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Aura Flores Pérez
INDICACIONES PARA REPORTAR PRÁCTICAS.
Las prácticas se realizaran bajo el formato de guía de práctica , donde el
instructor proporciona al alumno :
ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR ACTIVIDAD DEL ALUMNO
El instructor le proporcionara el objetivo
de la práctica.
El alumno realizara una revisión
bibliográfica y de técnicas de laboratorio
para diseñar la práctica bajo la guía del
catedrático.
En caso de existir un manual de técnicas
de laboratorio ,esté será proporcionado
para que el alumno seleccione la técnica
más adecuada dependiendo de los
reactivos existentes.
El instructor revisara antes de la
práctica la información recolectada, la
cual se presentara en borrador, en su
cuaderno de laboratorio.
Durante su desarrollo experimental el
instructor supervisará el trabajo del
equipo., siendo esté parte de la
El alumno presentara como reporte de la
práctica.
El marco teórico., ( donde se
presentara de forma resumida la
información bibliográfica previamente
recabada y analizada.
El desarrollo experimental será la
explicación de la práctica, incluyendo
materiales y reactivos., en caso
necesario explicar con dibujos.
Las observaciones realizadas durante
la práctica se anotaran en una libreta de
laboratorio estrictamente personal, la
cual le servirá posteriormente para el
reporte de laboratorio.
Aura Flores Pérez
calificación práctica.
Conclusiones personales.
Discusión de resultados ,
comparando los resultados bibliográficos
con las observaciones prácticas .
La bibliografía se anotara de forma
tradicional.
La practica se entregara al instructor en
la siguiente sesión una ves que está se
ha terminado .
El alumno entregara la práctica, una
semana después de terminada., En caso
de no lograr setenta % de calificación .,
se corregirán los errores marcados .,
asignando una calificación máxima de
ochenta y cinco.
En las evaluaciones teóricas, se harán
preguntas básicas, de técnicas usadas
para diferentes determinaciones de
componentes biológicos, la práctica
contara en un porcentaje de la
calificación de las diferentes unidades.
Aura Flores Pérez
MATERIAL NECESARIO PARA EL DESARROLLO DE LA PÁCTICA EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA.
Libreta de laboratorio individual.
Por equipo:
Detergente
Brocha chica para limpiar balanza.
40 Cajas de Petri desechables esteriles
Cajas desechables con medio de cultivo .
Bisturí con navaja.
Cinco jjeringas ;10., 5., 2 ml.
Algodón en paquete. de pliegues de 400gr.
Tijeras de buena calidad medianas.
Cinta adhesiva Maskintape.
Papel de estraza. 20 pliegos.
Cerillos.
Bandeja grande de plástico.
Cubreboca y gorra de forma individual .
Papel aluminio un rollo.
Aura Flores Pérez
Un paquete de Kleenpack.
Lápiz graso.
Benzal frasco de un galón
Bulbo de hule para gotero.
Tijeras.
Franela o magitel.
Jabón de tocador.
Jabón corta grasa.
Botes metálicos para caja.
Botes para tubos.
Papel de seda para microscópio.( por grupo )
.Escobillón para matraces de 250ml.
Escobillón para tubos 13 x100.
Escobillon para tubos de 20x 150.
1 Kg de bolsas de plastico para un kilo.
Tres metros de tela gaza para los tapónes de matraces erlenmeyer .
4 vasos de plástico desechables pequeños
Aura Flores Pérez
INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA .
MICROBIOLOGIA GENERAL
PROPUESTA PRACTICA .No 1
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE EL
DESARROLLO MICROBIANO
Objetivo : Demostrar el efectos de algunos factores físicos y agentes
químicos sobre el desarrollo bacteriano.
GENERALIDADES :
En la vida diaria controlar el desarrollo microbiano es de gran
importancia para el profesional que trabaja con organismos vivos, o bien
con materiales estériles es importante conocer el fundamento de las
diferentes técnicas y aplicarlas correctamente , algunos de los factores
físicos que se utilizan para esterilizar es utilizar una temperatura elevada ,
en un medio húmedo y con presión dentro del recipiente como es el
caso de la autoclave la cual inhibe el desarrollo microbiano .
Aura Flores Pérez
Si se modifican los valores de pH los microorganismos alteran su actividad
metabólica e incluso la inhiben , las diferentes temperaturas influyen en el
crecimiento de los organismos el efecto se observa desde las
temperaturas bajas donde se disminuye la velocidad de reacción hasta la
inactivacion de las enzimas o desnaturalización debido a un aumento en
la temperatura como la usada en los hornos para esterilizar .
Así mismo se propone probar el efecto de algunos compuestos químicos
antimicrobianos dejando abierta la propuesta de los estudiantes para
probar el efecto de algún extracto vegetal con propiedades
bacteriostaticas o bactericidas . En relación a los compuestos propuestos
son : metales pesados , halógenos, desinfectantes comunes como fenol,
benzal, alcohol, determinando si el efecto es bactericida o no., y la
“eficacia” de los compuestos probados observando su efecto en el
crecimiento microbiano.
