FUNDAMENTOS DE CRIOBIOLOGÍA ESPERMÁTICA PARA BANCOS DE SEMEN

A R T Í C U L O I I I

INTRODUCCIÓN

El objetivo principal de lacriopreservación de espermatozoides esmantener su viabilidad y funcionalidad abajas temperaturas durante largosperiodos de tiempo. Las célulascriopreservados se almacenan a -196ºCen nitrógeno líquido. A esta temperaturano existen fenómenos ni de difusión nienergía térmica suficiente para llevar a

cabo reacciones químicas. Por tanto, lasdificultades de la congelación noderivan de la permanencia a bajastemperaturas sino de los procesos deenfriamiento y calentamiento.

Durante estos procesos las células seencuentran en suspensión en unasolución acuosa. Dicha solución tendráunas propiedades coligativas quedependen fundamentalmente del

número de moléculas que hay en ella yno de la naturaleza de estas. Así, alañadir un soluto a una disolucióndisminuye el punto de congelación(punto crioscópico) y la presión de vapor,y aumenta la presión osmótica y el puntode ebullición. La ósmosis es elmovimiento del agua desde solucionescon baja concentración de soluto hastasoluciones con alta concentración desoluto y la presión osmótica es la presión

FUNDAMENTOS DE CRIOBIOLOGÍA ESPERMÁTICA PARA BANCOSDE SEMENBASES OF SPERM CRYOBIOLOGY APPLIED FOR SPERM BANKS

Ana Fernández1, Maria del Carmen Gonzalvo1 Ana Clavero1, Rafael Ruiz de Assín1, Sandra Zamora1, María Roldán1, Belén Rabelo1, Juan PabloRamírez2,3, Alberto Yoldi2, José Antonio Castilla1,2,3

1 Unidad de Reproducción Humana, Hospital Universitario “Virgen de las Nieves”, Granada.2 Banco de Semen CEIFER, Granada.3 Programa de Control de Calidad Externo para el Laboratorio de Reproducción de la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción(ASEBIR), Madrid.Para contacto: José Antonio Castilla Alcalá: Unidad de Reproducción. C/ Dr. Azpitarte S/N Edificio de consultas externas Hospital Materno-Infantil CP.18014 josea.castilla.sspa@juntadeandalucia

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RESUMEN

Los espermatozoides tienen unas características especiales para la congelación, en este trabajo se analizan estas característicasy su influencia en la supervivencia espermática aplicada a los bancos de semen. Entre ellas se encuentran factores propios deltipo celular a congelar y factores dependientes del protocolo de congelación. Dentro de los primeros podemos hablar deltamaño y la permeabilidad celular y entre los segundos nos encontramos la curva de congelación y la adicción de loscrioprotectores.

La curva de congelación se refiere a la respuesta celular a la congelación (shock por frío, formación de hielo y descongelación)que puede provocar lesiones crioinducidas como la formación de hielo intracelular, estrés osmótico o recristalización. Paraevitar estos daños en todos los protocolos se describe como parte fundamental la adicción de agentes crioprotectoresbeneficiosos para la supervivencia celular aunque también recogen aspectos perjudiciales como su toxicidad. Por último seanalizarán las bases y el papel de la vitrificación de espermatozoides en los bancos de semen.

Palabras clave: banco de semen, criobiología, vitrificación

ABSTRACT

The spermatozoa have special freezing characteristics, these characteristics and influences on the spermatic survival appliedto the sperm banks are analyzed in this work. Among them we find particular freezing factors depending on cellular type andfreezing protocol. Among those we will begin with size and the cellular permeability and secondly we will look the freezing curveand the addition of the cryoprotectors.

The freezing curve refers to the cellular response to freezing (cold shock, ice formation, and thawing) which could provokecryoinjuries such as intracellular ice formation, osmotic stress or re-crystallization. In order to avoid these damages allprotocols as a basic measure describe the addition of cryoprotecting agents as beneficial to the survival of the cell althoughthey also inflict detrimental aspects due to their toxicity. Finally the bases and the role of the vitrification of the spermatozoain the sperm banks will be analyzed.

Key words: sperm bank, cryobiology, vitrification

af.interior:Maquetaci n 1 25/06/2009 14:12 PÆgina 17


Ana Fernández et al. Fundamentos de criobiología espermática para bancos de semen

hidrostática que se genera a través de unamembrana semipermeable con ungradiente de concentración. Estaspropiedades deberemos tenerlas presentescuando al disminuir la temperatura duranteel proceso de congelación empiece aformarse hielo en el medio extracelular,pues el agua que forma parte del hielo nocontiene los solutos que tenía disueltos,aumentando la concentración de estos enel medio extracelular (hiperosmótico) y modificando las propiedades coligativasde este.

Durante estos procesos las células se comportan como osmómetros,variando su volumen en respuesta a loscambios osmóticos extracelulares, asílas células pierden o captan agua según se expongan a mediosextracelulares híper o hipo osmóticos,respectivamente; los movimientos deagua y crioprotectores a través de lamembrana celular durante lacriopreservación se rigen por diversosparámetros biofísicos que deben serdefinidos para cada tipo celular adiferentes temperaturas, y en definitivaserán los responsables del daño celular.

