Final Instructivo

Francisca Arcos Vergara Microbiologa Bsica 07 de abril de 2015

INSTRUCTIVO DE RECOLECCION Y

RECUPERACION DE LAS CEPAS ATCC

Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0

Revision: Abril 2015

Microbiologa Bsica

Pgina 1 de 6

INSTRUCTIVO DE

RECOLECCION Y

RECUPERACION DE LAS

CEPAS ATCC

Universidad Santo Toms Sede La Serena

Escuela de Tecnologa Mdica

Microbiologa Bsica

Firma

Elaborado por Aprobado por

Nombre Francisca Arcos Vergara

Cargo

Fecha 07.04.2015




Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0


Microbiologa Bsica

Pgina 2 de 6

1. LAS CEPAS ATCC

Son microorganismos certificados por la American Type Culture Collection. Rockville, EU, los que

suministran un cultivo puro de microorganismo y del cual garantizan que se cuentan con unas

caractersticas especificas que han sido comprobadas por pruebas morfolgicas, bioqumicas y

moleculares. Estas se utilizan para el anlisis de medios de cultivo, cepas, kits y reactivos de

diagnostico, en el mantenimiento de cultivos y en la evaluacin de procedimientos bacteriolgicos.

2. Materiales, Reactivos y Equipos

2.1 Materiales de laboratorio.

Criotubos de 2mL Cajas para criotubos Torulas estriles

Portaobjetos

Pipetas Pasteur o jeringas.

2.2 Reactivos.

Asas de siembra desechables (Culti-Loops) Medios de cultivo (agar sangre). Caldo de triptona de soja o de tioglicolato. Caldo glicerol 20%.

Kit de tincin Gram. Suero Fisiolgico.

2.3 Equipos

Freezer a -70C/ -20C. Refrigerador.

Estufa a 36C. Microscopio.

3. Desarrollo

3.1 RECOLECCION

Las asas de siembra desechables (Culti-Loops) derivan de American Type Culture Collection

(ATCC) u otras fuentes de referencia. Culti-Loops se fabrican en una planta certificada ISO-

utilizando una tcnica de preservacin de propiedad, garantizando la recuperacin mejorada y

reproducibilidad.




Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0


Microbiologa Bsica

Pgina 3 de 6

3.2 RECUPERACION asas de siembras desechables (Culti-Loops)

La pelcula de las asas se ha fabricado con una formulacin de gelatina secada mediante un

procedimiento especial. Para volver a hidratar la pelcula, las asas deben entrar en contacto tanto

con el calor como con la humedad.

Para elegir el medio en el cual se sembrara la cepa ATCC se debe tener en cuenta que si se elige un medio selectivo puede dar lugar a un crecimiento de las colonias lento o inexistente. Por tanto se recomienda elegir un medio no selectivo como lo es el de agar sangre o tambin como lo son los caldos de triptona de soja, caldo de tioglicolato.

3.2.1 PROCEDIMIENTO

Retire el envoltorio del asa.

Corte el eje del asa del mango con unas tijeras esterilizadas e introdzcalos en un tubo con unos 0.5 o 1 mL de medio liquido. Ya sea caldo de triptona de soja, un caldo de tioglicolato

Introduzca el tubo a la incubadora a 36C durante el tiempo suficiente para que la pelcula se disuelva completamente fuera del asa. Agite el tubo con suavidad para suspender el organismo.

Con una pipeta Pasteur, siembre por agotamiento en placas de agar sangre con varias gotas.

Incube las placas a 36C por 18- 24hrs.

Revisar crecimiento y pureza de las colonias.

Una vez realizada la recuperacin de las cepas ATCC en el caldo, luego el paso a la placa de agar

sangre con una previa incubacin de all se tomaran semillas de colonias que estarn aisladas con un

asa previamente esterilizada o torula estril tomar de forma abundante y aplicar en los criotubos que

contienen 0,5 a 1mL de glicerol al 20% o Suero Fisiolgico. El criotubo se tapa y se agita

fuertemente para emulsionar bien el crioprotector con la suspensin. Luego con una pipeta o jeringa

se aspira el exceso de lquido, procurando dejar las perlas casi secas. Es importante que las cuentas

se peguen lo menos posible unas a otras.