Así mismo se propone probar el efecto de algunos compuestos químicos
antimicrobiano dejando abierta la propuesta de los estudiantes para
probar el efecto de algún extracto vegetal con propiedades
bacteriostaticas o bactericida . En relación a los compuestos propuestos
son : metales pesados , halógenos, desinfectantes comunes como fenol,
benzal, alcohol, determinando si el efecto es bactericida o no., y la
“eficacia” de los compuestos probados observando su efecto en el
crecimiento microbiano.
Materiales y Reactivos :
Material y Equipo:
Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca de baquelita .
Cajas de Petri estériles.
Aura Flores Pérez
Cajas de Petri no estériles.
Hisopos estériles.
Pinzas de disección.
Asa y porta asa.
Tubos de ensaye pequenos esteriles para perforar el agar
Horno .
Matraces Erlenmeyer.
Mechero Bunsen.
Autoclave.
Algodón.
Papel de estraza.
Gradilla para tubos
Asa
5 Pipetas de 10 ml estériles y no estériles.
5 Pipetas de 1 o 2 ml estériles
REACTIVOS:
Caldo nutritivo . Cobre en forma de sal.( solución al
2% )
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HCL al 1 %
NaOH 10% Plata en forma de nitrato o coloidal
Agua destilada Yodo disuelto en alcohol al 2 %
Desinfectante para mesa( Benzal ) Alcholes : etanol 70%, metanol 70%,
propanol al 70%
Tween 80 preparado a una
concentración de 1%..
Cloro en presentación comercial
(cloralex )
Agar nutritivo Fenol al 2 %
Jabón de tocador. ( en solución ) Plomo en forma de sal ( solución al 2
%)
Detergente comercial ( en solución )
Cepas bacterianas
Staphylococcus aureus (10 ml de medio )
Escherichia coli. (10 ml de medio )
Aura Flores Pérez
PRACTICA 1.-
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO CELULAR
El catedrático : Expondrá las bases teóricas para el desarrollo
experimental , organizara el trabajo con los alumnos para su desarrollo .
El alumno :
Entregará un diagrama de flujo donde describa las cada uno de los
pasos que realizara en el laboratorio para lograr el Objetivo .
I.- ACTIVIDADES PROPUESTAS :
- Inocular con 1 ml de cada uno de los microorganismos con que se
trabajará en cada tubo con caldo nutritivo estéril.
T2.- Cada tubo será incubado durante 24 horas a diferentes temperaturas :
a - 5 °C., a 35 °C ; 45 °C ; y 75 °C.
T3.-Medir el desarrollo cualitativamente observando turbidez presente y
asignando cruces correspondientes.
T4.-Con los resultados de todas las cepas probadas ,llenar el siguiente
cuadro
Microorganismo -5°C 35 °C 45°C 75°C
E, coli
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S. aureus
.- Como explica los resultados obtenidos , con las diferentes temperaturas?
PREACTICA 2.-
IDENTIFICAR LA CONTAMINACION AMBIENTAL
Se sugiere que para probar el efecto del calor húmedo para controlar el
desarrollo microbianos, no se utilice ninguna cepa , se trabajara con la
población existente en el medio ambiente.
1.- Preparar en dos matraces Erlenmeyer , 120 ml de agar nutritivo, cada
uno. Seguir todas las instrucciones de preparación que tienen los frascos.
2.- Un matraz con medio se esteriliza en autoclave. Despues de esterilizar
el medio y esperar que se enfríe de 55°c a 60 °C., se vacía en TRES cajas
de Petri desechables, estériles. Toda la maniobra cerca del mechero.
(aproximadamente 25 -30 ml/caja)
4.- Se espera que se solidifique el medio y se incuban a 37 °C por 24 hr, revisar durante tres
días , para verificar que no exista contaminación.
5.- Una vez verificando que no hay cajas contaminadas, una se conserva la otras dos se
abren en difentes zonas del laboratorio
6.-Se incuban a 37°C por 24 -48 hr., se leen las cajas
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PRACTICA 3.-
EFECTO DE LOS FACTORES QUIMICOS SOBRE EL DESARROLLO MICROBIANO,
INSTRUCCIÓNES: Se propone que el estudiante trabaje de forma individual con una cepa,
por equipo se proporcionaran tres cepas diferentes , con las cuales se trabajaran por
diferentes personas del equipo.
Y además se propone que cada equipo utilice con una serie de reactivos otra técnica
para probar inhibición del crecimiento, la misma será investigada por cada equipo
La conclusión del desarrollo experimental se realizara en conjunto .
Previamente antes de iniciar la inoculación se deben tener preparadas y a prueba de
esterilidad suficientes cajas con agar nutritivo.
.-Usando hisópos estériles, sembrar masivamente en cajas de agar nutritivo con
cada uno de los diferentes microorganismos con los cuales se trabajara.
-En cada caja se probarán diferentes compuestos químicos, cada uno de los compuestos
químicos se colocaran colocando las soluciones dentro de los huecos.