CONCEPTOS GENERALES DEL TRASNPORTEA TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS DURANTELA CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN

A modo de ejemplo, podemos consideraruna célula como una “bolsa” rellena de unasolución salina sumergida en un medio decongelación (medio extracelular). Elenvoltorio de la bolsa, es decir, lamembrana celular tendrá propiedades demembrana semipermeable.

Las dos características principales quevan a definir el comportamiento de lamembrana son: el tamaño y lapermeabilidad.

TAMAÑO

Es el área de membrana disponible paraintercambiar agua con el medio exterior.

PERMEABILIDAD.

Este parámetro define la facilidad con laque el agua puede atravesar lamembrana ante un gradiente deconcentraciones. La permeabilidad de lamembrana celular esta regulada por unaley que refleja el hecho empírico de que

cuanto menor es la temperatura delsistema, menor es la permeabilidad de lamembrana. De esta manera la membranacelular pierde su carácter semipermeablepara pasar a tener un carácterimpermeable, por debajo de una ciertatemperatura crítica. Cuando enfriamos elsistema por debajo de dicha temperaturacrítica, el proceso de deshidratación sedetiene, esto se traduce en un aumentode la probabilidad de formación de hielointracelular. Experimentos de laboratoriomuestran que la permeabilidad de lamembrana celular, además de variar conla temperatura del sistema, tambiéndepende de la concentración de soluto enel medio extracelular.

El contenido de la “bolsa”, es decir, elmedio intracelular estará constituidopor dos regiones:

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE INACTIVO

En esta región incluimos orgánulosinternos de la célula, el núcleo celular,macromoléculas como por ejemploproteínas, etc. Son partes internas dela célula que no van a intervenir en elproceso del transporte del agua. Sedefine como el agua que nunca dejaráel interior celular en respuesta a unaumento de concentración de solutosen el espacio extracelular por estarasociado a las macromoléculas yestructuras intracelulares. Si una célulase deshidrata y reduce su tamaño más allá del volumen osmóticamenteinactivo puede comprometerse laviabilidad de esta (Hipótesis devolumen mínimo de Meryman paraexplicar el daño celular durante lacongelación) (Meryman, 1970).

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE ACTIVO

En esta región incluimos la soluciónintracelular en la que están flotando losorgánulos internos, el núcleo, etc., y quesi puede abandonar la célula.

RESPUESTA CELULAR A LA CONGELACIÓN

SHOCK POR FRÍO Y DAÑO DE ENFRIAMIENTO(DESDE 37ºC A 0ºC)

El shock por frío (cold shock) es el dañocelular debido a la sensibilidad frente ala velocidad de enfriamiento, y escausada por efectos de transición en la

fase lipídica (Drobnis et al., 1993). Eldaño de enfriamiento (chilling injury) esel daño debido a la sensibilidad frente auna temperatura específica o un rangode temperaturas.

Los ácidos grasos pueden existir en unestado rígido ordenado (gel) o en uno más flexible y relativamentedesordenado (fluido). La transición deun estado al otro se da en un rango detemperaturas, la media de la cual seconoce como temperatura de transiciónde fase (“melting temperature”, Tm).Esta temperatura de transición serámayor o menor dependiendo de lacomposición de los ácidos grasos de lamembrana. La mayoría de lasmembranas de células eucariotas tienensu Tm entre los 0ºC y los 20ºC.

La transición de fase en una membranaplasmática no se da simultáneamente entodos sus fosfolípidos y por tanto seespera la coexistencia de dominios enestado fluido y dominios en estado geldurante la transición. Esta situaciónproduce defectos en el empaquetamientode las membranas y está asociado a unamayor permeabilidad de solutos a travésde esta. Así, se ha demostrado que alalcanzar la temperatura de transición enuna bicapa determinada, se produce lamayor pérdida de solutos a través de lamembrana.

Además esta alteración causaalteraciones físicas de la membranaplasmática por la inducción de fallos enel empaquetamiento de lípidos, lasalteraciones transitorias de la faselipídica causan respuestas cinéticas nolineales en algunas enzimas, incluidasalgunas ATPasas de membrana. Esprobable que tales efectos sean en parteresponsables del mal control de laconcentración del calcio celular lo que esevidente a temperaturas por debajo delos 17 ºC (Bailey et al., 1994).

El choque térmico puede ser mitigadopor agentes crioprotectores, lapresencia de ciertos fosfolípidos(fosfatidil serina), una congelaciónlenta y pre acondicionamiento en unmedio con un nivel elevado de sales. Elespermatozoide humano pareceafectarse poco por el shock por frió ydaño por enfriamiento, probablemente

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gracias a la composición de sumembrana (Holt, 2000)

FORMACIÓN DE HIELO (0ºC A <-132ºC)

La respuesta de las células alenfriamiento, depende del método deenfriamiento. En particular la velocidadde enfriamiento es el parámetro críticoque determina los resultados delprotocolo de criopreservación. Acontinuación vamos a describir losprocesos básicos que han sidoobservados, cuando se induce hielo enel medio extracelular, en función delperfil de enfriamiento aplicado.

