ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Práctica n° 3

Aislamiento e Identificación de Coliformes Fecales provenientes de carne molida cruda

Grupo N° 5 – B

Integrantes:

Karen Galindo

Jelissa Patiño

Pamela Quespás

Fecha de Realización: miércoles 20 de Mayo de 2015

Fecha de Entrega: viernes 29 de Mayo de 2015

1. Resumen

El objetivo de la práctica fue aislar e identificar posibles colonias de coliformes fecales presentes en carne molida en diferentes medios de cultivo. La metodología empleada fue un rayado de microorganismos en dos cajas petri para cada uno de los medios EBM y MacConkey. Luego de 24 horas se realizó la prueba de Gram Stain y se analizaron las muestras al microscopio; después de comprobar la presencia de coliformes se realizó nuevamente en cada uno de los medios un inóculo para dentro de 24 horas más comprobar el desarrollo únicamente de dicha bacteria. Se constató la presencia de otros microorganismos puesto que no se trataba de medios específicos así como también que en las segundas siembras la mayoría de los microbios eran coliformes. Se recomienda respetar los tiempos de la tinción de Gram para que la muestra refleje los colores característicos de la especie.

2. Fundamento Teórico

Los coliformes son un grupo de bacterias entéricas que comparten características bioquímicas en común y son útiles como indicadores de sanidad de alimentos y agua, clasificándose así en fecales y totales. Entre los más importantes se encuentra la E.coli, enterobacter, klebsiella y citrobacter.

Características de coliformes totales:

Bacilos Gram negativos (se tiñen de color rosado). Aerobios o anaerobios. No son esporógenos. Son oxidasa negativos (no usan oxígeno durante la transferencia de electrones). Fermentan la lactosa produciendo ácido láctico y gas en 24-38 horas a 36ºC.

Los coliformes fecales comparten las mismas características que los anteriores, pero además:

Crecen con lactosa y la fermentan a 44.5ºC ± 2ºC produciendo ácido y gas en las primeras 48 horas de incubación.

Son termotolerantes (Castro, 2009, p. 4 – 6)

Estos han sido considerados tradicionalmente como indicadores de deficiencias en la calidad microbiológica en el tratamiento del agua destinada para el consumo humano y de determinados alimentos. Esto se debe a que en medios acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales, así que su ausencia indica que el agua es microbiológicamente segura. Con respecto a los alimentos, cuando su presencia excede en número a un valor de referencia experimentalmente establecido en la leche pasteurizada, por ejemplo, se pueden advertir ciertas deficiencias de este producto, como:

Tratamiento térmico insuficiente. Contaminación posterior al tratamiento. Almacenamiento del producto final a una temperatura demasiado elevada

(Calderón, 2000, p. 20).

Los medio más utilizados para la siembra e identificación de coliformes son los siguientes:

MacConkey Agar

Es un medio de cultivo específico para bacterias gram negativas y cepas que fermenten (Lac+) y que no (Lac –), la lactosa, además, sirven como un indicador visual de pH.

(Lac +): Se encuentran las bacterias como Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella, las cuales producen acidez, disminuyendo el pH bajo 6,8, dando como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas.

(Lac –): Son bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella, las que utilizaran peptona en su lugar, formando amoniaco, esto incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras.

(Slow –): Son bacterias que, en cambio fermentan la lactosa de manera lenta, como: Serratia 3 y Citrobacter 4 (Camacho, 2009, p.2; Castro, 2009, p. 7).

EBM Agar

Es un medio de cultivo denominado también EAM, selectivo y diferencial que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas, y muestra si las últimas que crecen son o no fermentadoras de lactosa. Se utiliza también para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales, permitiendo el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae (Camacho, 2009, p.2).

3. Equipos y Materiales utilizados

Muestras producto del enriquecimiento. Cajas petri de MacConkey Agar. Cajas petri de EBM Agar. Asas. Mechero. Estufa a 35 y 44 °C; modelo BOEKEL 132000, de 3 – 9 °

4. Descripción de la actividad

Purificación.

Se tomó con el ansa una gota de la solución con coliformes y se prepararon streak plates en los medios MacConkey agar y EBM. Se incubó 24h a 35°C.

Luego de ese tiempo, se examinaron los medios para determinar colonias típicas de Coliformes fecales.

