Informe del análisis realizado a los cultivos recibidos en ...

Informe del análisis realizado a los cultivos recibidos en el Centro Nacional de Referencia de Micobacteriología, de parte de la Red Nacional

de Laboratorios del Programa Nacional de Control de la Tuberculosis, durante el 2020.

Centro Nacional de Referencia de Micobacteriología - Inciensa-2021

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Centro Nacional de Referencia de

Micobacteriología

Informe del análisis realizado a los cultivos recibidos en el Centro

Nacional de Referencia de Micobacteriología, de parte de la Red

Nacional de Laboratorios del Programa Nacional de Control de la

Tuberculosis, durante el 2020.

Fecha de elaboración: Mayo 2021

Resumen

Para la elaboración de este informe, se analizaron los 359 cultivos recibidos en

el Centro Nacional de Referencia de Micobacteriología (CNRM), durante el 2020,

de parte de 18 laboratorios de la Red Nacional de Laboratorios. Las cepas fueron

cultivadas en Agar Sangre, Bact/Alert, Löwenstein-Jensen y cultivo líquido MGIT,

a partir de muestras enteras de distinta procedencia: muestras respiratorias (en

su gran mayoría de esputo), abscesos o secreciones, biopsias, líquidos estériles

y otros orígenes. El tiempo transcurrido desde la toma de la muestra hasta su

ingreso al Inciensa, fue de 34 ± 17 días para micobacterias del complejo

Mycobacterium tuberculosis y de 28 ± 19 días para micobacterias no

tuberculosas. De los 359 cultivos recibidos, el 15% presentaron crecimiento por

microorganismos distintos a micobacterias (contaminación), lo cual fue

evidenciado en el CNRM a nivel macroscópico (morfología del cultivo o control

de crecimiento en Agar Sangre) o microscópico (Frotis de la cepa y tinción con

Ziehl-Neelsen). Se realizó análisis moleculares para identificación de la cepa a

303 cultivos, de las cuales 200 fueron identificadas como micobacterias del

complejo Mycobacterium tuberculosis, 92 fueron identificadas como

micobacterias no tuberculosas y 11 cultivos fueron negativos por micobacterias.




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Elaborado por

Dra. María Laura Fernández Montes de Oca

Revisado por

Dr. Carlos Trabado Alpízar

Grupo técnico del CNRM

Dra. María Laura Fernández Montes de Oca

Dra. Sarah Jbara Chacktoura

Dra. Milena Brenes Calvo

Tec. Maureen Aguilar Méndez

Tec. Andrea Madrigal Vargas

Tec. Diana Mendoza Solano

Tec. María Fernanda Villalta Calderón

Dr. Carlos Luis Trabado Alpízar (coordinador)

Tres Ríos, La Unión, Cartago, Costa Rica, 2021

Contactos:

Dra. María Laura Fernández Montes de Oca [email protected]

Dr. Carlos Luis Trabado Alpízar [email protected]

Cita sugerida: Fernández M.L. (2021). Informe del análisis realizado a los cultivos recibidos

en el Centro Nacional de Referencia de Micobacteriología, de parte de la Red Nacional de

Laboratorios del Programa Nacional de Control de la Tuberculosis, durante el 2020. La Unión,

Costa Rica. Inciensa 2021. Disponible en: http://inciensa.sa.cr

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

http://inciensa.sa.cr/




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Abreviaturas y Definiciones

Abreviaturas

• AS: Medio de cultivo Agar Sangre.

• BAAR: Bacilos Alcohol Ácido Resistentes

• CNRM: Centro Nacional de Referencia en Micobacteriología

• EMB: Etambutol (E).

• H. Anexión: Hospital de la Anexión

• H. Guápiles: Hospital de Guápiles

• HEBB: Hospital Enrique Baltodano Briceño

• HEP: Hospital Escalante Pradilla

• HM: Hospital México

• HMMV: Hospital Manuel Mora Valverde

• HMPJ: Hospital Max Peralta Jiménez

• HMS: Hospital Monseñor Sanabria

• HNN: Hospital Nacional de Niños

• HRACG: Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia

• HRBC: Hospital Raúl Blanco Cervantes (Hospital Nacional Geriátrico

Gerontológico)

• HSC: Hospital de San Carlos

• HSJD: Hospital San Juan de Dios

• HSRA: Hospital San Rafael de Alajuela

• HSVito: Hospital de San Vito

• HSVP: Hospital San Vicente de Paul

• HTFC: Hospital Tony Facio Castro

• Inciensa: Instituto Costarricense de Investigación y Enseñanza en Nutrición y

Salud

• INH: Isoniazida (I).

• L.LABIN: Laboratorios Labin

• LJ: Löwenstein-Jensen

• MTB: Mycobacterium tuberculosis.

• NTM: Micobacteria no tuberculosa o ambiental

• PSA: Prueba de sensibilidad a antibióticos.

• PZA: Pirazinamida (P).

