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HUELLAS MOLECULARES DE LA EVOLUCIÓN CELULAR,

LA TEORÍA ENDOSIMBIÓTICA Dr. Carlos de Paz Villasenín & Luís José Míguez Rodríguez1

Resumen: Se presenta una actividad destinada al alumnado de la asignatura Biología de 2º de Bachillerato. Se pretende introducir los procedimientos básicos de la investigación biológica a través de herramientas bioinformáticas, utilizando como escenario la demostración de la teoría endosimbiótica mediante secuencias disponibles en bases de datos moleculares reales.

Palabras clave: Biología, 2º Bachillerato, Bioinformática, SIB, Teoría Endosimbiótica.

Introducción Según el ordenamiento actual, todo organismo vivo pertenece a uno de los tres dominios de la vida:

Bacteria (Eubacterias o bacterias “verdaderas”), Archaea (Arqueobacterias, un “anciano” grupo de bacterias que viven en hábitats con condiciones extremas) y Eukarya (incluyendo hongos, plantas y animales superiores). Las Eubacterias (comúnmente llamados “Bacterias”) y las Arqueobacterias, a los que conjuntamente llamamos Procariotas, son organismos unicelulares y son, en cuanto a su estructura celular, mucho más simples que las células eucariotas. No presentan compartimentación interna y, lo más significativo, no contienen una envoltura nuclear alrededor de su ADN, es decir, no tienen núcleo. Contrariamente a los procariotas, los eucariotas son unos recién llegados a la Tierra, apenas llevan aquí 2 billones de años, en comparación con los 3,5 billones de años de antigüedad de los procariotas. Las células eucariotas son frecuentemente más grandes y mucho más complejas que las procariotas; contienen núcleo y orgánulos internos especializados como mitocondrias o cloroplastos. Estos orgánulos cumplen funciones

1 IES “A Sardiñeira”. Dpto. de Bioloxía e Xeoloxía. A Coruña (Spain)

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específicas. Por ejemplo, la mitocondria produce energía para la célula en forma de ATP. Los eucariotas incluyen tanto organismos unicelulares como pluricelulares, incluyendo, entre otros muchos, plantas, hongos y animales.

La Teoría Endosimbiótica de la Evolución fue propuesta por Lynn Margulis en 1970. Margulis proponía que las mitocondrias y los cloroplastos de células eucariotas eran originalmente procariotas que fueron “engullidos” por otros procariotas. De acuerdo a la teoría, ciertos procariotas adquirieron la habilidad de utilizar el oxígeno acumulado en la atmósfera en procesos más eficientes de oxidación de compuestos orgánicos proporcionando cantidades de energía sin precedente. Esto proporcionaba una considerable ventaja a un organismo hospedador que, en lugar de digerirlo, estableciese con él una relación de simbiosis en la que uno proporciona nutrientes y protección,

mientras el otro produce energía suficiente para ambos. Aunque hoy en día la teoría está generalmente aceptada, fue duramente criticada cuando Margulis la

propuso. Efectivamente, muchos científicos sólo aceptaron sus postulados cuando años después, en 1981, Lynn obtuvo evidencias moleculares que apoyaban su teoría a través del uso de herramientas bioinformáticas2.

Gracias a los avances en genética y tecnología computacional, las herramientas bioinformáticas han crecido de forma espectacular en velocidad, fiabilidad y disponibilidad, hasta el punto de estar a disposición de cualquiera que disponga de un terminal conectado a Internet.

En este tutorial se indican los pasos a seguir para obtener evidencias que apoyan la Teoría Endosimbiótica, usando el Entorno Educativo de “Biology Workbench”, traducción al castellano del Biology Student Workbench (SIB) de la Universidad de Illinois, que facilita en gran medida el acceso del alumnado de bachillerato a las herramientas más habituales en bioinformática.

2 Publicadas en su libro “Symbiosis in Cell Evolution”.

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El SIB es la versión Educativa de “Biology Workbench” una colección de herramientas bioinformáticas

que, entre otras cosas, permite a los usuarios:

• La búsqueda de secuencias, tanto de proteínas como de ácidos nucleicos, en diferentes bases de datos moleculares.

• El análisis de esas secuencias, incluyendo el alineamiento múltiple y la comparación cuantitativa.

Fundamento Para generar datos que soporten la Teoría Endosimbiótica, vamos a utilizar herramientas

bioinformáticas para buscar secuencias con alto grado de similitud (homología) con genes mitocondriales y cloroplásticos de dos organismos eucariotas simples. El problema al que nos enfrentamos es que las secuencias de genes eucariotas y procariotas que vamos a comparar han evolucionado de forma independiente durante 2 billones de años. Incluso si originalmente las mitocondrias o los cloroplastos fueron células procariotas, después de 2 billones de años sus genomas podrían haber sufrido cambios suficientes para que no existiese punto alguno de similitud con el genoma procariota original. Una solución a este problema es escoger la secuencia de un gen que sea absolutamente indispensable para la supervivencia de la célula. Con este condicionante habría sido altamente conservado ya que cualquier mutación ocurrida en el mismo, que ocasionase cambios importantes en relación a su función, habría sido letal para la célula.