La existencia de solutos en el aguaproduce un descenso del punto decongelación (punto crioscópico entre -5ºC y -10ºC) y en consecuencia lacristalización del agua se produce atemperaturas menores a la del punto decongelación del agua pura (0ºC). Estoproduce, al disminuir la temperatura, unsobreenfriamiento de la muestra (Mazur,1977). En esta situación el comienzo delproceso de formación de hielo es denaturaleza aleatoria, y depende de laprobabilidad de formación de un puntode nucleación, punto de inicio de unfrente de cristales de hielo que esinversamente proporcional a latemperatura. Cuanto mayor sea ladiferencia entre la temperatura a la quecomienza a formarse hielo y latemperatura de cambio de fase, mayorserá la velocidad de crecimiento de loscristales de hielo. En el peor de loscasos, puede ocurrir que la temperaturaa la que comienza a formarse hielo seatan baja, que la velocidad de crecimientode los cristales resulta explosiva. Enestas condiciones los cristales de hieloactúan como lanzas que atraviesan lascélulas, destruyéndolas por completo.

Para evitar este problema, en algunosprotocolos, se induce la formación dehielo extracelular (nucleación óseeding), mediante un descenso bruscode temperatura (fig.1) para garantizarque cuando la temperatura del sistemasea la de cambio de fase, tengamoshielo. Existen numerosas maneras deinducir la formación de hielo. En el casode muestras de células aisladas se tocala muestra con una aguja fría, a unatemperatura inferior a la de cambio defase. Además este descenso de

temperatura inducido pretende evitarfluctuaciones de temperatura sobre lasmembranas celulares. Esto es debido aque al congelarse el medio decongelación se libera calor por laformación de cristales (calor latente dela fusión) que provoca un fuerteaumento en la temperatura y comoconsecuencia la temperatura de lascélulas no disminuye en paralelo con lacaída de la temperatura del dispositivo decongelación. De hecho, la temperatura dela muestra puede permanecer estáticadurante 2-3 min antes de reanudarse elenfriamiento. Varios estudios handemostrado que este período entre laformación de hielo y la reanudación deenfriamiento, el punto de congelaciónmeseta, es perjudicial para lasupervivencia celular (Fuller et al., 2004).En los protocolos habituales decongelación de semen no se realiza el“seeding” o nucleación inducida pues nose ha visto que mejoren las tasas desupervivencia, lo cual puede ser debido aque el espermatozoide humano contieneuna matriz intracelular altamente viscosagracias a la abundancia de proteínas yazucares. Su pequeño tamaño, hace quesu contenido de agua sea bajo y suestructura compartimentalizada hace quela formación de pequeños cristalesintracelulares no afecte a toda la célulasino a zonas aisladas.

La formación de hielo extracelularrompe el equilibrio isotónico por una

única razón: el agua que forma parte delhielo no contiene los solutos que teníadisuelta cuando formaba parte de ladisolución acuosa del medioextracelular. Por lo tanto, cuandocomienza a formarse hielo fuera de lascélulas, simultáneamente se estáproduciendo un aumento de laconcentración de los solutos disueltosen el medio extracelular.

Mientras tanto, en el interior de lascélulas no se ha producido cambioalguno. Debido a la naturalezasemipermeable de la membrana celular,este gradiente en la concentración desolutos entre el medio extra eintracelular origina una sobrepresión dellado de la disolución que tiene unaconcentración de solutos menor, quedesencadena un flujo de disolvente purodesde la región menos concentradahacia la región de mayor concentración.Esta sobrepresión se puede interpretarcomo la diferencia de presionesosmóticas que tienen las dosdisoluciones.

Vemos por tanto que la formación dehielo extracelular, tiene comoconsecuencia la evacuación de aguadesde el medio intracelular hacia elmedio extracelular, en un proceso quellamaremos Deshidratación Celular.

En el espacio intracelular no tiene lugarla formación de hielo en estos momentos

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Fig. 1 Curva de congelación.

(1)Nucleación: liberación de calor por formación de cristales, provocando ascenso de la temperatura.

(2) La Tª de la muestra no descienda en paralelo con la caída de la temperatura, pudiendo permanecerestática durante 2-3 min.




(<-10ºC) posiblemente por la barrerafísica que impone la membrana celular alproceso de nucleación y al crecimiento delos cristales de hielo. Además, laprobabilidad de iniciar la nucleación en elmedio intracelular es mucho menor queen el medio extracelular ya que lanucleación está directamente relacionadacon el tamaño del compartimiento acongelar (Mazur, 1963).

Paradójicamente la formación de hieloextracelular, en principio podría evitarque se formase hielo dentro de la célula,ya que al aumentar la concentración desolutos en la región intracelular, el puntocrioscópico disminuye. Por lo tantopodemos tener una solución intracelularlíquida a temperaturas muy inferiores alos cero grados centígrados, que esaproximadamente el punto crioscópico(temperatura en que se produce el cambiode fase liquida a sólida) del mediointracelular original, cuando existíaequilibrio isotónico natural. No obstante,esto no llega a ocurrir debido a que lavelocidad con que la célula es capaz deevacuar agua es muy pequeña comparadacon la velocidad con que disminuye latemperatura.

DESCONGELACIÓN

Durante la descongelación sereproducen los cambios osmóticosinversos a los descritos para lacongelación. Así, cuando el aguacongelada cambia de estado (sólido alíquido), la concentración de solutos enel medio extracelular se reduceprogresivamente y la célula vuelve ahidratarse para compensar estadiferencia de concentraciones entre elexterior y el interior celular.

