos a los Estados Unidos, al Reino Unido y a Los Países Bajos (19).

También se puede apreciar, que el tercer lugar en exportaciones peruanas de esencias, lo

ocupa el aceite esencial de arrayan, con un valor de US$ 11 545,33 FOB total registrado

por cada 44,03 kg netos de aceite esencial, para el año 2007 (19).

Tabla 2: Ranking de aceites esenciales exportados por el Perú - año 2007.

Fuente: Veritrade L.T.D. (2007)

10

En el Perú normalmente encuentra aplicación en la fabricación de aguas de colonia y en

aguas de baño. El Arrayán contiene tanto en sus hojas como en sus frutos una esencia

aromática fuertemente antiséptica, el Mirtol.

Entre las empresas que comercializan aceite esencial de Arrayan están:

Inkanatural Botella de 10 ml a 25 soles

Essential oils Perú- EOP Botella de 10 ml a 44 soles

Aroma y sabores del mundo Por 0.20 ml a 10.60 soles

II. Aceites Esenciales

DEFINICIÓN

Los aceites esenciales son las fracciones líquidas volátiles, que contienen las sustancias

responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética

(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica

(saborizantes). Generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes que

pueden ser: Compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos,

cetonas, ésteres y ácidos), Monoterpenos, Sesquiterpenos y Fenilpropanos (20).

CLASIFICACIÓN (21)

Los aceites esenciales se clasifican con base en los siguientes criterios: Consistencia, origen

o naturaleza química de los componentes mayoritarios.

Por su consistencia

o Las Esencias Fluidas. Son líquidos muy volátiles a temperatura ambiente (esencias

de albahaca, caléndula, citronela, pronto alivio, romero, tomillo, menta, salvia,

limón).

11

o Los Bálsamos: Son de consistencia más espesa, poco volátiles, contienen

principalmente sesquiterpenoides y son propensos a polimerizarse (bálsamos de

Copaiba, bálsamo de Perú, bálsamo de Tolú).

o Oleorresinas: Tienen el aroma de las plantas en forma concentrada, son típicamente

líquidos muy viscosos o sustancias semisólidas (caucho, gutapercha, chicle,

oleorresinas de páprika, de pimienta negra, de clavero). Contienen los aceites

esenciales, los aceites fijos, los colorantes y los principios activos de la planta.

o Los Concretos: Se obtienen de plantas aromáticas frescas por extracción con

solventes apolares (hidrocarburos). Tienen forma de semisólidos coloreados, libres

del solvente original. Estos componentes no son muy solubles en las bases para

perfumes siendo así necesaria su conversión en absolutos.

o Los Absolutos: Son productos de conversión de concretos por la extracción con

etanol absoluto. Una vez completa la disolución, los absolutos se refrigeran a

temperaturas de -5 °C a -1°C. A estas temperaturas las ceras se precipitan y se

pueden remover por filtración. El rendimiento de absolutos a partir de concretos

varía de 10% a 65 %.

Por su origen

o Aceites Esenciales Naturales: Se obtienen directamente de la planta y no se someten

posteriormente a ninguna modificación fisicoquímica o química, son costosos y de

composición variada.

o Artificiales: Se obtienen por enriquecimiento de esencias naturales con uno de sus

componentes; también se preparan por mezclas de varias esencias naturales

extraídas de distintas plantas.

o Sintéticos: Son mezclas de diversos productos obtenidos por procesos químicos, son

más económicos y por lo tanto se utilizan mucho en la preparación de sustancias

aromatizantes y saborizantes.

Por la naturaleza química

Según la estructura química de los componentes mayoritarios que determinan el olor

particular de los aceites, estos se dividen en tres grupos principales:

12

o Monoterpenoides (Iinalool, nerol, 1-8 cineol, geraniol)

o Sesquiterpenoides (farnesol, nerolidol)

o Fenil propanos oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas)

Los monoterpenoides se encuentran principalmente en plantas de los órdenes Ranunculales,

Violales y Primulales, mientras que son escasos en Rutales, Cornales, Lamiales y Asterales.

Por el contrario, los sesquiterpenoides abundan en Magnoliales, Rutales, Cornales y

Asterales. Aunque en los aceites esenciales tanto los monoterpenos, los sesquiterpenos y los

fenilpropanos se les encuentran en forma libre, más recientemente se han investigado los

que están ligados a carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos

del aceite como tal.

BIOSÍNTESIS DE LOS ACEITES ESENCIALES

Los compuestos terpenoides naturales son sintetizados de la ruta de la acetil-coenzima por

medio de intermediario común que es el ácido mevalónico.

Estudios recientes muestran que muchos terpenoides no se originan de esta ruta, por lo que

se muestra una ruta alterna que implica al piruvato, gliceraldehido- 3-fosfato y un

intermedio 1-desoxi-xilulosa-5fosfato (20).