Usaremos por lo tanto secuencias mitocondriales y cloroplásticas de nuestros eucariotas simples y las correspondientes de diferentes tipos de procariotas para construir árboles filogenéticos. Asumiendo que cuanto antes divergen dos organismos a partir de un antecesor común, más diferentes serán sus secuencias

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entre sí, mediante la construcción de árboles filogenéticos deberíamos ser capaces de determinar que las secuencias mitocondriales y cloroplásticas son más próximas a ciertos tipos de procariotas.

PARTE I Abriendo una cuenta de usuario Debemos estar registrados para poder utilizar el Entorno Educativo de Biology Workbench (SIB). Si ya

disponemos de una cuenta de usuario, entramos directamente en el sistema. En caso contrario, 1) Abrimos la página principal del Student Biology Workbench. La dirección es:

http://bighorn.animal.uiuc.edu/cgi-bin/sib.py3 2) Clic en el botón, “Registration”.4 Se abrirá un breve formulario en el que debemos aportar

nombre, dirección de correo electrónico, un nombre de usuario y una contraseña. Los dos últimos datos serán necesarios para acceder al sistema en sucesivas ocasiones.

3) Después de enviar la información necesaria mediante la pulsación del botón “Register”

accedemos directamente al sistema en el apartado de “Preferencias”. En sucesivas ocasiones se accede mediante la introducción del nombre de usuario y contraseña en los campos que aparecen en la página principal del sistema.

3 La versión en castellano está disponible en http://bighorn.animal.uiuc.edu/cgi-bin/esib.py. 4 En el momento de redactar este tutorial, el mismo enlace “Registro” de la página en castellano, no era funcional. De todos modos, podemos realizar el registro en la página en inglés y luego ingresar en el sistema a través de la que está en castellano usando nuestro nombre de usuario y contraseña. De hecho, estos datos nos permiten acceder también a sesiones de trabajo con la versión profesional Biology Workbench v.3.2

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Crear una nueva sesión En la parte superior de la página se observan los accesos a los diferentes grupos de herramientas que

el sistema proporciona: “Preferencias”, “Analizar Proteínas”, “Analizar Ácidos Nucleicos”, y “Analizar Alineamientos”5 (como ya hemos dicho, en el momento de acceder, el sistema nos sitúa en “Preferencias” donde disponemos de las herramientas de sesión).

En este tutorial no se hará uso de “Analizar Ácidos Nucleicos”. La única diferencia entre “Analizar

Proteínas” y “Analizar Ácidos Nucleicos” es que, mientras las herramientas para ácidos nucleicos operan sobre secuencias nucleotídicas, las herramientas accesibles desde “Analizar Proteínas” operan sobre las mismas secuencias traducidas previamente a aminoácidos. Las herramientas de búsqueda, visualización, edición y alineamiento de secuencias, trabajan exactamente igual en ambos casos.

Para mantener cierta organización a la hora de usar el entorno, es muy recomendable crear una nueva

sesión para cada motivo de investigación o práctica: 1) Pulsamos el botón “Nueva”

2) Nombramos la sesión como “Endosimbiosis” y pulsamos “Start New Session”

5 Los equivalentes de la página americana son “Preferences”, “Protein Tools”, “Nucleic Tools” y “Alignment Tools”

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Se observa que estamos situados en la sesión que hemos creado, “Endosimbiosis”, porque aparece

en la parte superior de la página de herramientas:

y en el fondo de la misma página inmediatamente después de la sesión por defecto (“Default

Session”).

Podemos intercambiar la sesión active entre las disponibles marcando el botón de radio y pulsando el

botón “Abrir” de las herramientas de sesión. Para continuar con este tutorial, seguiremos con “Endosimbiosis” como sesión activa.

Formato Workbench En este tutorial, se instruye en el uso de las herramientas que permiten realizar búsqueda y análisis de

secuencias de aminoácidos para ser importadas al SIB. Para acceder a las herramientas de proteínas, debemos hacer clic en el botón “Analizar Proteínas” en la parte superior de la página.

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Se abre una página en la que las herramientas se sitúan en una tabla. La columna de la izquierda

nos muestra una breve descripción de la misma y, cuando se requieren, los campos para establecer parámetros que afectan a la herramienta en cuestión. La activación de la misma se realiza mediante pulsación del botón situado en la columna de la derecha.

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PARTE II Uso de la herramienta Ndjinn: búsqueda de secuencias en bases de datos En esta sección veremos el procedimiento de búsqueda de una secuencia aminoacídica determinada

en las bases de datos moleculares. En primer lugar, seleccionamos un gen mitocondrial como motivo de búsqueda. Necesitamos uno altamente conservado, en otras palabras, uno que no haya sufrido demasiados

cambios a lo largo de millones de años. Los genes que intervienen en la respiración celular, muchos de los cuales residen en el genoma mitocondrial, entran en esta categoría. Dicho esto, vamos a utilizar la secuencia del gen de la enzima succinato deshidrogenasa (succinato-deH) de Reclinomonas americana.

