Fuentes. Normas de calidad. Toma y transporte de la muestra.Análisis microbiológico. Valores microbiológicos de referencia para los

alimentos. Factores que influyen en el tipo y número de microorganismos presentes.

Con frecuencia se requiere realizar un análisis microbiológico

del alimento para determinar su CALIDAD, la cual es

necesaria para:

Estimar su vida de anaquel.

Determinar si es adecuado para consumo humano

Confirmar si se necesita establecer algún criterio microbiológico.

Microorganismos indicadores: se relacionan

con la calidad microbiológica del alimento.

Microorganismos marcadores: sugieren que

puede haber la presencia de agentes

patógenos en el alimento.

Es ampliamente usada como un amplio indicador de la calidadmicrobiológica de los alimentos.

Es inadecuada para asegurar la calidad de alimentos fermentados, ya que contienen una gran cantidad de m.o. como consecuencianatural de su preparación.

Rev. Cient., vol.18(2): 207-217. 2008

En los alimentos, la calidad compromete 3 aspectos:

Seguridad. Un alimento no debe contener niveles de agentespatógenos o sus toxinas.

Aceptabilidad/vida de anaquel. Un alimento no debe contenerlos niveles suficientes de m.o. para producir alteraciones o dañosorganolépticos, dentro de un inaceptable corto periodo de tiempo.

Consistencia. La calidad de un alimento debe ser consistente con respecto a la seguridad y vida de anaquel. El consumidor no acepta productos que muestren grandes variaciones entre lotes.

Para distinguir la calidad aceptable o inaceptable de un alimento, se requiere la

aplicación de los criterios microbiológicos definidos por la International

Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF).

1. Norma o Estándar microbiológico: criterios especificados en leyes o

regulaciones. Es un requerimiento legal, regulado por la agencia apropiada.

2. Especificación microbiológica: criterios aplicados en el comercio. Condición

contractual de aceptabilidad aplicada a un comerciante que intenta definir la

calidad microbiológica de un producto o ingrediente. Una falla resulta en el

rechazo del lote o un bajo precio del mismo.

3. Guía microbiológica: permite monitorear la aceptabilidad de un producto o

proceso. Difiere de la norma o estándar y de la especificación en que tiene

carácter de advertencia, en lugar de obligatoria.

1. Declaración de los alimentos a los que se aplica el criterio. (los alimentos difieren en su origen, composición y tratamiento; poseen diferente hábitat microbiano y suponen diferente deterioro y problemas de salud pública).

2. Declaración de los m.o. o toxinas de interés. (debe ser realista y basada en una sólida comprensión de la ecología microbiana del alimento en cuestión).

3. Información sobre los métodos analíticos utilizados para detectar y cuantificar los m.o./toxinas.

4. Número y tamaño de las muestras que se toman por lote o bien de una fuente de importancia tal como un punto en la línea de procesamiento.

5. Límites microbiológicos apropiados para el producto. (para ciertos patógenostales como Staphylococcus aureus o Clostridium perfringens, su presencia no necesariamente indica un peligro, por lo que se requiere una especificación de los límites numéricos).

Planes de Atributos de Dos-clases:

Esquema simple de muestreo por atributos, en donde las muestras se clasifican como aceptables o defectuosas en función del resultado. Una muestra es defectuosa si contiene más de un número determinado de m.o., o bien, en casos donde se detecta el m.o. al aplicar pruebas de presencia o ausencia. El esquema simple de dos clases se define por 3 números:

◦ n: # de unidades de las muestras a analizar.

◦ m: cuenta por arriba de la cual la muestra es defectuosa (no se usa en esquemas en donde la sola presencia/ausencia de m.o. es+ ó -).

◦ c: máximo número permitido de unidades de muestra, la cualpuede exceder el valor de m antes de rechazar el lote.

El plan de dos clases se prefiere cuando el m.o. de interés no está permitido en el alimento

Planes de Atributos de Tres-clases:

Introduce otra categoría y divide las muestras en 3 clases: aceptable, marginalmente aceptable e inaceptable. El esquema se define por 4 números:

◦ n: # de muestras tomadas por lote.

◦ M: cuenta máxima (si se excede el valor se rechaza el lote).

◦ m: cuenta que separa la calidad buena de la marginal (no se debe exceder).

◦ c: máximo número de muestras de prueba que puede caer en la categoría de marginalmente aceptable, antes de rechazar el lote.

Se utiliza regularmente cuando existe un númeropermitido de m.o. presentes en una unidad-volumen

Si un producto tiene elevadas cuentas, es debido a:◦ que la materia prima es de baja calidad?

◦ hay una higiene deficiente en el proceso de producción?

◦ las condiciciones de almacenamiento son deficientes?

◦ por la combinación de algunos de los anteriores?

La manera más efectiva para controlar la calidad de un alimento es a través de la intervención en la fuente u origen, durante el proceso de producción.

Entrenamiento del personal, que incluya los sig. tópicos:

◦ Los m.o. como la principal causa de deterioro alimenticio, enfermedades

microbianas y caract de los tipos comunes de envenenamiento de los

alimentos.