1. Biosíntesis del Ácido Mevalónico

Comienza con dos moléculas acetilCoA que se condensan. Seguido otra unidad de

acetilCoA que ha perdido un H-α. La hidrólisis de una de las dos funciones tioéster da lugar

a la β-hidroxi-β-metilglutarilCoA. Se da una segunda hidrólisis del otro grupo de tioéster

seguido de dos reducciones sucesivas con una reductasa NADPH-dependiente se logra

obtener el Ácido Mevalónico (20). (Figura 2)

13

Figura 2: Biosíntesis del ácido mevalónico

2. Biosíntesis de IPP y DMAPP

Dos unidades básicas que originan los terpenoides provienen del ácido mevalónico, son:

Isopentenilpirofosfato (IPP) y gama, gamadimetilalilpirofosfato (DMAPP). Una molécula

de ácido mevalónico es pirofosfatada por dos unidades de ATP para originar mevalonil-

pirofosfato.

Se produce una descarbonatación por medio de ATP, generando Isopentenilpirofosfato

(IPP). Un doble enlace en IPP da la unidad DMAPP (20). (Figura 3)

14

Figura 3: Biogénesis de las unidades isoprénicas básicas: Isopentenilpirofosfato (IPP) y γ,γ-

Dimetilalilpirofosfato (DMAPP)

3. Condensación cabeza-cola de IPP y DMAPP

Un IPP se puede condensar con varias unidades de DMAPP por una condensacion “cabeza-

cola”, donde la cabeza es la funcion pirofosfato y la cola el extremo donde estan los

metilos. En la Figura 4 se ve el origen del Geralnilpirofosfato, precursora de monoterpenos

naturales. La condensacion de geranilpirofosfato con una nueva unidad IPP da origen al

farnesilpirofosfato, el cual es el precursor de todos los sesquiterpenos naturales (20). (Figura

4).

15

Figura 4: Formación de terpenoides a partir de IPP y DMAPP

CAVIDADES SECRETORAS (22)

Los espacios secretores pueden encontrarse en cualquier lugar de la planta y las secreciones

son variadas: Terpenos volátiles en Mirtaceae, Umbelliferae; bálsamos y resinas en

Coniferae; gomas o mucílagos en Sterculiaceae y Malvaceae.

Pueden presentarse como cavidades más o menos esféricas o como canales o conductos. Su

origen es esquizógeno o lisígeno, a veces mixto.

16

Los espacios lisígenos se forman por lisis de células enteras (holocrina), y quedan rodeados

de células más o menos desintegradas. Las secreciones se originan en las células antes de

que éstas se desintegren. La lisis comienza en unas cuantas células y luego se extiende a las

vecinas. Estos espacios pueden formarse como respuesta a lesiones.

En el exocarpo de Citrus hay cavidades lisígenas (Figura 5), se pueden ver a simple vista

como pequeñas masas translúcidas.

Figura 5. Corte transversal del exocarpo de Citrus (Rutaceae) con cavidades lisígenas

Por otro lado, en los espacios o cavidades esquizógenos la cavidad se forma gracias a que

las células se separan por disolución de la laminilla media y por dilatación de los espacios

intercelulares. Las células que limitan los espacios se diferencian formando el epitelio

secretor (figura 6.). La secreción es merocrina (22).

Figura 6. Ontogenia de una cavidad esquizógena

Para Myrtus communis las hojas aromáticas presentan canales o cavidades esquizógenas

secretoras que parecen puntos hialinos, rellenas de aceites esenciales, fundamentalmente de

compuestos terpénicos, y frecuentemente con células secretoras taníferas dispersas (23).

17

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO:

Se trabajaron dos métodos distintos de extracción de los aceites por lo que el material tuvo

diferentes tratamientos. De esta forma, 379.2 gramos de la especie botánica Myrthus

communis “Arrayan” se mantuvo en fresco y 401.4 gramos fue llevado a secado en estufa.

La planta provino del Centro mayorista de verdura, “La Parada”.

METODOLOGÍA

1. RECOLECCIÓN:

Las ramas con las flores de las especie M. communis fueron recolectadas de la sierra de

Junín. Se hizo una selección de las mismas, para luego proceder a su secado en la estufa.

2. TRITURACIÓN, DESECACIÓN Y ALMACENAMIENTO:

Secado en estufa: Se pesaron 401.4 g de muestra, se colocó en una fuente hecha de

cartulina y se colocó en estufa a una temperatura de 47° C y se realizó determinaciones de

peso con la mayor frecuencia posible hasta alcanzar un valor constante. El material seco, se

almacenó a temperatura ambiente en la misma fuente de papel acondicionándola para que

no haya un intercambio de humedad.

3. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES

Según la variedad del material vegetal, parte de la planta a emplear y estabilidad del aceite

esencial que se pretenda obtener, se emplean diversos procedimientos físicos y químicos de

extracción, donde su correcta aplicación será lo que determine la calidad del producto final.

Sin embargo, en materia de rendimiento es importante establecer que ninguna cantidad de

mejoras en los aspectos tecnológicos compensará la mala calidad del material vegetal (24).