Generalmente se considera que para larecuperación de las células son necesariastasas de recalentamiento rápidas. Esto seha atribuido a la posibilidad de quepequeños cristales de hielo intracelularformados en algunas células durante lacongelación podrían crecer durante unproceso lento de recalentamiento,produciéndose el concepto decongelación durante el calentamiento,también llamado recristalización. Sólo siel calentamiento es tan rápido como paraevitar el crecimiento de los cristales dehielo este fenómeno puede evitarse (Rallet al., 1980).

LESIONES CRIOINDUCIDAS

Cuando la temperatura del medio alcanzalos -132ºC, el agua no existe en estadolíquido y los canales donde se encuentranlas células se encuentran en un estadovítreo (con una alta viscosidad) y sincristalización, un estado en el que losfenómenos de difusión de las reaccionesbioquímicas no son posibles (Mazur,1984) (Tabla 1). Por tanto parece claro

que la formación de hielo extracelular noes la responsable del daño celular ya quelas células criopreservadas se mantienenen dichos canales de solución nocongelada mientras crecen los cristales

de hielo en la solución extracelularsuperenfriada (Nei ,1978).

Por otra parte, observacionesexperimentales muestran que cuandoenfriamos muestras a altas velocidades, lasupervivencia de las células al proceso decriopreservación disminuye conformeaumentamos la velocidad deenfriamiento. Y que cuando enfriamosmuestras a muy bajas velocidades,

la supervivencia de las células al procesode criopreservación disminuye conformedisminuimos la velocidad de enfriamiento(Fig. 2). Cuando la supervivencia celularse dibuja en función de la velocidad de

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Fig.2: porcentaje de daño celular en relación a la velocidad de enfriamiento por efecto osmótico (----) ó porformación de cristales (——).

Tabla 1. Daños espermáticos durante la crioconservación.



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enfriamiento, el resultado produce unacurva característica “forma de Uinvertida”(Fig. 3).

Para tratar de explicar este doblecomportamiento de la supervivenciafrente a las velocidades de enfriamiento,se ha propuesto una teoría denominadaHipótesis de los Dos Factores (Leibo,1970). En ella se proponen dosmecanismos distintos como causa de losdaños en las células, durante el protocolode criopreservación (producción de hielo y deshidratación celular o estrésosmótico). Siendo clave para determinarla importancia de cada factor la velocidadde congelación (Fig.2).

FORMACIÓN DE HIELO INTRACELULAR

A partir de que se inicia la nucleaciónextracelular y la correspondientedeshidratación celular lo que suceda enel espacio intracelular dependebásicamente de la velocidad deenfriamiento (Mazur, 1963; Nei et al.,1970). Si ésta es demasiado rápida, lacélula puede no ser capaz dedeshidratarse suficientemente rápido yal llegar a la temperatura de nucleaciónintracelular, el agua remanente secongela formando hielo intracelular. Lamanera en la que este hielo daña a lacélula, no es del todo conocido, pero sepiensa que es debido a una disfunción deorigen mecánico de las propiedades dela membrana celular y de otrasestructuras celulares suspendidas en suinterior, como pueden ser orgánuloscelulares o grandes macromoléculas de

proteínas. Lo que si se sabe es quecuanto mayor sea la cantidad de hieloformado dentro de la célula, menor es laesperanza de que la célula sobreviva.

Podríamos pensar, llegados a este puntoque un buen protocolo decriopreservación sería aquel en el que lavelocidad de enfriamiento fuera tanlenta que apenas formásemos hielo,pues permitirá la salida de todo el aguaintracelular. Sin embargo existe otromecanismo que provoca daños celularesy que precisamente actúa cuando lasvelocidades de enfriamiento son muyreducidas, lo que hace inviable esteprotocolo que acabamos de proponer.

ESTRÉS OSMÓTICO

Este mecanismo, activo a bajasvelocidades de enfriamiento, estárelacionado con la deformaciónmecánica de la célula, debida a lareducción de tamaño originada por elproceso de deshidratación tan intenso,y a la prolongada exposición de la célulaa elevadas concentraciones deelectrolitos. Este mecanismo se conocecomo “Efecto de Solución” ( Mazur et al.,1970) Existen básicamente dos teoríascomplementarias para explicar elfenómeno de estrés osmótico durante lacriopreservación.

La primera (hipótesis de altasconcentraciones de iones) achaca a lasinteracciones de las altas concentracionesde iones alcanzadas en el medioextracelular con las proteínas demembrana, lo que provocaría la

desnaturalización de estas mediante laformación de puentes de disulfuro entreaminoácidos (Lovelock, 1953; Karow, 1965)

La segunda hipótesis (hipótesis delvolumen celular mínimo) relaciona elefecto de la deshidratación producidadurante la concentración de solutos y lamuerte celular con la vuelta a lascondiciones isotónicas después de lacongelación (choque osmótico)(Merryman, 1970). Se basa en que elvolumen se reduce en relación alaumento de la osmolaridad extracelular,a medida que la célula pierde volumenpor la pérdida de agua, la compresión delcontenido citoplasmático aumenta laresistencia de la célula a seguirperdiendo volumen, y al excederse laresistencia física de la membrana seproducirán lesiones irreversibles en supermeabilidad y pérdida de lípidos de lamembrana celular. Esta perdidaafectaría a la integridad de la membranaplasmática que perdería su capacidad deexpansión durante la rehidratación alvolver a condiciones isotónicas.

