fosfatasa

Revista Colombiana de Investigación en Odontología 2011; 2 (6): 141- 154

1. Juan Carlos Munévar 2. Javier Niño 3. Martha Cecilia Tamayo 4. Daniela Escobar 5. Alberto Jose Vega 6. María Fernanda Ulloa 7. Ángela María Puertas 8. Gloria Bautista 9. Jorge Forero

1. OD. MS Ciencias Biológicas. MS Biología dental. Especialización Bioética. Profesor asociado. Facultad de odontología. Investigador instituto UIBO - Universidad el Bosque.2. OD. Especialista en endodoncia. Docente posgrado en endodoncia .Facultad de Odontología - Universidad el Bosque.3. OD. Especialista en periodoncia – PUJ. Profesor asistente. Unidad de investigación Facultad de Odontología – Universidad el Bosque.4-5-6-7. Residentes posgrado en endodoncia .Facultad de Odontología - Universidad el Bosque.8. Bc UIS .Ms. en estadística U. Nacional de Colombia Profesor asistente. Unidad de investigación Facultad de Odontología - Universidad el Bosque.9. OD. Especialista en endodoncia – PUJ. Director posgrado de endodoncia, Facultad de Odontología - Universidad el Bosque.

Recibido 02 Octubre 2011/ Modificación 02 Noviembre 2011/ Aceptado 06 Diciembre 2011

DETERMINACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD FOSFATASA ALCALINA DE LAS CÉLULAS PULPARES EXPUESTAS A TRES CEMENTOS ENDODÓNTICOS

EVALUATION IN VITRO THE ACTIVITY OF THE ENZYME ALKALINE PHOSPHATASE IN HUMAN DENTAL PULP EXPOSED TO THREE ENDODONTIC CEMENTS

Objetivo. Evaluar la actividad de la enzima fosfatasa alcalina en pulpa dental humana expuesta a tres cementos endodónticos para recubrimiento pulpar directo; MTA ProRoot™, cemento Portland tipo I con oxido de bismuto al 25% y cemento Portland tipo I. Métodos. Se utilizó como grupo control positivo; cultivo de osteoblastos, y como controles negativos cultivos de fibroblastos pulpares sin exposición y cultivos de fibroblastos pulpares expuestos a Levamisol. Se utilizó una muestra por conveniencia de 9 pozos con 5000 fibroblastos de pulpa dental humana, 3 replicas por cada condición estudiada, para un total de 27 pozos por grupo y cada grupo fue expuesto cada cemento por 72 horas y evaluados por fluorometría Los datos fueron analizados con ANOVA y comparaciones múltiples de Bonferroni (p < 0,005). Resultados. Al evaluarse la actividad fosfatasa alcalina de los tres cementos, se encontró mayor porcentaje de esta actividad en el cemento Portland (15.56 DS +/- 9.92) seguido de MTA (13.37 DS +/- 7.61) y en cemento Portland + Óxido de Bismuto al 25% (11.88 DS +/- 6.36); sin presentar diferencias estadísticamente significativas entre los tres. Al comparar la actividad de la fosfatasa alcalina se encontraron diferencias estadísticamente significativas siendo mayor la actividad reportada por los fibroblastos pulpares no expuestos (33.04 DS +/- 21.93).Conclusiones. La actividad de la fosfatasa alcalina de los fibroblastos pulpares estuvo disminuida frente a los tres cementos evaluados a las 72 hrs. comparados con la actividad de esta enzima observada en fibroblastos sin estímulo alguno.

Palabras Clave: Fosfatasa Alcalina; Pulpa Dental; MTA; Portland; Óxido de Bismuto, Fluorometría.

