Hidrolizados de proteína

Acta Bioquím Clín Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

Química Biológica Actualización

Hidrolizados de proteína: procesos y aplicacionesProtein hydrolysates: processes and applications

Ricardo Benítez1*, Albert Ibarz2**, Jordi Pagan2**

1. Magíster en Ciencias Químicas.2. Doctor en Ciencias Químicas

* Grupo de Química de Productos Naturales,Departamento de Química, Universidad delCauca, Popayán – Colombia.

** Departamento de Tecnología de alimentosUTPV-CeRTA, Universidad de Lleida, Av.Rovira Roure, 191, 25198 Lleida – España

Resumen

En la hidrólisis enzimática de proteínas hasta péptidos o aminoácidos, poracción de enzimas proteolíticas, la composición final y, por tanto, el uso delos hidrolizados dependerá principalmente de la fuente proteica, del tipo deproteasa usada, de las condiciones de hidrólisis y del grado de hidrólisis al-canzado en la reacción. Los hidrolizados se utilizan ampliamente en la tec-nología alimentaria por sus propiedades nutricionales o funcionales (solu-bilidad, poder emulsificante, capacidad espumante). En este trabajo semuestra la tendencia actual en las técnicas empleadas para la obtenciónde hidrolizados mediante enzimas y los diferentes métodos usados para elcontrol de estos preparados; se indican además sus posibles aplicaciones.

Palabras clave: hidrólisis enzimática * proteínas * proteasas * caracteriza-ción * grado de hidrólisis

Summary

In the enzymatic hydrolysis of proteins up to peptides or amino acids, bythe action of proteolytic enzymes, the final composition and therefore theuse of the hydrolizates will depend on the protein source, on the type ofprotease used, on the hydrolysis conditions and on the hydrolysis gradereached in the reaction. Hydrolizates are used widely in food technologydue to their nutritional or functional properties (solubility, emulsifientpower, foaming capacity). This work shows the present trend in the skillsused to obtain hydrolizates by means of enzymes as well as the differentmethods used for the control of these preparations; besides theirs likelyapplications are also indicated.

Keywords: enzymatic hydrolysis * proteins * proteases * characterization *degree of hydrolysis

Acta Bioquímica Clínica LatinoamericanaIncorporada al Chemical Abstract Service. Código bibliográfico: ABCLDL.ISSN 0325-2957ISSN 1851-6114 en línea

Introducción

En los hidrolizados de proteína se potencian diver-sas características funcionales, tales como viscosidadbaja, mayor capacidad de agitación, dispersión y altasolubilidad, que les conceden ventajas para el uso enmuchos productos alimenticios, respecto a las proteí-nas originales (1-5).

Una de las aplicaciones más importantes de loshidrolizados de proteínas es su utilización como fuen-te de nitrógeno en la formulación de dietas enteralescon destino a la alimentación infantil y/o de adultosenfermos. Estas dietas entéricas se diseñan para serabsorbidas en el intestino sin una digestión previa enel estómago y son esenciales en el tratamiento depacientes con desórdenes estomacales o problemas dela mucosa intestinal, así como en lactantes con sindro-mes de malabsorción-malnutrición, con cuadros aler-génicos en la mayoría de los casos (6).

Las características que deben cumplir estos hidro-lizados de proteínas para formar parte de una dietaenteral son: no producir desequilibrios osmóticos nialergias, presentar un alto valor nutritivo, no muyinferior al de la proteína de partida y tener un saboraceptable.

El grado de hidrólisis es la propiedad fundamentalde un hidrolizado y va a determinar en gran medidalas restantes características del mismo y por tanto suposible uso. Se define como el porcentaje de enlacespeptídicos rotos en relación a la proteína original. Elgrado de hidrólisis final está determinado por las con-diciones utilizadas, siendo éstas, la concentración desustrato, la relación enzima/sustrato, el tiempo deincubación y las condiciones fisicoquímicas tales comoel pH y la temperatura. Otro factor que también va adeterminar el grado de hidrólisis es la naturaleza de laenzima, caracterizada por su actividad específica y tipode actividad. Así, la naturaleza de la enzima usada nosólo va a influir en el grado de hidrólisis, sino tambiénen el tipo de péptidos producidos.

