GCQTOF. TECNOLOGIA SIN PRECEDENTES...La identificación de compuestos en muestras complejas a nivel...

Nueva herramienta de alta

resolución en GCMS para ampliar

su potencial en I+D o análisis de

muestras complejas

7200 GC-QTOF José Juan Rivero.

Especialista de Espectrometría de Masas [email protected]

AGILENT TECHNOLOGIES

901.11.68.90

GCQTOF. TECNOLOGIA SIN PRECEDENTES

La identificación de compuestos en muestras complejas a nivel de trazas

(ppb) es difícil y generalmente requieres estrategias analíticas no-rutinarias

o sistemas de configuración atípica y poco robustas como :

1- Potentes métodos de extracción/enriquecimiento

2- Sistemas GC de alto poder de separación (e.g.GCxGC)

3- Detectores selectivos y/o MS.

Sin embargo, para análisis a nivel rutinario de éste tipo de compuestos se

requieren enfoques con técnicas más simples, rápidas y robustas para

incrementar la productividad.

Desafortunadamente los sistemas GC/MS (SIM) o 1D GC en combinación

con detectores específicos como el PFPD o ECD no son a menudo

suficientes para conseguir la selectividad requerida.

El reto en GCMS : problemas analíticos complejos


• Recoge todos los iones Full Scan. Análisis retrospectivo

• Comparable en sensibilidad a un SIM.

• Además genera datos en masa exacta. Alta selectividad.

1ª Estrategia

Modo TOF

• PERO, ¿Qué pasa cuando la Resolución y la Δ Masa no son suficientes?

• GC-QTOF-MS/MS

• Altísima selectividad

2ª Estrategia

Modo Q-TOF

= +

¿Que es el 7200? 7200 GC/Q-TOF = 7890 + 7000 + 6500

MS Cuadrupolo /Tiempo de vuelo

MS Tiempo de Vuelo

MS Triple Cuadrupolo

7200 Analyzer: La fusión de dos plataformas Cuatro etapas de vacío

6500 LC/MS

Q-TOF

7000 GC/MS

QQQ

Nuevo . . . Pero totalmente probado Dual-stage ion mirror improves

second-order time focusing for

high mass resolution.

Hexapole collision cell accelerates

ion through the cell to enable faster

generation of high-quality MS/MS

spectra without cross-talk

Split-flow turbo differentially

pumps the ion source and

quadrupole analyzer compartments

4GHz ADC electronics enable a high

sampling rate (32 Gbit/s) which improves

the resolution, mass accuracy, and

sensitivity for low-abundance samples.

Dual gain amplifiers simultaneously

process detector signals through both low-

gain and high gain channels, extending the

dynamic range to 105.

Analog-to-digital (ADC) Detector:

Unlike time-to-digital (TDC) detectors

which record single ion events, ADC

detection records multiple ion events,

allowing very accurate mass

assignments over a wide mass range

and dynamic range of concentrations.

New Removable Ion Source

includes repeller, ion volume,

extraction lens and dual filaments

Proprietary INVAR flight tube

sealed in a vacuum-insulated

shell eliminates thermal mass

drift due to temperature changes

to maintain excellent mass

accuracy, 24/7. Added length

improves mass resolution.

Hot, quartz monolithic quadrupole

analyzer and collision cell identical

to the 7000 Quadrupole MS/MS

New Internal Reference Mass

can be delivered to the source at

a low and high concentration

Two 300L/s t urbos pump the

focusing optics and flight tube

Removable Ion Source (RIS)

Automated

Retractable

Transfer Line

RIS

Automated

Gate Valve

Cambio de fuente en 30 minutos con RIS

Nueva fuente limpia

Fuente sucia

1pg OFN

Ventearenfriar la fuenteabrir la cámara y cambiar/limpiar componentes

Cerrar la cámaraeliminar el airecalentar la fuente

dejar estabilizar temperatura y vacío

Sistema de detección con amplio rango dinámico ADC consigue una respuesta de mayor rango lineal que TDC

TDC cuenta digitalmente los iones

que llegan en una ventana de tiempo.

Con la llegada a alta velocidad de los

iones, varios iones que llegan al

mismo tiempo son contados como

uno solo.