4.-Todaslas caja donde perfore con la boca de un tubo de ensayo estéril, haga cuatro
perforaciones equidistantes .,
5..- Inocule cada caja con hisopo estéril, con Staphylococcus aureus
6.- Una caja para los alcoholes y el merthiolate que contiene mercurio : Metanol., Etanol.,
Propanol.
7.- Una caja para los halógenos : Cloro ( Cloralex)., Yodo en solución en alcohol al 2%.,
Fluor o solución bucal con fluor.
8.- Una caja con desinfectantes como Fenol 2%, 4% y al 8% ., Benzal al 2 % y benzal sin
diluir .
Incube por 24 hr a 37 °C.
10- Mida el diámetro del halo de inhibición de cada compuesto.
Aura Flores Pérez
Llene el cuadro siguiente con los resultados del experimento anotando
el diámetro de inhibición.
COMPUESTO
QUIMICO
Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus
aureus.
Plata coloidal
Cobre en solución
Sulfato de cobre al
20%
Metanol
Etanol
Propanol
Bactericidas :
Fenol
Benzal
Cloro
Yodo
Fluor
Aura Flores Pérez
NSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA .
MATERIA DE MICROBIOLOGIA
PROPUESTA PRACTICA .No 4
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN , AISLAMIENTO Y TINCIÓN
OBJETIVO: En esté experimento el estudiante desarrollara las diferentes
técnicas, de inoculación y aislamiento propuestas, comprobando cuales son
las más adecuadas dependiendo de las características morfológicas de cada
organismos .
INTRODUCCION : Las diferentes técnicas utilizadas para aislar o bien para
cultivar un organismo dependen del criterio que se utilice
Las técnicas de inoculación tienen diferente objetivo, algunas se utilizan con
el único fin de que los microorganismos se multipliquen sobre el medio de
cultivo., a estas se les llama técnicas de inoculación masiva.
Cuando se parte de mezclas bacterianas, las técnicas que se utilizan son:
aislamiento por estría cruzada, con estas técnicas se separan bacterias , sobre
la superficie del agar , y además permite comprobar si la técnica cumplió su
función haciendo una comparación de la morfología macroscópica .
El aislamiento o separación de diferentes microorganismos como levaduras
Aura Flores Pérez
de bacterias , bacterias de bacterias o bien simplemente para contar la
población microbiana por el método de las diluciónes y la siembra por
vaciado es muy común .
Materiales y Procedimientos.
Cajas de Petri estériles, con agar nutritivo.
Cajas de Petri estériles.
Matraz Erlenmeyer de 150 ml con agua estéril
Microscópio binocular.
Varilla angular de vidrio.
Asa con circunferencia.
Varilla de cristal en angulo recto.
Tubos de ensaye con 9 ml de agua destilada estéril.
Tubos de ensaye con medio de cultivo inclinado.
Mechero Fisher.
Alcohol de 95°
Pipetas estériles de 1 ml.
Pipetas estériles de 2 ml.
Aura Flores Pérez
Medio de Agar de Soya y Trpticaseína .
Algodón
Aguja de disección,
EQUIPO PARA TINCION DE GRAM.
Colorante cristal violeta.
Solución de yodo para Gram.
Solución decolorante, acetona -butanol (95%)
Safranina de Gram.
Palillo aplicador.
5Jerigas de 5 ml y de 10ml
CEPAS BACETRIANAS. por equipo
Cepas 1 de Escherichia coli o Citrobacter sp. en tubo inclinad
EL ALUMNO .
Después de leer cuidadosamente la práctica e investigar lo referente a la
misma para lograr el objetivo entregara al maestro un diagrama de flujo
donde indique los pasos a seguir .
PROCEDIMIENTO PARA BACTERIAS:
Inoculación masiva; De dos bacterias y una levadura en cajas de Petri con
medio de cultivo nutritivo, (previamente colocada a prueba de esterilidad).
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Al inocular la caja Petri semi abierta y mantenga la tapa inclinada por encima
del agar para proteger la superficie contra contaminación durante cada paso
de la operación de sembrado como se observa en la figura.
l estudiante debe tener cuidado de no rasgar la superficie del agar, durante el
sembrado, se trata que las bacterias adheridas a la asa se distribuyan sobre la superficie
del agar .
La distribución se hace con un asa o con hisopo trazando lineas paralelas
sobre la superficie y luego se continua estriando sin que se crucen las líneas
Etiquete la cajas con su nombre y el número de experimento, incúbelas a la
temperatura ambiente en posición invertida, para evitar que el agua que se
condensa en el interior de la cubierta gotee sobre la superficie de crecimiento.
La condensación puede dispersar y mezclar los organismos haciendo imposible
el aislamiento de las colonias puras.
POR VARILLA ACODADA.
En una caja de Petri se coloca 0.1ml de una suspención bacteriana ,en el
centro de la caja de Petri.
La varilla, tiene un doblez con un angulo de 90°, esta se sumerge en alcohol,
se acerca a la flama del mechero para que se inflame, siempre cerca de la
zona estéril, se deja enfriar.
Se coloca sobre la muestra se efectúa un corrimiento de la muestra con la
varilla, en un angulo de 360°C.