Los hidrolizados que se producen para su uso enalimentación se pueden agrupar en: hidrolizados conbajo grado de hidrólisis, entre el 1% y el 10%, para lamejora de las propiedades funcionales; hidrolizadoscon grados de hidrólisis variable para su uso comosaborizantes y por último, hidrolizados extensivos, congrado de hidrólisis superior al 10%, para su uso en ali-mentación especializada.

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS

La hidrólisis proteica se realiza normalmente en unreactor, con control de agitación, pH, temperatura ytiempo del proceso. El sustrato se disuelve o resuspen-de en agua hasta que el pH y la temperatura se estabi-

lizan; a continuación se agrega la proteasa dando inicioa la hidrólisis. A medida que ésta progresa se produceuna disminución del pH debido a la rotura de los enla-ces peptídicos. En los casos de hidrólisis enzimática elpH debe ser mantenido en el óptimo de la enzimamediante la adición de base diluida. Para finalizar lahidrólisis proteica la enzima puede ser inactivada concalor, mediante una disminución del pH o con unacombinación de ambos. O también puede ser retiradadel medio mediante filtración y la proteína finalmenteprecipitada.

SUSTRATOS

El material de partida utilizado para la obtenciónde los hidrolizados proteicos puede ser de origen ani-mal, vegetal o bacteriano.

Entre los vegetales, los más usados son las proteínasde soja, trigo y arroz, principalmente en países desa-rrollados. De los sustratos de origen animal se empleael pescado, principalmente en países orientales, comoJapón o Corea. También se han aprovechado las pro-teínas de residuos cárnicos como tendones o huesos yde microorganismos, como algas.

Para la elección de una fuente proteínica adecuadadebe tenerse en cuenta el uso que vaya a tener el hidro-lizado, así como el valor agregado del producto finalcon respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para laobtención de hidrolizados con propiedades gelificantesy emulsificantes se suelen emplear colágeno y gelatinapor su capacidad para formar geles transparentes (7).También se ha extendido el uso para este fin de prote-ínas de huevo, de carne, de sangre, de vísceras e inclu-so de cereales. Como fuente de fermentación para elcrecimiento de microorganismos, se emplean loshidrolizados de levaduras o caseína: éstas también sonlas fuentes cuando los hidrolizados se usan en cosméti-ca. Cuando la finalidad del hidrolizado es su uso comofuente de nitrógeno, se usan proteínas de pescado yproteínas microbianas en alimentación animal, y pro-teínas de soja y lácteas en alimentación humana, sien-do estas últimas, especialmente las proteínas del lacto-suero, la materia prima ideal para la preparación dealimentos infantiles y dietas enterales (2)(8-12).

Ya en la reacción propiamente dicha, la secuenciade aminoácidos y la estructura tridimensional de la pro-teína afectan su sensibilidad hacia el ataque proteolíti-co y el tipo de péptidos formados durante la hidrólisis.Las caseínas son proteínas algo más flexibles y son ade-más, fácilmente hidrolizadas. Las proteínas del sueropor el contrario, son proteínas globulares, difíciles deacceder para las enzimas proteolíticas. Esta digestibili-dad puede ser mejorada por una desnaturalización porcalentamiento previo. Otra diferencia importanteentre proteínas es su estructura primaria. En proteínasde suero los aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos


228 Benítez R et al.

están aleatoriamente distribuidos sobre la proteína,mientras las caseínas contienen dominios hidrofílicos ehidrofóbicos distintos. La hidrólisis de las proteínascon diferente distribución de aminoácidos hidrofóbi-cos y grupos cargados producirá péptidos que difierenen la distribución de grupos hidrofóbicos e hidrofíli-cos. En un estudio de hidrolizados de β-lactoglobulinay β-caseína se demostró que los péptidos obtenidos dehidrólisis de la β-lactoglobulina mostraron distribucio-nes similares de cargas y grupos hidrofóbicos, care-ciendo de áreas distintas de hidrofóbicos o hidrofílicos.

Por el contrario, la caseína produjo péptidos que difie-ren en la distribución de la carga y de los aminoácidoshidrofóbicos en su secuencia (13-15).

PROTEASAS COMERCIALES

Actualmente se encuentran disponibles comercial-mente muchas proteasas grado-alimenticio (Tabla I).Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen,(animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su modode acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base


Hidrolizados de proteína 229

Tabla I. Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio (15)(18).