3.1 Destilación Por Arrastre Con Vapor De Agua

La destilación por arrastre con vapor es una técnica usada para separar sustancias orgánicas

insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no volátiles que se encuentran en la

mezcla, como resinas o sales inorgánicas. Con esta técnica se pueden separar sustancias

inmiscibles en agua y que se descomponen a su temperatura de ebullición o cerca de ella,

18

Figura 8. Destilador tipo

Clevenger

por lo que se emplea con frecuencia para separar aceites esenciales naturales que se

encuentran en hojas, cáscaras o semillas de algunas plantas (mitecnológico). El material

vegetal generalmente fresco y cortado en trozos pequeños (troceado), se coloca en un

recipiente cerrado y somete corrientes de vapor de agua sobrecalentado. Los compuestos

volátiles que están presentes en la muestra son arrastrados por el vapor de agua, este

posteriormente condensa y se recolecta sobre un recipiente que contiene agua, lo cual

permite que se lleve a cabo una separación de dos fases (Figura 7). Los aceites esenciales

son generalmente insolubles en agua y menos densos que ésta, lo que facilita la separación

de la fase orgánica, que se obtienen en un embudo de decantación. Esta técnica es muy

empleada y reconocida, se usa generalmente para extraer esencias fluidas, utilizadas para

perfumería y cosmética. Se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza

del aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada (20).

3.2 Hidrodestilación (Equipo Clevenger)

La hidrodestilación es una técnica de destilación directa. En este

tipo de extracción el material vegetal que puede estar molido,

cortado, entero o la combinación de éstos, se dispone en un

recipiente cerrado y se adiciona agua hasta ¾ de la capacidad del

recipiente. Posteriormente éste se somete a calentamiento durante

Figura 7. Destilación por arrastre de vapor

19

el proceso de extracción. El agua al llegar al punto de ebullición genera vapor. La

generación del vapor debe ser interna (base del recipiente), produciendo la presión

suficiente para vencer la resistencia hidráulica del material vegetal. Conforme el vapor

entra en contacto con la planta, éste extrae los componentes volátiles. La mezcla de vapor

saturado y aceite esencial, fluye hacia un condensador, en donde se condensa y enfría hasta

la temperatura ambiente (Figura 8). A la salida del condensador, se obtiene una emulsión

líquida inestable, la cual es separada en la trampa de Clevenger o en un tubo separador

(Figura 8), en donde se va acumulando el aceite esencial debido a su inmiscibilidad en el

agua. La trampa posee un ramal lateral por la cual el agua es desplazada para favorecer la

acumulación del aceite. Esta técnica es utilizada comúnmente para extraer aceite esencial

de diferentes tipos de vegetales (24).

4. ANÁLISIS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Se realizó en el Laboratorio de Ecologia Microbiana y Biotecnologia Marino Tabusso

(LMT) de la UNALM. Se utilizó el método de difusión en agar reportado en el estudio de

Sánchez et al, 2012 (25) con ciertas modificaciones. Los microorganismos fueron incubados

en caldo LB hasta obtener una densidad óptica de 0.05 (106 ufc/ml). Se inocularon 100 µl

de cada microorganismo en placas petri con agar Mueller-Hinton (25). Finalmente, se añadió

el aceite esencial (desde 5-10µl) en diversos puntos, y se dejaron incubar a 28 ºC por 24h.

Los microorganismos empleados fueron: un gram positivo (Bacillus amyloliquefaciens) y

dos gram negativo (Escherichia coli, Pseudomonas poae).

5. ANÁLISIS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA

La prueba antifungica se realizó en el Laboratorio de Micologia y Biotecnologia (LMB) de

la UNALM. Se trabajó en condiciones asépticas, se ejecutó el método disco agar difusión

con Aspergillus niger y Penicillium variabile según el estudio reportado por Akli Ouelhadj

et al, 2011(26). Los hongos fueron sembrados en tubos de agar PDA por 5 días, transcurrido

ese tiempo se le agregó a cada tubo Tween 80 al 0.1 % para cosechar las esporas y preparar

los inóculos a 107 spores/ml. Este se inoculó en agar PDA por incorporación en placas

Petri, luego se añadió el aceite esencial a un volumen de 30 µl, encima del papel Whatman

20

Tabla 3. Cuadro comparativo entre los dos método utilizados en la extracción.

de 6mm de diámetro, en el centro de la placa. Se incubó a 28ºC por 72 h, pero también se

evaluó el transcurso del experimento a 48 h.

RESULTADOS

Rendimientos obtenidos por Arrastre de vapor e hidrodestilación

Actividad antibacteriana

Luego de 24 horas se determinó que había actividad antibacteriana contra la bacteria B.

amyloliquefaciens, gram positiva (Fig. 7), mientras que para la muestra de Pseudomonas

poae no se evidenció inhibición puesto que los microrganismos crecieron uniformemente

en toda la placa (Fig.8). En el caso de E. coli se observó un retraso en el crecimiento del

microorganismo (Fig.9) en las zonas donde se inoculó el aceite. Sin embargo, no se puede

hablar de un efecto bactericida, como se vio en B. amyloliquefaciens.