Artículos Originales

ABSTRACT

Objective. To assess the activity of the enzyme alkaline phosphatase in human dental pulp exposed to three endodontic cements for direct pulp capping; ProRoot ™ MTA, Portland cement type I with bismuth oxide 25% Type I Portland cementMethods. Group was used as positive control culture of osteoblasts, and as negative controls fibroblast cultures without pulp exposure and pulp fibroblast cultures exposed to levamisole. We used a convenience sample of 9 wells with 5000 human dental pulp fibroblasts, 3 replicas for each condition studied, for a total of 27 wells per group and each group was exposed for 72 hours each cement and evaluated by fluorometry data were analyzed with ANOVA and Bonferroni multiple comparisons (p <0.005).Results. In assessing the alkaline phosphatase activity of the three cements, found a higher percentage of the activity in the Portland cement (15.56 SD + / - 9.92) followed by MTA (13.37 SD + / - 7.61) and Portland cement + bismuth oxide to 25% (11.88 SD + / - 6.36), without statistically significant differences between the three. By comparing the alkaline phosphatase activity were found statistically significant differences being greater the activity reported by pulp fibroblasts not exposed (SD 33.04 + / - 21.93).Conclusions. The alkaline phosphatase activity of pulp fibroblasts was diminished compared with three cements tested at 72 hrs. compared with the activity of this enzyme observed in fibroblasts without any stimulus.

Keywords: alkaline phosphatase; Dental Pulp; MTA; Portland; Bismuth Oxide; fluorometry.

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INTRODUCCIÓN

El éxito biológico y clínico del recubrimiento pulpar radica en la inducción del potencial dentinogénico de las células pulpares para formar una capa mineralizada denominada puente dentinal (1), para la preservación de la vitalidad pulpar, disminuyendo la sensibilidad y el dolor, generando mínima respuesta inflamatoria, y ausencia de signos radiográficos de distrofia pulpar (2). Los materiales para recubrimiento pulpar directo deben controlar la infección, tener una adherencia estrecha a la dentina para prevenir microfiltración, ser de fácil manipulación y finalmente permitir la formación de una barrera de tejido mineralizado (3).

A través de los años, se han utilizado diversos materiales de recubrimiento pulpar tales como hidróxido de calcio, resinas hidrofìlicas, cementos a base de ionómero de vidrio,

fosfatos tricálcicos y más recientemente mineral trióxido agregado (MTA) (4). Éste último fue desarrollado en la Universidad de Loma Linda y presenta propiedades físicas y biológicas favorables para ser usado como material de recubrimiento pulpar; tales como biocompatibilidad, radiopacidad, buen selle, propiedades antimicrobianas e inducción de tejidos mineralizados (5-6).

Uno de los parámetros para medir el éxito de los materiales de recubrimiento pulpar es la actividad de la fosfatasa alcalina; que juega un papel importante en los cambios metabólicos en pulpa dental y en otros tejidos del cuerpo durante los procesos de diferenciación celular y es capaz de estimular la formación de dentina reparativa, considerada también un importante indicador de formación ósea y marcador fenotípico de células osteoblásticas (7-9). Seltzer en 1975 reportó que mediante el uso de un agente de recubrimiento pulpar,

Munévar - Determinación In Vitro de la actividad fosfatasa | 143

la fosfatasa alcalina puede estimular el tejido para formar matriz dentinal (10).vvcvaAlgunos estudios han evaluado el uso de MTA como material de recubrimiento pulpar (11-13), mostrando resultados aceptables en cuanto biocompatibilidad, menor inducción de inflamación pulpar y formación de un mayor puente dentinario. En efecto se ha observado que el MTA induce procesos biológicos favorables en la formación completa de puente dentinal libre de túneles provocando un mínimo efecto tóxico pulpar, sin signos de inflamación, provocando liberación de interleucinas necesarias para diferenciación celular, siendo un cemento no mutagénico que favorece la adherencia y el crecimiento celular (14-17). Además, estimula la diferenciación de células pulpares en odontoblastos para inducir la síntesis de una matriz mineralizada, especialmente durante la dentinogénesis reparativa asociada con injurias y/o enfermedades del complejo dentinopulpar, (18) y promueve la mineralización de la dentina cuando es usado en recubrimiento pulpar directo involucrando en este proceso la deposición inicial de osteopontina (19-20).