En resumen, a velocidades deenfriamiento lentas el daño celular seproduce por la elevada concentración desolutos en el medio extra celular y aelevadas velocidades de enfriamientopor la formación de hielo intracelular.Existe una velocidad de enfriamientopara cada célula en la cual estos dosdaños son bajos denominándose,velocidad optima de enfriamiento,alcanzándose un máximo en laprobabilidad de supervivencia de lascélulas a la criopreservación.

A pesar de que se ha comprobado lavalidez universal de la hipótesis de los Dos Factores en todas las células estudiadas, el protocolo decriopreservación que optimiza lasupervivencia no es universal, es decir,cada tipo de célula requiere su propioprotocolo optimizado, de acuerdo con suspropiedades biofísicas (Nijs et al., 2001).

RECRISTALIZACIÓN

El agua en estado líquido, al enfriarse vaformando cristales y como hemoscomentado esta formación no eshomogénea, existiendo al mismo tiempoen estado líquido y sólido. El agua enestado líquido se va haciendo cada vez

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Fig. 3: Relación entre el porcentaje de supervivencia y la velocidad de enfriamiento.




mas viscosa, hasta que alcanza los -132ºC, en donde es tan viscosa que no puedeconvertirse en cristal, llamándose a esafase estado vítreo.

Todos los materiales biológicos debenalmacenarse por debajo de la temperaturade transición de fase del agua de líquido aestado vítreo (aproximadamente-132ºC)para poner fin a toda actividad biológica.A temperaturas superiores a -132ºC sereduce la longevidad celular a cuestión desemanas o meses, pues aun puede existiragua líquida y por lo tanto actividadcelular.

La transición a estado vítreo de unasolución acuosa congelada no ocurrerepentinamente en -132ºC; sino que esun fenómeno progresivo entre estatemperatura y -90ºC. En una célulacongelada a -196ºC que pasa a -80ºC,algunas moléculas de agua vuelven aestado líquido que pueden convertirseen cristales que provocan pequeñosdaños de recristalización. El problema esque los pequeños daños sonacumulativos; y cada incidente decalentamiento que se produzca porencima de -132ºC (por Ej. El sacar uncanastier del nitrógeno líquido paraextraer otra pajuela) contribuirá adisminuir la supervivencia funcional delas células criopreservadas.

AGENTES CRIOPROTECTORES

Además de una adecuada velocidad deenfriamiento, para mejorar laviabilidad celular es necesario alterarel comportamiento físico-químico delas soluciones acuosas en las cualestiene lugar la criopreservación, paraello se añaden al medio de congelaciónlos agentes crioprotectores (CPA). LosCPA son sustancias muy hidrosolublesy de baja citotoxicidad que disminuyenel punto eutéctico de una solucióndeterminada (temperatura mínima a laque una solución se encuentra enestado líquido). El descenso del puntoeutéctico implica que se alcanzará unaconcentración dada de solutos a unatemperatura menor, de forma que en elmomento en el que se induce lanucleación en el espacio extracelular lacélula estará más hidratada y elgradiente osmótico al que estarásometida será menor en el momento enque el espacio extracelular se congela.

Los crioprotectores pueden clasificarseen agentes penetrantes y no penetrantes,de acuerdo a la permeabilidad a través dela membrana celular.

CPA PENETRANTES

Son sustancias de bajo peso molecular ypermeables a través de la membrana, queprotegen a la célula de las lesionesproducidas por las congelaciones avelocidad lenta. Los más utilizados son:1,2-Propanodiol (PROH), Dimetilsulfóxido(DMSO), Etilén-Glicol (EG), Glicerol.Todos estos compuestos tienen encomún que sus moléculas son pequeñas,es decir, tienen un peso molecularrelativamente bajo; así el glicerol tiene92.09 de peso molecular, lo que lepermite atravesar la membrana celular.Si bien la célula es permeable a estosagentes su permeabilidad nunca es de lamisma magnitud que la del agua. Dentrode este grupo el glicerol es el más usadoen la criopreservación espermática.

CPA NO PENETRANTES

Son sustancias de alto peso molecular,que son efectivas cuando se utilizanvelocidades altas de congelación. Eltamaño de estas moléculas es muysuperior a las del grupo anterior. Asípor ejemplo, el peso molecular de lasacarosa es 342. No son crioprotectorespropiamente dichos, ya que nopenetran en la célula sino que ejercensu acción crioprotectora promoviendola rápida deshidratación celular ysuelen usarse asociados a los agentespenetrantes. Los más utilizados son:Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil-pirrolidona (PVP), Dextrano yPolietilen-glicol (PEG), (en congelaciónde semen humano las más usados sonlos dos primeros).

Dependiendo de la permeabilidad delcrioprotector utilizado y de sucitotoxicidad, la adición se realiza adistintas temperaturas. Los agentescrioprotectores pueden añadirse yextraerse en pasos, es decir aumentandoo disminuyendo gradualmente laconcentración de crioprotector en elmedio, lo que reduce el stress osmóticosobre la célula a congelar; o bienañadirse (o extraerse) en un solo paso,lo que reduce el tiempo de exposicióncelular al crioprotector.