• RIF: Rifampicina (R).

• USTL: Unidad de servicios técnicos de laboratorio.




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Definiciones

• Cepa: Población o colonias puras de bacterias de una sola especie,

descendientes de una única célula.

• Cepa resistente: Cepa que crece en presencia de un antibiótico.

• Cepa sensible: Cepa que no crece en presencia de un antibiótico.

• Complejo Mycobacterium tuberculosis: Grupo de micobacterias conformado por

las especies M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti y M. canettii.

• Concentración crítica: Es la concentración del antibiótico en el ensayo, que

permite interpretar un resultado como resistente o sensible.

• Medio de cultivo agar sangre: Facilita el crecimiento de la gran mayoría de las

bacterias Gram-positivas y Gram-negativas así como de hongos (mohos y

levaduras), a partir de una base rica y complementada, ofreciendo óptimas

condiciones de desarrollo para microorganismos no fastidiosos. En este medio no

crecen micobacteria del Complejo Mycobacterium tuberculosis

• Medio de Cultivo BacT/ALERT®: Proporciona un entorno óptimo para la

recuperación de una amplia gama de organismos, incluyendo bacterias, hongos y

micobacterias.

• Medio de cultivo Löwenstein Jensen (LJ): Medio de cultivo para el crecimiento de

micobacterias.

• Micobacteria: Grupo de bacterias actinomicetales, bacilos delgados, alcohol

ácido resistentes.

• Tubo MGIT: Tubo BD BBLTM MGITTM, del inglés Mycobacteria growth indicador

tube. Contiene 7mL de caldo Middlebrook 7H9 modificado, el cual permite el

crecimiento y detección de micobacterias.




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Contenido

1. Introducción ……………………………………………………….………..….6

2. Análisis ………………………………………………………………………....6

2.1 Total de cultivos recibidos en el CNRM ……..…………………....6

2.2 Medios de cultivo utilizados ………………………………………...8

2.3 Tipo de muestras procesadas …………………………….………..8

2.4 Tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su ingreso

al Inciensa…………………………………………………………………10

2.5 Presencia de contaminación en los cultivos recibidos ……..…..13

2.6 Identificación de las cepas recibidas ……………………………..17

3. Conclusiones y recomendaciones .……………………………………:.….19




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1. Introducción

En seguimiento de la normativa nacional, el CNRM recibe de parte de la Red

Nacional de Laboratorios que procesan muestras para el cultivo por micobacterias

(laboratorios de bioseguridad nivel 2), todos los cultivos positivos por micobacterias,

para su debida identificación y análisis varios.

Como parte del control de calidad externo de la red de laboratorios que realizan

cultivo, el CNRM analiza aspectos varios de todos los cultivos recibidos, para así

evaluar de manera indirecta, el trabajo de los laboratorios de la red. La información

obtenida, sirve para generar propuestas de capacitación y control de parte del

CNRM, que resulten en una mejora en la calidad y homogeneidad en el trabajo

realizado por estos laboratorios, teniendo en cuenta las necesidades específicas de

los diferentes centros de salud.

En el presente informe se plasma el análisis de los cultivos recibidos en el CNRM,

durante el 2020. Se toma en cuenta: el total de cultivos recibidos, laboratorio de

procedencia, medio de cultivo utilizado, muestra origen del cultivo, tiempo

transcurrido desde la toma de la muestra y el ingreso de la cepa al Inciensa, cantidad

de cultivos contaminados e identificación de las cepas.

2. Análisis

2 .1 Total de cultivos recibidos en el CNRM

De 18 laboratorios y en un período de 12 meses, se recibió un total de 359 cultivos.

Esto implica un promedio de 29,9 cultivos por mes. Estudios anteriores han arrojado

promedios de 38 cultivos por mes (enero 2017 a abril 2018) y 36,5 cultivos por mes

(mayo 2018 y diciembre 2019). Por lo tanto, la cantidad de cultivos recibidos en el

CNRM disminuyó durante el 2020, probablemente debido a la pandemia causada

por el virus SARS-CoV-2.

Como se puede apreciar en la figura 1, la cantidad de cultivos enviados, varía por

parte de cada laboratorio. Los laboratorios que remitieron mayor cantidad de cultivos

fueron el Hospital San Juan de Dios (65), el Hospital México (63) y el Hospital Tony

Facio Castro (48); los cuales suman el 49% de los cultivos recibidos en el CNRM.

Por otro lado, los laboratorios Hospital Manuel Mora Valverde, Hospital Nacional de




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Niños, Hospital de la Anexión, Hospital de Guápiles y Hospital de San Vito fueron

quienes enviaron menor cantidad de cepas al CNRM (menos de 5), lo que

representa el 2% de las cepas envidas al CNRM.

