Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos
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Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los
Protozoarios Parásitos
Nutrición
• Dependencia metabólica del hospedero• Capacidad biosintética limitada• Conocimiento derivado de cultivos y en pocas
especies• Single omission tests: difícil sacar conclusiones• Sustancias nutritivas universales: HC, aa,
vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas
Nutrición - Mecanismos
• Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas
• Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad
• Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración
• Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis
Glúcidos
• Transporte mediado en membranas celulares• T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b)
fructosa y glucosamina• T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de
glicerol• E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso
limitante• Plasmodium: modulación de la membrana de la
célula huésped (eritrocito) con poros.
Caso: Metabolismo de Galactosa en Trypanosoma brucei.
• El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei.
• Gal está presente en cantidades importantes en las VSG
• Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).
Glicoconjugados de superficie en Trypanosoma brucei
Mutante condicional null para galE• Bajo condiciones no permisivas
que induce la deprivación de Gal.
• Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE
• Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar.
Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.
Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos
(A)Growth of galE-cKO with and without Tet
(B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO without Tet
(C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells.
• Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.
Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG
El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina
Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG
El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol
Aminoácidos
• Translocación – mediada en su gran mayoría• Endocitosis de proteínas.• T. brucei: 4 sitios operativos• T. cruzi: Arg altamente específico, con 3
sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala
• Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma
Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii
• En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato
• T. gondii carece del gen de la CPSI• Deprivación de Arg bloquea
multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.
Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos
Verde: proteína expresada por taquizoítos
Rojo: proteína expresada por bradizoítos
Azul: núcleos teñidos con DAPI
A: 48hs medio normal
B: 48hs medio sin Arg
C: 7 d sin Arg
D: 14 d sin Arg
E: Contraste de fase de D
F: Cepa PLK 4 d sin Arg
Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium
Hemoglobina· 95% de las proteínas totales de GR· Abundante (>300 mg/ml o approx 5
mM)· 60-80% es degradada durante el
estadio eritrocitario · 110 g (en un total de 750) se
consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%
Trofozoíto en GR
Merozoíto entrando un GR
Endocitosis del citoplasma eritrocitario
food vacuole
cytostome
pinocytosis (rings)
Vacuola DigestivaUn lisosoma especializado
ATP
ADP
H+
(pH 5-5.4)
Proteasas de la vacuola• plasmepsinas I & II
(aspártico)• falcipainas I - III (tiol)• falcilysinas (metallo)
digestion de hemoglobina
citoplasmaparasitario
Camino endocítico
El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb
• Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α)– ‘región bisagra’– conservada– Importante para estabilizar el
tetrámero• Se forman fragmentos
grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior – Se libera Heme
a-F33/L34í
La digestión de la Hb es un proceso ordenado
• Exopeptidasa?• Amino acidos libres?
hemoglobina
+ hemefragmentos deglobina grandes
Fragmentos chicos (6-8 aa)
plasmepsina
falcipainaplasmepsinafragmentos medios
(20 aa) falcilysina
La vacuola Digestiva de PlasmodiumUn lisosoma especializado
hemoglobin
+heme globinfragments
small fragments(6-8 amino acids)
ATP
ADP
ATP
ADP
H+ plasmepsin
falcipain
plasmepsin
falcilysin
Pfmdr-1?
aminoacids
amino-peptidase
proteins
• Desestabiliza y lisa membranas • Las hidrolasas se liberan en el
citoplasma del parásito • El parásito muere
El Heme libre es tóxico
Posible Mecanismos de Detoxificación• heme hemozoína (pigmento malárico)• Degradación mediada por H2O2 o GSH• heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)
Hemozoína = b-Hematina
heme b-hematina
b-hematina forma cristales insolubles
'biocristalizacion' or 'biomineralización'
La vacuola digestiva Un lisosoma especializado
hemoglobin
+heme globinfragments
small fragments(6-8 amino acids)
hemozoinATP
ADP
ATP
ADP
H+
Fe3+
Fe2+O2
-O2 O2
?
plasmepsin
falcipain
plasmepsin
falcilysin
Pfmdr-1?
aminoacids
amino-peptidase· Fe se oxida después
de liberarse de la Hb· La oxidación
promueve la formation of ROI
· Estrés oxidativo
Nucleótidos
• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo
• Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos
• En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina
• Locus para transporte de nucleósidos• Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie• Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina
Transportadores de purinas en Plasmodium
Vías de salvataje de purinas en parásitos
Lípidos
• Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados• Apicomplexa: transporte a través de vacuola
parasitófora• Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado
en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria
• Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto
Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii
METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS
Generalidades Objetivos del metabolismo energético
• a) Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía
• b) Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas
Esquema de Metabolismo Energético
KINETOPLASTIDOS• Trypanosoma brucei como modelo:• a) Depende únicamente de glicólisis para
producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol
• b) Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes
• c) Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma
• d) Flujo glicolítico es relativamente alto• e) Enzimas glicosómicas no glicolíticas
deprimidas
Glicólisis
• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200.
• Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria
• Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa.
• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.
• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP
Glicólisis y glicosomas
•
Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de T. brucei
Amebas Intestinales y Giardia
• Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol
• Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa
• Sin citocromos• Almacenan glucógeno• Toleran bajas concentraciones de oxígeno
Glucolisis
Glucolisis anaerobia
Mitosomas
- Descrito en E. histolytica, G. lamblia- El origen mitocondrial del mitosoma está
apoyado por:- i) Doble membrana- ii) localización de proteínas de la
maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina)
- iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales
Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica
Trichomonas
• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O
• La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones
• La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones
Hidrogenosomas
• Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular
• 1 um, doble membrana• Comparten ancestro con
mitocondrias• Tricomonas, ciliados
anaerobios, hongos
MalatePyruvateME
NAD(P)+NAD(P)H
2Fd-2Fd
PFOAcetyl-CoA Acetate
ASCT
Succinyl-CoASuccinate
ADP + PiATP
AAC
STK
[Fe]HydNAD(P)-FO
2H+
H2
Double membrane
hsp70
cpn60
Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)
CO2
CO2
ADPATP
Transitpeptides
Protein import
N
Enzyme found also in mitochondriaAlpha-proteobacterial ancestryUnknown ancestry
CoASH
Fungi and Trichomonas
Generación de ATP en Hidrogenosomas
Acidocalsomas
Organelos ácidosAlmacenan calcioEn varios microorganismosPrimero definidos en
tripanosomátidosAlta densidad electrónicaAlta concentración de
fosfatos, Ca++., Mg++
Apicoplastos
-Organelo cloroplasto-símil- Vias biosintéticas de origen
cianobacteriano-Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote-En Apicomplexa-Semiautónomos, genoma propio reducido