Se tomó una colonia sospechosa, se realizó Gram Stain para confirmar que es Gram – y se prepararon streak plates en los medios MacConkey agar y EBM. De nuevo se incubaron por 24h a 35°C.

Se analizaron las colonias, se tomó una colonia sospechosa, se realizó Gram Stain y se confirmó que es Gram –.

Identificación.

Mac Conkey Agar: Las colonias sospechosas son pequeñas de forma circular y color rosado.

EBM Agar: Las colonias sospechosas son de color verde brillante metálico.

Gram Stain

Se hizo un frotis de una colonia en un portaobjetos, siguiendo elsiguiente procedimiento:

Se puso una gota de agua destilada en el portaobjetos. Se tomó una colonia con el ansa y se disolvió en la gota de agua destilada. Se evaporó el agua con el mechero. Se agregó una gota de violeta de metilo y dejó que se tiña por 2 minutos. Se lavó delicadamente con agua. Se agregó yodo y dejó por 2 minutos. Se decoloró con acetona suave y rápidamente. Se lavó con agua. Se tiñó con fucsina durante 1 minuto. Se lavó con agua. Se vio en el microscopio. Células teñidas de violeta eran Gram +; células teñidas de

rosado eran Gram –.

5. Resultados

Tabla 5.1 Observaciones de la primera incubación, luego de 24 horas a 35°C

Medio Muestra Contenido de coliformes Gram Stain

EBM Primer Streak Plate 1 Gram -Segundo Streak Plate 1 Gram -

MacConkey Tercer Streak Plate 2 Gram -Cuarto Streak Plate 3 Gram -

Tabla 5.2 Observaciones de la segunda incubación, luego de 24 horas a 35°C

Medio Muestra Contenido de coliformes Gram Stain

EBM Primer Streak Plate 3 Gram -Segundo Streak Plate 2 Gram -

MacConkey Tercer Streak Plate 3 Gram -Cuarto Streak Plate 3 Gram -

6. Discusión de resultados

La identificación de Coliformes fecales en la carne molida cruda sobre el medio EBM en la primera incubación se logró. Al observar los Streak Plate se visualizaron dos tipos de colonias identificables, unas de color violeta oscuro y otras de color verde metálico, indicando la existencia de diferentes microorganismos al utilizar el eosina azul de metileno (EMB) el mismo que funciona como medio diferencial en el aislamiento y detección de coliformes al existir varias bacterias en la muestra es decir los colorantes analíticos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. En la bibliografía se menciona que las colonias lactosa (+) dan colonias de color violeta, los coliformes presentan un característico brillo verde metálico, las de enterobacter presentan un color violeta sin brillo metálico (ojo de buey).

La presencia de tipos diferentes de microorganismo se debió a que el inóculo fue tomado de una muestra enriquecida con microorganismos el mismo que mayoritariamente poseía coliformes este no estaba exento de otros, por ello se llevó a la identificación y posterior aislamiento de microorganismo de interés, por ello los primeros platos poseían pocas colonias de interés debido a que la competencia con las otras bacterias se vio limitada las pocas las mismas que fueren analizadas bajo el Gram Stain y posteriormente se aisló, Al tomar el inoculo de las colonias visualizadas en los primeros platos y posterior al tiempo establecido se comprobó eficazmente que el microorganismo fue aislado debido a que en los streak plates se observaba sobre el rayado solo color verde brillante metálico es decir las colonias sospechosas evidentemente eran coliformes, al realizar Gram Stain se comprobó lo dicho. Al realizar Gram Stain, los bacilos Gram - toman un color rosado. Esto se evidencio en el microscopio.

Al trabajar en el segundo medio de MacConkey este medio es selectivo, utilizado para la investigación presuntiva de microorganismos coliformes, Debido a que el componente estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora Gram positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH.se pudo observar que tanto los inóculos de los Streak Plate de la primera y segunda incubación en este medio proliferaron en exceso, el rayado fue difícil reconocerlo debido a que las colonias cubrían todo el plato, se sospechaba de coliformes puesto que las colonias eran redondas y de color rosado intenso se tomó una muestra y efectivamente correspondía a Gram-. Para este medio la identificación y aislamiento no hubo problema.

