Identificación Genética de Desaparecidos en Argentina y ... · Se necesitan 15 puntos. Un...
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Genética Forense: Aplicaciones
1. Investigación de Paternidad y Parentesco.
2. Criminalística Forense: match entre sospechoso y evidencia biológica.
3. Investigaciones históricas.
4. Investigación de desaparecidos.
5. Desastres en masa: identificación de restos.
6. DNA en FFAA: “dog tag”.
7. Bases de datos de DNA: crímenes reincidentes.
Genoma Humano: diferentes tipos de ADN
Genome 3.2Gb
Genic 25%
mtDNA 16.5kb
Coding and
Regulatory 1.5%
Repetitive 54%
Tandem repeats (VNTR) 9%
Interspersed 45%
Satellite 5% Micro-satellite 1%Mini-satellite 3%
Non-coding 24%
Extra-Genic 75%
SINE 13% LINE 21% LTR 8% DNA transposon 3%
ADN nuclear
Doble cadena.
100.000 genes.
ADN diploide. (Y haploide)
Recombinación genética.
Mutación.
2 copias por célula.
Anular de doble cadena.
37 genes.
ADN haploide (materno).
No recombinación.
Mutación (ADNmt>ADNn).
1000-10.000 copias por célula
(2-10 copias/mit y hay ≈ 1000
mt/cel
ADN mitocondrial
Autosomicos(transimitidos en parte por
ambos progenitores)
Cromosoma-Y(transmitido completo,
pero solo por hijos)
Mitochondrial (transmitido completo,
pero solo por hijas)
Marcadores de linaje
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 9.1, ©Elsevier Science/Academic Press
Diferentes patrones de herencia
Autosomicos STR
Polimorfismos de interés en genética forense
STR (short tandem repeats)
nDNA
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
mtDNA (mitocondrial)
nDNA (nuclear)
Indels (Insertion/deletions)
nDNA
POLIMORFISMOS
Secuencia (SNPs)
1. TGATTCGCCTAG
2. TGATCCGCCTAG
3. TGATACGCCTAG
4. TGATGCGCCTAG
Longitud (VNTR)
GATA
GATA GATA
GATAGATAGATA
GATAGATAGATAGATA
SNPs: ADNmtADNnuc
Short Tandem Repeat (STR)
PCR/Short Tandem Repeats (STRs)
AATG
7 repeats
11 repeats
AATG AATG
Primers fluorescentes
Homocigota = ambos alelos son de igual longitud= 1 banda o pico
Heterocigota= los alelos son diferentes = 2 bandas o picos
♂
♀
Imagen
scanneada Electroforesis capilar – EFG perfil genético
Se usa la PCR para amplificar regiones STR y marcar los
amplicones con colores usando primer específicos de locus
8 repeats
10 repeatsLocus 1
8 repeats
9 repeatsLocus 2
Detección de la muestra
CCD Panel
Separación
por color
Ar+ LASER
(488 nm)
Fluorescencia Prisma
Espectrofotográfico
Capilar o Gel
Separación por tamaño
Fragmentos de ADN
marcados (PCR)
Ventana de
detección
PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN Y
DETECCIÓN DE FRAGMENTOS
EFG
AMEL
D3
TH01 TPOX
Penta D
Penta EFGAD21 D18
CSF
D16D7
D13D5VWA D8
Amplificación STR con multiplex
Perfil STR: pasos involucrados
Cuantificación de ADN RT-PCR
Mat Biol ADN
Genotipo
Material Biológico utilizado
Sangre
Uñas
Cabello
Hisopos
Semen
Saliva
Orina
Dientes
Hueso
TejidosTODOS PRODUCEN EL MISMO PERFIL