Se incuba a temperatura de 37°C por 24 hr.
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Observar el aislamiento de las colonias, describir la morfología colonial. Decidir en
su base a sus observaciónes cuales son las ventajas y desventajas .
Observe el crecimiento, describa la morfología colonial según se pide para
cada cepa :
ASLAMIENTO POR DILUCIONES
En cinco tubos de ensayo se colocan 9.9 ml de agua destilada estéril , se
esterilizan teniendo cuidado de dar un leve giro en sentido contrario al tapón de
rosca.
Apartir de una suspención de varios(2) microorganismos haga diluciónes ,
utilizando pipeta estéril y a partir de las dos últimas diluciónes inocule por
vaciado , agite con movimientos circulares para dispersar las bacterias .
Incube a temperatura 37 °C por 24 horas
Cuente el número de bacterias que se desarrollaron en un contador de colonias
Cual es su criterio sobre el uso de está técnica y los cuidados que debe tener
TINCIÓN DE BACTERIAS .
La tinción de Gram.
Limpie 4 portaobjetos y prepare 4 frotes idénticos en cada porta, de la
siguiente manera: cerca de uno de los extremos del portaobjetos prepare un
pequeño frotes de la cepa en estudio más o menos del tamaño de una
moneda pequeña.
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Caliente el portaobjetos sin excederse solo para fijar las bacterias al cristal.
Cubra el portaobjetos con cristal violeta de Gram teniendo cuidado de que el
liquido bañe al frote déjelo reaccionar por un minuto .
Descarte el exceso de colorante y lave en la llave brevemente.
Aplique el yodo de Gram y déjelo reaccionar por un minuto.
Lave en la llave.
Agregue con cuidado la solución decolorante , gota a gota , tan pronto como
las gotas de la solución ya no arrastren el color , lave a la llave para detener la
acción del decolorante .
Cubra el porta con la solución de Safranina ., y déjela reaccionar por 10 a 20
segundos
Lave el exceso de colorante y seque al aire .
Describa la morfología microscópica de las cepas que inóculo y compare con
las aisladas .
Aura Flores Pérez
INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ CHIAPAS
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PROPUESTA PRACTICA N°5
CURVA DE CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI .
OBJETIVO :
Se determinarán experimentalmente el tiempo que tardan dos
microorganismos diferentes en desarrollar las diferentes etapas de
crecimiento , condiciónes óptimas y variando las situación para cuantificar
como afecta en su curva de crecimiento.
INTRODUCCION :
Las células vivas presentan diferentes etapas en su desarrollo cada una de
estas indica las características de desarrollo de la población que se está
midiendo . Para medir las diferentes etapas de desarrollo se utilizan diferentes
técnicas , para la las bacterias microscópicas se recomienda la técnica de
aislamiento por diluciónes e inoculación por vaciado., comparándola con la
técnica de lectura de la turbidez .
Para las bacterias fotosintéticas se recomienda la técnica determinación de
clorofila y peso seco para cuantificar su desarrollo .
MATERIAL Y EQUIPO :
Aura Flores Pérez
7 Matraces Erlenmeyer de 150 ml
2 Matraces Nefelométricos
2 Matraces Erlenmeyer de 250 ml
2 Matraz de 500 ml Erlenmeyer
1 Matraz Kittazato
10 vasos de precipitado de 250 ml.
10 Tubos de ensayo de 16 x 150
20 Pipetas de 1 ml .
7 discos de papel filtro a peso constante
12 cajas de pertri estériles.
Algodón
Mechero Fisher.
Papel de estraza para envolver.
Papel aluminio .
EQUIPO :
Espectrofotómetro
Bomba de vacio
Contador de colonias
Aura Flores Pérez
Embudo Buchner
Una agitadora de matraces
Una lampara de luz natural
Autoclave
Horno
agua destilada.
agar nutritivo
CEPAS
caldo nutritivo con la cepa de Escherichia coli con un crecimiento de 10 a 12hr
a 37 °C
Matraz con cepa de Phormidum .
Desarrollo experimental propuesto :
DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO POR METODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
De forma simultánea también leerá la variación de la absorvancia durante el
desarrollo de la curva de crecimiento, de tal forma que compare ambos
resultados .
Aura Flores Pérez
a) En un matraz nefelométrico prepare 50 ml de medio de cultivo , esterilizar y
dejar 24 horas a prueba de esterilidad .
b) inocular al mismo tiempo los dos matraces el erlenmeyer con 100ml de medio
y el nefelométrico con 50 ml de medio .
c) Iincubar a 37 °C en agitadora
CIANOBACTERIAS :
Para diferenciar la técnica usada en la determinación de el crecimiento de
bacterias y de cianobacterias, prepare medio de cultivo para cianobacterias
y distribúyalo en 7 matraces.
Incubar la CIANOBACETRIA a temperatura ambiente, y con una lampara de
luz blanca .
La determinación se realizara por cuantificación de clorofila y peso seco , en
papel filtro wattman ., y por clorofila la lectura se realizara cada 24 horas en
el caso de cianobacterias .
