DIRECCIÒN DE PRESTACIONES MÈDICAS UNIDAD DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÒN

COORDINACIÒN DE INVESTIGACIÒN HOSPITAL DE INFECTOLOGÍA CMN “ LA RAZA”

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Unidad  de  Investigación  Médica  en  Infectología  e  Inmunología  

 

CLAVE  DE  FORMATO:  36A143-­‐20-­‐03   Fecha  de  emisión:     Versión:  1.0     Página  1  de  2    

 

   

   

 

 

 

 

UIMII

EXTRACCIÓN DE RNA DE SANGRE PERIFERICA O DE MEDULA OSEA

MEDIANTE COLUMNAS 36A143-20-03

Fecha de emisión:

Elaboró: Francisco Xavier Guerra Castillo

No. páginas: 2 Versión 1.0

Revisó: Dra. Gloria Ma. Calderón Rodríguez. Dra. Ma. De la Luz Martínez Rodríguez. M.en C. Melisa A. Martínez Paniagua. M.en C. Ericka Nelly Pompa Mera. TLC. Berenice Jacques Flores. TLC. Rafael Fuentes Flores.

Fecha:

Aprobó: Dra. V Carolina Bekker Méndez Encargada de la Unidad de Investigación Médica en Infectología e Inmunología.

Fecha:

 

 

 

 

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1. Mezclar   1   volumen   de   sangre   total   con   5   volumenes   de   Buffer   EL   en   un   tubo   con   el   tamaño  adecuado  para  la  cantidad  del  volumen.  

2. Incubar  por  10-­‐15  minutos  a  4ºC  y  pasar  por  el  vortex  por  unos  segundo  dos  veces  durante   la  incubación.  

3. Centrifugar  a  2500  RPM  por  10  minutos  a  4ºC;  remover  el  sobrenadante  completamente.  

4. Agregar  de  nuevo  Buffer  EL  al  botén  celular;  agregar  2  volumenes  por  cada  volumen  de  sangre  total  utilizada  desde  el  inicio  del  proceso.  Resuspender  las  celulas  por  medio  del  vortex.  

5. Centrifugar  a  2500  RPM  por  10  minutos  a  4ºC;  remover  el  sobrenadante  completamente.  

6. En  caso  necesario  realizar  un  lavado  on  PBS  utilizando  3  volumenes  por  cada  volumen  de  sangre  total.  Centrifugar  a  2500  RPM  por  5  minutos  a  4ºC,  remover  el  sobrenadante  completamente.  

7. Una  vez  que  el  botón  se  vea  completamente  limpio,  trasladar  el  boton  a  un  tubo  eppendorf  de  1.5   mL.   Si   el   botón   inicial   es   muy   grande   debido   a   la   cantidad   de   sangre   utilizada,   dividir   la  muestra  resuspendiendo  en  PBS  y  de  nuevo  centrifugando  para  obtener  el  botón  de  células.  

8. Adicionar  el  Buffer  RLT  de  acuerdo  con  la  siguiente  tabla:  

Buffer  RLT  (μL)   Sangre  Total  (mL)   No.  de  leucocitos  

350   0.5   2  x  106  

600   >0.5  a  1.5   >2  x  106  a  1  x  107  

Nota:   Preparar   el   Buffer   RLT   antes   de   ser   usado;   se   utiliza   10   μL   de   Beta  mercaptoetanol   por  cada  1  mL  de  RLT.  

9. Una  vez  adicionado  homogenizar  mediante  pipeteo  hasta  que  no  se  visualicen  coagulos  o  restos  del   botón.   Trasladar   directamente   al   QIAshredder   (columna   lila)   ajustando   la   pipeta   a   750   μL  para  evitar  la  formación  de  burbujas  y  se  pueda  trasladar  en  un  solo  paso.  

10. Centrifugar  a  14,000  RPM  por  2  minutos  a  4ºC.  

11. Remover  el  QIAshredder  y  conservar  el  producto  centrifugado.  Agregar  un  volumen  (350  o  600  μL)  de  alcohol  al  70%  y  mezclar  mediante  pipeteo.  

12. Trasladar  un  volumen  máximo  de  700  μL  de  la  mezcla  al  QIAamp  (columna  blanca)  y  centrifugar  a   10,000   RPM   por   15   segundos   a   4ºC.   Descartar   el   líquido   filtrado   y   utilizar   un   nuevo   tubo  colector  de  2  mL  para  el  QIAamp,  trasladar  otros  700  μL  del  homogeinizado  y  centrifugar  en  las  mismas  condiciones.  

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13. Transferir  el  QIAamp  a  un  nuevo  tubo  colector,  adicionar  700  μL  de  Buffer  RW1  y  centrifugar  a  10,000  RPM  por  15  segundos  a  4ºC.  Descartar  el  tubo  colector  y  el  filtrado.  

14. Transferir   el   QIAamp   a   un   nuevo   tubo   colector,   adicionar   500   μL   de   Buffer   RPE   (previamente  preparado,  asegurandose  que  se  haya  agregado  el  etanol  al  RPE)  y  centrifugar  a  10,000  RPM  por  15  segundos  a  4ºC.  Descartar  el  tubo  colector  y  el  filtrado.  

15. Nuevamente  transferir  el  QIAamp  a  un  tubo  colector  y  volver  a  pipetear  500  μL  del  Buffer  RPE  y  centrifugar  a  14,000  RPM  por  3  minutos  a  4ºC.  Descartar  el  tubo  colector  y  el  filtrado.  

16. Es  recomendable  volver  a  transferir  el  QIAamp  a  un  nuevo  tubo  colector  y  centrifugar  a  máxima  velocidad  pero  esta  vez  solo  un  minuto.  Descartar  el  tubo  colector.  

17. Transferir  el  QIAamp  a  un  tubo  “eppendorf”  de  1.5  mL  y  pipetear  directamente  a  la  membrana  30   a   50   μL   de   agua   libre   de   RNAsas.   Centrifugar   a   10,000   RPM  por   1  minuto   a   4ºC.   Nota:   se  puede  dejar  incubando  a  una  temperatura  de  15  a  25ºC  dentro  de  la  campana  de  seguridad  con  el  agua  libre  de  RNAsas  antes  de  centrifugar  la  muestra.