R. americana es un eucariota muy simple que, como muchos otros eucariotas, se supone que no ha cambiado mucho desde su forma original. Esto es importante puesto que buscamos secuencias mitocondriales que

hayan cambiado lo menos posible. La enzima succinato-deH participa en el ciclo de Krebs de la respiración celular y es crucial para la supervivencia celular. Así, podemos especular que el gen codificador de la misma ha cambiado de forma mínima durante los billones de años de divergencia evolutiva, porque cualquier mutación que alterase dramáticamente este gen resultaría en muerte celular. En otras palabras, las mutaciones en el gen de la succinato-deH no pasarían el filtro de la selección natural.

1) Utilizaremos la herramienta “Ndjinn”; podemos localizarla en el cuadro de herramientas de proteínas, en la primera celda de la columna derecha. Lo primero será definir los parámetro de búsqueda (en los campos de la columna de la izquierda a la altura del botón “Ndjin”): escribimos como motivo de búsqueda: “Reclinomonas americana succinate dehydrogenase”.

Inmediatamente debajo observamos la relación de bases de datos en las que podemos realizar la búsqueda. Entre las disponibles algunas son boutiques de secuencias dedicadas a diferentes grupos de organismos (por ejemplo, “GenBank Bacteria” contiene un gran número de secuencias de diferentes bacterias), otras contienen secuencias genómicas completas de diferentes organismos.

3) Puesto que buscamos secuencias de un organismo unicelular eucariota, seleccionamos GenBank Invertebrate Sequences. Esta base de datos contiene únicamente secuencias de ADN de organismos invertebrados y, por lo tanto, también de eucariotas unicelulares como R. americana.

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3) Pulsamos el botón “Ndjinn”. Se abrirá una página con los resultados de la búsqueda. En el momento de redactar este tutorial, esta búsqueda particular reporta un único resultado6.

5) Seleccionamos “GBINV:2258325 Reclinomonas americana mitochondrion, complete genome” marcando el cuadro situado a la izquierda de la misma.

Ya sólo queda pulsar el botón “Import Sequence(s)” situado al final del listado de resultados. Con ello importaremos la secuencia seleccionada a nuestra base de datos personal dentro de la sesión actual “Endosimbiosis”. En la mayoría de los casos nos encontraríamos tantas secuencias importadas como hayamos marcado. Sin embargo, estamos ante un caso especial. Observamos que, como resultado de la importación aparece un amplio listado de resultados que, en conjunto, son el genoma mitocondrial completo de R. americana.

6 Si aparece un número diferente de resultados no hay de qué preocuparse, las bases de datos están siendo actualizadas diariamente como resultado de los frutos obtenidos por multitud de equipos de investigación a lo largo de todo el mundo.

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Uso de la herramienta “ViewRecord” Desafortunadamente, las secuencias génicas mitocondriales de R. americana no están disponibles de

forma individual en las bases de datos, únicamente están presentes como parte del genoma mitocondrial completo, lo que, debido a su tamaño dificulta en gran medida su manejo. Para aislar la secuencia de un gen específico del genoma mitocondrial de R. americana, necesitamos realizar un trabajo extra. Debemos localizar la secuencia del gen de la succinato-deH, copiarlo y añadirlo como una secuencia individual a nuestro listado de secuencias importadas.

1) El primer paso es localizar la secuencia del gen de la succinato-deH. Selecciona los 10 primeros registros obtenidos en el paso anterior y pulsa “Ver Registros”7 para ver las diferentes secuencias contenidas en esos registros del genoma mitocondrial completo. En la página que se abre podemos ver diferentes informaciones. En la columna de la izquierda figuran encabezados que hacen referencia a las diferentes categorías. Debemos localizar el apartado “Features”. En él, bajando un poco por la página, veremos los típicos cuadros marcados seguidos de la etiqueta “CDS”. Son los diferentes genes y sus secuencias. El genoma mitocondrial de R. americana contiene 67 genes codificantes de proteínas.

2) Para localizar el gen de la succinato-deH usaremos la utilidad “Buscar en esta página…) del menú “Editar” de nuestro navegador de Internet.

7 En el momento de redactar este tutorial esta herramienta no era funcional en la versión en castellano del SIB. Si al pulsar “Ver Registros” se abre una página sin resultados, se hace inevitable usar la versión americana, cuya herramienta equivalente es “ViewRecords”. Podemos abrirla en una ventana nueva pulsando aquí; luego abrimos una sesión usuario y mantenemos simultáneamente ambas, americana y castellana, abiertas. Los cambios en una afectarán a la otra sin más que pulsar “Actualizar” en nuestro navegador cada vez que hagamos algo en una y queramos que se refleje en la otra.

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3) Tecleamos “succinate” (atención: en ingles) en la caja de diálogo que aparece y pulsamos

“Buscar siguiente”

Pulsando sucesivamente el botón “Buscar siguiente” localizaríamos 3 secuencias independientes

para la succinato-deH (cada una con su propia etiqueta CDS). Son las secuencias para 3 subunidades, por orden de aparición: “subunit 3”, “subunit 4” y “subunit 2”.