Tipo de proteasa

Serinproteasa

Animal

Bacteriana

Cisteinproteasas

Plantas

Aspartato proteasas

Animal

Fúngica

Metalo proteasas

Animal

Bacteriana

Preparaciones enzimáticasMezcla de papaína,quimopapaína y lisozima.Mezcla de tripsina,quimiotripsina, elastasa ycarboxipeptidasa.Mezcla de serin-, aspartato-y metalo- proteasas.Mezcla de endo- y exo-proteasas, actividad en pHalcalino y neutro.

Nombre

Tripsina

Quimotripsina

Elastasa

Substilisin. Carlsberg,AlcalasaSubst. BPN,Substilisin Novo

PapaínaBromelainaFicina

PepsinaQuimosinaAspergilopeptidasa ANewlasa

Carboxipeptidasa A

Neutrasa®Termolisina

Papaína cruda

Pancreatina

Veron P, Sumicina LP,Biocina A

Pronasa

Fuente

Porcino, bovino

Bacillus licheniformis

Bacillus amyloliquefaciens

Papaya PiñaLátex de Ficus

Porcino, bovinoBecerroAspergillus saitoiRhizopus sp.

Páncreas

Bacillus amyloliquefaciensB. thermoproteolyticus

Fruto de la papaya

Páncreas (bovino y porcino)

Aspergillus oryzae

Streptomyces griseus

Temp. (°C)

30-6045-55

50-60

40-55

40-7520-65

35-5040-50

40-55

30-80

40-55

Intervalode pH

7-98-9

6-8

6-10

6-10

5-85-85-8

1-44-62-53-6

7-8

6-7,57-9

5-9

7-9

4-8

7-9

Sitio de acción catalitica

-*Lis (o Arg) ----*Trp (o Tir, Fe,

Leu) ----*Ala----

-*AAhf----

-*Fe (o Val, Leu)-AAhf ---

-Fe (o Tir, Leu)*-Trp (o Fe, Tir)

Glu, Asp, Leu *---Similar a la pepsina

*Carbonilo del AA terminal del péptido,excepto Pro, Arg, Lis

-Fe, Leu, Val*----Ile, Leu, Val, Fe*---

Amplia especificidad

Muy amplia especificidad



* Indica sitio de acción de la proteasa sobre el sustrato. AAhf Indica AAs hidrofóbicos.

en su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizanenlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína.Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoá-cidos terminales de las proteínas o péptidos. La natu-raleza del centro catalítico de las proteasas difiere deacuerdo con los aminoácidos y otros ligandos queintervienen en la formación del complejo enzima-sus-trato. El centro activo contiene aminoácidos o biencationes metálicos que promueven la catálisis, deno-minándose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartatoproteasas, según intervengan los aminoácidos serina,cisteína o ácido aspártico. En las metalo-proteasas laactividad está promovida por un catión metálico, sien-do el más frecuente el zínc (16). Todas las serinprote-asas tienen actividad endo. Contrariamente, las meta-lo-proteasas son sobre todo exo-proteasas (17).

Las primeras enzimas proteolíticas utilizadas en laindustria alimentaria fueron proteasas pancreáticas deorigen animal, si bien cada vez están adquiriendo ma-yor importancia las de origen bacteriano o fúngico. Enla Tabla I se presentan algunas de las proteasas comer-ciales de grado alimentario disponibles en el mercadoy se indica la especificidad de parte de ellas. Los prepa-rados enzimáticos suelen ser mezclas de estas enzimasy normalmente se venden en estado líquido o comopolvos.

ETAPAS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

La hidrólisis proteolítica no se desarrolla en unasola reacción. Se trata de un conjunto de reaccionessimultáneas de ruptura de enlaces, con distintas espe-cies cargadas en equilibrio, lo que da una gran com-plejidad a este tipo de procesos.

Se propone un proceso de hidrólisis constituidopor tres reacciones consecutivas. Primero, la forma-ción de un complejo enzima-sustrato (proteína), y des-pués la rotura del enlace amídico dando como resul-tado la liberación de un péptido. Finalmente, elpéptido restante se separa de la enzima después de unataque nucleofílico de una molécula de agua. El pro-ceso puede reiniciarse sobre los dos nuevos péptidos osobre uno solo de ellos. Estos tres pasos se representanesquemáticamente en la Figura 1.