GENÉTICO EN UN INDIVIDUO
Muestra obtenida para ser
identificada Biología
Extracción
DNA
Cuantificac
DNA
Análisis de Multiples
Marcadores (STR)
Tecnología
Separación y Detección de los
Marcadores Analizados
(Alelos STR)
Genotipo de la
muestra
GenéticaComparación del Genotipo de
las muestras entre sí
(PA y familiar)
Si no hay match exclusión
Si hay match inclusión
Generación de Informe con
Valor de Probabilidad
Estadística
Perfil de ADN: pasos involucrados
GENETICA FORENSE
VALORACIÓN ESTADISTICA DE LA “ANALISIS DE ADN”
VALORA LA INCERTIDUMBRE DE NUESTROS
RESULTADOS
VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE UN MATCH
ENTRE PERFILES GENETICOS
• MATCH POR
PARENTESCO
• MATCH POR
PROVENIR DEL
MISMO
INDIVIDUO
MATCH POR AZAR
X Y
LR= prob X / prob Y
Frecuencias
genotípicas en la
población
HIPÓTESIS DE FISCALIA HIPÓTESIS DE DEFENSA
UN EJEMPLO DE INCLUSIÓN
PADRE ALEGADO: 10 / 8
HIJO: 10 / 11
MADRE: 12 / 11
X= Probabilidad que PA transmita el alelo 10 = 0,5
Y= Prob que HA transmita el alelo 10 frec f10 en poblac= 0,04
IP= X/Y= 0,5/0,04= 12,5
PP= IP/PI+1= 12,5/13,5= 0, 92 92%
IP= X/Y
INVESTIGACIÓN DE PATERNIDADPROBABILIDAD ACUMULADA EN UNA INCLUSIÓN
LOCUS IP IPAcum PP
CSF1PO 1,238 1,23 55,1 %
D12S1090 8,333 10,31 91,1 %
D13S317 1,961 20,23 95,28 %
D16S539 3,257 65,88 98,50 %
D21S11 7,813 514,79 99,80 %
D3S1744 4,484 2308,34 99,95 %
D5S818 1,355 3127,80 99,96 %
D7S820 2,941 9198,88 99,98 %
D8S1179 6,173 56784,70 99,99 %
F13A01 8,333 473186,92 99,999 %
F13B 4,132 1955208,34 99,9999 %
FGA 2,924 5717029,06 99,99998 %
LPL 2,500 71462863,36 99,99999 %
RECONSTRUCCIONES: CON HIJOS DEL
PADRE ALEGADO
1,2,3,4
1/3 2/9
1,2,3,4
2/4
7/9
?
SIN MADRE DE LOS HIJOS DEL PADRE
ALEGADO
1/2
1/3 2/9
3/4
2/4
7/9
?
CON MADRE DE LOS HIJOS DEL PADRE
ALEGADO
Inclusión con menor fuerza:
si el PA no fuera 2?
Inclusión con mayor fuerza:
el PA es 2
Complejidad en la identificación de desaparecidos
Número de individuos denunciados como desaparecidos
Número de individuos presumidos de estar desaparecidos
Número de víctimas (NMI)
Episodios “abiertos” o “cerrados” (a priori)
Condiciones de los restos (post-mortem):
Degradación / descomposición
Grado de desarticulación re-asociaciones
Restos mezclados re-asociaciones
Muestras de referencia disponibles (ante-mortem):
Pertenencias personales de la víctima (DNA match directo)
Familiares de la victima (DNA analisis de parentesco)
Enterramientos ilegales Argentina
Década del ’70.
1. 1975 – 1978: ~35 años de episodios:
• Pocos familiares del desaparecido para comparar
• Degradación del ADN por influencia del suelo en restos envejecidos
2. Fosas comunes o individuales “en tierra”
3. Universos cerrados: un evento único hipótesis fuerte
comparación directa con familiares consanguíneos.
4. Universos “abiertos”: sin hipótesis de identificación bases de datos
genéticas comparaciones masivas huesos/familiares.