TECNICA DE AISLAMIENTO :
Aura Flores Pérez
1.- Una ves que se tiene el cultivo de Escheria coli, en caldo nutritivo en las
condiciónes especificadas .
2.- Rotular los tubos con claves que indique la serie de diluciónes que se
realizaran en los recipientes que contienen 9.9 ml o bien se puede hacer en
frasco de gerber añadiendo 99 ml de agua y esterilizar en agua destilada .
3.- Se recomienda tomar cada hora las muestras durante las siguientes 6
horas y despues cada 2 horas hasta concluir el tiempo de prueba .
4.- Al cumplirse cada uno de los intervalos ,
Usted tomará con la pipeta exactamente 0.1ml de cultivo bacteriano y lo
transferirá al tubo con 9.9 ml de agua destilada estéril .
Tape bien el tubo y agítelo bien para desbaratar los racimos de bacterias
Esta primera dilución es 1:100 del cultivo original .
5.- Transfiera con la pipeta exactamente 0.1ml de está dilución al siguiente
tubo con 9.9 ml de agua estéril, repitiendo el lavado de la pipeta como en el
caso anterior .
Agítelo bien. En esta nueva suspención es una dilución 1: 10 000 del cultivo
original
6.-Repita dos veces más el mismo procedimiento transfiriendo exactamente
0.1ml de esta nueva dilución como anteriormente se explico .
Aura Flores Pérez
7.- Para inocular de las diluciónes que anteriormente se realizaron, se
seleccionan de las últimas dos diluciónes 1 ml , utilizando la técnica de
vaciado, cuidar que la temperatura del medio no sea muy alta ,
inmediatamente agitar para distribuir las bacterias por todo el medio ,
8.- Espere que solidifique el agar, inviértalas e incube a 37 °C por 24 - 28 hr.
Para preparar el medio para cianobacterias se da siguiente lista de materiales
.
SOLUCION DE MACROELEMENTOS SOLUCION DE MICROELEMENTOS
NaHCO3 25 g/l H3BO3 2.85 g/l
Ca CL 2. 2 H2O 25 g/l MnCL2.4H2O 1.81 g/l
Mg SO4 7 H 2 0 25 g/l ZnSO4.7 H2O 0.222 g/l
Na2CO3 5 g/l CuSO4.5 H2O 0.080 g/l
Na2EDTA. 2H2O 1.1 g/l MoO3Na 0.015 g/l
KNO3. 7H2O 200 g /l
K32HPO4 25 g/l
FeSO4.7H2O 1 g/l
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1.- De esta solución se toma 1 ml y se añade a 1 l de agua tanto de
macroelementos como de microelementos .se esteriliza en autoclave.
2.- Se inocula con una suspención de 10 ml de cianobacterias , en condiciónes
de esterilidad con una pipeta estéril .
3.- Se incuba cerca de una lampara de luz blanca , se mueve de ves en
cuando, o bien se coloca en una agitadora para que suavemente se agite .
4.- Para determinar su crecimiento se puede determinar la concentración de
clorofila por día , y hacer una curva de peso seco contra tiempo
Aura Flores Pérez
INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUÍMICA
MATERIA DE MICROBIOLOGIA
PROPUESTA PRACTICA N°6
INOCULACION EN MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS ,
DIFERENCIALES Y ENRIQUECIDOS
MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDO , SELECTIVO Y DIFERENCIAL
OBJETIVO: Seleccionar los medios de cultivo en base a su función y
composición química, determinar la morfología macroscópica de las cepas
en los diferentes medios .
INTRODUCCION: Los medios de cultivo se clasifican en base a diferentes
características , desde el punto de vista de composición química y en base a su función .
Es importantes identificar las funciones bioquímicas que tiene cada uno de los
componentes dentro de los medios de cultivo, en este desarrollo experimental se
propone que el alumno seleccione diferentes medios de cultivo como pueden ser medios
enriquecidos, selectivos y diferenciales , que más frecuentemente se utilizan para
identificar las características macroscópicas que caracterizan a cada cepa .
Aura Flores Pérez
Para estudiar el medio donde se cultiva un tejido vegetal ., se sugiere hacer
una revisión bibliográfica del tema y visitar un laboratorio que se especialice en
esto .
MATERIALES Y REACTIVOS:
MATERIALES Y EQUIPOS. REACTIVOS.
Autoclave
Medio de cultivo sólido
enriquecido, selectivo,
diferencial.
Estufa de incubación Medio de cultivo líquido.
Horno Agua destilada
Mechero. Desinfectante.
Cajas de Petri. Soluciónes Bouffer para calibrar
potenciómetro.
Tubos con tapón de rosca.
Matraces Erlenmeyer CEPAS.
Probeta. Escherichia coli (bacilos, G-)
Espátula. Bacillus subtillis (bacilus, G +)
Balanza. Staphylococcus aureus ( cocos G
+)
Gradilla. Pseudomonas aeruginosa (
Aura Flores Pérez
bacilo G-)
Microscópio estereoscópico .
Potenciómetro.
Asa y portasa.
Algodón.