Para la hidrólisis de proteína, la unión sustrato-enzi-ma es esencial. En el caso de proteínas globulares, lamayoría de los enlaces peptídicos están localizados en

el interior de la proteína y no son accesibles para laenzima, por esto, se considera que para proteínas glo-bulares es necesario efectuar la desnaturalización de laproteína antes de proceder a hidrolizarla, ya que des-pués de la desnaturalización estarán expuestos másenlaces peptídicos. En solución, las proteínas en esta-do plegado (nativo) y no plegado (desnaturalizadas)están en equilibrio. Solamente las moléculas no plega-das son susceptibles a degradación por enzimas prote-olíticas, como se representa esquemáticamente en laFigura 2.

Si la velocidad de desnaturalización (v0 = v+0-v-0) esmenor que v1, la etapa de desnaturalización es la etapalimitante de la velocidad de hidrólisis y cada proteínadesnaturalizada será rápidamente hidrolizada hastalos productos finales. El hidrolizado resultante, ade-más de contener ambas proteínas intactas, contendrálos productos finales, aunque serán deficientes en pép-tidos de tamaños intermedios. Este tipo de reacciónestá designada como una reacción “en etapas sucesi-vas”. Si, además, la desnaturalización de la proteína esmás rápida que la hidrólisis (v1<v0), las moléculas de laproteína serán degradadas a intermedios pero poste-riormente son degradadas lentamente en productosfinales. Este tipo de reacción es llamada de “cremalle-ra”, obteniéndose un hidrolizado que contiene princi-palmente péptidos de tamaño intermedio. Ambosmecanismos de hidrólisis están implicados en la mayo-ría de las reacciones proteolíticas (18).

Si la proteína se desnaturaliza irreversiblemente an-tes de la hidrólisis, el número de enlaces de péptidosdisponibles se incrementa notablemente y la degrada-ción de la proteína debería proceder de acuerdo conun tipo de reacción “cremallera”. Para estas proteínasdesnaturalizadas otros factores tales como la disminu-ción de la solubilidad media influyen en la velocidadde reacción inicial (18).

CONDICIONES DE LA HIDRÓLISIS

Debe establecerse la relación [proteína]/[protea-sa] una vez que se ha efectuado un posible pretrata-miento de la proteína si es necesario. A continuacióndeben ser definidas las condiciones de la reacción delproceso de hidrólisis. Las principales variables que de-terminan el resultado de la reacción son temperatura,



Nativa

V-0

V+0

E

V1

E

V2

Desnaturalizada Intermedios Productosfinales

v: velocidades de reacción, E: enzima

Figura 2. Teoría de Linderstrøm-Lang (17)

E + S

k-1

k1 k2

H2O

k3

ES EP + H-P’ E + P-OH+ H-P’

Figura 1. Mecanismo catalítico de una proteasa (16).

E: enzima, S: sustrato, P, P’: péptidos resultantes, kx: constante velocidad dereacción.

pH, relación enzima-sustrato y el tiempo de reacción.Los primeros 3 factores determinan la velocidad dereacción y pueden influir en la especificidad de la en-zima. El tiempo de reacción solamente determina elgrado final de hidrólisis (18). Los efectos interactivosentre los parámetros de la hidrólisis también influyenen la composición del hidrolizado. Si el proceso de hi-drólisis no se controla, el pH de la solución cambiarádespués del inicio de la hidrólisis debido a la forma-ción de grupos aminos nuevos, los cuales son capacesde liberar o aceptar protones, dependiendo del pHde la hidrólisis. A un pH bajo todos los grupos aminoestán protonados y solamente parte de los grupos car-boxilo están desprotonados, resultando en una capta-ción neta de protones por cada enlace peptídico roto,causando un incremento del pH. A pH neutro y alca-lino la hidrólisis resulta en una disminución de pH,pues todos los carboxilos están desprotonados y sola-mente parte de los grupos amino están protonados.Con el fin de prevenir un cambio de pH durante la hi-drólisis, la reacción debería llevarse a cabo en un sis-tema buffer o en un sistema de pH-stat en el cual el pHse fija en el valor deseado. En este laboratorio las reac-ciones con la enzima neutrase® de Novozymes, se efec-túan en un biorreactor Minifors®, de la empresa InforsHT - Bottningen, Suiza, con control y regulación au-tomática del pH, lo que permite que la enzima siem-pre actúe en el valor óptimo de pH determinado y elcálculo final de base o ácido consumido durante elproceso, pueda traducirse en el cálculo del grado dehidrólisis, como se verá más adelante.