Este año no se recibieron cepas de parte del Área de Salud Cariari, Hospital Carlos

Luis Valverde Vega, Hospital CIMA, Hospital Clínica Bíblica, Hospital de Ciudad

Neilly, Hospital de Upala, Hospital del Trauma, Hospital William Allen y Laboratorios

San José

Figura 1. Cantidad de cultivos recibidos en el CNRM según laboratorio de procedencia.

Los laboratorios que enviaron menos de 5 cultivos, para un total de 7 cultivos, fueron:

Hospital Manuel Mora Valverde =3, Hospital Nacional de Niños =1, Hospital de la Anexión

= 1, Hospital de Guápiles = 1 y Hospital de San Vito =1.




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2 .2 Medios de cultivo utilizados

El 80% de las cepas recibidas fueron cultivadas en medio sólido LJ. El resto de

crecimientos se obtuvieron en cultivos realizados en medio líquido MGIT (Hospital

México), botellas BACT/ALERT® (Hospital de Niños y Hospital de San Carlos) y

placas de agar sangre (Hospital Enrique Baltodano Briceño, Hospital Max Peralta

Jiménez y Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia) (Ver figura 2).

Figura 2. Medios de cultivo utilizados para el aislamiento de micobacterias.

2.3 Tipo de muestras procesadas

Los cultivos enviados al CNRM provenían de una gran variedad de muestras

enteras, tanto de origen estéril como no estéril, cultivadas con el fin de aislar

micobacterias que pudieran estar presentes en la muestra.

Tal y como se observa en la figura 3, la mayor cantidad de muestras cultivadas para

el aislamiento de micobacterias, son muestras respiratorias, siendo este el origen

del 86% de los cultivos recibidos. Específicamente, el 70% de las cepas recibidas,

provienen del cultivo de esputos y el 16% a partir de otro tipo de muestras

respiratorias, en las cuales se incluyen aspirados bronquiales, lavados

bronquioalveolares y lavados bronquiales.

Un 9% de las cepas, provenían de cultivos de abscesos o secreciones y de biopsias

de distintos sitios anatómicos y tejidos (tanto sitios estériles como no estériles). Un

3% de las cepas fueron cultivadas a partir de líquidos biológicos estériles (líquido




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peritoneal, líquido pleural y sangre). El 2% restante fueron cepas cultivadas a partir

de otro tipo de muestras, como lo son orinas, jugos gástricos y líquidos de catéter.

Figura 3. Origen de las cepas de micobacterias enviadas al CNRM.

Todos estos datos son similares a los de años anteriores, por lo que los tipos de

muestras enteras cultivadas para el aislamiento de micobacterias son prácticamente

los mismos en tipo y cantidad.

Tal y como se observa en la figura 4, en la gran mayoría de los laboratorios, más

del 40% de las cepas enviadas al CNRM fueron cultivadas a partir de muestras de

esputo. De hecho, las cepas enviadas por el Hospital Escalante Pradilla, Hospital

Monseñor Sanabria, Hospital Manuel Mora Valverde, Hospital de San Vito, Hospital

Nacional de Niños y Hospital de Guápiles, fueron cultivadas a partir de esputo.

A excepción de lo anterior, el Hospital México y el Hospital Max Peralta enviaron la

misma cantidad de cepas cultivadas a partir de esputos y de otras muestras

respiratorias. Adicional, el Hospital de la Anexión envió un único cultivo, proveniente

de una biopsia.




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Figura 4. Origen de los cultivos enviados al CNRM por laboratorio.

2.4 Tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su ingreso al Inciensa

Según el Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis de la PAHO

(OPS, 2008) el cultivo en un medio sólido a base de huevo, como lo es el medio de

cultivo Löwenstein-Jensen, permite identificar el crecimiento de colonias de M.

tuberculosis y otras micobacterias de crecimiento lento en muestras positivas, con

baciloscopías de 3+, en no más de 30 días. Este tiempo de detección puede incluso

disminuir y ser de unos 10 días si se utilizan medios líquidos ricos, incubados en

equipos de detección automatizados, como es el caso del caldo Middlebrook 7H9

en tubos MGIT. Si las muestras presentan menor cantidad de bacilos (incluso con

baciloscopías negativas), el tiempo de crecimiento puede extenderse hasta 8

semanas en medios a base de huevo, y hasta 6 semanas en agar o caldo

enriquecidos.

Por lo tanto, los cultivos de muestras por micobacterias se incuban, en medio sólido

Löwenstein-Jensen hasta por 8 semanas (56 días) y en tubos MGIT por 6 semanas

(42 días). Se debe estar evaluando el cultivo con periodicidad, para detectar

cualquier indicio de positividad, la cual, en caso de darse, el laboratorio debe




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reportar, a la brevedad posible, el desarrollo del crecimiento y enviar el cultivo al

CNRM para los análisis correspondientes. Por otro lado, si transcurrido el periodo

de incubación no se detecta crecimiento, se reporta el cultivo como negativo.