◦ Prevención del envenenamiento de los alimentos a través del control del

crecimiento microbiano, supervivencia o contaminación.

◦ Normas de higiene del personal, para evitar principalmente la contaminación

de alimentos con bacterias de la flora común (ej. S. aureus, Salmonella) o de

contaminación (ej. Listeria, B. cereus).

◦ Principios de la manipulación y

almacenamiento de los alimentos

(correcto uso de refrigeradores y

congeladores, importancia del

monitoreo de T°C, necesidad de

rotación y evitar la contaminación

cruzada).

◦ Procedimientos correctos de limpieza.

◦ Conocimiento sobre las plagas

comunes encontradas en los alimentos,

incluyendo métodos para su exclusión

y control.

◦ Introducción a los requerimientos de

las legislaciones y normas actuales en

alimentos.

Además de entrenamiento, el personal debe tener facilidades de operación.

Equipamiento.

Ejemplos de equipamiento bueno y deficiente:

a) Colcación de lassondas

b) Evitar el espaciomuerto

c) Evitar problemas de limpieza

Limpieza y desinfección.

Desinfectantescomunes:

(1) Cloro y compuestosclorados

(2) Iodófotos(3) Compuestos

cuaternarios de amonio (QUATs)

(4) Biguanidas(5) Surfactantes de

ácidos aniónicos(6) Surfactantes

enfotéricos

Muestreo: sucesión de pasos para asegurar que la muestra posea las características esenciales del lote.

Muestra: una porción de material tomada y seleccionada de tal forma que posee las características esenciales del lote (IUPAC).

La muestra seleccionada para el análisis debe ser

representativa del lote entero del alimento y lo

suficientemente grande para poder llevar a cabo todas las

determinaciones.

La técnica de análisis debe ser ejecutada con estricto apego a la metodología establecida.

Comparación con normas o estándares de calidad.

Uso del sentido común

Criterios

Canadá (“Canadian Food and Drug Directorate”): 5 unidades

por partida o la raíz cuadrada del número de unidades de la

partida

Inglaterra: del 5 al 10% del número de unidades por partida

Estados Unidos (“Association of Food and Drug Officials of

the United States”): 10 unidades por partida

Aguas y alimentos líquidos

Superficies

Especímenes sólidos de gran tamaño

Unidades sólidas de pequeño tamaño

Muestras al personal que labora con alimentos

Técnicas de manejo de muestras

Todo el material que se use debe esterilizarse y envolverse

Al colectar la muestra hay que evitar contaminación del ambiente (polvo, tierra, agua, saliva)

Rotular o etiquetar

Consignar información que pueda afectar la prueba o el significado del resultado. Por ejemplo la presencia de algún conservador, olor, color, condiciones de conservación, temperatura

Se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en recipientes o piezas grandes habrá que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una muestra representativa. O bien manejar varias muestras independientes de áreas que se considere pueden tener mayor riesgo.

• En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la superficie y profundas (minimizando la contaminación de la superficie)

• En alimentos congelados se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar

Muestras líquidas congeladas

Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración (2-8°C) o en congelación si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar el alimento.

Acortar el tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra.

Muestras líquidas deben encontrarse homogéneas, emplearse de 100 a 500 ml.

• Obtención de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda de bisturí y pinzas, uso de hisopos inertes estériles humedecidos en solución diluyente estéril.

• Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmósfera y usar líquidos de dilución con bajo potencial redox como el medio de Stuart (a partir de tioglicolato) o medio enriquecido para clostridios (con cisteína).

NOM-113-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa

NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos

NOM-115-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos

NOM-127-SSA1-1996. Modificación de NOM-127-SSA1-1994, Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización

NOM-143-SSA1-1995, Bienes y Servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes

Técnicas de muestreo para el control microbiológico:

Técnicas de manejo de muestras

Muestra líquida congelada: fundirla y homogeneizarla. No es recomendable que el producto llene totalmente el recipiente, para evitar escurrimientos y contaminación.

Muestras sólidas: se pesan 10 gramos y se diluyen en 90 ml de solución diluyente, se licua o se puede usar un mortero estéril. Se considera como la primera dilución. Para las diluciones sucesivas se usan pipetas diferentes inoculando simultáneamente a las cajas petri.

El volumen que se transfiera nunca será menor del 10% de la capacidad total de la pipeta, por ejemplo para 0.1 ml no se usa una pipeta de más de 1 ml.

• Agua peptonada 0.1% pH 6.8–7.0

• Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 7

• Solución de Ringer (soln. fisiológica tricluorada)

• Medio enriquecido para clostridios

• Solución de sacarosa al 20% o NaCl al 15%, osmófilos y halófilos respectivamente.

Consiste en contar colonias que se desarrollan después de cierto tiempo en el medio de elección.

Presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra.

Vertido

Superficie

Conteo en placa

o Seleccionar las placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo.

o Contar todas las colonias de la placa.

o Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes:

o 301-500 colonias: se divide en dos partes y el número de colonias contadas se multiplica por 2.

o 501-800 colonias: se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas se multiplica por 4.

o >800 colonias: se cuentan de 10 a 20 cuadros, se promedia y se multiplica por el número de cuadros que ocupa la caja.