Time-to-Digital Converter Analog-to-Digital Converter

ADC mide la amplitud de la señal

iónica analogica del detector. Con

la llegada a alta velocidad de los

iones, varios iones que llegan al

mismo tiempo son contados

individualmente y sumados.

TDC 1 ADC

2

32Gbit/sec

Amplio Rango Dinámico ADC es importante para la linealidad de las areas

TDC tiene un menor rango de

linealidad permitiendo sólo reducidos

rangos de cuantificación

Time-to-Digital Converter Analog-to-Digital Converter

ADC tiene un mayor rango de linealidad

permitiendo la cuantificación en rangos

de concentración más amplios

Ions

Response

Ions

Response

Conceptos en masa exacta

Diferencias claves con equipos de masa nominal

Zoom en un pico espectral de MS a 0.1 u de

resolución

La resolución a linea de base

entre m/z 614 y 615 no llega a

conseguirse

614.0

614.1 613.9

615.0

El mismo compuesto en un GCQTOF 7200 . . .

614.0

614.1

615.0

Resolución

En línea de Base

La alta resolución

beneficia para la

separación

cromatográfica

GC. . .

Y también

beneficia al

espectro de

masas . . .

Resolución y exactitud de masa

R = 614/0.68 = 903

Δmz = 0.1/614

= 160 ppm

Pw=0.68

Mz=614

SQ

TQ

IT

TOF

Q-TOF

R = 614/0.0423 = 14522

Δmz = 0.0004/613.96

= 0.7 ppm

Resolución : R=mz/FWHM

Exactitud de masa: Δmz=dm/mz*106, ppm

PFTBA masa 614

C12F24N=613.964203

1 Da.

1 Da.

Calculo de masa exacta y error en la medida

Error si se omite el electrón

NH

N

O OO

O

OO

O O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H

HH

Reserpina (C33H40N2O9)

Atom Masa del Atomo Nº de Atomos Suma

Hidrogeno 1.00783 40 40.31300

Carbono 12.00000 33 396.00000

Nitrogeno 14.00307 2 28.00615

Oxigeno 15.99492 9 143.95424

Total 608.27338

Mas H+ 1.00783 1 1.00783

Total 609.28121

Menos e- 0.00055 1 0.00055

609.28066

Calculada = exacta o teórica

(Medida -Calculada) X 1,000,000

Calculada

0.9027039 ppm

= ppm

Internal Reference Mass (IRM)

• El objetivo de exactitud de masa para el 7200 es de

~2-5ppm en cualquier condición

• Agilent ha desarrollado un sistema propio Internal

Reference Mass (IRM) que proporciona al sistema

corrección del eje de masas “en el aire”.