Teniendo presente esta información, sería de esperar que los cultivos que son

referidos al CNRM sean detectados como positivos en su mayoría alrededor de los

30-40 días, siendo el tiempo límite de 56 días para aquellos cultivos con muy poco

crecimiento.

Sin embargo, el CNRM no cuenta con la fecha exacta de cultivo, para así poder

analizar los tiempos de positividad de las cepas referidas (tiempo transcurrido entre

el cultivo de la muestra y la detección de crecimiento). Por lo tanto, en este informe

se analizó el tiempo transcurrido entre la toma de muestra del paciente y el ingreso

del cultivo al Inciensa, pues se espera que la muestra sea cultivada el día de su

toma. Este periodo de tiempo, por lo tanto, comprende la toma de la muestra, su

procesamiento y cultivo, la detección del crecimiento, embalaje del cultivo, envío y

recepción en el Inciensa.

En el CNRM se recibieron cultivos con un tiempo transcurrido desde 5 días (dos de

ellos eran cultivos negativos) hasta 103 días (un cultivo con una cepa de M.

tuberculosis contaminada), con un promedio de (33±17) días en total.

Específicamente, los cultivos de micobacterias del complejo M. tuberculosis fueron

enviados en un promedio de (34 ± 17) días y los cultivos de micobacterias no

tuberculosas un promedio de (28 ± 19) días. Estos tiempos se acortaron en relación

a años anteriores, en donde el promedio de tiempo de envío era de 46,5 días, lo

cual refleja una mejoría en la revisión de cultivos por parte de los laboratorios de la

red.

De los 357 cultivos con fecha de recolección de la muestra (ya que dos cultivos no

indicaban fecha de recolección por lo que no fueron considerados en este cálculo),

38 ingresaron al Inciensa con un periodo igual o superior a los 57 días,

representando este dato el 11% de los cultivos. Los tiempos de envío mejoraron

considerablemente a los del informe anterior (32% de los cultivos enviados con un

periodo igual o superior a los 57 días).

En la figura 5 se puede observar, por laboratorio, los tiempos transcurridos entre

toma de muestra e ingreso de la cepa al Inciensa, para todos los cultivos enviados.




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Figura 5. Tiempo transcurrido entre toma de muestra y envío del cultivo al Inciensa, por

laboratorio. La mediana (medida común del centro de los datos) está representada por la

línea en la caja. La caja de rango intercuartil representa el 50% intermedio de los datos,

donde se muestra la distancia entre el primer cuartil y el tercer cuartil (Q3-Q1). Los

bigotes representan los rangos del 25 % de valores de datos de la parte superior y el 25

% de la parte inferior, excluyendo los valores atípicos, los cuales se muestran como

puntos sueltos.

Hubo 4 laboratorios con mayor porcentaje de cultivos enviados con un periodo

mayor a los 56 días: 80% de los cultivos del laboratorio 13, 19% de los cultivos del

laboratorio 3 (incluyendo un cultivo con un periodo de 103 días) y 14% de los cultivos

del laboratorio 1 y 7.

Por otro lado, el tiempo de detección para micobacterias ambientales de crecimiento

rápido se acorta significativamente y se puede evidenciar en pocos días. Por

ejemplo, se recibieron cultivos de M. fortuitum, M. abscessus y M. mucogenicum

con un periodo menor o igual a los 10 días entre la toma de muestra y su ingreso al

Inciensa. También, se recibieron cepas de M. tuberculosis con un periodo menor o

igual a los 10 días, con la particularidad de haber sido cultivadas en tubos MGIT.




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Es importante controlar que no se den demoras innecesarias en la detección de

cultivos positivos, ya que esto retrasa el diagnóstico, la detección de resistencias, el

tratamiento oportuno, y facilita la contaminación de los cultivos por otros

microorganismos.

2.5 Presencia de contaminación en los cultivos recibidos

Según el Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis Parte 2

Cultivo, la contaminación de los cultivos se expresa como el porcentaje de tubos

contaminados sobre el total de tubos sembrados. Cuando se utiliza el método de

Petroff para descontaminación de muestras enteras, este valor no debe superar el

(3-4) %. Cuando se descontamina con concentraciones menores de hidróxido de

sodio o bien se cultiva en medios de cultivo más ricos (por ejemplo, tubos MGIT)

este porcentaje puede llegar a (8-9) %.

Sin embargo, el CNRM no cuenta con la totalidad de la información de parte de los

laboratorios de la red (por ejemplo, el total de cultivos realizados), para poder

calcular el porcentaje de contaminación de los cultivos de la red. Por lo tanto, en

este informe lo que se evaluó fue el porcentaje de cultivos contaminados del total

de cultivos recibidos.

La contaminación de los cultivos fue detectada en el CNRM a dos niveles:

macroscópico y microscópico.

a) Macroscópico:

o Mediante la observación directa del cultivo: En los tubos con medio de cultivo

sólido Löwenstein-Jensen se consideró contaminación la presencia de colonias

distintas a micobacterias, presencia de hongos, medio azulado o medio licuado.