Material vegetal Aceite esencial

extraído Rendimiento

Arrastre de vapor 270g fresco 0.1 ml 0.037ml/100g material fresco

Hidrodestilación

(Clevenger)

400g fresco

(174.3g seco) 0.9 ml

0.2ml/100g material fresco

(0.5ml/100g material seco)

21

Contra Bacillus amyloliquefaciens (gram positiva)

Contra Pseudomonas poae (gram negativa)

Figura 9: Actividad antimicrobiana del arrayan contra Bacillus

amyloliquefaciens. Inóculo del aceite de 5ul y 7ul. Diámetro de inhibición de

13 y 23mm, respectivamente

Figura 10: Actividad antimicrobiana del arrayan contra Pseudomonas poae. Inóculo del

aceite de 5ul y 7ul. No se reportó inhibición.

22

Contra Escherichia coli (gram negativa)

Tabla 4: Diámetro de los halos de inhibición

ESPECIE DIÁMETRO

A 5 ul A 7 ul

Bacillus amyloliquefaciens 13 mm 23 mm

Pseudomonas poae - -

Escherichia coli 0.9mm (10ul) 0.7mm

(-) No presencia de halos de inhibición

Actividad antifúngica

Luego de 72 horas se determinó que no había actividad antifungica del arrayan contra los

dos microorganismos (Figura 11, 12)

Figura 11: Actividad antimicrobiana del arrayan contra E.coli. Inóculo del aceite de 5ul, 7ul

y 10µl. Se observó un retraso en el crecimiento (zonas resaltadas), más no efecto bactericida.

10

7

5

23

Contra Penicillium variabile

Figura 12: Actividad antimicrobiana sobre Penicillium variabile con 30uL de aceite de arrayan a

las A. 48h y B. 72h. El aceite se agregó sobre papeles estériles. Se nota una demora en la

esporulación, mas sí hubo crecimiento.

A.

B.

24

Contra Aspergillus niger

DISCUSIÓN

A.

B.

Figura 13. Actividad antifúngica sobre Aspergillus niger con 30 uL de aceite de arrayán a A. 48h y

a B. 72h. El aceite se agregó sobre papales estériles. Se nota una demora en la esporulación, mas sí

hubo crecimiento miceliar.

25

DISCUSIÓN

Extracción de los aceites esenciales

Se realizaron dos metodologías para la extracción de aceites esenciales. La metodología

más conocida es el equipo Clevenger (27) usado en muchos laboratorios y considerado en

varios estándares internacionales como el más adecuado para la determinación del

contenido total del aceite esencial de una planta aromática (28). Los resultados corroboran

este hecho, pues tenemos que la extracción por el método de hidrodestilación, equipo

Clevenger, fue más efectivo con 0.2ml/100g material fresco en comparación a los

0.035ml/100g material fresco (no fue suficiente para llevar a cabo las pruebas necesarias

para el valor agregado). Esto se debe a múltiples razones: el flujo de vapor producido en el

generador no fue adecuado (demasiado bajo) para la cantidad de materia prima utilizada; el

montaje de laboratorio es de vidrio y no está aislado, las pérdidas de calor a los alrededores

son muy altas, lo que hace que el vapor se condense con demasiada facilidad (29); si el

material queda muy apretado, el vapor se acanala disminuyendo el rendimiento del aceite

(30). Por otro lado, el rendimiento logrado para el arrayán en hidrodestilación fue de 0.5%

(v/p-muestra seca); por lo que se puede decir que el rendimiento de extracción obtenido es

bajo, pero dentro del rango reportado por Farrell (1985) (31), quien menciona que la mayoría

de los aceites esenciales tienen rendimientos de extracción de 0.5-2%. Sin embargo, es

importante recordar que el rendimiento puede variar dependiendo de la región y época de

cosecha del arrayán, así como del modo de proceso y preparación de la muestra utilizada

(32); subvalorando la producción de aceites esenciales por la planta. Eso se refleja en los

resultados de otras investigaciones, los cuales reportan rendimientos similares al nuestro:

0.29, 0.54 y 0.36% (33). Los resultados que se vienen mencionando fueron obtenidos por el

equipo Clevenger, el cual tuvo la característica de ser utilizado con material seco. Si bien el

secado reduce la cantidad de aceite en cada planta, puede incrementar enormemente el

rendimiento por tanda porque se puede colocar más material en cada tanda. De esta forma

se asegura que mayor área de muestra esté expuesta a los vapores.

26

Actividad Antibacteriana

El aumento de la prevalencia de microorganismos resistentes a los fármacos

antimicrobianos es una preocupación importante en todo el mundo. Así, con tantos agentes

antibacterianos disponibles para el tratamiento de infecciones sistémicas, este no es ningún

problema en la actualidad, pero la capacidad de los microorganismos para adquirir

resistencia a múltiples fármacos puede negar el efecto terapéutico de una familia entera de

agentes antibacterianos. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos,

seguros y eficaces es necesario. Las plantas podrían ser una buena fuente para este

propósito, y muchos extractos de plantas presentan actividades anti-microbianas (34).