El MTA es una mezcla de cemento Portland refinado y óxido bismuto más ciertas cantidades de SiO2, CaO, MgO, K2SO4, y Na2SO4. Debido a que su mayor componente es cemento Portland - mezcla de silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico, gypsum y aluminatoférrico tetracálcico (21), éste podría ser utilizado como una alternativa terapéutica. En efecto las características químicas y físicas de estos dos cementos han sido comparadas; y se ha reportado que el MTA y el cemento Portland son similares tanto microscópica como macroscópicamente cuando se han analizado por difracción de rayos X (22-26). Pero se diferencian en que el Portland no contiene Óxido de Bismuto, el cual es el componente que le da la característica de radiopacidad a algunos materiales dentales, y si contiene azufre de 1.6 a 3%, que no contiene el MTA (25-26). Cuesta et al en 2007 (27) determinó que la mínima proporción de Óxido de bismuto necesaria que el cemento portland

tenga una adecuada radiopacidad es del 25 %. A esta mezcla también se le ha evaluado su biocompatibilidad como material de recubrimiento pulpar (28) y su microfiltración como cemento de obturación retrógada (29). En dichos estudios se observó que el cemento Portland más Óxido de bismuto al 25% presentó mayor efecto tóxico el ProRoot MTA™; probablemente porque que uno de sus componentes es el oxido de azufre (SO3) que afecta la viabilidad celular; y que presenta mayor microfiltración que el ProRoot MTA™ en un 25.46%.

Hay pocos estudios sobre la actividad de fosfatasa alcalina en MTA cuando es utilizado como material de recubrimiento pulpar; sólo se reporta una estimulación leve de esta actividad cuando MTA es utilizado como material de obturación retrógada (30) y en la literatura no existe estudios que hayan evaluado la actividad fosfatasa alcalina de los cementos Portland y Portland más Óxido Bismuto al 25% como materiales de recubrimiento pulpar.

Por tal razón el propósito de este estudio es evaluar in vitro la actividad de fosfatasa alcalina en células de la pulpa expuestas a tres cementos endodónticos: MTA, cemento Portland y cemento Portland más Óxido Bismuto al 25%.

MATERIALES Y MÉTODOS

En este estudio experimental in Vitro exploratorio se usó un tamaño de muestra por conveniencia de 9 pozos por 3 replicas por cada condición estudiada para un total 27 pozos por grupo (ver tabla 1). Cada pozo contó con 5000 fibroblastos de pulpa dental humana.

Las células fueron obtenidas de dientes sanos (premolares con indicación de exodoncia por ortodoncia y terceros molares) sin patología infecciosa coronal ni radicular comprobada clínica y radiográficamente, de pacientes que concedieron su consentimiento informado firmado. (Investigación de riesgo mínimo

- Resolución 8430). Las exodoncias de los dientes fueron realizadas, en su mayoría, por residentes de cirugía oral y máxilofacial en las Clínicas Odontológicas de la Universidad

El Bosque, siguiendo con todas las normas de asepsia y antisepsia.

GRUPO CONDICIÓN1 FIBROBLASTOS CON MTA2 FIBROBLASTOS CON PORTLAND + OXIDO DE BISMUTO 25%3 FIBROBLASTOS + PORTLAND4 FIBROBLASTOS CONTROL5 OSTEOBLASTOS (CONTROL POSITIVO)6 FIBROBLASTOS CON LEVAMISOL (CONTROL NEGATIVO)

Una vez realizada la exodoncia, se sumergió cada muestra tres veces en hipoclorito de sodio al 5.25 % durante 1 minuto, luego se lavó con solución salina y se efectuó la odontosección transversal de los dientes a nivel de la unión amelocementaria mediante una fresa de carburo Nº 556 o 557 en una pieza de mano de alta velocidad sin refrigeración bajo irrigación manual constante con solución salina; se extrajeron las pulpas dentales con pinzas estériles de microcirugía para depositarlas en una solución de trasporte (RPMI), en la cual fueron llevadas inmediatamente al laboratorio de la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO) de la Universidad El Bosque para su procesamiento.