En el caso de tubos con medio de cultivo líquido, no se realizó evaluación

macroscópica.

o Mediante el subcultivo de la cepa recibida en una placa de agar sangre, la cual

se incubó a 37 °C durante al menos 48 h. Ya que las micobacterias en general

no crecen en agar sangre (a excepción de algunas micobacterias ambientales de

crecimiento rápido), un crecimiento en este medio al repicar la micobacteria, es

considerado como microorganismo contaminante.




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b) Microscópico: Mediante la elaboración de un frotis de la cepa y su posterior

tinción con la técnica de Ziehl-Neelsen. El objetivo de esta tinción es confirmar en

el cultivo la presencia de BAAR, y a la vez, detectar otro tipo de microorganismos

contaminantes que no se tiñen de rosado con esta técnica, sino que se observan

color azul.

De los 359 cultivos recibidos, el 85% fueron cultivos libres de contaminación,

mejorando levemente respecto al informe anterior, el cual había arrojado un

porcentaje del 18% de cultivos recibidos contaminados. En la figura 6 se detalla la

forma en la cual se dio la detección de la contaminación.

Figura 6. Detección de contaminación en los cultivos recibidos en el CNRM.

De los 54 cultivos contaminados, a 12 (el 22%) se le detectó la contaminación a

nivel macroscópico mediante observación directa (morfología). De estos, en 7

cultivos la contaminación era tal que el medio Löwenstein-Jensen estaba

completamente azulado y en algunos casos hasta licuado, por lo que no fue posible

realizar ningún tipo de análisis.

La apariencia morfológica del 26% de los cultivos parecía libre de contaminación,

sin embargo, al realizar el frotis se detectó la presencia de microorganismos

distintos a micobacterias. Sin embargo, en estos casos no se obtuvo crecimiento de




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ningún microorganismo en el control en Agar Sangre, por lo que es probable que la

contaminación observada no se debiera a contaminantes vivos.

Al 26% no se le detectó contaminación mediante inspección morfológica ni en el

frotis, sino hasta que se realizó el subcultivo en Agar Sangre. Al 39% restante, se le

detectó la contaminación tanto a nivel de frotis como a nivel de subcultivo en Agar

Sangre, por lo que en estos casos sí hay certeza que el microorganismo

contaminante se encuentra vivo.

De los 18 laboratorios que refirieron cepas, destacan positivamente cuatro de ellos,

cuyos cultivos estaban libres de contaminación. El resto de laboratorios enviaron al

menos un cultivo con presencia de microorganismos contaminantes.

En la figura 7 se detalla la procedencia de los 54 cultivos que presentaron algún

grado de contaminación. Poco más del 60% de cultivos contaminados que

ingresaron al CNRM provenían de 4 laboratorios los cuales se encuentran dentro

de los 6 laboratorios que refieren mayor cantidad de cepas cultivadas. El 40%

restante de las cepas contaminadas fueron enviadas por 10 laboratorios distintos.

Sin embargo, no necesariamente, los laboratorios que más enviaron cultivos

contaminados al CNRM, son los que en total envían más cultivos. Según se observa

en la figura 8, hay una tendencia a que entre menos se cultive en el laboratorio, se

da mayor contaminación de los cultivos; y, los que más cultivan, tienen menor

porcentaje de contaminación.




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Figura 7. Procedencia del total de cepas contaminadas que fueron recibidas en el CNRM.

Figura 8. Porcentaje de contaminación del total de cultivos enviados al CNRM por

laboratorio. Cada número de laboratorio corresponde al mismo de la figura 7.




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Los cultivos realizados a partir de esputos y otras muestras respiratorias, son los

que presentaron mayor porcentaje de contaminación, pues en el 18% de los esputos

recibidos y el 14% de otras muestras respiratorias, se detectó la presencia de

microorganismos contaminantes. El 13% de los cultivos a partir de una biopsia (de

piel) presentaron contaminación. El 11% de cultivos a partir de abscesos o

secreciones presentaron contaminación. Las muestras respiratorias, biopsias de

piel y abscesos y secreciones, tienen un alto porcentaje de probabilidad de

contaminación ya que por su origen anatómico vienen acompañadas de microbiota

normal del paciente. Este tipo de muestras deben de ser descontaminadas de una

manera muy cuidadosa, previo al cultivo.

Si bien los cultivos recibidos no corresponden a la totalidad de cultivos realizados

en los laboratorios de la red, sino que representan una muestra pequeña del total,

es preocupante que algunos centros hayan enviado cultivos evidentemente

contaminados, y no los hayan descartado desde el momento en que se detectó la

contaminación, corriendo el riesgo así de contaminar otros cultivos de otros

pacientes. El CNRM no cuenta con la información de si en estos casos, se le solicitó

una nueva muestra al paciente para volver a cultivar.

