HPLC

Historia

En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fundó Waters Corporación y comenzó a vender instrumentos de HPLC. Esto promovió el uso de HPLC en las áreas de análisis prácticos. Los sistemas de CL que Waters Corporation desarrolló utilizan bomba de alta presión que genera un rápido flujo de eluyente, y por lo tanto resultó en una mejoría dramática en el tiempo de análisis. Comparados con la "cromatografía de baja presión" los nuevos tipos se llamaron "cromatografía líquida de alta presión". Por lo tanto, se solía pensar que HPLC significa cromatografía líquida de alta presión, sin embargo hoy en día es

-Filtración al Vacío entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los métodos de adquisición de datos. En lugar de observar los cambios de las capas con los ojos, se acopló el sistema detector y la información de datos fueron grabados en hojas de papel.

¿Qué es Cromatografía Líquida de Alta Resolución?

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

El HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la mezcla. El solvente trabaja a una presión de 6,000 psig.

Los componentes o analitos deben ser disueltos en un solvente y se pasan por la columna cromatográfica a altas presiones.

La resolución depende de la interacción entre el soluto, los componentes y la fase estacionaria.

Elección del solvente

1. No degradar o disolver la fase estacionaria 2. Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión 3. Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan

detectores UV) 4. Se prefieren solventes de punto de ebullición intermedio.

Filtración y Desgasificación de solventes

Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre (0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

Hay 3 métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC:

-Filtro a la Entrada del Solvente

-Filtración en Línea

Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:

-Sonificación

-Burbujear Helio

-Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo

-Desgasificación al Vacío en Línea

-Temperatura

Preparación de fase móvil

-Ajuste de pH, parámetro critico en la retención de solutos ionizables (medir antes de dosificar modificador orgánico)

-El pH de la solución aumenta con la incorporación de un modificador orgánico.

-A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice

-A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice y la fase enlazada.

Fase estacionaria

Principales parámetros de la fase estacionaria:

-Tamaño de partícula: 3 a 10 µm

-Distribución de partícula: con una desviación máxima del 10 %

-Tamaño de poro: 70 a 300 Å;

-Área superficial: 50 a 250 m2/g

-Densidad de la fase (número de sitios activos por unidad de área): 1 a 5 por 1 nm2

Equipo

Bomba

En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte más importante del sistema. El desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. La bomba se colocaba en lo más alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En esta etapa el requisito más importante del sistema era poder generar una alta presión. Sin embargo, hoy en día, la generación de alta presión es normal y lo que más preocupa más hoy en día es proporcionar una presión constante en cualquier condición, para proporcionar un caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporción del flujo puede influir el análisis en gran medida.La mayoría de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de vaivén de un pistón de motor (bombas de pistón). Debido a este movimiento del pistón, se produce "pulsos". Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsación y las bombas recientes crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo, los análisis actuales requieren una sensibilidad muy alta para cuantificar una pequeña cantidad de analitos, e incluso un pequeño cambio en la velocidad del flujo puede influir en el análisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el análisis de alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.

InyectorUn inyector se coloca al lado de la bomba. El método más simple es utilizar una jeringa, y la muestra se introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisión de la medición por CL tiene mucho que ver con la reproducibilidad de la inyección de la muestra, el diseño de los inyectores es un factor importante. El método de inyección más utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automático (auto-inyector) del sistema también es ampliamente utilizado ya que permite una serie de inyecciones repetitivas en un tiempo programado.

Columna

La separación se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la columna es el corazón de un sistema de CL. La teoría de la cromatografía en columna no ha cambiado desde la época de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora

en el desarrollo de la columna. Las columnas recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se utiliza es de gel de sílice o de polímeros en comparación con el carbonato de calcio utilizado por Tswett.El eluyente utilizado para la CL varía de ácido a solventes básicos. La mayoría de la cubierta de la columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el análisis de algunos analitos como las biomoléculas y los compuestos iónicos, el contacto con el metal no es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de poliéter éter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar.

DetectorLa separación de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector se utiliza para observar la separación obtenida. La composición del eluyente es consistente cuando no hay analito está presente, en cambio la presencia del analito cambia la composición del eluyente. Lo que el detector hace es medir estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de señal electrónica. Hay diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican en la lección 6.

Registración de DatosEl cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal electrónica, y así no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador gráfico se utilizaba muy popularmente. Hoy en día, una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es más común. Hay varios tipos de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora. También hay programas que están diseñados específicamente para el sistema LC. Ofrece no sólo la adquisición de datos, pero también cateréticas como máximo de ajuste, la corrección de línea base, el cálculo automático de la concentración, la determinación del peso molecular, etc.

Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. A continuación se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema básico de LC.

DesgasificadorEl eluyente utilizado para análisis con LC puede contener gases como oxígeno que son no visibles a nuestros ojos. Cuando el gas está presente en eluyente, este se detecta como un ruido y causas una línea base inestable. Generalmente los métodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte), uso de bomba de vacio, sistema destilación, y / o calentamiento y agitación. Sin embargo, estos métodos no son convenientes cuando el disolvente se deja por un período de tiempo determinado (por ejemplo, durante un análisis largo). El desgasificador usa unos tubos de membrana de polímero especial para eliminar los gases. Los numerosos pequeños poros en la superficie del tubo de polímero permite que el aire pase a través mientras que previene cualquier otro líquido pasar a través del poro. Mediante la colocación de esta tubería bajo el contenedor de baja presión, crea las diferencias de presión dentro y fuera de la tubería (mayor en el interior del tubo). Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a través de los poros y eliminar el gas. En comparación con el tipo clásico de desgasificación por lotes, el desgasificador se puede utilizar on-line, es más conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas HPLC contienen un desgasificador.Horno de columnaLa separación con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. Con el fin de obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura

constante. También para algunos análisis, como el azúcar y los ácidos orgánicos, se puede obtener mejor resolución a temperatura elevada (50 ~ 80 ºC). También es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay posibilidades de que los diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separación sean diferentes. Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna (calentador columna).

Ventajas y desventajas de la cromatografía liquida HPLC

Ventajas Desventajas-Velocidad de análisis -Instrumentación costosa -Alta resolución -Difícil análisis cualitativo -Resultados cuantitativos -No existe detector universal-Buena sensibilidad y sensible-Automatización -Elevado costo de operación-Amplio espectro de aplicaciones -Experiencia indispensable

Aplicaciones

La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la literatura química. En la mayoría de los casos, éstas consisten en determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica cromatográfica resulta muy difícil. Estos resultados comprenden:

Compuestos iónicos: como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.

Compuestos de alto peso molecular: como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.

Compuestos termolábiles y no volátiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos.

En los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la HPLC se utiliza para la contaminación de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, hervicidas, etc.). También es posible la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares que son contaminantes atmosféricos muy importantes

En cromatografía líquida el análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo.

El bioquímico con frecuencia en un campo de investigación es el que plantea el problema de analizar compuestos volátiles y de alto peso molécula. Por ejemplo, se han efectuado determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico.

En el campo bioquímico la determinación de esteroides en cromatografía líquida ha sido el de detección, ya que sólo el detector de luz ultravioleta es lo bastante sensible para poner de manifiesto estos compuestos a bajas concentraciones, pero no todos los esteroides absorben en la región ultravioleta. Esto ha dado lugar a la formación de compuestos derivados de los esteroides que absorben en el ultravioleta a fin de hacer posible el análisis.

El análisis de medicamentos es también una aplicación muy interesante, la determinación de los componentes activos de una tableta analgésica. También el análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc.

En caso de que el compuesto analizar sean de alto peso molecular, se usa cromatografía de permeación o de exclusión. Es posible combinar dos o más técnicas cromatográficas para efectuar separaciones difíciles. La de permeación es útil en el estudio de polímeros, facilitando la determinación de la distribución de pesos moleculares, y en la investigación de productos naturales para efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular.

En separaciones según el tipo químico su finalidad no es la separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.

Bibliografía

Armstrong DW. Optical isomer separation by liquid chromatography. Anal Chem 1987;59:84A- 91A. Bidlingmeyer BA, Warren FV. Column efficiency measurement. Anal Chem 1984;56: 1583-1596. Bright FV. Bioanalytical applications of fluorescence spectroscopy. Anal Chem 1988;60:1031A-1039A.

http://www.shodex.net/index.php?lang=3&applic=1472 http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica

%20ambiental/Tema6.pdf http://www.quiminet.com/articulos/que-es-la-cromatografia-liquida-de-alta-

eficiencia-hplc-14764.htm https://www.google.hn/url?

sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&ved=0CD8QFjAF&url=http%3A%2F%2Fexa.unne.edu.ar%2Fquimica%2Fquimica.analitica%2Farch_descargas%2Farch_seminarios2006%2Fmonografia-Beck-Ibarra.doc&ei=CsgQVen8HcGzggTh7IGYBg&usg=AFQjCNGsuF9z5jTVz6Y_yNDz6tGkpC-Xow&sig2=B-5Uyo_QicbJ2BPjsWDN-g