PROCEDIMIENTO:
MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y/ DIFERENCIALES.,Y ENRIQUECIDOS .
Para el desarrollo de está práctica se recomienda primero a partir de una lista
de medios existentes en el laboratorio seleccionar y clasificar los medios de
estos distinguir dos o tres medios que se encuentren clasificados como medios
complejos y sintéticos.
Elegir dos medios de cultivo enriquecidos, dos selectivos, y dos diferenciales
A partir de una lista de medios hacer la clasificación y llenar el siguiente
cuadro:
Aura Flores Pérez
Clasificación de Medios de Cultivo
PROCEDIMIENTO :
Preparar medio de cultivo:
MEDIO DE CULTIVO : Escherichia coli Staphylococcus aureus
EMB
MAC CONKEY
XLD
VERDE BRILLANTE
ASM
SS AGAR
1. Para los medios con agar , se siguen las instrucciones que hay en cada uno
de los medios , para pesar y disolver los componentes del medio.
2. Se debe dejar a “ Prueba de Esterilidad “ por 24 hr .
3. Los medios después de prepararlos y haber pasado la prueba de esterilidad
, se pueden utilizar, o bien guardarlos en refrigeración.
4. La inoculación de los medios con las cepas se hará con una asa. Y se
recomienda la estría cruzada para aislar las colonias y hacer la descripción
Aura Flores Pérez
morfológica de cada una de las cepas microbianas en los diferentes medios
de cultivo.
5. Anotar las características morfológicas de las diferentes cepas como son:
forma de la colonia:
tamaño de la colonia:
bordes:
elevación:
apariencia:
7. Por regla general siempre se debe hacer frote y tinción de la cepa que se
inocula antes y despues que está se desarrollo para verificar que no hubo
contaminación.
Con respecto al desarrollo morfológico en los diferentes medios se recomienda
consultar el Manual Bioxon para verificar que la colonia inoculada se
desarrollo conforme se esperaba.
Se recomienda consultar el capítulo de medios de cultivo de esté texto ,como
guía.
Anote y fotografie el color de los medios antes de inócular compruebe que es
como lo marca la bibliografía
Después del desarrollo microbiano y diga como es el color del medio e
interprete el significado del cambio , del crecimiento o de la inhibición del
microorganismo .
OBSERVACIONES
INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ
Aura Flores Pérez
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA .
MATERIA DE MICROBIOLOGIA .
PROPUESTA PRACTICA N° 7
PARA PROBAR MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIA
( PRUEBAS BIOQUÍMICAS.)
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES .
Durante el proceso de aislamiento e identificación de bacterias en el trabajo
de laboratorio se seleccionan medios de cultivo para dirigir la selección de
bacterias que se consideran patógenas o enterotoxigenicas ., en el caso de
que el aislamiento sea dirigido a otros fines como aislar microorganismos con
actividad antibiótica, o productores de enzimas, vitaminas u otros., la estrategia
de selección cambia .
Una ves que las bacterias se aislaron en medios selectivos y/o diferenciales, y
se determina que se ha logrado aislar una sola colonia microbiana, con las
características morfológicas que son interesantes, como lo es el que sean o no
fermentadoras de azucares como lactosa , tamaño, apariencia , color entre
otros.
Posteriormente se inoculan en medios enriquecidos para que de aquí, se
toma un inóculo para hacer las pruebas bioquímicas,
Aura Flores Pérez
MATERIAL: REACTIVOS:
Tubos de ensaye de 13 x100 Agar MIO
Matraces erlenmeyer de 125 ml. Agar SIM
Probeta de 50 ml Agar de LIA
Espátula Agar TSI
Mechero Agar de Citaro de Simons.
Balanza granataria. Gelatina nutritiva.
Autoclave. Caldo R.M. - V.P.
Gradilla. Caldo Urea.
Asa bacteriológica.
CEPAS
Escherichia coli.
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis.
Aerobacter sp.
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Estas pruebas se desarrollan en medios diferenciales , donde el
microorganismo inoculado debe tener una única célula de origen., aislado de
las otras colonias que se hayan desarrollado. Las pruebas que se realizan
reciben diferentes denominaciones ., las más comunes son :
MIO : M : MOVILIDAD., I INDOL., O: DESCARBOXILACIÓN DE LA ORNITINA.
SIM : S: SULFURO DE HIROGENO I : INDOL M: MOVILIDAD.
LIA: L : LISINA DESCARBOXILACIÓN.
TSI : FERMENTACIÓN DE TRES AZÚCARES : GLUCOSA., SACAROSA., Y
LACTOSA.
CITRATO DE SIMMONS: UTILIZACIÓN DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE
ENERGIA Y DE CARBONO..
CALDO R.M. - V.P. : DETERMINA LA HABILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS
PARA PRODUCIR, ACIDO( R.M.) O ACETOINAS ( V.P.) A PARTIR DE GUCOSA.
CALDO UREA: DETERMINAR LA CAPACIDAD PARA PRODUCIR UREASA .
