Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental...
Transcript of Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental...
![Page 1: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/1.jpg)
Inducción de Proteína
Recombinante
Bioquímica Experimental
2020-2
Q.A. Moisés Méndez Ramírez
Dra. Sobeida Sánchez Nieto
![Page 2: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/2.jpg)
Utilidad de la producción de proteínas recombinantes• Amplia variabilidad de aplicaciones científicas y comerciales.
• Creciente investigación en ingeniería genética para mejorar la eficiencia en su producción y obtención en diferentes sistemas.
• Desarrollo de nuevos protocolos y herramientas de manipulación y purificación.
![Page 3: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/3.jpg)
Logros de la ingeniería genética
![Page 4: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/4.jpg)
Impacto de la ingeniería genética en la sociedad
https://elpais.com/noticias/manipulacion-genetica/
![Page 5: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/5.jpg)
Elección del sistema de clonación
![Page 6: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/6.jpg)
Sistema de expresión en bacterias: E. coli
Ventajas:• Fácil manipulación genética.• Secuencia conocida.• Mínimo entrenamiento de manejo.• Tiempo corto de propagación.• Medios de cultivo y procesos de
operación baratos.• Fácil escalamiento y automatización.
Limitantes:• Perdida de funcionalidad o nula expresión de
proteínas de eucariontes y de membrana.• Diferente carácter químico de citoplasma. • Formación inadecuada de enlaces disulfuro.• Niveles altos de proteasas.• Gran diferencia entre chaperonas.• Mínimas modificaciones post-traduccionales.• Baja capacidad de secreción de proteínas solubles.• Proteínas no glicosiladas.
![Page 7: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/7.jpg)
Cepas más empleadas de E. coli
• BL21 (DE3)
• Contiene al gen T7 de RNApolimerasa.
• Útil para plásmidos con promotor T7.
• Alta expresión de proteínas recombinantes.
• Baja actividad de RNAsas.
• Ausencia de proteasas de membrana externa (OmpT), reduce degradación de proteínas heterólogas.
• Inducción por IPTG.
• DH5α
• Alto rendimiento y calidad del DNA.
• Asegura la estabilidad del inserto; previene la recombinación.
• Permite selección de colonias por coloración blanca o azul en X-gal (Blue/White screening).
• Evita degradación por endonucleasa.
• E. coli str. B F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
F– endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG purB20 φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK–mK+), λ–
Genotipo:Genotipo:
La elección de la cepa dependerá de la aplicación, la eficiencia, el genotipo y fenotipo deseado.
![Page 8: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/8.jpg)
Características básicas de un vector de clonación
• -Marcador de selección.• -Sitio de clonación múltiple.• -Origen de replicación.• -Promotor y terminador para el gen de interés.• No contiene al gen de interés. (Es el vector vacío)
![Page 9: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/9.jpg)
Vector de clonación pET 24 (+)
![Page 10: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/10.jpg)
Vector recombinantepET-TEM-1-ompA-β-Lactamasa
• El vector pET-TEM-1 promueve la sobreexpresión de β-Lactamasa( ̴ 32kDa), unida al péptido señal ompA ( ̴ 1.kDa).
• Confiere resistencia a Kanamicina.
• Posee la secuencia del promotor T7 del bacteriofago T7 y al operador y represor del operón Lac.
![Page 11: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/11.jpg)
Utilidad de las -lactamasas
• β-Lactamasas catalizan la hidrólisisdel enlace de amida en el anillo β-lactámico de penicillinas ycefalosporinas, siendo su producciónun mecanismo de resistencia.
Estructura de los clases A-D de β-Lactamasas
![Page 12: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/12.jpg)
La producción de proteínas puede estar regulada en diferentes niveles
![Page 13: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/13.jpg)
Operón LacUnidad regulatoria que contiene varias regiones diferentes de genes estructurales controlados por un solo promotor:
Promotor, Operador, Genes estructurales, Terminador.
![Page 14: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/14.jpg)
Inducción de la expresión de β-Lactamasa
El IPTG (isopropil-β-galactosidasa) induce la expresión de la proteína de interés al unirse a la proteína represora de LacI, permitiendo la síntesis y unión de la RNApolimerasa T7.
El promotor T7, es un promotor fuerte del bacteriófago T7 que favorecerá la unión de la polimerasa.
Bajo estas condiciones se dará un mayor nivel en la transcripción del gen de interés.
![Page 15: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/15.jpg)
Protocolo Experimental
![Page 16: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/16.jpg)
Protocolo experimental para obtener la curva temporal de expresión de -lactamasa
![Page 17: Inducción de Proteína Recombinante...Inducción de Proteína Recombinante ioquímica Experimental 2020-2 Q.A. Moisés Méndez Ramírez Dra. SobeidaSánchez Nieto Utilidad de la producción](https://reader035.fdocuments.co/reader035/viewer/2022062402/5eb3ae420bba3f2f307df494/html5/thumbnails/17.jpg)
Ligas de interés
• Science and History of GMOs and Other Food Modification Processes.
https://www.fda.gov/food/agricultural-biotechnology/science-and-history-gmos-and-other-food-modification-processes
• A time line of biotechnology
https://blogs.systweak.com/biotechnology-journey-from-its-origin-till-date-infographic/
• The Evolution of the Revolution. Biotechnology time line.
https://topforeignstocks.com/wp-content/uploads/2018/11/Innovations-in-Biotechnology-A-Timeline-New.png
• Schumann, Wolfgang, & Ferreira, Luis Carlos S.. (2004). Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genetics and Molecular Biology, 27(3), 442-453.
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1415-47572004000300022
• Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in microbiology, 5, 172. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172
• Julian K-C. Ma, Pascal M. W. Drake and Paul Christou. (2003 ) The production of the recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews. Genetics, 4, 794-805.
https://www.nature.com/scitable/content/Genetic-modification-The-production-of-recombinant-pharmaceutical-15030/#
• C. L. Tooke, P. Hinchliffe, E. C. Bragginton, C. K. Colenso, V. H.A. Hirvonen, Y. Takebayashi, J. Spencer. (2019). β-Lactamases and β-Lactamase Inhibitors in the 21st Century. Journal of Molecular Biology, 413 (18), 3472-3500. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2019.04.002.
• Briand, L., Marcion, G., Kriznik, A. et al. A self-inducible heterologous protein expression system in Escherichia coli. Sci Rep 6, 33037 (2016). https://doi.org/10.1038/srep33037