En el presente estudio se evaluó cualitativamente la actividad antibacteriana in vitro del

aceite esencial de M. communis según la presencia o ausencia de zonas de inhibición. Las

pruebas se realizaron utilizando diferentes bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram +),

Escherichia coli, y Pseudomonas poae (Gram -). Los resultados que se muestran en la

Tabla 4 difieren de lo señalado en otros trabajos. Por ejemplo, Akin et al, 2010 (34),

realizaron el test de disco difusión, reportando inhibición del crecimiento en E. coli, S

aureus y P. Aeruginosa; siendo los diámetros (en mm) 15, 15 y 7, respectivamente.

Yadegarinia et al, 2006 (13), también señaló efecto inhibitorio del aceite esencial de Arrayán

a una concentración de 8µl/ml en E. coli (13mm), S aureus (10mm) y C. albicans

(21.33mm). Así mismo, Nabavizadeh et al, 2014 (35), llevó a cabo el test de disco-difusión,

dando zonas de inhibición para E. faecalis (21mm), S aureus (48mm) y C. albicans

(26mm).

Sin embargo, es difícil comparar directamente los datos con la literatura señalada porque

varias variables influyen en los resultados, como la diferente composición química del

aceite esencial debido a factores ambientales (como la geografía, la temperatura, la

duración del día, nutrientes, etc) a los que se encuentra expuesta la planta. Estos factores

intervienen en las vías biosintéticas y en consecuencia, la proporción relativa de los

principales compuestos característicos (13,15,34 ). Entonces, como la mayoría de los trabajos

citados son provenientes de una región completamente distinta a la nuestra, Europa

occidental y medio oriente, es muy probable que esta sea una de las razones de las

discordancias encontradas.

27

Por otro lado, se notó que Pseudomonas poae no se vio afectada y E. coli sufrió un retraso

en su crecimiento (Fig. 10 y 11), mientras que B. amyloliquefaciens (Gram +) sí es inhibido

por el aceite esencial. Fig. 9. Coincidiendo con otros estudios donde se informó que las

bacterias Gram-negativas son más resistentes a los extractos a base de plantas y aceites

esenciales (36). La causa de este comportamiento recae en que la estructura hidrofílica de la

membrana externa de las bacterias Gram-negativas está constituida esencialmente del lipo-

polisacárido (LPS), lo cual bloquea la penetración del aceite hidrófobo y evita la

acumulación del aceite esencial en la membrana de la célula diana (37).

En los últimos años, como se ha mencionado, varias publicaciones han documentado la

actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y de los extractos de plantas. Los

componentes mayoritarios en el aceite de M. communis son α-Pinene (29.1%), Limonene

(21.5%), 1,8-cineole (17.9%) y Linalool (10.4%), siendo los dos últimos los principales

responsables de su efecto antimicrobiano (13,34). Ambos son compuestos terpenoides y uno

de los principales mecanismos de acción propuestos consiste en la disrupción de la

membrana celular bacteriana mediante 3 posibles vías: aumentando la permeabilidad de la

membrana a iones pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y

desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos 3 efectos

produce la muerte en la célula bacteriana (38).

Actividad antifúngica

Los productos químicos sintéticos son conocidos por sus propiedades cancerígenas. La

aplicación excesiva de fungicidas sintéticos fue advertido después de su toxicidad y

contaminación residual que resulta. Del mismo modo, muchos patógenos pueden

desarrollar resistencia a estos fungicidas. Para ello, la lucha contra los microorganismos se

dirige al uso de métodos orgánicos. Actualmente, además de lo ya mencionado, los aceites

esenciales son una herramienta muy útil para aumentar la vida útil de los productos

alimenticios. Estas sustancias naturales ricos en antioxidantes y compuestos

antimicrobianos se consideran alternativa importante para resolver los problemas de

28

deterioro post cosecha relacionadas con molde y para evitar la pérdida de la calidad y

cantidad de fruta durante el almacenamiento (39).

Por lo anterior, se evaluó la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de M.

communis contra dos cepas de hongos pertenecientes a los principales hongos que causan el

deterioro de los alimentos incluidos frutas: Aspegillus niger y Penicillium variabile.

En la figura 12a, muestra que a las 48 horas, el aceite esencial de arrayan (30ul) mostró una

aparente actividad fungicida contra P. variabile manifestando un posible halo de

inhibición. Sin embargo, esto fue distinto a las 72 horas (figura 12b) en donde se observó

un crecimiento dentro de la zona de inhibición, lo cual sugiere una actividad fungistática

mas no fungicida ya que el crecimiento del hongo se vio retrasada en comparación al resto

de la placa, esto por una posible alteración morfológica de las hifas de todo el hongo (40).