En la cabina de flujo laminar bajo condiciones de esterilidad, se coloco la muestra de pulpa dental en cajas Petri, donde se lavaron agregando 3000 µL de PBS estéril (Penicilina 100U/ml Estreptomicina 100U/ml y Anfotericina 2.5 µg/ml), con el fin de limpiar e hidratar la muestra quitando los residuos necróticos o con sangre. Se fragmentó el tejido con hoja de bisturí Nº 15, obteniendo explantes tisulares de un diámetro aproximado de 1 mm, que se organizaron radialmente en una caja de cultivo T25. Se dejaron los explantes en adhesión durante 1 hora y media con 100 µL de DMEM suplementado al 10%

con SFB, antibióticos (Penicilina 100 U/ml / esteptomicina100µg/ml) y anfotericina 2,5 µg/ml. Luego se depositaron 4ml de medio de cultivo DMEM, suplementado al 10% con SFB, antibióticos (penicilina 100 U/ml– estreptomicina 100µg/ml) y antimicótico (anfotericina 2,5 µg/ml). Se incubó a 37°C, atmósfera húmeda y 5% de CO², hasta obtener un 70% de confluencia celular de este cultivo primario. Se revisó y se cambió el medio cada dos días para observar la proliferación, la confluencia celular y descartar contaminación, utilizando el microscopio de contraste de fase (ZEISS- Id03) a 10X y 20X.

Se utilizó como control experimental positivo en la fluorometría, cultivos de osteoblastos obtenidos por explantes de calvaría craneana de 2 ratones de 8 y 14 días de nacidos los cuales fueron suministrados por el bioterio de la Universidad El Bosque que fueron sacrificados con un descenso en temperatura. Luego de separar los huesos parietales se lavaron con PBS estéril, con antibióticos y antimicótico (concentración 1X) y se seccionaron en explantes que fueron depositados sobre cajas de Petri estériles en forma radial, y se dejaron en adhesión durante 1 hora con 100 μL de DMEM suplementado al 10% con SFB, antibióticos y antimicótico. Después de este tiempo se dejó el cultivo en incubación con 4


ml de DMEM. Se revisó y se cambió el medio cada tres días para observar la proliferación, la confluencia celular y descartar contaminación, utilizando el microscopio de contraste de fase (ZEISS- Id03) a 10X y 20X.

Para evaluar la posible contaminación bacteriana de los cultivos primarios de pulpa y osteoblastos, se colocaron los cultivos en caldo BHI y posteriormente se incubaron a una temperatura de 37 C, 5% de CO2 durante 24 horas para observar crecimiento bacteriano como fuente de contaminación de cada cultivo. Así mismo se evaluaron el medio de cultivo y reactivos que fueron utilizados para el mantenimiento celular, sembrando por agotamiento 100 μL de cada solución en agar sangre y se incubaron de 24 a 48 h a 37º C, 5% de CO2 y 80% de humedad.

Se expuso el tercer pasaje o sub-cultivo de células pulpares (31) a los tres cementos:

1. El MTA (ProRoot MTA™ Gris), se preparó inmediatamente antes de ser utilizado; mezclando el polvo con el agua estéril en una proporción de 6:1 con la ayuda de una espátula de plástico sobre una loseta de vidrio estéril.2. Del cemento Portland tipo I (Diamante®) se mezclaron 10 gr. de polvo con 0.016 ml de agua destilada sobre en una loseta de vidrio hasta obtener una consistencia pastosa como la del MTA.3. El cemento Portland con oxido de bismuto al 25% (27); para cuya mezcla inicial se combinó 7.5 gr. de cemento Portland tipo 1(Diamante®) y 2.5 gr. de óxido de bismuto, se le agregó 0.016 ml de agua destilada sobre en una loseta de vidrio mezclándola hasta obtener una consistencia pastosa como la del MTA.