Hasta el presente, los estudios efectuados sobrecinética de la hidrólisis han sido escasos, aplicándoseen general la cinética de tipo Michaelis-Menten(19)(20) que es demasiado simple para representar elmecanismo de la hidrólisis de proteínas, o bien cinéti-cas empíricas con 3-5 parámetros de ajuste lo que limi-ta su aplicabilidad (21).

Caracterización del hidrolizado

Debido a la hidrólisis, las propiedades molecularesde las proteínas cambian, produciéndose la disminu-ción del peso molecular, el aumento de la carga y laliberación de grupos hidrofóbicos, entre otros fenó-menos (22). Estos cambios moleculares pueden serdetectados con varios métodos analíticos, los cualesreflejan una o varias propiedades fisicoquímicas de lasmoléculas (Fig. 3). Como resultado de los cambiosmoleculares, las propiedades funcionales de las prote-ínas se ven afectadas (Fig. 3). Aunque el término pro-piedad funcional con frecuencia se aplica solamentepara indicar propiedades tecno-funcionales de loshidrolizados, esto debería también abarcar propieda-des bio-funcionales, las cuales pueden ser subdivididasen nutricionales y fisiológicas o funcionalidad biológi-ca (23). Las propiedades nutricionales de la hidrólisisreflejan por ejemplo su digestibilidad aumentada yalergenicidad disminuida cuando se las compara conlas proteínas parentales. Las propiedades fisiológicasabarcan bio-actividades potenciales del hidrolizado,las cuales se originan de la liberación de péptidos bio-activos. Finalmente, las propiedades tecno-funcionalesrepresentan funcionalidad tecnológica, tales comosolubilidad, propiedades emulsificantes y espumantes(Fig. 3).

El parámetro más usado para describir el resultadode un proceso de hidrólisis es el grado de hidrólisis(DH). Otro parámetro importante para la hidrólisisde proteína es la distribución del peso molecular delos péptidos en los hidrolizados. Para esto se empleantécnicas como SDS-PAGE (24) o cromatografía deexclusión por tamaño (20)(25)(26). Estas técnicas seusan frecuentemente para comparar la acción hidro-lítica de varias proteasas, o para caracterizar hidroli-zados hipoalergénicos. Finalmente, los hidrolizados



Caracterización Molecular

Grado de hidrólisis Distribución de peso molecular Perfil cromatográfico

Propiedades moleculares alteradas Tensión superficial (hidrofobicidad)

Carga Peso molecular

Propiedades funcionales

Exposición de: Tecno-funcionales Bio-funcionales

Grupos hidrofóbicos Solubilidad Nutricional Fisiológica

Grupos R (AA-cadena lateral) Emulsión Digestibilidad Bioactividad

Espuma Hipoalergenicidad Inhibición ACE

Gusto Actividad antimicrobiana Biodisponibilidad

ACE: Enzima convertidora de angiotensina.

Figura 3. Cambios en las características de la proteína debido a la hidrólisis.

se caracterizan ocasionalmente mediante cromatogra-fía de fase reversa (20)(24), la cual detalla campos deinformación acerca de la complejidad de los hidroli-zados. Sin embargo, la comparación directa de hidro-lizados es difícil con los perfiles que determina estatécnica cromatográfica (27).

A continuación se describen las ventajas y limitacio-nes de los métodos más usados en la hidrólisis de pro-teínas para el control del proceso y caracterización delos hidrolizados obtenidos.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Cuando se requiere determinar la actividad proteo-lítica de una enzima, uno de los ensayos más emplea-dos es el método de Anson. En este método, se hidro-liza hemoglobina desnaturalizada con la proteasadeseada a pH 7.5, temperatura de 25 °C durante 10min. La hemoglobina que no se hidrolizó se precipitacon ácido tricloroacético (TCA) y al sobrenadante,después de filtrado, se le añade reactivo fenólico deFolin-Ciocalteu que produce una coloración azul contirosina, triptófano y en menor grado con cistina, cis-teína e histidina. La absorbancia se mide a 750 nm.Para obtener la línea de calibrado se utiliza una prote-asa de actividad Anson conocida, usualmente tripsinapancreática, que se somete al mismo ensayo que laproteasa problema (28).