Este resultado difiere de Akli Ouelhadj et al 2011 (24), quienes afirman que a un volumen de

aceite superior a los 20 ul, Penicillium. sp es extremadamente sensible y genera halos de

(para 30 ul) de 46 mm. En cambio, Martinetz et al 1998 (41) reportó que el extracto de

aceite esencial de M. communis fue inefectivo en Penicillium sp resultado que apoya lo

reportado en este trabajo.

Situación similar se dio para Aspergillus niger. En la figura 13a, muestra que a las 48 horas,

existe una aparente inhibición alrededor del papel Whatman de unos 0.5 mm y más allá de

esa distancia un crecimiento miceliar sin esporulación en comparación de toda la placa. A

pesar de ello a las 72 horas (figura 13b) el crecimiento se dio dentro de la posible zona de

inhibición y la esporulación se hizo cada vez más evidente dentro de la zona de crecimiento

sin esporulación que se observó en la figura 13a. Con lo anterior, se sugiere lo mismo que

para P. variabile, una actividad fungistática mas no fungicida. Resultado contradictorio a lo

dicho por Akli Ouelhadj et al 2011 (24) de quienes se siguió la metodología para evidenciar

la actividad antifungica, si para un volumen de 20 ul A. niger no mostraba extrema

sensibilidad en comparación a Penicillium. sp, entonces con 30 ul se esperó halos de

inhibición más, iguales o cercanos a 59.5 mm y una extrema sensibilidad al aceite de M.

communis. Sin embargo, no fue así y más bien se podría apoyar los resultados en el trabajo

de Sadeghi Nejad B et al (2014)(42) quienes mencionan que a una alta concentración del

aceite se observó un muy bajo efecto inhibitorio contra A. niger.

29

Según la literatura consultada, la actividad antifúngica del aceite esencial de M. communis

es debido a sus componentes principales: cineol (éter), α-pineno y limoneno

(monoterpenos), y también a sus constituyentes minoritarios: mirtenol, linalol, geraniol

(alcoholes terpénicos) y eugenol (fenol)(24) .

Si monoterpenos tales como α-pineno y limoneno se encuentran entre los principales

componentes que contribuyen a la alta actividad antimicrobiana de Myrtus communis(43) y

según Derwich et al 2010 (44), esta actividad de los monoterpenos se explica por la

presencia de grupos hidroxilo fenólicos capaces de formar enlaces de hidrógeno con los

sitios activos de las enzimas de la célula diana. Entonces, se puede sugerir que el aceite

esencial extraído del arrayan presentaba esos compuestos (puesto que la composición de

una aceite no cambia) no obstante, estos estaban en una baja concentración lo que podía

influir en una baja actividad antifungica. Para tal caso a través de GC y GC-MS, se hubiera

tenido la composición real del aceite extraído (45).

CONCLUSIONES

Por lo tanto, la extracción del aceite de Myrtus communis es más efectiva y con un mayor

rendimiento usando el equipo de Clevenger con muestra estabilizada.

Presenta una actividad antibacteriana contra Gram positiva (Bacillus amyloliquefaciens)

mas no, para Gram negativas (Escherichia coli, y Pseudomonas poae) y no se evidenció

actividad antifúngica contra Aspergillus niger y Penicillium variabile sino más bien una

actividad fungistatica.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Bandoni A, et al. Los Recursos Vegetales Aromáticos en Latinoamérica. Ciencia y

Tecnología para el Desarrollo CYTED. Universidad Nacional de la Plata, La Plata –

Argentina; 2000

2. Fenaroli G. La Sostanze Aromatichi. I. Sostanze Aromatiche Naturali. Roma: Ed.

Hoepli; 1963.

30

3. Sumbul S., Aftab Ahmad M., Asif M., Akhtar M. Myrtus communis Linn: A

review. Indian J Nat Prod Resour. 2011; Vol. 2(4): 395-402

4. Davis PH. Myrtaceae, in Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Vol. 4.

Edinburgh, the University Press; 1982.

5. Traveset A, Riera N and Mas RE. Ecology of Fruit colour Polymorphism in Myrtus

communis and Differential Effects of Birds and Mammals on Seed Germination and

Seedling Growth. J Ecol. 2001; 89: 749-760.

6. Aronne G and De Micco V. Hypocotyl features of Myrtus communis (Myrtaceae): a

many-sided strategy for possible enhancement of seedling establisment in the

Mediterranean environment. Bot J Linn Soc. 2004; 145:195-202.

7. Mimica-Dukić N., Bugarin D., Grbović S., Mitić-Ćulafić D., Vuković-Gačić B.,

Orčić D., Jovin E., Couladis M. Essential Oil of Myrtus communis L. as a Potential

Antioxidant and Antimutagenic Agents. Molecules. 2010, Vol. 15: 2759-2770.

8. Gortzi O., Lalas S., Chinou I., Tsaknis J. Reevaluation of bioactivity and antioxidant

activity of Myrtus communis extract before and after encapsulation in liposomes.

Eur Food Res Technol. 2008; 226 (3): 583-590.