Reglas para conteo en placa

o El número de colonias contadas deberá ser multiplicada por el inverso de la dilución y considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra).

o Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos al inicio de la cifra por ejemplo:

129 se reporta 130

2,417 se reporta 2400

49 se reporta 49

o Técnica empleada para el análisis de muestras que suponen una pequeña concentración de m.o.

o Estimación de la densidad de bacterias en el alimento.

o Tiene una base estadística: la probabilidad de obtener tubos con cultivo positivos va a disminuir conforme es menor el volumen de muestra inoculada.

o Permite la inclusión de agentes selectivos y se utiliza cuando se requiere de un medio enriquecido previo a la identificación de un grupo microbiano.

Frecuentemente se utilizan como una etapa de enriquecimiento para aumentar la concentración de m.o.de interés.

Se consideran positivos aquellos que después de incubados presenten enturbiamiento, cambio de color, formación de gas.

Ejemplo: en caldo lactosado, las bacterias coliformesproducen fermentación de carbohidratos.

Fermentación de carbohidratos

De los tubos positivos de la prueba presuntiva se inoculan a la prueba confirmativa.

El número de tubos positivos y negativos determinará el Número Más Probable (NMP) mediante el uso de una tablaen la cual se estima la concentración de microorganismos en el alimento.

Técnica del Número Más Probable

Tabla del NMP para estimar la concentración de m.o. en el alimento.

Pruebas confirmativas

Ejemplo: para coliformes, caldo lactosa bilis verde brillante o agar EMB

Medios diferencialesContienen productos químicos para dar lugar a una alteración visible del medio de cultivo.

Agar Eosina azul de metileno (EMB). Contiene lactosa, sales y colorantes (eosina y azul de metileno), para diferenciar entre fermentadores y no fermentadores de lactosa. Ej. E. coli (fermentador) produce colonias oscura o con brillo metálico.

Agar McConkey. Adicionado con sales biliares y cristal violeta. Para selección y recuperación de Enterobacteriaceae y bacterias Gram(-). Bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias rojas.

Agar entérico de Hektoen. Adicionado con elevada concentración de sales biliares como inhibidor. Para aumentar el rendimiento de Salmonella y Shigella.

Colonias de E. coli (grandes, rosas) y Proteus vulgaris(pequeñas, de color castaño) que crecen juntas en una placa Petri. En circunstancias normales estas bacterias son inofensivas y habitan en el intestino humano favoreciendo la digestión, si bien pueden convertirse en patógenas y producir infecciones del tracto urinario.

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Caldo de urea (o agar urea de Christensen). Para detectar la enzima ureasa que poseen algunas bacterias entéricas.

Medios característicosPara examinar bacterias con actividades metabólicas, productos o requerimentos especiales

- +

Agar con hierro y 3 azúcares (TSI). Contiene lactosa, sacarosa, glucosa, sulfato amónico ferroso y tiosulfato sódico. Para identificar m.o. entéricos por su capacidad para utilizar azúcares y liberar sulfuros.

Agar citrato. Para diferenciar bacterias que pueden desaminar o decarboxilar lisina.

+ -

Medio de sulfuro, indol y motilidad (SIM). Para diferenciar m.o.entéricos. Se observa la formación de sulfuro, indol (por la utilización de triptófano) y la motilidad

Agar Salmonella-Shigella (SS), adicionado con sales biliares para inhibir coliformes. Se producen colonias incoloras por la incapacidad de fermentar lactosa

Agar sulfito de bismuto (BS). Para aislar Salmonellatyphi; colonias negras con tono metálico

Agar sal manitol (MS), adicionado con 7.5% de sal. Se usa para aislar estafilococos

Klebsiella pneumonie E. coli

Salmonella sp.

Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Salmonella sp.

Klebsiella pneumonie Pseudomonas aeruginosa

a) Factores extrínsecos. Derivados de la condiciones físicas del ambiente en

el que se almacena el alimento.

b) Factores intrínsecos. Derivados de la composición del alimento: actividad

de agua (aw), pH, potencial redox, nutrientes, estructura del alimento, agentes antimicrobianos presentes, etc.

c) Tratamientos tecnológicos. Modifican flora inicial como consecuencia del

procesado del alimento.

d) Factores implícitos. Comprenden las relaciones entre los m.o. establecidas

como consecuencia de los factores a, b y c.

Son aquellas que se relacionan con el alimento:

◦ pH (acidez).

◦ Concentración y tipo de nutrientes.

◦ Potencial redox.

◦ Contenido de humedad.

◦ Actividad o disponibilidad de agua (Aw).

◦ Agentes antimicrobianos naturales.

◦ Estructura física y biológica de los alimentos.

Son aquellas que se relacionan con el ambiente o entorno:

◦ Temperatura de almacenamiento.

◦ Humedad relativa o del ambiente.

◦ Presencia y concentración de gases (CO2, O2).

◦ Tipo, número y actividades de otros microorganismos en el alimento.