GRADO DE HIDRÓLISIS

El grado de hidrólisis es el parámetro clave para elseguimiento y control de las reacciones de hidrólisisde proteínas. Representa la proporción de enlacespeptídicos hidrolizados sobre el número total de enla-ces. Se calcula de acuerdo con la ecuación 1, donde hes el número de enlaces peptídicos hidrolizados y htotel número total de enlaces peptídicos presentes en laproteína nativa. Ambos h y htot son expresados enmeq/g (18).

DH = (h/htot ).100% [1]

Los métodos para medir el DH se basan en: ladeterminación de los grupos α-amino libres, la deter-minación de nitrógeno soluble tras precipitar la pro-teína con ácido tricloroacético y la valoración del pro-tón liberado tras la ruptura de un enlace peptídico adeterminados valores de pH.

DETERMINACIÓN DE LOS GRUPOS α-AMINOLIBRES

La cantidad de grupos α-amino liberados puede sermedida usando reactivos que reaccionen específica-mente con grupos amino, produciendo derivados que

pueden ser detectados espectrofotométricamente. Paraello puede utilizarse la valoración con formol (29), aun-que el gran número de interferencias que presenta estemétodo lo desaconsejan en el caso de los hidrolizadosde proteínas. También se utilizan reactivos como ninhi-drina, ortoftaldialdehído (OPA) y ácido trinitrobence-nosulfónico (TNBS), que reaccionan con los gruposamino libres.

La técnica más antigua es la de reacción con ninhi-drina, de gran sensibilidad, que presenta el inconve-niente de la larga duración de los ensayos y la interfe-rencia del amonio, además de dar como resultadovalores mucho más bajos de DH, cuando se comparacon OPA y TNBS, los cuales correlacionan bien (30).El método del TNBS (7), que se basa en la reacción degrupos amino primarios con el ácido trinitrobenceno-sulfónico, ha sido utilizado por diferentes autores parael análisis de hidrolizados de proteínas (31). Despuésde la incubación de las muestras con tiempos entre 15y 60 minutos y a temperaturas entre 30 y 50 °C se midela absorbancia a 420 nm. Entre los inconvenientes deeste método pueden mencionarse la inestabilidad delreactivo, el riesgo de explosión, el alto valor de losblancos, la contaminación del reactivo con ácido pícri-co, la interferencia de azúcares reductores y amonio,la no reactividad de prolina e hidroxiprolina así comola alteración de los resultados por la reacción de losgrupos α-amino de lisina con el reactivo. Algunosautores prefieren el método de la OPA al método deTNBS tanto por su rapidez como por su seguridad. Sinembargo, estos autores midieron el derivado de laOPA por absorción UV inmediatamente después de laadición de los reactivos. Posteriores investigacionesdemostraron que la absorción de la OPA fue establesolamente durante 20 min. Además, este método tieneel inconveniente de no reaccionar con prolina y sóloparcialmente con cisteína (30).

DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO SOLUBLE

En este caso las técnicas más usuales son el métodoKjeldhal, la reacción de Biuret o la determinaciónespectrofotométrica en la región UV de péptidos congrupos aromáticos. En este laboratorio se ha emplea-do el método de Dumas, que consiste en la oxidacióndel compuesto con CuO, con lo que el nitrógeno de lamuestra pasa a nitrógeno gas (N2), midiéndose elvolumen desprendido, con buena correlación contraotros métodos espectrofotométricos (29)(32).

DETERMINACIÓN DE LOS PROTONES LIBERADOSMEDIANTE POTENCIOMETRÍA

Algunos autores monitorean el DH adicionandouna base (o un ácido, dependiendo del pH inicial dela hidrólisis), para mantener el pH de la hidrólisis



constante. La cantidad de base empleada es propor-cional al DH. Sin embargo, este consumo no está rela-cionado de una forma simple con el grado de hidróli-sis alcanzado, siendo necesario para establecer estarelación el conocimiento del pK medio de los gruposα-amino liberados en la hidrólisis (18)(33). El métodosólo es aplicable a la hidrólisis enzimática de proteínasa pH neutro, alcalino o fuertemente ácido (pH≤3) ypuede ser realizado de forma sencilla y precisa (34).

DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓNAPARENTE DE PESO MOLECULAR

Una vez determinado el DH, puede estimarse la dis-tribución y el promedio de la longitud de la cadenapeptídica (PCL) de los hidrolizados (ecuación 2), asu-miendo que todos los hidrolizados son solubles (18).

PCL = 100/%DH [2]

La longitud de la cadena peptídica está relacionadacon el promedio del peso molecular de los péptidosen los hidrolizados. Sin embargo, los hidrolizados conPCL similar podrían tener péptidos de distribucionesde peso molecular sustancialmente diferente.

La distribución de tamaños de los péptidos de unhidrolizado puede ser útil para predecir la capacidadantigénica del mismo, así como para mostrar diferen-cias en la actuación de distintos pretratamientos delsustrato o enzimas utilizadas. Normalmente se utili-zan métodos cromatográficos o electroforéticos paraeste fin.

La electroforesis en gel, SDS-PAGE (gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida) ha sido la técnica másutilizada para la caracterización de hidrolizados y pro-teínas a pesar de sus limitaciones en la separación depéptidos de peso molecular bajo (22). La cromatogra-fía de exclusión por tamaño (SEC) con columnas deSephadex G-25 o G-50, ha sido el método elegido pordiferentes autores. En este método las moléculas sonseparadas principalmente con base al volumen hidro-dinámico, el cual depende del tamaño y conformaciónde las moléculas. Desafortunadamente, la separacióntambién está influenciada por interacciones no especí-ficas entre componentes proteináceos y el material dela columna, como interacciones ión-hidrofóbico. Estasinteracciones dependen de la elección de eluentes ydel material de la columna (35-37). El efecto de lasinteracciones no específicas en el cálculo aparente dela distribución de tamaño molecular (MWD) puede serreducido por inclusión de un gran número de pépti-dos para calibración que difieren en sus propiedadesmoleculares. Sin embargo, el método que mejoresresultados ha dado, por su mayor resolución y más fácilcuantificación, ha sido la cromatografía líquida deexclusión, SE-HPLC, con columnas de gel TSK (38).

Otro método cromatográfico, a menudo usado enlos análisis y separación de proteínas hidrolizadas, esla cromatografía de fase reversa (RPC). La caracterís-tica más importante para la separación en RPC es ladiferencia en hidrofobicidad entre aminoácidos. Parapéptidos pequeños (<15 residuos), la hidrofobicidadde las cadenas de aminoácidos en los péptidos deter-mina el tiempo de elución de la columna de fasereversa (39-41). Sin embargo, para péptidos grandes,la longitud del péptido también influye en el tiempode retención (41)(42). Generalmente, la resoluciónde la cromatografía en fase reversa es mejor que la dela cromatografía de exclusión. Sin embargo es másdifícil relacionar los resultados con las propiedadesmoleculares de los hidrolizados, pues varias caracte-rísticas, como la longitud de los péptidos, la composi-ción de aminoácidos y la presencia de áreas hidrofó-bicas influyen en el tiempo de retención y por tantoen el perfil cromatográfico.

SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS YAMINOÁCIDOS

Una correcta separación e identificación de lospéptidos de un hidrolizado de proteínas complemen-taría la información dada por la determinación delgrado de hidrólisis y la distribución en pesos molecu-lares, y ayudaría a un mejor conocimiento de la com-posición del producto.

La electroforesis (SDS-PAGE) y los distintos méto-dos cromatográficos (fase reversa, RP-HPLC; exclu-sión, SE-HPLC; filtración en gel, cambio iónico) hansido las técnicas más empleadas en la separación depéptidos y aminoácidos, mientras que para la identifi-cación de los mismos, después del fraccionamiento, seha utilizado generalmente espectrometría de masas,cromatografía de gases, análisis de secuencias o deter-minación de aminoácidos (43)(44). Lemieux y Amiot(45)(46) evaluaron las distintas técnicas empleadaspara la separación de péptidos, concluyendo que lacromatografía líquida de exclusión, SE-HPLC, es latécnica que mayor información aporta sobre la com-posición del hidrolizado, ya que es el volumen mole-cular el criterio de separación empleado, y no el esta-do de ionización, la carga o la hidrofobicidad de lospéptidos como en otras técnicas, que no obstante pue-den ser complementarias. También pusieron demanifiesto la ineficacia de los distintos métodos en laseparación de péptidos de peso molecular inferior a1.000 Da. En este sentido, el desarrollo de nuevas téc-nicas capaces de separar y cuantificar los péptidos dePM inferiores a 1.000 Da puede ser importante, espe-cialmente si el hidrolizado se va a utilizar en la formu-lación de dietas enterales, en cuyo caso debe estarconstituido fundamentalmente por di- y tripéptidos(45)(46).