9. Tretiakova I, Blaesius D, Maxia L, Wesselborg S, Schulze-Osthoff K, Cinatl J Jr,

Michaelis M., Werz O. Myrtucommulone from Myrtus communis induces apoptosis

in cancer cells via the mitochondrial pathway involving caspase-9. Apoptosis. 2008;

13(1): 119-131.

10. Mansouri S, Alireza Foroumadi A, Teimour Ghaneie T, Najar A G. Antibacterial

activity of the crude extracts and fractionated constituents of Myrtus communis.

Pharmaceut Biol. 2001; 39(5): 399-401.

11. Al-Saimary I E, Bakr S S, Jaffar T, Al-Saimary A E, Salim H, Al-Muosawi R.

Effects of some plant extracts and antibiotics on Pseudomonas aeruginosa isolated

from various burn cases. Saudi Med J. 2002; 23(7): 802-805.

12. Feisst C, Franke L, Appendino G and Werz O. Identification of molecular targets of

the oligomeric nonprenylated acylphloroglucinols from Myrtus communis and their

implication as anti-inflammatory compounds. J Pharmacol Exp Ther. 2005; 315(1):

389-396.

31

13. Yadegarinia D., Gachkar L., Bagher Rezaei M., Taghizadeh M., Alipoor Astaneh

S., Rasooli I. Biochemical activities of Iranian Mentha piperita L. and Myrtus

communis L. essential oils. Phytochemistry. 2006; (67): 1249–1255

14. Bajalan I., Akbarzadeh M., Veysanlu F. Chemical Composition of Myrtle Essential

Oil (Myrtus Communis L.) in Gilane Gharb from Iran. WSJ; Vol. 1(5): 59-65.

15. Ghnaya A., Chograni, Messoud C., Boussaid M. Comparative Chemical

Composition and Antibacterial Activities of Myrtus communis L. Essential Oils

Isolated from Tunisian and Algerian Population. J Plant Pathol Microb. 2013; Vol.

4(7).

16. Avellaneda G, Roa G. Estudio de la estructura de mercado para la comercialización

de aceites esenciales en Colombia. [Informe en internet]. Colombia: Universidad

Industrial de Santander, 2008. [citado 15 de nov 2014]. Disponible en:

http://repositorio.uis.edu.co/jspui/bitstream/123456789/8335/2/128806.pdf

17. Llanos Arapa S. Extracción y caracterización del aceite esencial de Molle (Schinus

Molle L.).[Tesis para optar el título de Ingeniero en Industrias Alimentarias]. Tacna:

Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann; 2012.

18. Sistema de Bibliotecas de Sena. Introducción a la Industria de los Aceites

Esenciales extraídos de Plantas Medicinales y Aromáticas. [libro en internet].

Bogota: Servicio Nacional de aprendizaje SENA.[citado 15 de nov 2014].

Disponible en:

http://repositorio.sena.edu.co/sitios/introduccion_industria_aceites_esenciales_plant

as_medicinales_aromaticas/

19. Veritrade L.T.D. Estudio de Aceites Esenciales. 2007. Recuperado el 30 mayo de

2010. Disponible en:

http://www.amcham.org.pe/tradecenter/veritrade/samples/Customized%20Reports

%20Sample%20-%20A.pdf

20. Martínez A. Aceites esenciales. [monografía en internet]. Medellín: Universidad de

Antioquia; 2001. [citado 15 nov 2014]. Disponible en :

http://farmacia.udea.edu.co/~ff/esencias2001b.pdf

21. Sistema de biblioteca SENA. Introducción a la industria de los aceites esenciales de

plantas medicinales y aromáticas. Bogotá; 2006.

32

22. Santamaría MP, Roselló J, García FJ, Vilella V. Capítulo 5: Células y tejido del

cuerpo vegetal. Tejidos protectores y secretores. Biología y Botánica. Vol 1.

Velencia: Universidad Politécnica de Valencia; 2004.

23. Briggs BC, Johnson LA. Proc. Linn. Soc. New South Wales. 1979; 102: 157-256.

http://www.floraiberica.es/floraiberica/texto/pdfs/08_095%20MYRTHACEAE.pdf

24. Cerpa, M. Hidrodestilación de aceites esenciales. Valladolid. [Tesis Doctoral].

Valladolid: Universidad de Valladolid. Facultas de Ciencias. Departamento de

Ingeniería Química y Tecnología del Medio Ambiente, 2007.

25. Sánchez Jaramillo C, Bedoya Pérez JC, Acosta Zamora E. Estudio del Efecto

Antimicrobiano del Aceite Esencial de Aloysia triphylla sobre Cepas S. aureus y B.

cereus, E. coli, Salmonella sp, Listeria monocytogenes y Pseudomonas aeruginosa

[artículo en internet]. Colombia: Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid.

2012. [citado 15 de nov 2014]. Disponible en:

http://aiquruguay.org/congreso/download/TL18.pdf

26. Ouelhadj A, Beddar K, Djamel D. Chemical composition and Antifungal activity of

the Myrtus communis and Pistacia lentiscus essential oils of Mediterranean regions

in laboratory medium and Strawberry fruit. 2011.