Desarrollo:
1.- Preparar los medios de cultivo especificados, calculando los mililitros para
un tubo por cepa y un tubo testigo. (Verificar antes de preparar el medio el pH
del agua )
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2.- Distribuirlos, colocando 3 ml en cada tubo. Taparlos con algodón y
colocarlos en un recipiente para esterilizar.
3.- Esterilizar según las indicaciones específicas para cada medio de cultivo .
4.- Después de esterilizar, gelificar los medios de:
LIA, la inclinación no debe ser pronunciada.
TSI (Triple azúcar y hierro) , se debe inclinar lo suficiente para que se forme un
pico de flauta largo.
El Citrato de Simons inclinación normal.
El SIM no se inclina , se deja detenido en la gradilla para que se gelifique en
ese lugar.
5.-Dejar a prueba de Esterilidad por 24 hr a 37°C.
6.- Inocular cada cepa en la serie de pruebas bioquímicas preparadas,
siguiendo las instrucciones de sembrado para cada una.
7.-Incubar el tiempo señalado para cada prueba y a la temperatura
especificada.
8.-Después del tiempo de incubación , observar detenidamente cada prueba
comparando con el tubo testigo los cambios que se han producido y en el
caso necesario agregar reactivos que se indican.
9.- Con los resultados obtenidos , elaborar un cuadro y consultar la bibliografía
para comprobar la identidad del microorganismo estudiado.
PRUEBAS COMUNES PARA EL ESTUDIO DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE.
Aura Flores Pérez
PRUEBA MEDIO/
INOCULO
REACTIVO INCUBACION
a 37°C
POSITIVO NEGATIVO.
INDOL caldo peptonado
o caldo triptona.
0.5 de reactivo
Kovacs.
1-2 dias Rojo Amarillo claro
R.M.
ROJO DE
METILO (RM)
Caldo glucosa 0.5 ml rojo de
metilo
1-2 Rojo Amarillo
V.P.
VOGES-
PROSKAUER.
Caldo glucosa 0.2ml de KOH
0.6ml de alfa
naftol 5%.
1-2 Rojo Turbio o café
CITRATO DE
SIMMONS
Medio de
Simmons con
Azul de
bromotimol,
inoculado en
estría
ninguno 4 días Crecimiento y
vire del medio a
color azul.
Medio de color
verde
( no vira )
PRODUCCIÓND
E H2S
TSI o Kligler
(inoculación por
picadura y
estria)
ninguno 1-2 hasta 7 días En la picadura se
lee un
precipitado
negro.
No cambia.
PRODUCCION
DE UREASA
Caldo Stuart rojo
de fenol
ninguno 2 horas Violeta Rojizo
CRECIMIENTO
EN KCN
Caldo cianuro de
Moeller.
2 dias crecimiento no crece.
PRODUCCION
DE FENIL
ALANINA DE 5
AMINASA
Agar fenil
alanina(estria)
0.4 de FeCl 10% 1 dia Producción de
ac. fenilpirúvico ,
verde en la estría
.
Amarillo
L I A. Medio de Moeller
con púrpura de
ninguno 4 días Moeller : violeta
ó Rojo
Amarillo
fermentación de
Aura Flores Pérez
M I O.
DESCARBOXILA
SA DE LA
ORNITINA,
LISINA Y
ARGININA.
bromocresol ,
sello de aceite
mineral o
parafina./ inoculo
picadura.
Medio de
Falkow con
purpura de
bromocresol.
Falkow púrpura.
la glucosa.
SIM
SULFURO DE
HIDROGENO.
INDOL.
MOVILIDAD.
SIM (picadura)
indol:
0.5 ml de
reactivo de
Kovacks
2 dias Sulfhidrico :
precipitado negro
Indol : rojo
Movilidad: turbio
o difución del
inóculo.
SH: color del
medio no
cambia.
Indol: amarillo.
Movilidad :solo
crece en la
picadura.
T S I
FERMENTACIO
N DE
AZUCARES
:GLUCOSA
SACAROSA Y
LACTOSA.,
T S I.
Medio
enriquecido y
con rojo de fenol
., tiosulfato.,
fierro.
18- 24 Hr Superficie
lactosa +
:amarillo.
Fondo amarillo y
burbujas de aire
:
Sin cambio o de
color rojo
:lactosa -
Sin cambio:
Aura Flores Pérez
MOVILIDAD Y
PRODUCCIÓN
DE SH
GAS DE
GLUCOSA
glucosa +., gas
+
Fondo y
picadura negro:
H2S +
glucosa -
sacarosa -
Fondo sin
cambio.
PRUEBA MEDIO REACTIVO INCUBACIÓN POSITIVO NEGATIVO.
INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ.
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
PROPUESTA PRACTICA DE MICROBIOLOGIA
Aura Flores Pérez
PRACTICA N° 8 HONGOS
OBSERVACION E IDENTIFICACIÓN MORFOLOGICA DE HONGOS.
OBJETIVO:
Identificar las características macroscópicos y microscópicas más distintivas de
algunas cepas de hongos , observando la organización de sus estructuras
reproductoras Para esto se deberá utilizar la técnica de inoculación para
hongos filamentosos, y para levaduras
MATERIAL: REACTIVOS:
Estufa de incubación. Alcohol para flamear las pinzas y aguja.