Existen dos formas diferentes deadicción o disminución gradual del CPAal medio. En la primera, la solución deCPA (en el caso de adición) o un mediode cultivo (en el caso de dilución) seañaden en distintos pasos pero con un“volumen fijo”. En la segunda, la adiciónde CPA o diluyente varían en volumenpara producir cambios equilibrados en lamolaridad del CPA. Esto ha sidodenominado como “fixed molar step”(Gao et al., 1995; Gilmore et al., 1997).

Aunque células pequeñas (comoespermatozoides) contienen muy pocaagua, su cantidad corresponde en granparte (45-75%) al volumenosmóticamente inactivo, y esto es lo quehace que se deshidrate muy poco encomparación con otras células. Losespermatozoides humanos se puedenhinchar sólo un 110% de su volumenisosmótico original mientras que puedendisminuir un 75% de su volumen yretener ≥90% de su motilidad original(Gao et al., 1995). Como vemos losespermatozoides toleran menos unfuerte hinchazón que un encogimiento,y es por eso que la eliminación del CPAtras la descongelación puede tener unefecto dramático sobre las tasas desupervivencia espermática.

Si la dilución del CPA se realiza en unsolo paso, se obtiene un incremento delvolumen espermático del 160 % y unapérdida de aproximadamente el 70% dela motilidad. Por el contrario, el máximoaumento del volumen de un célulautilizando una dilución “fixer molarstep” nunca supera el límite superior delvolumen celular y por consiguiente notienen ningún efecto adverso sobre lasupervivencia espermática. Además laadición de CPA también parece causarmenor daño cuando se realizagradualmente (Gilmore et al., 1997).Todo lo anterior obliga a cuidar almáximo el tiempo empleado en laadición de los medios de congelación alsemen y la dilución con medio de cultivotras descongelación, siendo necesarioinvertir varios minutos en ello segúncada protocolo.

BENEFICIOS DE LOS CPA

A pesar de que el uso de estas sustanciasen los protocolos de criopreservación esuna práctica habitual, los mecanismos

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de protección no son del todo conocidos.Los mecanismos que con certeza sesaben que actúan a favor de lasupervivencia celular son mecanismosfísicos:

-Dilución de los electrolitos: La altaconcentración de los electrolitos en lasúltimas etapas de la deshidratacióncelular, fue una de las hipótesis de losmecanismos causantes de la muertecelular. Los CPA protegen a la célula delos efectos de los solutos. Este objetivose logra porque las CPA diluyen la altaconcentración de electrolitos. Esteefecto es descrito por la “regla de fases”,que establece que en un sistema de dosfases, como agua líquida y hielo a en unapresión dada, la concentración total desoluto en la fase líquida es constante parauna determinada temperatura. Así, comoel agua se solidifica en hielo, la soluciónrestante contendrá progresivamentemayores concentraciones de CPA yelectrolitos. Como la concentración totalde CPA y electrolitos debe ser constante,mayor es la concentración de CPA ymenor es la concentración deelectrolitos. Así, la CPA efectivamentediluye la concentración de electrolitosen la solución limitando así su toxicidad.

-Disminución de la concentración deagua: El otro mecanismo que causabamuerte celular era la formación de hielointracelular. Al introducir en el mediomás moléculas (de crioprotector), loscristales de hielo en crecimiento tienenuna mayor dificultad para encontrarmoléculas de agua y seguir asícreciendo, reduciendo de esta manera elriesgo de muerte celular.

-Aumento de la viscosidad: Al añadirsustancias crioprotectoras al mediointracelular, la viscosidad de ésteaumenta. Esto reduce la movilidad de lasmoléculas en su seno, por lo que laformación de cristales de hielo se vemenguada, aumentando de esta manerala probabilidad de supervivencia.

-Efecto coligativo: Al añadir un soluto(CPA) a un disolvente (medio decongelación) el punto crioscópico de lasolución desciende, necesitándose unatemperatura más baja para el cambio defase. Por lo tanto, las célulasexperimentarían menos estrés salinoque si estuvieran bajo las mismas

condiciones sin CPA. Este efecto ‘saltbuffering’ podría impedir elestablecimiento crítico de altasconcentraciones de soluto en la fracciónresidual de congelación hasta que elsistema se enfría llegando atemperaturas muy bajas donde toda laactividad molecular es inhibida(Lovelock et al., 1954).

-Otros mecanismos de naturalezabioquímica, se sospecha que sontambién causantes de la elevada tasa desupervivencia que se alcanza al añadiragentes crioprotectores. Tan sólocomentaremos a modo de ejemplo queciertos agentes crioprotectores podríanestabilizar la membrana celularmediante interacciones electrostáticascon los fosfolípidos de ésta(Hammerstedt et al., 1990).

En resumen, los crioprotectores reducenla cantidad de hielo formado a unatemperatura determinada y por tanto laconcentración de soluto durante lacongelación y así la deshidratacióncelular. Esta reducción en ladeshidratación celular hará que la célulano llegue nunca al volumen celularmínimo durante el proceso decongelación.