• El sistema IRM utiliza compuestos conocidos del background

para bloquear el eje de masas en cada espectro

• Requiere un sistema robusto de señal de calibración IRM en

muestras con y sin matriz

calc mass obs mass ppm Error obs mass ppm Error

2-formyl thiophen 111.9977 111.9967 -8.9 111.9973 -3.6

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0078 -6.3 127.0085 -0.8

2-formyl thiophen 111.9977 111.9972 -4.5 111.9972 -4.5

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0084 -1.6 127.0085 -0.8

2-formyl thiophen 111.9977 111.9978 0.9 111.9974 -2.7

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0091 3.9 127.0085 -0.8

2-formyl thiophen 111.9977 111.9966 -9.8 111.9974 -2.7

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0076 -7.9 127.0087 0.8

2-formyl thiophen 111.9977 111.9968 -8.0 111.9974 -2.7

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0080 -4.7 127.0086 0.0

2-formyl thiophen 111.9977 111.9969 -7.1 111.9976 -0.9

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0079 -5.5 127.0088 1.6

2-formyl thiophen 111.9977 111.9966 -9.8 111.9977 0.0

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0080 -4.7 127.0088 1.6

2-formyl thiophen 111.9977 111.9970 -6.3 111.9975 -1.8

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0084 -1.6 127.0088 1.6

2-formyl thiophen 111.9977 111.9973 -3.6 111.9980 2.7

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0083 -2.4 127.0084 -1.6

2-formyl thiophen 111.9977 111.9980 2.7 111.9979 1.8

2-acetyl-thiazole 127.0086 127.0086 0.0 127.0084 -1.6

Average ABS Error 5.0 1.7

Standard Deviation of Error 4.0 2.0

Excellent: < 5 ppm Excellent: < 5 ppm

Good: < 10 ppm Good: < 10 ppm

2 pg on col DG

5 pg on col DG

10 pg on col DG

1000 pg on col DG

20 pg on col DG

50 pg on col DG

100 pg on col DG

200 pg on col DG

500 pg on col DG

uncorrected IRM corrected

1 pg on col DG

Ejemplo de correciónn con IRM Exactitud de masa para 2-formyl thiophene y 2-acetyl thiazole en Whisky

Error promedio < 2 ppm sobre un rango de concentraciones > X1000

Varias fórmulas posibles con MSD SQ, TQ or IT Pero sólo unas pocas con QTOF

1

10

100

1000

10000

0.1 1 10 100 1000

# P

oss

ible

Ch

emic

al F

orm

ula

s

mass uncertainty, ppm

Possible Number of Chemical Formulas at m/z 272

Formulas made of:

C,H,N,O,F, & Cl

mass uncertainty

ppm amu # of Possible

Formulas 1000 0.3 7657

368 0.1 4050 100 0.03 1223

37 0.01 466 10 0.003 120

4 0.001 43 1 0.0003 11

0.4 0.0001 5 0.1 0.00003 2

Octafluoronaphthalene (CAS

313-72-4)

C10F8 = 271.98667

La masa exacta reduce el riesgo de confundir compuestos de masa similiar

¿TOF a qué velocidad?

TOF mide siempre el rango de masas completo

Q-TOF muestra siempre el espectro total de fragmentación

• Velocidad Spectral :

• Máximo típico : 25-50 spectra/sec (Hz) en disco

• La velocidad utilizable depende también de la cantidad

de señal.

• Nuevas oportunidades en analisis GC/MS:

• “Fast GC” y “Ultra high resolution GC”: ~ 20-40Hz

La velocidad mejora la deconvolución

Time

La deconvolucion requiere diferencias en tiempo

Mayor velocidad = mejor deconvolución

La baja velocidad no

permite diferenciar los

dos máximos

La alta velocidad

discierne entre ambas

sustancias

Time Time

La deconvolucion requiere diferencias en tiempo

Mayor velocidad = mejor deconvolución

La baja velocidad no

permite diferenciar los

dos máximos

La alta velocidad

discierne entre ambas

sustancias

Time Time

El Q-TOF 7200 en modo TOF

permite:

•Altas velocidades de adq.

•Mantener una excelente S/N

•Nuevo algoritmo de Deconvolución

MassHunter


• Recoge todos los iones Full Scan. Análisis retrospectivo

• Comparable en sensibilidad a un SIM.

• Además genera datos en masa exacta. Alta selectividad.

1ª Estrategia

Modo TOF

• PERO, ¿Qué pasa cuando la Resolución y la Δ Masa no son suficientes?

• GC-QTOF-MS/MS

• Altísima selectividad

2ª Estrategia

Modo Q-TOF

¿Porqué Q-TOF?

En ocasiones la potencia combinada de

Resolución cromatográfica GC (Agilent)

+

La resolución espectral MS (Agilent)

No es suficiente debido a:

Escasa ΔMass Defect (Naturaleza)

+

Intensidad de iones en la Matriz (Muestra)

La alta resolución en MS/MS puede solucionar

algunos de éstos problemas

• ¿Puede medirse masa exacta en

matrices reales?

• ¿Cuales son las limitaciones?