Cada vial se debe etiquetar y guardar congelado idealmente a -70C (con duracin indefinida) o a

20C (con duracin de 1 ao).

Marcar los tubos con:

Nombre de la cepa.

Nombre de coleccin de origen.

Numero de la cepa.

Guardar en caja y mantener en Freezer a -20C. Registrar.




Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0


Microbiologa Bsica

Pgina 4 de 6

3.3 Mantencin de las cepas ATCC para realizar controles

Recuperar uno de los viales congelados y tomar solo una de las perlas que se deposita en

la placa de agar sangre y con ayuda de un asa esterilizada anteriormente rodar hasta que

se descongele completamente y luego esto se incuba por 24.48hrs, volver a congelar el

criotubo rpidamente y nunca volver a congelar una perla una vez descongelada.

Tener cuidado de no descongelar el criotubo ya que las cepas perdern viabilidad.

Los subcultivos pueden mantenerse de 1 a 2 semanas para realizar los controles

correspondientes, indicando el nombre de la cepa y fecha de traspaso. Luego de este periodo hacer traspaso nuevamente para obtener cultivo fresco.

No se deben realizar ms de 4 subcultivos de estos traspasos, para que la cepa no pierda sus caractersticas.

Cuando se tengan los 4 subcultivos es necesario volver a sembrar desde las copias congeladas en los Criotubos.

4. CONTROL DE CALIDAD

Objetivo: Mantener la recoleccin y recuperacin de las cepas controles en condiciones optimas para utilizarlas como material de referencia.

Este control se realizara cada dos semanas, para evaluar la viabilidad y confiabilidad de las cepas

ATCC cada vez que se realice un subcultivo.

Si la siembra en el agar sangre crece, forma colonias, esto es un signo de que la cepa sigue viable.

Realizar tincin de Gram a las distintas cepas ATCC evaluando su resultado si coincide con

los conocidos. As se podr evaluar si las cepas a controlar no han cambiado su viabilidad y

caractersticas generales.

Positivo (+); negativo (-).

Resultados esperados luego de aplicar la tincin gram con una

previa incubacin de la cepa en agar sangre por 24hrs. a 36C

Cepa Tipo y numero de

coleccin Resultado esperado (Gram)

Enterococcus faecalis

ATCC 29212 Cocacea grampositivo en diplococos o en cadena

Staphylococcus

aureus ATCC 25923 Cocacea grampositivo en racimo




Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0


Microbiologa Bsica

Pgina 5 de 6

4.1 INDICADORES

Cantidad de cepas ATCC que no formo colonias en las placas de agar sangre en relacin al total de las cepas que si formaron. Rango: 1 a cepa que no formo colonias en placa de agar sangre. Valor optimo: 0 cepa que no forma colonias en placa de agar sangre. Valor aceptable: 1 cepa que no formo colonias en placa de agar sangre. Valor crtico: 2 cepas que no forman colonias en placas de agar sangre.

Porcentaje de las cepas que dieron cocaceas grampositivo sobre el total de las cepas a las cuales se les aplico la tincin. Rango: 1% a 100% de cepas que dieron cocaceas grampositivos en tincin gram Valor ptimo: 100% de las cepas que dieron cocaceas grampositivos en tincin gram. Valor aceptable: 99% de las cepas que dieron cocaceas grampositivo en tincin gram. Valor crtico: 98% de las cepas dieron cocaceas gram positivas en tincin gram.




Fecha de emisin:

07.04.2015

Revision: 0


Microbiologa Bsica

Pgina 6 de 6

Anexo n1

Stock de cepas ATCC que se encuentran en el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Santo Tomas La Serena.

Cepa Tipo y numero de

coleccin N de lote Fecha de caducidad

Staphylococcus aureus

ATCC 25923 528877 31/01/2016

Pseudomonas aeruginosas

ATCC 27853 563195 30/04/2016

Enterococcus faecalis

ATCC 29212 512632 31/12/2015

Klebsiella pneumoniae

ATCC 700603 493554 30/11/2015

Escherichia coli ATCC 25922 482944 31/10/2015

Final Instructivo

Documents

Transcript of Final Instructivo