ASPECTOS PERJUDICIALES DE LOS CPAS

A pesar de los bien conocidos efectosbeneficiosos de los agentescrioprotectores, éstos pueden ser muydañinos, especialmente cuando sonempleados en altas concentraciones. Losprincipales efectos dañinos son dos:

-Toxicidad: Los agentes crioprotectoresson sustancias químicas que encondiciones normales no se encuentranen el interior de las células. Por ello,cuando atraviesan la membrana celulary se difunden por el medio intracelular,lo que realmente estamos haciendo esenvenenar a la célula (Fuller et al. 2004).Sin embargo como el metabolismocelular está muy ralentizado, la accióntóxica de los crioprotectores se ve muydisminuida, salvo que empleemos muyaltas concentraciones a temperaturasrelativamente altas (en el entorno de los0ºC).

-Ósmosis: La adición de CPA ejerce per seun estrés osmótico sobre las células

porque aumentan la osmolaridad delmedio. Las células inicialmente sedeshidratan para compensar la fuerzaosmótica inducida por la presencia de losCPA y después se hidratan a la vez que elagua vuelve al interior celular junto conel CPA (permeable). Cuando el CPApermeable entra en la célula (lo hacemás lentamente que el agua, debido a unmayor coeficiente de permeabilidad dela membrana al agua que al CPA), lascélulas regresan a su volumen isotóniconormal. Tras la eliminación del CPApermeable por dilución de la muestratras la descongelación, el agua entra enlas células rápidamente, debido algradiente osmótico que se genera, yentonces el CPA sale de las células máslentamente; por lo tanto, las células sehinchan antes de alcanzar el equilibrio.Estos cambios en el volumen de la célula(contracción e hinchazón) pueden ser losuficientemente grandes como paracausar un daño celular irreversible. A lapresión osmótica a partir de la cual seproducen estos daños se le denomina “límite de tolerancia osmótica”. Estoslímites son únicos no sólo para cada tipode celular, sino también para cadaespecie celular.

-Cambios en la permeabilidad al agua dela membrana plasmática: diferentesCPAs reducen la permeabilidad al aguaen diversos grados, y así losespermatozoides se deshidratan máslentamente de lo esperado (Gilmore etal., 1995). El flujo de agua en lamembrana es realizado por dos vías, porcanales proteicos y a través de la bicapalipídica. Por lo tanto, un CPA podríaafectar la permeabilidad de la membrana en al menos tres maneras.Primero, el CPA podría modificar labicapa lipídica, causando un cambio ensu permeabilidad. Segundo, unamodificación de la bicapa lipídica podríaafectar indirectamente a la actividadtrasportadora de las proteínas demembrana. Tercera, el CPA podríainterferir directamente con la función delas proteínas transportadoras de agua (principalmente a los canalesespecíficos para el transporte de agua,o secundariamente a canales que sonpresumiblemente para transportaralguna otra molécula, como la glucosa,pero que además facilitan el trasporte deagua).

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OTROS COMPONENTES DE LOS MEDIOS DECRIOCONSERVACIÓN

AGENTES QUE INTERACTÚAN CON LAMEMBRANA PLASMÁTICA

El shock por frío esta probablementerelacionado con la transición de fase dela membrana lípidica, cuyos resultadosson separación de las fases y la pérdidade permeabilidad selectiva. Diferentessustancias han demostrado que puedencambiar la composición lipídica de lamembrana celular mejorando su fluidez.La adicción de lecitina (de aceite desoja) o yema de huevo (que contienefosfolípidos y lecitina) protege a lamembrana espermática del shock porfrío.

El mecanismo exacto por el cual estassustancias protegen a la célula del shockpor frío es desconocido. Parece que elresponsable del efecto de la yema dehuevo es una lipoproteína de bajadensidad (LDL). Esta LDL puede actuaruniéndose directamente a la membranay modificando su permeabilidad oactivando a enzimas de la membrana(adenilato ciclasa, bombas iónicas,..)que mejorarían el comportamientoosmótico de las célula y la respuesta acrioprotectores permeables como elglicerol.

Además, el posible efecto beneficiosode algún detergente durante lacongelación (SDS, etc.) se atribuye aque el detergente modifica laspartículas de la yema de huevo (LDL)solubilizando lípidos, lo que facilita lainteracción de éstos con la membranaplasmática.

Varios investigadores han proporcionadoevidencia directa de que la Albúmina,en el medio de congelación se adhiererápidamente a la membranaespermática en el momento de ladilución, modifica la composicioneslipídicas del espermatozoide medianteintercambio lípidico o hidrólisis,promueve la hidrólisis de las proteínasde membrana plasmática, causa laentrada de iones Ca2+ en el citoplasma,y disminuye el colesterol y la cantidadde fosfolípidos en la membranaplasmática del espermatozoide. Estadisminución del colesterol induce unamayor fluidez de membrana y por tanto

resistencia a la congelación. Otrassustancias con propiedades lipofílicasutilizadas para extraer colesterol demembranas, como el metil-beta-ciclodextrina (un derivado de unoligómero cíclico de la glucosa),también han demostrado mejorar lasupervivencia espermática a lacongelación.

QUELANTES (EDTA, CITRATO)

Durante la criopreservación, existe undescontrol de la concentración decalcio intracelular. Este esprobablemente el motivo para lainclusión del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y citrato en algunosdiluyentes de semen; estos atraparían calcio y disminuirían el gradiente de concentración en toda la membrana plasmática delespermatozoide. Las concentracionesde calcio 0,1 mM. intracelulares soncuatro veces menores a las delambiente exterior. El EDTA atrapa otrosiones metálicos y podría también actuarinhibiendo la peroxidación de lípidos.

