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CATEDRA: VIROLOGIATEMA:EXTRACCION DE ADN Y PCR
CONTENIDOGeneralidades sobre el ADN Muestras para extraccin del ADN
Condiciones sobre la remisin de muestras.Mtodos de extraccin del ADN
EL MATERIAL GENTICO
CROMOSOMAS46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDESUN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE
EL MATERIAL GENTICOEs el responsable de transmitir caracteres heredados de una generacin a otra. los
Est conformado por millones de unidades de nucletidos
Cada nucletido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azcar y grupo fosfato
EL MATERIAL GENETICOBASES NITROGENADASBN BN BN ADENINA GUANINA PA
BN
BN
P
CITOSINATIMINA P
A
BN
BN
A
MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN
Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN
PROTECCION DEL PERSONAL
Prevenir contacto directo Condiciones de asepsia Vacunacin
MATERIALHUMANO.
PROTECCION DE LA MUESTR A CONTAMINACION PORBIOLOGICOCAUSADA POR
MICROORGANISMOS
CONTAMINACION MICROBIOLOGICA
LA TEMPERATURA LA HUMEDAD
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN CONTAMINACIN QUMICATECNICA PRODUCTOS QUIMICOS QUE PUEDEN ALTERAL LA DEL PCR
TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS
PUEDE OCUSACIONAR LA PERDIDA DE LA MUESTRA FENMENOS
DEGRADACION DE LAS MUESTRASINSECTOS
METEOROLGICOS
HUMEDAD AMBIENTAL ACCIN DE
Deteccin de mutaciones
Mtodo de diagnstico rutinario (relacin entre enfermedad y mutacin puntual)
Secuenciacin de ADNs fsiles
Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayora estn daadas o degradadas)
Diagnstico de enfermedades genticas
Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro
Identificacin de especies y control de cruces entre animalesPara descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro
Secuenciacin de genomas
Conocimiento bsico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)
Obtencin de protenas de inters mdico, comercial, etc...
(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulacin antes se obtenan a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)
Obtencin de vacunas recombinantesExtraccin del ADN del virus
(aternativa al uso de organismos patgenos inactivos)
ADN plsmido bacteriano
Integracin del plsmido hbrido en el ncleo de una clula de levadura
La levadura fabrica las protenas vricas con poder inmunolgico
Inyeccin de protenas vricas en un chimpanc
Diagnstico de enfermedades de origen genticoADN sano ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo
Mediante ingeniera gentica se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo
ADN complementario del ADN enfermoDIAGNSTICO
Biochip Microarray DNAchip
Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomala Hibridacin? Renaturalizacin No hibridacin? del ADN con la sonda fluorescente Desnatura lizacin del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar
EXTRACCION DE ADN ORGANICA CHELEX PAPEL FTA SALTING OUT Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra
Preparacin de Muestra Extraccin de ADN Orgnica
Extraccin por Chelex Extraccin de ADN utilizando papel FTA
EXTRACCION ORGANICA DE ADN PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)
EXTRACCION ORGANICA DE ADN COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO AADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AADA FCI => Fenol disuelve protenas y lpidos Particiona macromolculas basado en propiedades hidrofbicas e hidroflicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
FENOL CLOROFORMO VENTAJAS Tcnica Orgnica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), despus se realiza digestin con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: Reactivos altamente txicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.
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EXTRACCION POR CHELEX RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LACELULA UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX AADA MUESTRA AL TUBO AADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX 100C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DESNATURALIZADO A CADENAS SENCILLAS UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR
CHELEXVENTAJAS Tcnica inorgnica Previene la degradacin del ADN por quelacin de los iones metlicos durante la ebullicin al 5%. Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. los reactivos no son txicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.
Podemos obtener diferentes muestras de ADN humano para su extraccin, aislamiento y purificacin, con el objetivo de ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico.
EXTRACCION CON PAPEL FTA PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AOS UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnologa FTA Rompe clulas y membranas de organelos-Fsicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos Nucleicos-Previene Dao por radicales libres/UV -Previene Dao Enzimtico -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias
Provee Seguridad al Usuario-Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos
CARACTERISTICAS Y VENTAJAS
EXTRACCIN DE PAPEL FTA CUANTIFICACIN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes
Posible AUTOMATIZACIN
SALTING-OUT Tcnica de tipo inorgnica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN.
Toma de muestra Colectar 0,5 mL de sangre perifrica en un tubo de 1,5 mL estril conteniendo 20 l de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversin fuerte para garantizar homogenizacin. Conservar en refrigeracin hasta su procesamiento, el cual deber realizarse en un plazo no mayor de 48 horas despus de haberse realizado la toma de muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las clulas nucleadas.
SALTING OUT1. Lisis Celular 2. Extraccin 3. Precipitacin 4. Resuspensin
LISIS CELULAR Buffer de lisis I: (lisis glbulos rojos). Sucrosa MgCl2 1M Triton x 100 Buffer de lisis II: (lisis glbulos blancos) EDTA de Na NaCL.
EXTRACCION Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M
PRECIPITACION Isopropanol
Etanol al 70% lava el exceso de sales.
RESUSPENSION Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o tambin se puede realizar en agua.
CONCLUSIONES El ADN es el material gentico a travs del cual se transmite la informacin contenida en los genes de generacin en generacin. El ADN esta presente en los indicios biolgicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. El Salting-out es uno de los mtodos de extraccin de ADN mas utilizados por su fcil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.
TIPOS DE PCR
TIPOS DE PCR
Anidada
In situ
Transcriptasa inversa
Tiempo real
Multiplex
PCR anidada Comprende dos rondas de amplificacin con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de deteccin. Primero se realiza una reaccin con los iniciadores externos para amplificar una regin de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana. Despus, con este producto de amplificacin, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la regin especfica. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La desventaja de sta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra.
PCR in situ para la PCR in situ incluyen la fijacin y la permeabilizacin durante la preparacin de la muestra, un mecanismo para ciclacin y el material celular en la solucin o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las clulas o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfologa y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificacin de PCR de las secuencias blanco se realiza despus en las clulas intactas en tubos microEppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal
RT-PCR Es un mtodo sensible para la deteccin de los niveles de expresin del ARNm. Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reaccin de RT y la amplificacin por PCR.
ARN es la primera transcripcin inversa en cDNA utilizando una transcriptasa inversa El cDNA resultante se usa como plantillas para su posterior amplificacin por PCR utilizando primers especficos para uno o ms genes.
Es una variante de (PCR) utilizada para amplificar y cuantificar el producto de la amplificacin de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores especficos, dNTPs, un tampn de reaccin adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorforo, permita medir la tasa de generacin de uno o ms productos especficos.
PCR en tiempo real
Dicha medicin, se realiza luego de cada ciclo de amplificacin y es por esto que tambin se le denomina PCR en tiempo real.
PCR multiplex PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes.
Se amplifica mas de una secuencia blanco, que se logra agregando en la reaacion mas de un par de primers. Ahorra tiempo y esfuerzo