Genetica Forense: procesos en la Identificación de restos
Restos humanos Recolección de muestras PM
Extracción de ADN
Cuantificacion ADN
Amplificacion ADN
Problemas en muestras PM
Problemas en muestras de Ref
Problemas para generar perfiles
en muestras óseas degradadas
Comparaciones genéticas:
• Hipótesis fuertes
• Comparaciones masivas
Conciliation de datos:
•Investigación histórica
•Antropología, otros
Evaluación estadística:
•Prior odds
•Falsos positivos
•Límite pre-acordado para ID
IDENTIFICACIÓN
Genetica Forense: procesos en la Identificación de restos
Restos humanos Recolección de muestras PM
Extracción de ADN
Cuantificacion ADN
Amplificacion ADN
Problemas en muestras PM
Problemas en muestras de Ref
Problemas para generar perfiles
en muestras óseas degradadas
Comparaciones genéticas:
• Hipótesis fuertes
• Comparaciones masivas
Conciliation de datos:
•Investigación histórica
•Antropología, otros
Evaluación estadística:
•Prior odds
•Falsos positivos
•Límite pre-acordado para ID
IDENTIFICACIÓN
ARGENTINA: Problemas con las muestras
Referencia/familiares: despues de 30-35 de los episodios⇒ pocos familiares y genealogías
escasas.
Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida.
Múltiples desaparecidos en una misma familia.
Restos óseos: Degradación
Contaminación
Restos Mezclados
Score usado para calcular cantidad de familiares
a recolectar
Se necesitan 15 puntos.
Un progenitor/a= 10 puntos.
Un hijo/a= 10 puntos
Un hermano/a= 5 puntos.
Tíos, tías, medio-hermanos= 1.5 puntos.
Abuelo/a= 2 puntos.
Bonus si hay 4 abuelos= 2
Ejemplos:
Madre+1 hermano= 15 puntos
Tres hermanos= 15 puntos
2 Tías maternas + 2 tíos maternos + 1 hermano= 3+3+5= 11 puntos
Multiples desaparecidos en una familia
5860
35
38
3 11 14
1. Amelogenina + STR + Autosomicos + mtDNA + Y-STR
2. Antropología forense
Referencia
Desaparecido
512
?
• Padres fallecidos: 4 Hnos, uno desaparecido. Se exhuma
un resto masculino con fuerte presunción de ID.
• 15 autosomicos STRs ⇒ EXCLUSION
• Y-STR ⇒ EXCLUSION
• mtDNA= match con 1, 2 y 3 (única secuencia en la BD de
ADNmt de ~480 secuencias
• Posible genealogía errada?
• Probabilidad que 1, 2 and 3 sean Hnos Cptos= 1,6. 1012
• Se contactó a la familia para reanalizar la genealogía.
1 2 3
?
1 2 3
• La familia informó sobre una fuerte posibilidad de
medio-hermandad materna del desaparecido.
• Se analizan 23 STRs.
• LR= 15.943 y PP= 99,993% bajo la nueva
genealogía descrita.
INCONSISTENCIAS: un caso de no-paternidad
desconocida
BL-LP-A4-Esq1
PROBLEMAS EN LA MUESTRAS
Referencia/familiares: despues de 30-35 de los episodios⇒ pocos familiares y genealogías
pobres.
Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida
Múltiples desaparecidos en una misma familia
Restos óseos: Contaminación
ADN degradado
Restos mezclados
PROBLEMAS EN LA MUESTRAS
Referencia/familiares: despues de 30-35 de los episodios⇒ pocos familiares y genealogías
pobres.
Buenas genealogías!! Describir el vínculo siempre con respecto al MP.
Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida
Múltiples desaparecidos en una misma familia
Restos óseos: Contaminación
ADN degradado
Restos mezclados
RESTOS BIEN PRESERVADOS:
Más posibilidades de éxito para
la tipificación de ADN
HUESOS MAL PRESERVADOS,
DELGADOS O ESPONJOSOS:
ADN degradado o en poca
cantidad
Peroné (12)= 96%
Costilla (2)= 73%
Tibia (23)= 84%
Craneo (15)= 73%
Femur (115)= 85%
Diente (109)= 82%Radio (7)= 61%
Humero (22)= 54%
Cubito (8)= 52%
Vertebra (3)= 48%
Pelvis:
(coxal/ilium/ischium)
(20) = 33%
Homoplato (3)= 15%
Porcentaje de marcadores amplificados en distintos huesos
N= 338
X=Amplif/nº muestras/15
PROBLEMAS EN LA MUESTRAS
Referencia/familiares: despues de 30-35 de los episodios⇒ pocos familiares y genealogías
pobres.