Como se mencionó anteriormente la muestra del cual se tomó los inóculos para los primeros platos enriquecidos mayoritariamente con coliformes, pero esto no exenta que

existieran otros, logrando ser identificados en cada medio selectivo. Por esta razón se observaron colonias de color morado en menor proporción al realizar Gram Stain adicional a esto pudo haber contaminación durante la realización de cultivos debido a que también se tenía muestras en las que existían otro tipo de microorganismos como los staphylococcus.

7. Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones:

Se constató la presencia de otros microorganismos en la primera siembra en cada uno de los medios.

Los medios en los que se trabajó eran definidos no específicos. En las segundas siembras la mayoría de los microorganismos visualizados eran

coliformes. Las bacterias Gram – vistas al microscopio presentan un color rosado – rojizo. Después de 24 horas se evidenció un crecimiento microbiano abundante en ambos

medios de cultivo.

Recomendaciones:

Realizar el mismo procedimiento para muestras de agua y leche, que son alimentos de consumo global, y determinar de esta manera, si la calidad de los mismos hace que sean consumiblemente aptos.

8. Nomenclatura

En las tablas 5.1 y 5.2, según la cantidad de colonias:

0 = ninguna 1 = baja 2 = media 3 = alta

9. Preguntas

¿Qué dificultades encontró en esta práctica?, ¿cómo las solucionó, o cómo las evitaría?

Una de las dificultades de la práctica fue el reconocimiento de las colonias de coliformes fecales en el microscopio. Lo importante en este caso es seleccionar adecuadamente la colonia sospechosa, y no olvidar de donde se tomó la muestra. Al utilizar el microscopio se debe enfocar correctamente, seleccionando el lente respectivo y limpiar los lentes si es necesario.

En el Gram Stain, podría ocurrir confusiones en la toma de pigmentos. Para evitar esto se puede etiquetarlos de tal manera que no exista confusión alguna es decir (numerarlos), debido a que muchas personas realizan este procedimiento al mismo tiempo .Con esto se asegura elegir correctamente los reactivos.

¿Qué haría en el caso de que en la segunda rayada de platos se obtenga un Gram+ y un Gram– al mismo tiempo? ¿Qué significa esta mezcla? El hecho de que en el segundo rayado sea posible visualizar una mezcla de bacterias Gram+ y Gram- puede significar que la siembra de los microorganismos no se desarrolló de una manera adecuadamente aséptica o que existió contaminación debido al trabajo con diferentes especies en una misma área de trabajo. Al comprobar que la siembra no obtuvo los resultados esperados sería conveniente realizar un nuevo cultivo pero contrario al caso anterior, utilizar un medio específico que inhiba el desarrollo de bacterias Gram+, si no es posible extender el espacio en el que se trabaja.

¿Qué utilidad le encuentra a esta práctica?

La identificación de microorganismos patógenos presentes en alimentos de consumo general, ya que si estos se encuentran en una determinada cantidad en las muestras analizadas significan.

10. Bibliografía

Calderón, V. y Pascual, M. (2000). Microbiología Alimentaria: Matodología analítica para alimentos y bebidas. Recuperado de: https://books.google.com.ec/books?id=9EIfkks8uxMC&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false (Mayo, 2015)

Castro, C. (2009). Coliformes Totales: Calidad del Agua. Recuperado de: https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/6154/2/Coliformes%20totales%20Celia%20CAstro.pdf (Mayo, 2015)

Camacho, A. (2009). Determinación de coliformes totales por cuenta en placa. Recuperado de: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Tecnic-Basicas-Coliformes-en-placa_6528.pdf (Mayo, 2015)

Anexos

Anexo I

Apariencia de colonias de coliformes fecales en el medio de cultivo EBM Agar- Después de 24 h

Figura AI.1 Primer Streak Plate Figura AI.2 Gran stain Primer Streak Plate

Anexo IIApariencia de colonias de coliformes fecales en el medio de cultivo MacConkey

Figura AII. 1 Cuarto Streak Plate Figura AII.2 Gran stain Cuarto Streak Plate

Figura AII. 3 Primer Streak Plate Figura AII. 4 Gran stain Primer Streak Plate

Anexo III

Apariencia de colonias de coliformes fecales en el medio de cultivo MacConkey

Figura AIII. 1 Cuarto Streak Plate Figura AIII. 3 Gran stain Cuarto Streak Plate