QUÍMICA BIOLÓGICA PARA FARMACIA Y MEDIO AMBIENTECURSO 2008

Trabajo Práctico

Geles de poliacrilamida

La separación de proteínas utilizando geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) consiste en la separación de las mismas por su peso molecular.Aquí, se emplea el agregado de SDS el cual otorga a todas las proteínas una carga neta negativa homogeneizando así la relación carga/masa molecular. Esto hace que la migración de las proteínas hacia el ánodo, en presencia de un campo eléctrico, sea solo dependiente del peso molecular de cada una de ellas. En este caso también se agregará un agente reductor para romper los enlaces disulfuro formados por los restos de las cisteínas.

Armado de los geles

1. Armar los soportes de los geles en el armador. Usar separadores de 1,5 mm de espesor. Verificar que estos no pierdan, llenando el espacio entre vidrios con agua bidestilada.

2. En un vaso de precipitado adicionar

Nota: antes de adicionar el TEMED y el APS, mezclar bien, evitando la formación de burbujas ya que, el oxígeno inhibe la polimerización. Tener en cuenta que a partir del momento en el cual agreguemos estos dos reactivos,comenzará el proceso de polimerización.

4. Depositar 1 ml de agua bidestilada y dejar polimerizar.

5. Adicionar el peine para darle forma a las fosas.

Gel de separación 12,5% 1 gelAcrilamida:Bis acrilamida 30:0,8 2,08 mlBuffer Tris 1.5M, pH=8,8 (con HCl) 1,87 mlAgua bidestilada 964 μlSDS 10% 50 μlTEMED 2,5 μlPersulfato de Amonio (APS) 10% 25 μl

Gel de concentración 1 gelAcrilamida:Bis acrilamida 30:0,8 162,5 μlBuffer Tris 1.5M, pH=8,8 (con HCl) 156,2 μlAgua bidestilada 938 μlSDS 10% 12,5 μlTEMED 6,25 μlPersulfato de Amonio (APS) 10% 1,25 μl

Preparación de la muestra

Calcular el volumen de la muestra correspondiente a una masa de proteínas de por lo menos 30 μg y mezclar con el volumen necesario de buffer Laemmli x4 (buffer de siembra). Hervir la mezcla en baño de agua durante 5 minuntos y sonicar durante 15 minutos. Por último, centrifugar 3 minutos a 20000 g y sembrar.

Buffer de siembra, Laemmli x4 (Volumen final:10 ml)Tris HCl 1M pH 6.8 2 mlSDS 0,8 gGlicerol 2 mlEDTA Na 0,1 M 0,4 mlH20 2,6 ml

Agregar una punta de ansa de Azul de Bromofenol

Electroforesis

Colocar el gel en el soporte que posee los electrodos. Cargar la cuba con buffer de electroforesis e introducir el soporte con el gel. Sembrar la muestra en las fosas.La electroforesis se llevará a cabo a voltage constante de 100V hasta que el frente de corrida alcance la parte inferior del gel.

Buffer de electroforesis pH 8,3 ( Volumen final : 1L )Tris 6 g Glicina 28,8 gSDS 1gl

Tinción de las proteínas con Coomassie Blue R

Una vez finalizada la corrida, retirar el gel y depositarlo en una solución de CoomassieBlueR-250 (preparado en metanol-acético-agua)Dejar por lo menos 1 hora en agitación suave y decolorar con una solución agua-metanol-acético en proporción 50:40:10, hasta observar la aparición de bandas.