Buenas genealogías!! Describir el vínculo siempre con respecto al MP.
Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida
Múltiples desaparecidos en una misma familia
Restos óseos: Contaminación
ADN degradado
Restos mezclados
Fosa Común: ADN para re-asociacionesintra-esqueléticas
221306 Skeleton 1
221307 Skeleton 2
211308 Skeleton 3
221309 Skeleton 4
211310 Skeleton 5
221311 Skeleton 6
211312 Skeleton 7
221313 Skeleton 8
211314 Skeleton 9
211315 Skeleton 10
211316 Skeleton 11
211317 Skeleton 12
211318 Skeleton 13
211319 Skeleton 14
211320 Skeleton 15
Genetica Forense: procesos en la Identificación de restos
Restos humanos Recolección de muestras PM
Extracción de ADN
Cuantificacion ADN
Amplificacion ADN
Problemas en muestras PM
Problemas en muestras de Ref
Problemas para generar perfiles
en muestras óseas degradadas
Comparaciones genéticas:
• Hipótesis fuertes
• Comparaciones masivas
Conciliación de datos:
•Investigación histórica
•Antropología, otros
Evaluación estadística:
•Prior odds
•Falsos positivos
•Límite pre-acordado para ID
IDENTIFICACIÓN
Genética: comparaciones masivas
Valores de ID “a priori”
Falsos positivos
Falsos negativos
Inconsistencias familiares
Conciliación con otras disciplinas forenses
“a priori”: episodios con pocas víctimas
Valor “a priori”:
Un accidente de avioneta con 10 personas, buscamos a Juan: la probabilidad de encontrar a Juan entre los restos es 1/10.
Resultado del ADN= 100.000/1 a favor de quees Juan.
Probab Posterior= 1/10 x 100.000/1= 100.000/10= 10.000 los resultados son 10.000 veces mas probables si los restos son de Juan (99,99%).
Desastre masivo
Se trata de un Tsunami: 10.000 víctimas.
Valor “a priori”= 10.000 de encontrar a Juan.
Resultado de ADN= 100.000/1
1/10.000 x 100.000/1 = 100.000/10.000= 10
Probabilidad Posterior: los resultados son
apenas 10 veces más probables si los restos
son de Juan (90%).
El problema de los Falsos Positivos
Presunción fuerte:
1 resto + 1 referencia= 1 comparación alta probabilidad de identificar
correctamente.
2 restos + 2 referencias= 4 comparaciones igualmente alta probabilidad de
identificar correctamente.
Sin presunción de ID:
ILID: ~1200 esqueletos x ~9,000 referencias 107 comparaciones
probabilidad de match al azar o falso positivo.