4) Para el propósito de esta práctica, usaremos “subunit 2”, la última de las tres. La secuencia de este gen está justamente a continuación de la etiqueta “translation” (traducción), como por una secuencia de letras que representan los diferentes aminoácidos. Se puede observar que todas las secuencias comienzan con la letra M, Metionina, aminoácido codificado por el codón de inicio en el proceso de traducción. Resaltamos la secuencia “succinate:ubiquinone oxidoreductase subunit 2” (poniendo especial atención en que no queden incluidas en ambos extremos ningún signo gráfico distinto de las letras que representan los aminoácidos) y pulsamos el atajo de teclado Ctrl+C o seleccionamos “Copiar” del menú Editar del navegador.

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5) Ahora, debemos regresar a la página de “Analizar Proteínas” pulsando el botón “Return”

situado al final de la página. Uso de la herramienta “Añadir”

1. Una vez aislada la secuencia debemos crear un nuevo registro para ella, que posibilite su análisis con otras herramientas del entorno educativo de Biology Workbench.

2. Seleccionamos “Añadir”8.

Etiquetamos la secuencia (p.ej. “Reclinomonas americana succinate dehydrogenase, subunit 2”) y la pegamos en la caja destinada a tal efecto mediante el atajo de teclado Ctrl+V o seleccionando “Pegar” en el menú Editar del navegador. Completa el proceso pulsando el botón “Save” situado en la parte superior de la página.

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3. Una vez hayamos generado el nuevo registro podremos ver que la secuencia ha sido añadida al listado del final de la página con una etiqueta que comienza por “User entered” (entrada de usuario) para distinguirla de aquellas secuencias incorporadas a la sesión por importación desde bases de datos.

Recordemos que todos los pasos seguidos en la sección anterior (usando la herramienta “Añadir“

nueva secuencia proteica) fueron necesarios porque únicamente necesitamos una pequeña parte del genoma mitocondrial de R. americana. Este mismo procedimiento puede ser usado para aislar cualquier gen de un genoma completo o fragmento que contenga un conjunto de genes. De hecho lo usaremos nuevamente más adelante en este tutorial para aislar un gen diferente del mismo genoma con el que estamos trabajando.

PARTE III Usando la herramienta BLAST para localizar secuencias homólogas (similares) En esta sección vamos a utilizar la herramienta BLASTP para buscar secuencias homólogas al gen de

la succinato-deH mitocondrial (subunidad 2) de R. americana. 1) En la página de “Analizar Proteínas”, marcamos la casilla correspondiente a dicha

secuencia.

2) En la tabla de herramientas usaremos “BLASTP”, pero antes de pulsar el botón, debemos delimitar el ámbito de búsqueda, esto es, la(s) base(s) de datos sobre la que haremos la búsqueda. Deseamos comparar nuestra secuencia problema con otras de organismos tanto eucariotas como procariotas. La mejor base de datos en este caso es “SwissProt”.9

3) Hacemos clic sobre el botón “BLASTP”.

8 En el momento de redactar este tutorial esta herramienta no era funcional en la versión en castellano del SIB. Si al hacer clic sobre “Añadir” se abre una página con el mensaje de error “Unknown Module selected Añdir”, debemos utilizar la versión americana, cuyo equivalente es “Add”. (Ver también Nota a pie 7). 9 Si lo deseamos, podemos seleccionar más bases de datos simultáneamente. Para hacerlo, debemos hacer clic sobre cada una de las bases de datos seleccionada manteniendo pulsada la tecla Ctrl del teclado. Es necesario indicar que aumentar el número de bases de datos incrementa el tiempo de procesamiento.

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A la hora de escribir este tutorial, la lista de resultados estaba encabezada por los que siguen:

Observando los resultados, vemos que entre ellos hay varios registros de bacterias (entre otros los

señalados en la imagen anterior). Resumiendo, hemos seleccionado la secuencia de un gen mitocondrial eucariota y, buscando similitudes, hemos localizado secuencias, tanto de procariotas como de eucariotas, que responden a esa posible homología.

Si observamos un poco más en detalle podemos constatar dos cosas:

• El primer registro de la página de resultados corresponde al ADN mitocondrial de la propia Reclinomonas americana. Es lógico, la secuencia que hemos utilizado como motivo de búsqueda

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para aplicar BLASTP, está presente también en la base de datos utilizada (SwissProt) y obviamente es lo más cercano en similitud puesto que coincide punto por punto consigo misma.

• Las secuencias de procariotas que muestran mayor grado de similitud con la de R. americana son: Rickettsia prowazekii, Rickettsia conorii y Paracoccus denitrificans. Más importante que sus nombres es el hecho de que todas ellas se enmarcan dentro del grupo de las alpha-Proteobacterias. Esto sugiere que las células procariotas que habrían sido endocitadas hace millones de años, y que eventualmente habrían dado lugar a las mitocondrias, estarían relacionadas con las alfa-Proteobacterias actuales.