Luego de 24 horas de adhesión y proliferación celular in Vitro se depositaron 2.5 gr. de cada material recién preparado en cada una de las regiones de la caja de tal manera que se simularan las condiciones clínicas reales. Al cabo de 24 horas del endurecimiento del material, se incubaron las células por

48 horas más con el mismo sobrenadante. Después de 72 horas de exposición a 37° C, atmosfera húmeda y 5% de CO

2, se retiró

el material y se lavaron los pozos con Tris Buffer Salino (TBS). Se fijó la monocapa con paraformaldehido al 4% durante 30 minutos, y luego se permeabilizó con Triton X-100 al 0.1% por 1 hora. Se bloqueó la actividad fosfatasa alcalina endógena en los cultivos de células pulpares sin exposición a ningún cemento con Levamisol (Kasugai (33-34) (20 mM), en 5% de ácido acético durante 30 minutos, siendo éste el control negativo. A continuación, se bloqueron los sitios de unión no específicos lavando dos veces (2 minutos cada lavado) con buffer de bloqueo: suero de caballo al 10% en TBS (Tris 10 mM, NaCl 0.14M, pH 7.2). En seguida y dentro de un campo oscuro se agregó la solución fluorogénica Methil Umberil Phosphate (MUP) (Molecular Probes, H-6491) 3.6 mM (NaCl 100mM, Tris 100 mM y MgCl

2 50 mM) y se llevó a la incubadora a

37º C, antes de la lectura de fluorescencia. Para determinar la actividad de fosfatasa alcalina se utilizó el protocolo de fluorometría expuesto por Rincón et al en 2004 (32). La reacción entre el MUP (Metil-Umberil-Ferona) y la enzima fosfatasa alcalina fue leída por el fluorómetro PR-521 (TecnoSuma Habana Cuba) ®, y los resultados se dieron en unidades de fluorescencia (UF). Estas lecturas fueron realizadas cada 15 minutos en 3 tiempos: 30, 45 y 60 minutos, solo para evaluar el funcionamiento del aparato de fluorometría, pero solo se tuvieron en cuenta las lecturas correspondientes al último tiempo.

El experimento fue realizado por triplicado para validar la confiabilidad de los datos obtenidos y los datos de las tres repeticiones fueron promediados para cada condición.El promedio de las lecturas del grupo de fibroblastos + levamisol (control negativo), fue tomado como límite inferior con respecto a la actividad de la fosfatasa alcalina y el valor que se obtuvo del grupo de osteoblastos (control positivo), fue tomado como el valor del límite superior de la actividad de la fosfatasa alcalina.


El valor que arrojaron los fibroblastos pulpares no expuestos fue tomado como valor 0 relativo, es decir, que los valores que fueron superiores a éste los se consideraron como valores de mayor actividad de fosfatasa alcalina. De la misma manera los valores que fueron inferiores este valor se consideraron como valores de menor actividad de esta enzima. Estos valores fueron corregidos para eliminar los falsos positivos arrojados por el fluorómetro debido que los pozos con el medio emitieron valores positivos que fueron restados del valor total.

El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo a través de promedios y desviaciones estándar, y los grupos fueron comparados mediante la prueba de ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (p < 0,05)

RESULTADOS

Considerando la heterogeneidad de la varianza, se hizo necesaria la aplicación de una transformación logarítmica (ln) a los datos. Según la prueba de Levene esta transformación permitió su homogenización (P = 0.348).

Al evaluarse la actividad fosfatasa alcalina de los tres cementos a los tres tiempos de medición, se encontró mayor porcentaje de esta actividad en cemento Portland seguido de MTA y por último en cemento Portland + Óxido de Bismuto al 25% (ver tabla 2); sin presentar diferencias significativas entre los tres cementos a través de la prueba de Bonferroni (ver tabla 3).