2.6 Identificación de las cepas recibidas

De los 359 cultivos recibidos, se realizó identificación por micobacterias a 303 (al

84% de los cultivos recibidos). No se les hizo identificación a 56 cultivos debido a

que 6 cultivos estaban contaminados (3 no tenían presencia de BAAR al frotis y 3

tenían tal grado de contaminación que el medio LJ estaba licuado) y 50 cultivos

pertenecían a cepas aisladas de un paciente que ya contaba con una cepa

identificada.

La identificación de cepas de micobacterias se realiza mediante técnicas

moleculares, utilizando los kits de Genotype de la casa comercial Hain.

Específicamente se utiliza el kit GenoType MTBC para la identificación de

micobacterias del complejo M. tuberculosis y el kit GenoType CM/AS para identificar

micobacterias no tuberculosas. En algunas ocasiones, se utiliza también el kit

Anyplex MTB/NTM de Seegene, el cuál únicamente identifica si la micobacteria es

una NTM o una micobacteria del complejo M. tuberculosis

Según la figura 9, de los 303 cultivos a los cuales se les hizo identificación, a 11 se

le realizó identificación a pesar de no presentar BAAR en el frotis, arrojando un




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resultado negativo. A 292 cultivos se les identificó la presencia de una micobacteria,

esto a pesar de que algunas cepas presentaran contaminación. En 200 cultivos se

identificó la cepa como una micobacteria del complejo M. tuberculosis (68.49% de

las cepas identificadas) y 92 cultivos presentaron una cepa de micobacteria no

tuberculosa (31.51% de las cepas identificadas).

Figura 9. Identificación general de los cultivos a los cuales se les realizó algún ensayo

molecular de identificación.

Al detectar crecimiento (positividad) en los medios de cultivo específicos para

micobacterias, la principal consideración que deben tener los laboratorios de la red,

es si lo aislado corresponde a alguna micobacteria del complejo M. tuberculosis o

si se trata de una micobacteria ambiental.

En el caso de sospechosa de que el aislado corresponde a una micobacteria del

complejo M. tuberculosis, debe enviar el cultivo al CNRM, a la brevedad posible,

para su adecuada identificación. Sin embargo, cuando se sospeche de un

aislamiento de una micobacteria ambiental, para considerarlo clínicamente

significativo se debe cumplir que: 1) el paciente sea inmunosupreso, 2) el

aislamiento provenga de un paciente con antecedentes de enfermedad pulmonar

crónica, 3) que el paciente presente síntomas y signos de una micobacteriosis

similar a tuberculosis, 4) el cultivo provenga de una muestra con baciloscopía

positiva, 4) el cultivo provenga de una muestra de tejido o líquido estéril o 5) este

sea por lo menos el segundo aislamiento de este tipo obtenido a partir de distintas

muestras de un mismo paciente.




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Dadas estas circunstancias, no todo aislamiento de NTM debe ser considerado de

significancia, y, por lo tanto, los laboratorios deben estar en la capacidad de

diferenciar cuando están aislando micobacterias ambientales de relevancia clínica

o cuando se trata de una contaminación del cultivo. En el caso que el aislamiento

sea un NTM de relevancia clínica, el cultivo debe ser enviado al CNRM, a la

brevedad posible, para su identificación.

El CNRM no cuenta con toda la información para confirmar que las identificaciones

de cultivos por NTM se debieron a aislamientos de importancia clínica.

3. Conclusiones y recomendaciones


Cultivo, de la OPS/OMS, el cultivo complementa a la baciloscopia en el diagnóstico

de la tuberculosis, ya que permite poner en evidencia bacilos viables presentes en

escasa cantidad en una muestra, caracterizarlos para certificar su identificación y

conocer su perfil de resistencia a antibióticos. El cultivo puede ser aplicado en

laboratorios con medianos recursos y mantiene su posición como método de

referencia por su precisión.

Los laboratorios de referencia deben garantizar la calidad del cultivo mediante

controles de calidad, entrenamiento y la implementación de medidas correctivas

necesarias. Uno de los mecanismos aplicados por el CNRM, como laboratorio de

referencia nacional, es el análisis de los cultivos remitidos al CNRM, por parte de

laboratorios que cultivan muestras por micobacterias.

En el presente informe se genera una visión integral de los cultivos recibidos en el

CNRM en un periodo de 12 meses, comprendido entre enero y diciembre del 2020.

En dicho periodo, se recibió un total de 359 cultivos, de parte de 18 laboratorios. El

49% de los cultivos fueron remitidos por el Hospital San Juan de Dios, el Hospital

México y el Hospital Tony Facio Castro, quienes históricamente son de los

laboratorios que más remiten cultivos al CNRM para su estudio por micobacterias.

El medio de cultivo más utilizado para el aislamiento de micobacterias fue el medio

sólido LJ (en el 80% de los cultivos). Otros medios de cultivos utilizados con mucha

menor frecuencia fueron los tubos MGIT, botellas de BACT/ALERT® y placas de

agar sangre.