Uso de la herramienta CLUSTALW para comparar secuencias mediante alineamiento Ahora vamos a determinar en qué grado se parece la secuencia problema a la de una alfa-

proteobacteria usando CLUSTALW. Esta herramienta utiliza el alineamiento de secuencias para localizar regiones comunes entre ellas.

1) Seleccionamos la secuencia bacteriana que tenga mayor similitud con el gen de R. americana y hacemos clic sobre el botón “Import Sequence(s)”.

2) Inmediatamente, el sistema nos direcciona a la página “Analizar Proteínas”, y veremos

ambas secuencias en el listado, a continuación de la tabla de herramientas.

3) Seleccionamos ambas tal y como se muestra en la imagen anterior y hacemos clic sobre el botón de la herramienta “CLUSTALW”.

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4) En la siguiente pantalla aparecen alineadas ambas secuencias una sobre la otra.

Se utiliza un sistema de codificación por colores para diferenciar las regiones altamente conservadas,

en las que existe coincidencia de aminoácidos, de aquellas regiones no conservadas. Los aminoácidos idénticos son resaltados en azul y los no idénticos en negro. Ciertos pares de aminoácidos aparecen resaltados en verde. Esto significa que, aunque los aminoácidos son diferentes, poseen similares propiedades químicas.

También podemos observar que la secuencia bacteriana (etiquetada como DHSB_RICCN) tiene una cadena de aminoácidos en su comienzo mientras para R. americana sólo aparece una secuencia de guiones (----). Esto se debe a que la secuencia bacteriana es más larga que la de R. americana. La herramienta de alineamiento ha movido las secuencias una respecto a la otra para alcanzar el mayor grado de coincidencia posible. Se observa que todos los aminoácidos resaltados en azul son idénticos en ambas secuencias, poniendo en evidencia la extensa región homóloga entre ambas.

Un alto nivel de homología entre secuencias mitocondriales eucariotas y bacterianas, especialmente considerando que procariotas y eucariotas tomaron caminos evolutivos divergentes hace unos dos billones de años, aporta pruebas evidentes que apoyan la teoría de que las mitocondrias son productos evolutivos de formas bacterianas.

5) Una vez visualizado el alineamiento, regresamos a la página “Analizar Proteínas” haciendo clic en el botón “Return”.

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PARTE IV Uso de BLAST para buscar secuencias homólogas a la del gen de la NADH-deH mitocondrial

(subunidad 8) A continuación repetimos el mismo procedimiento usando un gen mitocondrial diferente de R.

americana. Esto será, en primer lugar, una ocasión para revisar el procedimiento de búsqueda, importación y alineamiento de secuencias de aminoácidos. En segundo lugar, nos servirá para mostrar que la homología observada entre genes de bacterias y de mitocondrias no se limitan a un único gen.

1) En la página “Analizar Proteínas”, usaremos la herramienta “Ndjinn”. Ponemos atención en que no esté señalada ninguna secuencia en el listado situado inmediatamente después de la tabla de herramientas.

2) Como motivo de búsqueda escribimos “Reclinomonas americana NADH dehydrogenase” y como base de datos para la búsqueda seleccionamos “GenBank Invertebrate Sequences”. Entonces hacemos clic en el botón “Ndjinn”.

Una vez más, nos encontramos con el problema de que el gen de la enzima que buscamos no está disponible como tal, sino formando parte del genoma mitocondrial completo.

Como antes, la secuencia debe ser aislada previamente y luego añadida al listado de secuencias

mediante la herramienta “Añadir”.

3) Selecciona los 10 primeros registros obtenidos en el paso anterior y pulsa “Ver Registros” (ver nota a pie 7) para ver las diferentes secuencias contenidas en esos registros del genoma mitocondrial completo.

4) Usamos la utilidad “Buscar en esta página…) del menú “Editar” de nuestro navegador de Internet para localizar “NADH dehydrogenase”.

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5) También ahora aparecen varias subunidades. Localizamos y copiamos la correspondiente a la subunidad 810.

6) Pulsamos “Return” para regresar a “Analizar Proteínas”.

7) Ejecutamos la herramienta “Añadir” (ver nota a pie 8).

8) Pegamos (Editar, Pegar) la secuencia en el espacio apropiado y lo etiquetamos como “Reclinomonas americana NADH deshidrogenasa, subunidad 8”.

9) Hacemos clic en el botón “Save” para guardar la secuencia. Podemos observar que la secuencia ha sido añadida en la zona de almacenamiento.

10) Seleccionamos la secuencia del gen de la NADH-deH para realizar una búsqueda

de secuencias similares sobre la base de datos “SwissProt” utilizando la herramienta “BLASTP”.

11) Entre los resultados de la búsqueda…

10 Si no apareciese, tendríamos que pulsar “Return” y seleccionar otros 10 registros del genoma completo para realizar la búsqueda.