GRUPOSPROMEDIO

(%)DS MÍNIMOS –

MÁXIMOSCondición Tiempo (minutos)

MTA(N 27)

30 9.31 5.27 0.0551 - 25.88

45 11.57 6.56 0.145 - 32.5760 13.37 7.61 0.255 - 37.47

Portland + Óxido de

Bismuto 25%(N 27)

30 7.614 4.096 -0.225 - 22.75545 10.01 5.41 -0.0949 - 30.5560 11.88 6.36 0.0651 - 36.98

Portland(N 27)

30 9.56 6.26 0.00510 - 30.1545 12.94 8.60 0.195 - 41.6160 15.56 9.92 0.405 - 48.92

Fibroblastos + Levamisol

(N 27)

30 5.934 1.728 1.115 - 10.75545 7.695 2.503 1.635 - 14.09560 9.067 3.059 2.085 - 14.395

Fibroblastos(N 27)

30 20.11 13.59 1.83 - 48.8345 27.46 18.62 2.61 - 69.4560 33.04 21.93 3.41 - 82.60


Tabla 1. Descripción de los de grupos de estudio

Al comparar la actividad de la fosfatasa alcalina producida por cada uno de los cementos con el grupo de fibroblastos sin cemento se encontraron diferencias estadísticamente significativas (ver tabla 3) siendo mayor la actividad reportada por los fibroblastos (ver tabla 2). El promedio de inhibición de actividad de fosfatasa alcalina con levamisol - control negativo - fue muy similar a los promedios

de activación dados por los tres cementos (ver tabla 2); sin embargo al aplicar la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni solo se presentaron diferencias estadísticamente significativas con el grupo Portland y el grupo MTA ( ver tabla 3).

GRUPOS PFibroblastos con Levamisol Vs Fibroblastos sin cemento 0.0000Fibroblastos con Levamisol Vs MTA 0.0398Fibroblastos con Levamisol Vs Portland + Óxido Bismuto 25% 0.9465Fibroblastos con Levamisol Vs Portland 0.0028Fibroblastos sin cemento Vs MTA 0.0000Fibroblastos sin cemento Vs Portland + Óxido Bismuto 25% 0.0000Fibroblastos sin cemento Vs Portland 0.0000MTA Vs Portland + Óxido Bismuto 25% 1.0000MTA Vs Portland 1.0000Portland Vs Portland + Óxido Bismuto 25% 0.4694

DISCUSIÓN

Pocos estudios se han llevado a cabo para evaluar el comportamiento de la enzima fosfatasa alcalina en células pulpares expuestas a materiales de recubrimiento pulpar, siendo el nuestro el primero en comparar dicha actividad frente tres cementos; MTA (ProRoot-Dentsply)™ , Portland tipo I (Diamante)®, y Portland tipo I (Diamante)®+ Óxido Bismuto al 25%, mediante la técnica de fluorometría, que fue elegida por ser una técnica reproducible, simple, confiable y de bajo costo que permite la detección precisa de la enzima en una longitud de onda específica, siendo una prueba más sensible que otros métodos como colorimétricos, espectofotométricos y electroforéticos (32).

En este estudio se observó que tal y como reportan los estudios (30,31,33,35). Las

células pulpares que no fueron expuestas a ningún cemento presentaron actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la menor actividad se observo en las células pulpares expuestas a levamisol. Sin embargo, se observó que al contrario de lo que se esperaba, las que fueron expuestas durante 72 horas a los cementos evaluados presentaron menor actividad que las no expuestas, lo que fue estadísticamente significativo.

Los resultados que se obtuvieron en este estudio con respecto a la exposición de fibroblastos pulpares a MTA- (ProRoot-Dentsply) ™ - ( 13.37 UF, DS – 7.61) podrían coincidir con los resultados mostrados por Bonson et al 2004 donde encontraron una reducida actividad fosfatasa alcalina durante los 4 primeros días de exposición. Sin embargo Bonson et al 2004 encontraron la máxima actividad después del noveno día.