Caja de Petri. Fenol al 2%
Varilla doblada en V Medio de cultivo para hongos : PDA O
AGAR CZAPEC.
Pipetas pasteur. Glicerina 20% , estéril.
Pipetas graduadas de 10 ml. (estériles) Formaldehido 10%
Porta objetos. Colorantes para la técnica de gram
Cubreobjetos. Colorantes para la técnica de azul de
algodón acético.
Espátula Desinfectantes.
Bisturí. MEDIO DE CULTIVO :
Pinzas de disección. P.D.A.
Aguja de disección CZAPECK
Aura Flores Pérez
Vaso de precipitado de 100 ml
Mechero Fisher.
Cepas:
Rhizopus nigricans
Mucor rouxxi
Aspergillus niger.
Penicillium sp.
Neurospora sitophila.
Hansenula polymorha.
Sacharomyces cerevisiae.
Desarrollo :
1.- Preparar con anticipación cajas con medio de PDA. Y Czapeck .
2.- A partir de los tubos donde se han desarrollado las cepas de hongos y
levaduras, tomar el inoculo con el asa recta o bien asa con un doblez en un
angulo de 90°., tomar una muestra de las hifas o esporas de los hongos y
depositarla en el centro de la caja con medio de cultivo.
En el caso de levaduras se inocula haciendo estrias para separar las colonias
.
3.- Las cajas se incuban a temperatura ambiente durante 4 a 8 días ., se
deben revisar diariamente , para verificar el desarrollo .
Aura Flores Pérez
4.- Cuando se observe que el desarrollo es suficiente se anotan los siguientes
datos: ver tabla N° 1.
5.-Describir la morfología microscópica tomando un poco del micelio entre
porta y cubreobjetos, tratando de desorganizar lo menos posible las estructuras
del hongo. Puede usarse lugol o lactofenol para la preparación.
6.-A las cepas de hongos levaduriformes , hacerles frote y teñir por el método
de Gram, observar a inmersión.
7.-A las cepas de hongos filamentosos practicarle el método del microcultivo,
para su completa observación.
8.-Compara sus observaciones con la bibliografía y anotar sus conclusiones.
Tabla N°1 Descripción de las características macroscópicas y
microscópicas de los hongos
Si las hifas son septadas o no.
El color del micelio
Si el micelio es claro o ahumado
Aspecto de la colonia si es un hongo filamentoso ; algodonosa.,
aterciopelada .,arenosa, vellosa.
La producción de esporas : sexuales o asexuales
Clasificación de el tipo de espora que se produce : oospora.,
cigospora., ascospora., basidiospora.
Aura Flores Pérez
Tabla N°1 Descripción de las características macroscópicas y
microscópicas de los hongos
Clase de esporas asexuales : esporangiosporas , conidios o
artrosporas
Característica de las estructuras donde se forman las esporas:
esporangios: tamaño, forma , color y locallización.
Conidios : simples ., ramificados , en cadena., formados por
gemación., en masas.
Forma y disposición de los esterigmas o fiálides.
Aspecto de los esporangióforos o conidióforos : simples o ramificados ,
tipo de ramificación ., tamaño y forma de la columnela apical del
esporangióforo.
Presencia de estructuras especiales: estolones., rizoides., células
basales., apófisis., clamidospoas., esclerocios ., etc.
METODO DEL MICROCULTIVO:
a.- Esterilizar cajas de petri de cristal , y dentro de está una varilla de cristal en
V ., encima de este se coloca un portaobjeto y un cubreobjeto.
b.- Preparar una caja con medio de cultivo para hongos (sabourond.,
czapeck. o papa dextrosa agar), en la parte externa de la caja cuadricular de
manera que se formen cuadros de 1 cm 2 .
Aura Flores Pérez
c.- En forma estéril , con bisturí, cuadricular por dentro del agar y transferir un
cúbito del mismo, al portaobjetos.
d.- Inocular con una cepa pura el centro de los cuatro costados con el asa en
angulo en 90° y despues colocar el cubreobjetos sobre el cubo de agar
inoculado.
e.- Con una pipeta estéril colocar en la base de la caja 10 ml de glicerol al 20%
estéril, cuidando de no mojar el microcultivo.
f.- Incubar a 28°C, observar cada 24 hr hasta detectar un buen desarrollo.
g.- Cuando se observe crecimiento del hongo, retirarle con una pipeta pasteur
y bulbo de hule, el glicerol al 20% estéril, cuidando de no mojar el microcultivo
.
h.- Agregar solución de formaldehido al 10% y dejarlo un mínimo de 2 horas
para su inactivación.
i.- Sacar el microcultivo. Puede observarse en microscopio estereoscópico y
después practicarle alguna tinción para hongos.
J.- Separar cuidadosamente el portaobjetos del cubreobjeto, quitar el agar
con cuidado , para no desorganizar el crecimiento , y teñir cada uno por la
técnica de azul de algodón acético.
Aura Flores Pérez
Aura Flores Pérez
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