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…otra vez podemos ver secuencias de procariotas entre aquellas con mejores puntuaciones (las

marcadas en la imagen anterior). Todas ellas (RHOCA o Rhodobacter capsulatus, RICCN o Rickettsia conorii, RICPR o Rickettsia prowazekii, RICTY o Rickettsia tiphi y PARDE o Paracoccus denitrificans) son alfa-proteobacterias. Una vez más, esto sugiere que este grupo bacteriano es el origen probable de las mitocondrias. Ahora veremos cuanto se parecen la secuencia del gen de la NADH-deH mitocondrial de R. americana (subunidad 8) y una de las de alfa-proteobacterias.

12) Seleccionamos dichas secuencias y pulsamos “Import sequences(s)”. Seleccionamos la secuencia de la primera de esas alfa-proteobacterias (Rhodobacter capsulatus (SWISSPROT:NUOI_RHOCA) marcando la casilla correspondiente junto a la de la NADH-deH (subunidad 8) de R. americana NADH-deH y pulsamos el botón de la herramienta CLUSTALW. El resultado se observa en la ventana que se abre.

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Se puede observar que hay una gran homología entre ambas secuencias. Podemos alinear nuestra secuencia problema con alguna perteneciente a otra clase de bacterias para comparar los distintos grados de similitud.

Nuestro análisis de los genes de la succinato-deH y NADH-deH sugieren que R. americana, un eucariota simple, posee genes mitocondriales homólogos a los de alfa-proteobacterias, posibles predecesores evolutivos de las mitocondrias. El siguiente paso consistirá en demostrar esta relación

mediante la construcción de un árbol filogenético (Parte VI del tutorial).

Si lo deseamos, podemos comprobar otros genes mitocondriales de R. americana repitiendo los pasos de esta sección. Algunos genes que proporcionan resultados interesantes son (ya en inglés para utilizar como motivos de búsqueda con la herramienta “Ndjinn”): ribosomal protein S12, succinate ubiquinone oxidoreductase subunit 2, elongation factor TU, apocytochrome c, and ATP synthase F1 subunit alpha. Al utilizar “BLASTP” en las búsqueda por comparación, observamos cuantas veces las especies del género Rickettsia (RICCN, RICPR y otros códigos en formato RICxx) u otras alfa-proteobacterias aparecen entre los 15 primeros registros localizados.

Parte V Centrándonos en los Cloroplastos Ahora que hemos demostrado la evidente relación entre genes

bacterianos y genes mitocondriales, sugiriendo un origen bacteriano para las mitocondrias, vamos a tratar de hacer algo similar con los cloroplastos. El gen cloroplástico con el que vamos a trabajar codifica una proteína ribosómica altamente conservada en el alga Porphyra purpurea.

1) Situados en “Analizar proteínas”, escribimos “Porphyra purpurea ribosomal protein S12” como motivo de búsqueda y seleccionamos la base de datos “SwissProt”. A continuación hacemos clic sobre el botón “Ndjinn”.

2) En el momento de redactor este tutorial entre los resultados obtenidos había distintas secuencias, ponemos atención en la que buscamos, a saber: “Chloroplast 30S ribosomal protein S12”

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Como esta es una secuencia propia para el gen de la proteína ribosómica S12, no se hace necesario

el proceso de localización de la misma en un genoma completo.

3) Seleccionamos la secuencia RR12_PORPU y hacemos clic en “Import Sequence”, el sistema nos devolverá a la página “Analizar proteínas” y la secuencia aparecerá en el listado del final de la misma.

4) Seleccionamos la secuencia “Porphyra purpurea S12 sequence” para utilizar como motivo de búsqueda con la herramienta BLASTP.

Tras restringir el ámbito de la búsqueda de homologías a la base de datos SwissProt, hacemos

clic en “BLASTP”.

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Una vez más, la secuencia con mejor puntuación es, evidentemente, la misma que usamos como motivo de búsqueda. Entre los resultados con mejores puntuaciones, se encuentran algunas secuencias bacterianas. Esto indica que la secuencia de la proteína ribosómica S12 del cloroplasto de P. purpurea es más próxima a las secuencias de proteínas ribosómicas S12 de algunas bacterias que a las de otras plantas. Las secuencias bacterianas con mayor similitud (Synechococcus, Synechocystis, y Spirulina platensis) pertenecen a la clase de las Cyanobacteria.11 Para ver la información de cada secuencia, debemos importarlas y luego utilizar la herramienta “VerRegistros”.

5) Independientemente de que hayamos hecha visualización, importamos, al menos, la secuencia bacteriana con mayor puntuación (“SwissProt:RS12_SYNP7”) marcándola y haciendo clic en “Import Sequence”. Automáticamente el sistema nos lleva a la página “Analizar Proteínas”.

Ahora usaremos la herramienta CLUSTALW para ver el nivel de homología entre la secuencia problema y la de la cianobacteria Synechococcus.

6) Marcamos ambas secuencia en el listado y hacemos clic directamente sobre “CLUSTALW”.

Aunque se trata de una secuencia muy corta, se observa un alto grado de conservación entre Porphyra

y Synechococcus (recordemos que las letras azules representan los residuos idénticos).

11 Del mismo modo que los genes de R. americana con lo que hemos trabajado mostraban una especial homología con las secuencias de alpha-Proteobacteria, el de la proteína ribosómica cloroplástica S12 de P. purpurea, muestra una alta homología con los correspondientes a genes de bacterias del grupo Cyanobacteria.