Tabla 2. Resultados descriptivos de medición de fosfatasa alcalina para cada uno de los grupos

La actividad de la fosfatasa alcalina es un importante indicador de formación ósea y un marcador fenotípico de células osteoblásticas (8-9). En endodoncia se ha demostrado que la fosfatasa alcalina es una enzima expresada en las fases tempranas de la mineralización y estimula al tejido pulpar para formar matriz dentinal en terapias de recubrimiento pulpar (36) y presenta varias isoformas que se han expresado en gran variedad de tejidos como hueso, hígado, riñón, intestino y placenta; además observaron una gran expresión de fosfatasa alcalina ósea en sitios de mineralización (37), lo que apoya el probable papel de esta enzima en la mineralización normal de hueso. En efecto esta actividad ha sido observada en varios tejidos dentales en los que hay procesos de mineralización tales como; ligamento periodontal, encía, hueso alveolar, cemento, esmalte, pulpa dental y saco dental, (38-39-10-33-40-41). Estudios comparativos in Vitro muestran que los fibroblastos del ligamento periodontal presentan niveles más altos de actividad de fosfatasa alcalina que los fibroblastos gingivales (42-43-40-44) y en fibroblastos pulpares se detecta 7.5 veces más actividad enzimática que en fibroblastos gingivales (31). Así mismo Goseki et al en1990 mostraron que en las células pulpares la actividad es mayor que en las células osteoblásticas (33), aun cuando se ha demostrado que las propiedades de ambas enzimas corresponden a la misma clase de isoforma: fosfatasa alcalina no específica de tejido (45-46). Los resultados del estudio de Goseki et al en 1990 no coinciden con los resultados este estudio, debido a que se presento menor actividad la fosfatasa alcalina en fibroblastos pulpares que en osteoblastos. Sin embargo cabe aclarar que los métodos utilizados en los dos estudios son diferentes, debido a en este estudio se uso el método fluorométrico ye en el de Goseki et al en 1990 usaron el método colorimétrico.

Para que ocurra la formación de un tejido duro tienen que suceder una serie de eventos celulares (47, 48,49), incluyendo los de

tipo inflamatorio particularmente en los primeros días de exposición a algún material de recubrimiento lo que podría explicar la baja actividad de la fosfatasa alcalina que se observo en los fibroblastos pulpares expuestos a los cementos que se utilizaron en nuestro estudio. Justamente varios estudios in vitro sugieren que en las etapas iniciales de la exposición, algunos materiales dentales producen reacciones inflamatorias y desnaturalización proteica ocasionando un retraso en la cicatrización de las células pulpares, y por ende en mineralización (18,50-55) y citoquinas como la interleuquina 1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) que están relacionadas a las etapas iniciales de la inflamación, han mostrado efecto inhibitorio sobre la actividad de fosfatasa alcalina (56-59).

No obstante, en dichos estudios in vitro el efecto inhibitorio fue evaluado durante un lapso de tiempo mucho mayor a las 72 horas que empleamos en este estudio, pero Tatsu y Kiyoshi en el 2006 observó que al exponer las células pulpares a TNF-alfa ,produce efecto inhibitorio sobre la actividad de fosfatasa alcalina a ese tiempo (60) a diferencia de lo reportado por Min et al en 2006 quienes observaron un efecto inhibitorio por parte de IL-1 y TNF-alfa hasta al séptimo día y demostró que estas citoquinas en conjunto ejercen un mayor efecto inhibitorio que cuando están solas (48).En este estudio se evaluó in vitro dicha actividad a 72 horas de exposición porque se quería apreciar el efecto inicial de estos biomateriales sobre células pulpares durante las primeras horas después de colocarlos.