BONE
SAMPLEREFERENCE KINSHIP LR
STR
LociEXCLUDED BY
1 210330 300238 sibling 10.576 12 Y-STR
2 210479 104024 son 14.905 14 Y-STR
3 210228 101874daughter 32.382 9 mtDNA
4 210161
102865 sibling
30.000 13 Adding NON-CODIS STRs102844 sibling
102845 sibling
5 230160 301156 sibling 14.956 13 Anthropology
6 210382 300177 sibling 32.785 14 Anthropology
7 210552 301008 sibling251.18
114 Exclution by adding mother and
two sons
8 210032 101509 sibling 49.010 13 Anthropology
9 210357 100680 sibling 46.975 15 Anthropology
Falsos positivos en comparaciones genéticas masivas:
Base de datos Argentina ILID (huesos ~1200; referencias~ 9000)
Genetica Forense: procesos en la Identificación de restos
Restos humanos Recolección de muestras PM
Extracción de ADN
Cuantificacion ADN
Amplificacion ADN
Problemas en muestras PM
Problemas en muestras de Ref
Problemas para generar perfiles
en muestras óseas degradadas
Comparaciones genéticas:
• Hipótesis fuertes
• Comparaciones masivas
Conciliación de datos:
•Investigación histórica
•Antropología, otros
Evaluación estadística:
•Prior odds
•Falsos positivos
•Límite pre-acordado para ID
IDENTIFICACIÓN
Conciliación de datos con otras disciplinas
MP1
40aRef1
MP2
20aRef2
H2 para MP2= hueso (hijo) Ref1 y (Hno cpto) de Ref2
H1 para MP1= hueso (Hno cpto) Ref1 y (tío) of Ref2
?
Resultados del ADN:
LR1= 7.258
LR2= 11.265
LR1/LR2= 0.64
~40 años
Identificación de MP1 mediante DNA + Antropología
231040
Número de muestras óseas procesadas y esqueletos
representados (re-asociaciones)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Jul-13
Skeletons
Bone samples
LIIDIncludes may 2013
IDENTIFICACIONES EAAF 1984-2012 (marz)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
901
98
41
98
51
98
61
98
71
98
81
98
91
99
01
99
11
99
21
99
31
99
41
99
51
99
61
99
71
99
81
99
92
00
02
00
12
00
22
00
32
00
42
00
52
00
62
00
72
00
82
00
92
01
02
01
12
01
2 m
arz año
N
ADN
OTROS METODOS
ADN
EAAF
ILID
PROPORCION DE DESAPARECIDOS EN ARGENTINA
POR PROVINCIA
PROVINCIAS MAYORITARIAS
38,0
20,91,8
3,2
7,3
7,5
21,3 B (Buenos Aires)
C (CF)
M (Mendoza)
S (Santa Fe)
T (Tucuman)
X (Córdoba)
Otras Provincias
EAAF – Total de identificaciones en diferentes proyectos
PAIS PROVINCIA REGION IDENTIFIC
ARG
EN
TIN
A
BUENOS AIRES
AVELLANEDA 105
GRAL LAVALLE 21
LA PLATA 22
LOMAS DE ZAMORA 35
SAN MARTIN 22
BUENOS AIRES (OTRAS) 110
CATAMARCA 3
CHACO 2
CORDOBA 16
CORRIENTES 1
ENTRE RIOS 3
MENDOZA 1
MISIONES 2
SALTA 1
SANTA FE 36
SGO DEL ESTERO 1
TUCUMAN 18
URUGUAY 10
TIMOR ORIENTAL 15
EL SALVADOR 29
BOLIVIA 14
ISLAS SALOMÓN 2
SUDÁFRICA 14
TOTAL 4832012-08-10
Proyectos para MPI donde el EAAF
trabaja con Genética Forense
America Central y SA
Argentina
Uruguay
Paraguay
El Salvador
Panama
Bolivia
Otros Países
Timor Leste
Islas Salomón
Sudáfrica
Pentridge Project (Australia)
Vietnam
Nigeria
El Salvador: Guerra Civil
Desde 1980 hasta 1992.
Ejercito gubernamental contra FMLN.
Aprox. 75.000 muertos/desaparecidos.
Aprox. 900 niños desaparecidos (huerfanos
adoptados).
Suelos ácidos, húmedos y temp templadas.
Restos esqueletizados de ~25 años PM.
Perspectivas Futuras (2014)
Argentina desaparecidos
Víctimas de Malvinas – Cementerio Darwin
Paraguay – Víctimas del Stronismo
Sudáfrica
Vietnam
Kenia
Nigeria
Otros…?
AGRADECIMIENTOS
EAAF
Laura Catelli
Carola Romanini
Magdalena Romero
Florencia Garrone
Alicia Borosky
Mercedes Salado Puerto