PROPIEDADES TECNO-FUNCIONALES

Los cambios de las características moleculares queocurren durante la hidrólisis de la proteína pueden darlugar al comportamiento tecno-funcional modificadodel hidrolizado cuando se lo compara con la proteínaintacta, por ejemplo solubilidad alterada, viscosidad,características sensoriales, emulsión y características dela espuma (22)(47).

SOLUBILIDAD

En el punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la solu-bilidad generalmente aumenta con la hidrólisis, ya quees principalmente el resultado de la reducción en pesomolecular y del aumento en el número de grupos pola-res (22)(48). El efecto de la hidrólisis sobre la solubili-dad a otros valores de pH depende de la proteína estu-diada. Los caseinatos por ejemplo, son muy solubles enlos valores de pH sobre y debajo del pI (pH 4-5) (49).Para la proteína del suero, que es algo menos solubleque la caseína, excepto en el pI, se ha observado unaumento de solubilidad con hidrólisis en la gama ente-ra de pH (50)(51).

SABOR AMARGO

Un efecto secundario negativo importante de la hi-drólisis de la proteína es la liberación de los péptidosgeneralmente con sabor más amargo que la proteínanativa (7). Se ha demostrado que el sabor amargo de lospéptidos puros, a pesar de depender de la fuente deproteína y de la especificidad de la enzima, está relacio-nado con la presencia y posición de aminoácidos hidro-fóbicos en los péptidos del hidrolizado. (52)(53). Sehan propuesto varios métodos analíticos para predecirel sabor amargo de los hidrolizados. Adler-Nissen (34)postula el aislamiento de péptidos hidrofóbicos extraí-dos con butanol en los que a través de la determinaciónde la hidrofobicidad y del peso molecular medio de es-tos péptidos, podría predecirse el grado de sabor amar-go. También se han utilizado parámetros químicos (54)y a través de la espectroscopía infrarroja (55) podríapredecirse el grado de amargor.

EMULSIONES Y ESPUMA

Las características de la emulsión y de formación deespuma de la proteína y de los hidrolizados de la pro-teína dependen del pH del sistema y de la enzimaempleada para la hidrólisis. Chobert (56), divulga lamejora en la emulsión y formación de espuma para loshidrolizados trípticos de la caseína, que está de acuer-do con los resultados encontrados por otros autores.La formación y estabilización de la espuma y las emul-siones deben ser medidas por separado (1)(4)(57-59).

Dentro de las técnicas, se determinan el índice de

actividad de la emulsión (EAI) que mide la turbiedadde las emulsiones con cierta fracción de aceite, mien-tras que la capacidad de emulsionar (EC) determina lacantidad de aceite que se puede dispersar por ciertacantidad de proteína o de hidrolizado. Aunque ambosmétodos se utilizan para cuantificar la capacidad deformación de emulsión y formación de espuma de loshidrolizados, no miden realmente las mismas caracte-rísticas (60).

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen al Ministerio del Medio Ambiente Espa-ñol, Expediente 521/2006/3-8.2, por la financiación del proyec-to de investigación.Ricardo Benítez agradece a COLCIENCIAS - Colombia por el fi-nanciamiento para su programa doctoral.

CORRESPONDENCIA

RICARDO BENÍTEZ B. [email protected]@tecal.udl.catCalle 5 # 4 - 70 POPAYÁN - ColombiaTel: 0057 2 8209800 EXT 2334 - 2320Fax: 0057 2 8209800 EXT 2306.

JORDI PAGAN i [email protected]. Alcalde Rovira Roure, 19125198 LLEIDA – EspañaTel : 0034 - 973702817Fax : 0034 – 973702596 -973238264

Para solicitud de separatas:Jordi Pagan i [email protected]

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Aceptado para su publicación el 4 de marzo de 2008



Hidrolizados de proteína

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