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Más abajo, en la misma página del alineamiento, podemos observar la puntuación del alineamiento

(porcentaje de similitud), que en este caso resulta ser de 87, un indicador extremadamente bueno de relación evolutiva.

Pulsamos “Return” para regresar a la página “Analizar Proteínas”.

Llegados este punto, hemos utilizado varias herramientas bioinformáticas para obtener evidencias que apoyan la teoría endosimbiótica. Durante la construcción de nuestro argumento, hemos constatado que:

• Las secuencias mitocondriales son más próximas a las de alfa-Proteobacterias que a las de otras clases bacterianas.

• Las secuencias cloroplásticas son más próximas a las de Cianobacterias que a las de otras clases de bacterias.

Para completar el análisis de las relaciones de mitocondrias y cloroplastos con determinados tipos de bacterias, utilizaremos otra herramienta del Entorno Educativo de Biology Workbench que permite crear árboles filogenéticos.

Parte VI ¿Qué es un árbol filogenético? Un árbol filogenético es un representación gráfica que los científicos utilizan para expresar las

relaciones evolutivas entre diferentes organismos. Se componen de nodos (organismos) y ramas (la representación de las relaciones entre organismos). Dos organismos relacionados estarán próximos en un árbol filogenético. Pero, ¿cómo determinan los científicos dónde situar un organismo dentro de un árbol filogenético? Simplificando mucho las cosas, podemos decir que, antes del advenimiento de la Bioinformática, los organismos eran agrupados por características morfológicas comunes. Por ejemplo, la

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distancia entre un perro y un gato era mucho menor que la existente entre un perro y un cocodrilo. Pero estos dos últimos eran mucho más próximos que un perro y una planta. Este método, aunque útil para especies morfológicamente muy distintas, es impreciso y completamente inadecuado para organismos microscópicos o tan próximos que apenas presentan diferencias morfológicas. Con la llegada de las herramientas bioinformáticas, se establece un nuevo método basado en la medida de la similitud entre secuencias de ADN. Como muchas mutaciones tienen lugar de forma aleatoria, se puede presumir que las diferencias en ADN aumentará con el tiempo en aquellos organismos que hayan evolucionado independientemente. Un árbol filogenético puede ser construido usando el Entorno Educativo de Biology Workbench mediante búsqueda, alineamiento y comparación de secuencias en diferentes organismos. Debemos usar secuencias altamente conservadas porque, entre los microorganismos, la tasa de mutación es muy alta de modo que en otro tipo de secuencias no encontraríamos similitudes adecuadas.

Árbol filogenético basado en el gen de la Succinato-DeH (Subunidad 2) Para construir nuestro primer árbol, usaremos un gen con el que ya estamos familiarizados: el de la

succinato-deH (subunidad 2). Este gen está presente en organismos de los tres dominios de la vida con un elevado grado de conservación, por lo que es un excelente candidato.

1) Seleccionamos la secuencia “R. americana mitochondrial succinate dehydrogenase, subunit 2”.

2) Seleccionamos la base de datos GenBank bacterial sequences y hacemos clic sobre BLASTP.

3) Para generar un buen árbol filogenético, necesitamos incluir organismos que representen las diferentes clases de bacterias12. De la tabla de resultados seleccionamos las siguientes secuencias13:

12 Incluimos alfa-, beta- y gamma-proteobacterias. El SIB nos limita dado que no permite modular el número de resultados de una búsqueda, estableciendo de forma predeterminada el máximo en 100. Con un máximo de 250 resultados (posible con Biology Workbench 3.2), el listado resultante de esta búsqueda incluiría también arqueobacterias, Bacillus y otros grupos. El listado aquí propuesto es el resultado de analizar dos filogenias obtenidas, cada una, con 50 de los 100 resultados de la búsqueda con BLASTP, con el objetivo didáctico de obtener un buen agrupamiento ilustrativo del objetivo perseguido. 13 Podemos utilizar la función “Buscar en esta página” del menú Editar del navegador de Internet para localizarlas fácilmente.

• 119668705_119670256.

• 34105712_34102377.

• 113524807_113527366.

• 91695138_91698679.

• 115421100_115422269.

• 82409200_82410054.

• 30180959_30181091.

• 72393774_72394442.

25

• 88597753_88597960.

• 58418577_58419173.

• 15619100_15619106.

• 21113259_21113260.

• 12057211_9106020.

• 114225560_114226885.

• 66270661_53757913.

5) “Importamos” todas las secuencias indicadas.

6) Constatamos que aparecen en el listado de secuencias importadas en la página “Analizar Proteínas”.

7) A continuación seleccionamos todas estas, además de la secuencia de la succinato-deH

(Subunidad 2) de R. americana.

8) Hacemos clic en el botón “CLUSTALW”. 9) La página de resultados de esta herramienta se hace, en este caso, difícil de interpretar por

lo que nos limitamos a hacer clic en el botón “Import Alignment”, que nos permite importar el alineamiento para poder utilizarlo después con las herramientas incluidas en la página “Analizar Alineamientos”. Precisamente a esta página nos remite directamente el sistema una vez importamos un alineamiento.