AGENTES QUE EVITAN LA PEROXIDACIÓNLIPÍDICA

Una serie de estudios han implicado a la peroxidación de los lípidos demembrana como causa de la funcióndefectuosa del espermatozoide despuésde la criopreservación del semen(Salamon and Maxwell, 1995). Losintentos de superar la peroxidacióndurante la criopreservación de semenhan incluido la realización del procesobajo condiciones anaeróbicas, ademásde el uso antioxidantes y la inclusión deagentes quelantes. Confirmar la eficaciade estas estrategias ha sido algoproblemático. Butirato hidroxitolueno,Glutation y Ditiotreitol han sido descritos como agentes protectores de la peroxidación durantecriopreservación, con mejoras en lamotilidad postdescongelación y laintegridad acrosomal.

BUFFER

Además de la elección del crioprotectory varios posibles aditivos, los diluyentesde semen deben estar preparados en unmedio acuoso. Algunas formulacionescomúnmente utilizadas, especialmente

aquellas con alto contenido de azúcar,no contienen un buffer de pH por lo quecomponentes como yema de huevopuede afectar el pH la solución. Muchosmedios incluyen citrato de sodio, TRIS( t r i s f o s f a t o - ( h i d r o x i m e t i l ) -aminometano) o buffers zwitterionicoscomo TES (N-trisfosfato (hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulponico ácido).No se debe utilizar tampón fosfato salino(PBS) como buffer en la congelaciónespermática, pues sus elevadasconcentraciones de sodio, al alterarselas bombas Na-K durante el proceso decongelación, pueden sen perjudicialespara el espermatozoide alcanzandoniveles tóxicos intracelulares.

VITRIFICACIÓN

La Vitrificación es la solidificación de unasolución alcanzándose el estado vítreocomentado anteriormente, sin formaciónde cristales. En este estado el agua sesolidifica pero no se expande, esto sucedegracias a un rápido enfriamiento queconduce a un aumento extremo de laviscosidad sin formación de hielointracelular. Este proceso es alcanzado poraumento tanto de la tasa de enfriamientocomo de la concentración de la solucióncrioprotectora (Taylor et al., 2004).

De hecho aunque introdujéramosdirectamente una pajuela decongelación en nitrógeno líquido ydespués lo sumergiéramos en agua paracalentarlo las tasas de enfriamiento ycalentamiento serían del orden de>2500ºC/min., lo que podría formarcristales de hielo intracelulares, yprovocar daños en el espermatozoide.Para aumentar la velocidad decongelación se han utilizado otrosdispositivos diferentes a la pajuelaclásica que permiten un mayor contactoentre la suspensión celular y elnitrógeno líquido como rejillas demicroscopia electrónica, semipajuela,cryoloop, cryotop, cryotip y cryoleaf(Fuller et al., 2004). Las tasas deenfriamiento y calentamiento puedenaumentar hasta 30000 ºC/min y42000ºC/min respectivamente, y asíevitar con éxito la formación de hielointracelular. Para conseguir esta altatasa es necesario que el volumen dondeestán contenidos los espermatozoidessea muy pequeño (micras), lo que haceque el número de espermatozoides

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vitrificados sea muy escaso, no siendoesta técnica útil para congelaciones desemen destinados a inseminaciónartificial o FIV sólo para ICSI.

La mayoría de los protocolos devitrificación requieren una altaconcentración de crioprotectores a finde deshidratar rápidamente elespermatozoide y prevenir el hielointracelular. Por lo tanto, la toxicidad delos crioprotectores debe ser consideradapara el éxito de la congelación. Engeneral, crioprotectores rápidos ypermeables son preferibles porque larápida permeabilidad acorta el tiempode exposición, reduce la lesión tóxica yminimiza la hinchazón osmótica durantela eliminación de los crioprotectores. Envitrificación es muy importante durante el calentamiento eliminar elcrioprotector rápidamente. Si las célulasestán directamente expuestas a soluciónisotónica, existe un riesgo de hinchazónosmótica, porque el agua difunde másrápido al interior de la célula que ladifusión al exterior del crioprotectordesde el espermatozoide. La estrategiamás común para evitar este daño esdescongelar las células o de losembriones en una solución hipertónicaque contiene agentes no-permeablespara contrarrestar el exceso de flujo deagua. La sacarosa es utilizadousualmente para diluir las célulasvitrificadas después de ladescongelación, actuando como unafuerza osmótica que restringe lapermeabilidad del agua en las células, yasí evitar “ lesiones por hinchazón”.

Sin embargo, se ha visto que losespermatozoides son capaces derecuperarse con técnicas de vitrificaciónsin adicción de CPA, utilizando tasas muyaltas de enfriamiento que podríadepender en cierto grado de una altapermeabilidad innata de la membrana alagua (Isachenko et al., 2004) óutilizando como único crioprotector lasacarosa (Hossain et al., 2007) ó elglicerol (Schuster et al., 2003). Portanto, el papel de las técnicas devitrificación de espermatozoides estátodavía por aclarar.

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