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Cultivo, de la OPS/OMS, la calidad del medio de cultivo es un punto crítico. Para

elaborar los medios a base de huevo se requiere de cierta infraestructura y personal

dedicado a la preparación y control de calidad del medio.

El Inciensa tiene centralizada la producción (mediante la USTL) y el control de

calidad (en el CNRM) de los medios de cultivo sólido Löwenstein-Jensen, que son

utilizados por los laboratorios que realizan cultivo, y así los soliciten (el HM y

HRACG, utilizan además tubos LJ comerciales). Los laboratorios que utilizan tubos

MGIT, botellas de BACT/ALERT® y placas de agar sangre, adquieren sus propios

reactivos. Es importante recordar a aquellos laboratorios que adquieren sus propios

medios de cultivo, que deben de aplicar controles de calidad antes de su uso.

Las muestras de origen respiratorio son las más cultivadas para estudio por

micobacterias (86% de los cultivos recibidos), siendo el esputo la más cultivada

(70% de los cultivos recibidos).

Hay tres factores, descritos en el Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la

Tuberculosis Parte 2 Cultivo, de la OPS/OMS; fundamentales para el adecuado

desarrollo de las micobacterias en cultivo: tiempo transcurrido entre toma de

muestra y realización del cultivo, técnica de descontaminación y condiciones de

incubación.

- Las micobacterias ambientales pueden sobrevivir fuera del hospedador si las

condiciones no son extremas, pero los integrantes del complejo M.

tuberculosis resisten menos fuera de él. De manera que la probabilidad de

hacerlos reproducir en el cultivo aumenta con la rapidez con la que se

siembre la muestra del paciente. La demora es muy crítica cuando el número

de bacilos es escaso o cuando el pH de la muestra es desfavorable para la

sobrevivencia del bacilo, como en el caso de lavados gástricos y orinas.

- No es posible aislar al bacilo de la tuberculosis inoculando muestras no

estériles (por ejemplo, muestras del aparato respiratorio que ha atravesado

las vías altas, orina que pasó por uretra, lesiones superficiales de piel, etc),

debido a que la flora habitual de estas zonas prolifera a mayor velocidad que

la mayoría de micobacterias. En estos casos, se debe de aplicar un

procedimiento de descontaminación a la muestra, previo a su inoculación en

el medio de cultivo.




21

- El bacilo de la tuberculosis se multiplica mejor cerca de los 37 °C. La

velocidad de desarrollo disminuye al alejarse de esta temperatura, muy

difícilmente crece por debajo de los 34 °C y puede morir por encima de los

40 °C. La luz solar (UV) es perjudicial para su sobrevivencia. Las

micobacterias ambientales, sí pueden preferir otras temperaturas para su

desarrollo, en particular más bajas.

Por lo tanto, es importante insistir en que el cultivo debe realizarse a la brevedad

posible, ya que, la probabilidad de hacer crecer micobacterias del complejo M.

tuberculosis en cultivo, aumenta con la rapidez que se siembre la muestra del

paciente. La postergación de la siembra, además permite la reproducción de la flora

contaminante. Por lo tanto, idealmente la muestra debe ser cultivaba el mismo día

o al día siguiente de su toma. El proceso de descontaminación (en caso de

requerirse) debe de seguirse según los protocolos establecidos, en tiempo y

concentración de reactivos, para eliminar microrganismos contaminantes, sin

afectar la viabilidad de las micobacterias. Y el proceso de incubación debe hacerse

en las condiciones adecuadas para favorecer el desarrollo de las micobacterias.

Con los datos suministrados al CNRM, no se puede hacer un análisis del tiempo

transcurrido entre la toma de la muestra y su cultivo, ni una evaluación del

procedimiento de descontaminación utilizado, ni la corroboración de las condiciones

de incubación. Estos son aspectos que tendrá que evaluar el CNRM utilizando otras

herramientas.

En cuanto se obtenga crecimiento con características típicas de micobacterias, se

debe de informar de inmediato el cultivo y enviarlo al CNRM para su identificación.

El tiempo en el que se detecta un cultivo positivo, depende de: lo enérgico del

método de descontaminación aplicado, el pH al que haya quedado el inóculo, la

riqueza del medio de cultivo, si el medio de cultivo tiene algún indicador de

crecimiento, características particulares de la cepa, la cantidad de bacilos en la

muestra y si el paciente está recibiendo tratamiento.

Con la información obtenida, el CNRM realizó un análisis del tiempo transcurrido

entre la toma de la muestra y el ingreso de la cepa al Inciensa, asumiendo que el

cultivo fue realizado el mismo día de la toma de la muestra, y el envío tan pronto fue

detectada la positividad en el medio de cultivo. El promedio en días para el total de

cultivos remitidos al CNRM fue de (33 ± 17) d, mostrando una ligera mejora en

relación a años anteriores, en donde el promedio de tiempo de envío era de 46,5 d.