10) Seleccionamos el alineamiento de secuencias como se indica en la imagen siguiente.

26

11) Hacemos clic en la herramienta “DRAWGRAM” y, en la página que se abre, obtenemos un

árbol filogenético semejante al que se muestra a continuación:

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Para que el árbol sea más significativo, debemos sustituir todos los números de identificación por los nombres de las bacterias y, aún mejor, incorporar de algún modo el grupo al que pertenece cada organismos, por ejemplo mediante un código de colores. Por desgracia, el SIB no proporciona ningún a herramienta para ello. Si lo hacemos de forma “manual”14, el resultado sería algo como lo que sigue:

Así, se hace evidente el agrupamiento según las diferentes clases de bacterias. Más importante es el

hecho de que R. americana se agrupa con las alpha-Proteobacteria, indicando, definitivamente, la estrecha relación con este grupo concreto de procariotas.

14 Guardar la imagen obtenida mediante la utilidad “Guardar imagen como…” del menú contextual que ofrece el botón secundario del ratón sobre la misma y, posteriormente, modificarla con un programa de edición de imágenes.

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Árbol filogenético basado en la secuencia génica de la proteína ribosómica cloroplástica S12 Para construir un segundo árbol, usaremos otra secuencia que ya nos es familiar: la de la proteína

ribosómica cloroplástica S12 de Porphyra purpurea. Como en el caso anterior, este gen está presente en todos los organismos con elevado grado de conservación,

1) Seleccionamos la secuencia “Chloroplast 30S ribosomal protein S12”. 2) Hacemos clic en BLASTP después de haber restringido la búsqueda por homología

a la base de datos “GenBank Bacterial Sequences”15.

4) Para generar un árbol significativo, necesitamos incluir el mayor número de divisiones o clases de bacterias posible. De los obtenidos, seleccionamos las secuencias siguientes:

15 Otra vez el SIB nos limita por el número de resultados máximo para una búsqueda. Con un máximo de 250 resultados (posible con Biology Workbench 3.2), el listado resultante incluiría un número de grupos mayor, lo que no impide obtener resultados significativos para el fin perseguido.

• 25168256_15026206

• 110681940_110683481

• 28204652_28204623

• 114336511_114338781

• 11612676_6457977

• 75699950_75701238

• 47118302_17133476

• 47118315_22295473

• 81167692_81168577

• 110164990_110165389

• 37508091_35214498

• 83574254_83576939

• 82943940_82947075

• 114307050_114307583

• 30139028_30139102

• 113524807_113528217

• 78496741_78497096

• 4100312_4100314

• 118413283_118413983

• 34482500_34482608

• 117576522_117579328

• 110279108_110282220

5) Hacemos clic en “Import sequence(s)”.

6) Observamos que las secuencias aparecen en el listado de la página “Analizar Proteínas”. Las seleccionamos todas junto a la secuencia problema.

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7) Hacemos clic en la herramienta “CLUSTALW”.

8) De modo similar a lo ocurrido en el apartado anterior, los resultados se hacen difíciles de interpretar y nos limitamos ahora a hacer clic sobre el botón “Import Alignment.” Como resultado, el sistema nos direcciona a la página “Analizar Alineamientos” del SIB.

Seleccionamos el alineamiento marcando la casilla de la izquierda y hacemos clic en DRAWGRAM.

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En la página que se abre obtenemos un árbol filogenético semejante al que se muestra a continuación.

Cuando sustituimos los identificadores numéricos por los nombres de los microorganismos y grupos a

los que pertenecen, se puede apreciar un claro patrón de agrupamiento:

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En él podemos observar que la secuencia de la proteína S12 del eucariota Porphyra purpurea se

agrupa con los miembros del grupo Cianobacterias como resultado de la estrecha relación evolutiva existente entre ambos.

Parte VII Conclusión Usando varias herramientas bioinformáticas, reunidas en el Entorno Educativo de Biology Workbench

hemos mostrado que los genes mitocondriales y cloroplásticos de eucariotas simples, presentan secuencias con alta homología con ciertos grupos de bacterias. Este tipo de evidencia es un apoyo firme a la teoría

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endosimbiótica, según la cual.las células eucariotas proceden de células procariotas que, tras un proceso de endocitosis, establecieron una relación simbiótica con otros procariotas. En esta relación, uno de los organismos proporciona nutrientes y protección mientras el otro produce suficiente energía para ambos. En concreto, hemos encontrado evidencias de que la mitocondria podría haber evolucionado a partir de alfa-proteobacterias y los cloroplastos a partir de Cianobacterias.

-oOo-

Referencias: Radomir Niewrzol, Saba J. Elderkin, Michael J. Darcy, John Sabo, and Deanna M. Raineri. “Understanding the Evolution of the Eukaryotic Cell: The Endosymbiotic Theory” . Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign. (http://bsw-uiuc.net/tutorials_current/Endosys/endosys.pdf).