La intensidad puede afectar los resultados

Dos picos espectrales con

anchura FWHM de 0.7 u y una

diferencia de masa de 0.5 u

Dos picos espectrales con

anchura FWHM de 0.05 u y una

diferencia de masa de 0.5 u

m/z m/z

GC o MS: La intensidad relativa puede afectar los resultados

La presencia de un pico interferente en la matriz de masa

muy similar puede afectar el cálculo de la masa exacta

Visión Profile del pico espectral

Centroide

m/z m/z

Interferencia = Analito Interferencia = 100 X Analito

Centroide

240.1218

240.0785

Flurenol methyl ester

m/z = 240.0781

Error de masa = 1.7 ppm

Dimetilan

m/z = 240.1217

Error de masa = 0.4 ppm

Resolución ~13.500

¿Cuanta Resolución y “Mass defect” son

suficientes para coeluidos? Ratio de Intensidades = 1:1

SIN corrección IRM

Dm = 0.043 Da.

240.1184

240.0780

Flurenol methyl ester

m/z = 240.0781

Error de masa = -0.4 ppm

Dimetilan

m/z = 240.1217

Error de masa = -13.7 ppm

Una resolución de 13.500 NO

es suficiente en éstos casos.

Para masas MUY parecidas y

ratios MUY diferentes se

requiere MS/MS o mejor

separación

¿Cuanta Resolución y “Mass defect” son

suficientes para coeluidos? Ratio de Intensidades = 50:1


2a Estrategia :

El modo QTOF-MS puede :

Reducir el ruido al seleccionar y filtrar un Precursor, suministrando

así mayor selectividad.

Confirmar la identidad de un compuesto a través de su espectro

MS/MS de Alta Resolución.

Elucidación Estructural.

MS/MS Reducción de ruido químico Cuando R y Exactitud no son suficientes (1pg OFN in PFTBA Background)

MS

m/z 272

54:1 S/N

MS/MS

272:222

216:1 S/N

Iones del

Analito

Iones de Matriz Iones del Analito con

pocos iones de matriz

Elucidación estructural por MS/MS.

C16H14O4 (Anillos + Enlaces Dobles = 10)

(M – H)+

269.0802

Estructuras

candidatas m/z

(experimental)

Fórmula Error

(ppm)

Score

269.0802 C16H13O4 2.2 80.7

193.0494 C10H9O4 0.6 96.7

167.0334 C8H7O4 3.0 N/A

166.0259 C8H6O4 0.6 N/A

138.0310 C7H6O3 1.1 98.1

110.0359 C6H6O2 3.0 N/A

95.0127 C5H3O2 0.9 99.5

– CH2=CH–C6H5

– CO

– CH3

– CO

– H

– C6H5

– CH=CH–C6H5

Formula Calculator: fórmulas consistentes con

la masa exacta y fórmula del Ión padre

C5H12O2PS3 m/z = 230.9732

Herramientas MassHunter para GC/Q-TOF

Cromatogramas de los compuestos

encontrados por deconvolución

Espectro del compuesto

encontrado con la herramienta

Caliper para el calculo de difrencias

entre dos fragmentos

Fórmulas calculadas de la

mólecula y sus fragmentos a través

de la masa exacta

1. Bloqueo del eje de masas por Referencia Interna para

exactitud sub 5ppm incluso en muestras con alta carga

de matriz

2. Fuente extraíble RIS para una limpieza, cambio de

filamentos o intercambio de fuentes EI/CI rápida y sin

romper vacío.

3. Q-TOF MS/MS:

• Reducción del ruido químico

• Selectividad

• Information estructural

• Desarrollo de métodos

4. Herramientas de software – Formula calculator / MSC (MS/MS Structural Correlation Tool)

Características Clave en el 7200

• El mundo cambia continuamente y desafortunadamente surgen

problemas nuevos y más complejos.

• Los nuevos retos requieren en ocasiones nuevas

herramientas/soluciones.

• El GC Q-TOF ofrece la capacidad de solucionar problemas con

nuevas estrategias.

Resumen – Qué recordar

• La Alta Resolución (HR), Mejor Exactitud de

masa (MA) y Alta Velocidad de barrido mejora

los resultados analíticos.

• Los espectros MS/MS con HR y MA hacen

posible la Elucidación Estructural

• Agilent ofrece el portfolio más amplio en

herramientas GC/MS :

SQ, IT, TQ, & Q-TOF

Jose Juan Rivero Especialista de Espectrometría de Masas

[email protected]

AGILENT TECHNOLOGIES

901.11.68.90

MUCHAS GRACIAS

por su atención

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