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Esto indica que los laboratorios que cultivan, están detectando más oportunamente

los cultivos positivos, y enviándolos al CNRM en un menor tiempo.

Sin embargo, hay que seguir insistiendo con este aspecto, en especial a aquellos

laboratorios que enviaron cultivos con un periodo igual o superior a los 57 d, ya que,

los periodos extendidos de tiempo en el reporte de cultivos positivos o en su envío

al CNRM, enlentecen no sólo el proceso de diagnóstico, sino que, además, se corre

el riesgo de iniciar un tratamiento inadecuado para el paciente. Se recomienda que

los laboratorios verifiquen sus procedimientos de revisión y evaluación de cultivos,

según la periodicidad recomendada (una vez por semana).

El 15% de los cultivos recibidos presentaron la presencia de microorganismos

contaminantes. Este aspecto mejoró levemente respecto al estudio anterior, en

donde se concluyó que el 18% de los cultivos presentaban contaminación. Sin

embargo, es preocupante que incluso, algunos laboratorios enviaron cultivos en

medio LJ completamente azulados o hasta licuados, aspectos que son un claro

indicativo de contaminación. Según el Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de

la Tuberculosis Parte 2 Cultivo, de la OPS/OMS, el bacilo de la tuberculosis no crece

en el medio desintegrado ni acidificado, por lo que, si se observa contaminación del

cultivo, en cualquier momento del periodo de incubación, se debe descartar el

cultivo (sea tubo, placa o botella), reportar de inmediato “Cultivo contaminado” y

solicitar una nueva muestra.

Los laboratorios que más enviaron cultivos no son necesariamente quienes envían

mayor cantidad de cultivos contaminados. Más bien hay una tendencia a que, entre

menos se cultive en el laboratorio, se da mayor contaminación de los cultivos. Esto

puede deberse a varios factores, como falta de condiciones de cultivo e incubación

adecuadas o falta de practica de parte del personal, pues no sea una actividad que

se realice con frecuencia en el laboratorio.

Los cultivos realizados a partir de esputos y otras muestras respiratorias, son los

que presentaron mayor porcentaje de contaminación. Estas muestras, debido a su

origen anatómico, deben de ser descontaminadas. Por lo que, nuevamente, se

recomienda a los laboratorios revisar sus procedimientos de descontaminación,

para disminuir la presencia de microorganismos contaminantes en los cultivos.

El enviar cultivos contaminados, lo que indica es que hay factores dentro del

procesamiento y cultivo de las muestras, que deben monitorearse y evaluarse, así

como valorar la recapacitación del personal en el procesamiento de muestras e




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identificación de contaminación para disminuir estos porcentajes. Por ejemplo, se

debe revisar los protocolos de descontaminación que utilizan los laboratorios.

Además, se debe de evaluar las condiciones de incubación, para detectar puntos

en los cuales se podría estar dando la contaminación de los cultivos. También, se

debe analizar la magnitud y características de la contaminación que ocurre en la

rutina. Todo esto para garantizar la calidad de los cultivos.

Finalmente, en relación a los cultivos en los cuales sí se identificó la presencia de

una micobacteria, el 68.49% fueron identificadas como micobacteria del complejo

M. tuberculosis y 31.51% fueron identificadas como micobacteria no tuberculosa.

Desde el 2017, que se viene realizando este análisis, se ha visto que la proporción

de cepas identificadas como MTB y NTM se ha mantenido constante: alrededor de

un 68,8% de micobacterias del complejo MTB y un 31,2% de micobacterias

ambientales.

El cultivo debe provenir de un caso relevante, es decir, que el crecimiento

corresponda a una micobacteria que realmente estaba presente en la muestra del

paciente y que tenga alta probabilidad de ser la responsable de la infección. Este

punto es importante ya que pueden recuperarse crecimientos puros de

micobacterias ambientales presentes como contaminantes en algún reactivo

utilizado en el proceso o incluso que se presentan como colonizantes transitorios en

el paciente y que no necesariamente son los causales de su cuadro clínico.

Del período de tiempo analizado se puede concluir que existe heterogeneidad entre

las muestras cultivadas por micobacterias, la calidad de las cepas cultivadas que

son referidas por los diferentes laboratorios y la variedad de especies de

micobacterias detectadas. También existen diferencias en la gestión del trabajo de

los laboratorios, evidenciado en los tiempos de duración entre la toma de las

muestras y la llegada del cultivo al Inciensa y el porcentaje de cultivos

contaminados.

Los resultados obtenidos en este estudio, evidencian la necesidad de que el CNRM

fortalezca la capacitación y acompañe a los laboratorios que cultivan, no solamente

en materia técnica sino además en temas de gestión de la calidad, sobre todo

dirigidos al cultivo de muestras, revisión de cultivo y reporte del resultado. Esto en

miras de aumentar la efectividad, disminuir los tiempos de respuesta y mantener la

bioseguridad.

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