GK-07
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GK-07
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CalorMicroondasUV radiaciónAgitación fuerteDetergentesMetales pesadosSolvente orgánicos Ácidos y bases fuertesSales > Temperatura
> pH
> detergente
> sustancias solubles en agua
efecto de
DENATURACION de PROTEINAS
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Preparación de proteínas
factor atención durante la preparación
temperatura evitar alta temperatura, dejar en HIELO
congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado
denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas
efecto de diluciónoxidaciónmetales pesadoscrecimiento de bacterias
proteasas
mantener conc. > 1mg/mlincluir 0,1 – 1mM DTT en el tamponincluir 1 – 10mM EDTA en el tamponutilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelarincluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO
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PURIFICACION DE PROTEINAS
- necesario para revelar su estructura- desarrollo de inhibidores- desarrollo de vacunas- aislar proteínas recombinantes para vacunas-- etc...
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Vacuna de proteína recombinanteVacas clonadas y geneticamente
modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia)
Taste receptors
Diseño de drogas
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Estrategia de purificación de proteínas
- selección del tejido- homogenización- clarificación – precipitación- solubilización y PURIFICACIÓN
- captura- purificación mediana pureza- purificación, ultra pureza
necesario test para monitorearej. detección inmunológica o test funcional
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John Kendrew, mioglobina, Max Perutz, hemoglobina
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Cachalote (Physeter catodon)
17,8 kDa
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Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,
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Localización de los átomos
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Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.
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Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)
FUNCION
Para obtener cristales proteína pura
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Proteína, Purificación
-Fraccionamiento celular-Centrifugación-Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH -Cromatografía exclusión por tamaño -Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina
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Fraccionamiento celular
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TIPOS DE CENTRÍFUGAS
SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA
DE BAJA VELOCIDAD MICRÓFUGA
DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA
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TIPOS DE ROTORES
ROTORES FLOTANTES
ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES
ROTOR VERTICAL
centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga
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ROTORES FLOTANTES
DESPUÉS
PELLET
SOBRENADANTE
ANTES
HOMOGENEIZADO
CENTRIFUGACIÓN
En gradiente de densidad:
Centrifugación diferencial:
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Fraccionamiento celular
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Fraccionamiento celular
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Fraccionamiento celular
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Fraccionamiento celular
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CROMATOGRAFIA
-por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-)
-por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel
- por especificidad: afinidad entre proteína-proteínaej. anticuerpo
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
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proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa
las proteínas con carga negativa pasan de largo
Ej. intercambiadorcationico
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Cromatografía de Intercambio Ionico
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CM-agarosa CARGA NEGATIVAcarboximetil-agarosa
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DEAE-columna CARGA POSITIVADietilaminoetil
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Intercambio iónico
- intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-)
proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna
-intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+)proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna
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CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
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Cromatografía de filtración en gel
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Cromatografía de filtración en gel
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DIALISIS
Separación por tamañoeliminación de sal
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bolsa de diálisis
solución concentrada
tampón
al principio de la diálisis en equilibrio
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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
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Cromatografía de Afinidad
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Proteína retenido por interacción con ligando
Elusión por adición de exceso de ligando
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Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación
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ELECTROFORESISelectro-foresis; del griego, estar llevado
Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno
Las proteínas se separan por- carga eléctrica- tamaño y forma
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SS
A1
A2
el -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox
( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro)
-mercaptoetanol
SH
HS
A1 A2
+
El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol
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Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH
a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada
negativamente
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SH
El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el
desplegamiento de las mismasSDS
–– –– –––– –– ––––
– – – –––– –
La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va
a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)
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Fuente de poder
electrodo de platinum
reservorio de tampón superior e inferior
única conexión eléctrica vía el gel
Elec
trodo
de
plat
inum
+
CÁTODO
ÁNODO
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![Page 53: GK-07](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062814/56816866550346895ddec702/html5/thumbnails/53.jpg)
SDS-PAGEcondiciones denaturantesfraccionamiento por tamañocomparación con estándar de tamaño molecular
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Proteína purificada
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Determinación de la secuencia de proteínas
ESTRUCTURA PRIMARIA
- composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC
- determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres
- secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente
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![Page 58: GK-07](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062814/56816866550346895ddec702/html5/thumbnails/58.jpg)
Pero: proteínas > 100 aa
Proteínas
- fragmentar
- secuenciar péptidos
- ordenar secuencia
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Tratamiento Punto de ruptura
tripsina
quimotripsina
proteasa V8
bromuro de cianogeno (CNBr)
Lys, Arg
Phe, Trp, Tyr
Asp, Glu
Met
- C – C – N – C – C – N – C – C – N -
O
O
O
H
H
HR1
R2
R3
cortan el enlace peptídico
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tratamiento
Ej.
péptidos secuenciados
Tyr-LysGlu-Met-Leu-Gly-ArgPro-Met-ArgMet-Gly-Cys-Lys
Leu-Gly-Arg-MetTyr-Lys-Glu-MetGly-Cys-Lys-Pro-Met+ amino acido básico
Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg
hidrólisis con tripsina
hidrólisis con CNBr
fragmentos con tripsina
fragmentos con CNBr
SECUENCIA deducida:
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