Cuando se comparo la actividad de la fosfatasa alcalina de fibroblastos expuestos al MTA con fibroblastos no expuestos; se encontraron diferencias estadísticamente significativas siendo mayor la actividad de los fibroblastos no expuestos, lo que está en desacuerdo con los resultados reportados por Min et al en 2009; que al evaluar in Vitro la actividad fosfatasa alcalina de fibroblastos


pulpares frente a MTA mediante colorimetría, encontraron que la actividad producida por el MTA fue estadísticamente similar a la del grupo control –fibroblastos pulpares sin cemento- al primer día. Pero al tercer día se pudo observar que la actividad fosfatasa alcalina con MTA se mantuvo igual, mientras que en fibroblastos pulpares sin exposición de cemento la actividad enzimática disminuyo (61), Sin embargo, cabe aclarar que en este estudio no hubo un contacto directo entre las células y los materiales evaluados para la detección enzimática y al igual que en el estudio de Bonson et al en 2004 utilizaron un método de medición diferente al nuestro. Cuando se compararon los tres cementos entre sí, se encontró que la mayor actividad de fosfatasa alcalina se dio en las células expuestas a Portland ( 15.56 UF, DS- 9.92), seguido por las células expuestas a MTA ( 13.37 UF, DS - 7.61) y por último las células expuestas a Portland + Óxido de Bismuto al 25% ( 11.88 UF, DS - 6.36), sin embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas.

Aunque se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las células expuestas al MTA y al Portland frente al grupo de células expuestas al levamisol ( 9.067 UF, DS – 3.059), el efecto de la exposición de las células pulpares al cemento Portland + Óxido de Bismuto al 25 % fue estadísticamente igual al obtenido en las células expuestas a levamisol, que tiene un potente efecto inhibitorio sobre la fosfatasa alcalina (33-34). Esto podría sugerir que el Óxido de Bismuto podría estar afectando la actividad de la enzima en estas 72 horas de exposición, acorde por lo reportado por los estudios de Min et al en 2007 y Camargo et al en el 2009; en los que se han observado los efectos citotóxicos de este elemento sobre células pulpares humanas, indicando que dicha toxicidad se manifiesta a corto plazo - 1día - pero con el paso de los días el Óxido de Bismuto tiende a ejercer un efecto protector (51-52).

Hoy por hoy, el MTA es considerado el material por excelencia para recubrimiento pulpar directo. Sobre el MTA se han realizados múltiples estudios in vivo e in Vitro para evaluar sus propiedades, pero aún no es completamente claro el mecanismo por el cual induce la formación y mineralización de un puente dentinal. Por una parte Schroder et al 1985 sugirieron que el MTA por sí mismo no es el que promueve la mineralización como tal, sino que el efecto de controlar la infección y de estimular el proceso de cicatrización en las células pulpares serían los responsables de la formación del puente dentinal (62). Por otro lado, Mitchell et al 1999 y Koh et al en 1998 sugieren que el recubrimiento pulpar con MTA induce cambios funcionales y citológicos en las células pulpares que fueron expuestas resultando en la formación de fibrodentina y dentina reparativa (63-64) y Kuratate et al en 2008 reportan que esta formación ocurre entre los 7 y 14 primeros días de aplicado el MTA (20), lo que podría explicar la mínima actividad de la fosfatasa alcalina producida por los fibroblastos expuestos a este cemento cuando lo comparamos con los fibroblastos no expuestos a ningún cemento a las 72 horas.

Basados en los resultados del presente estudio, se recomiendan nuevas investigaciones sobre medición de actividad de fosfatasa alcalina en tiempos mayores de exposición de 72 horas. También se sugiere evaluar el papel de las citoquinas inflamatorias y la concentración de Óxido Bismuto en cemento Portland debido a que pueden alterar la actividad de la fosfatasa alcalina.

A partir de los resultados de este estudio se concluye que: los tres cementos presentaron una disminuida actividad de fosfatasa alcalina a las 72 horas de exposición sin presentar diferencias entre ellos, el cemento Portland tipo I con óxido de bismuto al 25% actúa como el Levamisol, inhibiendo la actividad de esta enzima en las primeras 72 horas de exposición a los cementos y los fibroblastos pulpares sin exposición a ningún material presentaron mayor actividad de fosfatasa alcalina en las


primeras 72 horas de manera estadísticamente significativa con respecto a los otros grupos evaluados.

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