27. Günther, E. 1948. The Essential Oils. Vol. 1: History and origin in Plants

Production Analysis. Krieger Publishing: New York, USA.

28. Rodríguez-Álvarez M., Alcaráz-Meléndez L., Real-Cosío S. Procedimientos para la

extracción de aceites esenciales en plantas aromáticas. 1a ed. S.C. La Paz, Baja

California Sur, México: Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste; 2012.

29. Albarracín GC, Gallo SG. Comparación de dos métodos de extracción de aceite

esencial utilizando piper aduncum (cordoncillo) procedente de la zona cafetera.

[Tesis]. Manizales: Universidad Nacional de Colombia. Ingeniería Química; 2003.

30. Garin DL. Steam distillation of essential oils - Anethole from anise followed by

permanganate oxidation to anisic acid. J. Chem. Educ. 1980; 57 (2):138.

31. Farrel KT. Spices, Condiments and Seasoning. Avi. Connecticut. 1985:414.

32. Baizabal RH. Evaluación de la capacidad antioxidante y antimicrobiana del aceite

esencial y del polvo de romero (Rosmarinus officinalis L.) en queso fresco de vaca.

33

[Tesis]. Puebla, México: Universidad de las Américas Puebla. Escuela de

Ingeniería. Departamento de Ingeniería Química y Alimentos; 2010.

33. Calle M. Control de la germinación in vitro de Araujia sericifera con aceites

esenciales de Laurus nobilis, Myrtus communis, Citrus sinensis y Citrus limon.

[Tesis Maestría]. Valencia: Universidad Politécnica de Valencia. Escuela Técnica

Superior Ingenieros Agrónomos. Departamento de Ecosistemas Agroforestales;

2010.

34. Akin M, Aktumsek A and Nostro A. Antibacterial activity and composition of the

essential oils of Eucalyptus camaldulensis Dehn. and Myrtus communis L. growing

in Northern Cyprus, Afr J Biotechnol, 2010; 9 (4), 531-535.

35. Nabavizadeh M, Abbaszadegan A, Gholami A, Sheikhiani R, Shokouhi M, Sedigh

Shams M, Ghasemi Y. Chemical constituent and antimicrobial effect of essential oil

from Myrtus communis leaves on microorganisms involved in persistent endodontic

infection compared to two common endodontic irrigants: An in vitro study. J

Conserv Dent. 2014; 17(5): 449–453.

36. Amensour M, Bouhdid S, Fernández-López J, Idaomar M, Skali Senhaji N, Abrini

J. Antibacterial Activity of Extracts of Myrtus communis Against Food-Borne

Pathogenic and Spoilage Bacteria. Int. J. Food Prop., 2010; (13):1215–1224,

37. Bezic, N, Skocibusic, M, Dinkic V, Radonic, A. Composition and antimicrobial

activity of Achillea clavennae L. essential oil. Phytother. Res. 2003, (17), 1037–

1040.

38. Maguna, F. Romero, A. Garro, O. Okulik, N. Actividad Antimicrobiana de un

grupo de Terpenoides [artículo en internet]. Argentina. Universidad Nacional del

Nordeste. 2006. Disponible en:

http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/cyt2006/08-Exactas/2006-E-057.pdf

39. Serrano M. A, Martínez-Romero D, Guillén F, Valverde J. M, Zapata P. J, Castillo

S, Valero D. The addition of essential oils to MAPas a tool to maintain the overall

quality of fruits. Trends in Food Science & Technology. 2008,(19), 464-471.

40. Curini M, Bianchi A, Epifano F, Bruni R, Torta L, Zambonelli A. Composition and

in vitro antifungal activity of essential oils of Erigeron canadensis and Myrtus

communis from France. Chem Nat Compd. 2003;39(2):191–4.

34

41. Martinetz H, Johnson M, Phillips B. Antimicrobial effects of Myrtus Communis L.

essential oil on cilinical isolates of Fusarium and Penicilium. Med Plant. 1998;34

(6):85–9.

42. Sadeghi B, Erfani M, Yusef, Zarrin M. Antifungal Efficacy of Myrtus communis

Linn. Jentashapir J Health Res. 2014; 5(4): e21879.

43. Rasooli I., Moosavi M. L., Rezaee M. B y Jaimand K. Susceptibility of

Microorganisms to Myrtus Communis L. Essential Oil and its Chemical

Composition. J. Agric. Sci. Technol. 2002,4: 127-133.

44. Derwich E., Manar A., Benziane Z et Boukir A. GC/MS Analysis and In vitro

Antibacterial Activity of the Essential Oil Isolated from Leaf of Pistacia lentiscus

Growing in Morocoo. World Applied Sciences Journal. 2010,8: 1267-1276.

45. Mahboubi M, GhazianBidgoli F. In vitro synergistic efficacy of combination of

amphotericinB with Myrtus communis essential oil against clinical isolates of

Candida albicans. Phytomedicine. 2010, 17: 771–774