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INTRODUCCIÓN

La contaminación de los alimentos es un problema serio para la industria alimentaria, debido a que da lugar a la aparición de productos inaceptables para el consumo humano. La producción industrial de alimentos es un proceso que se desarrolla a gran escala, razón por la cual las consecuencias de pérdidas por contaminación microbiana son elevadas y altamente costosas. Este fenómeno generalmente es un proceso mixto, en el que participan bacterias, levaduras y hongos filamentosos; al mismo tiempo es un proceso competitivo, en el cual prevalecen aquellos grupos que muestran la mayor adaptación a las condiciones ambientales, que se manifiestan en el producto en particular. Comparadas con hongos filamentosos y bacterias, las levaduras juegan un papel secundario en la descomposición de alimentos, sin embargo, existen determinadas condiciones relacionadas con el proceso de preservación de estos y su propio manejo, que pueden favorecer el incremento en las poblaciones de levaduras dañinas. Las levaduras son consideradas generalmente como favorables cuando se asocian a los alimentos, debido al papel que juegan en la obtención de productos y bebidas fermentables, entre los que se conocen la fabricación de pan y productos de pastelería; producción de alcohol, vinos y cidras, cervezas, entre otras bebidas. Esta imagen se ha fortalecido en la actualidad por el descubrimiento en estos microorganismos de capacidades nutricionales como son, la producción de vitaminas del complejo B, su uso como fuente de obtención de proteínas para la alimentación de animales y humanos y más recientemente, su uso como hospedero para la obtención por vías de la tecnología del DNA recombinante de compuestos de gran utilidad para la industria médico farmacéutica, como proteínas virales para la fabricación de vacunas y otros inmunopotenciadores, hormonas, interferones, proteínas de la sangre y productos afines. Es lógico pensar que bajo condiciones óptimas de crecimiento, las poblaciones de bacterias superan el crecimiento de levaduras y hongos filamentosos, debido a que poseen un tiempo de generación más corto. Esto implica que las levaduras y mohos solo pueden competir con las bacterias en la alteración de los alimentos, cuando las condiciones ambientales afectan de forma severa la actividad bacteriana. Existen determinadas técnicas para la preservación de alimentos que dañan el crecimiento de las bacterias, pero al mismo tiempo favorecen el crecimiento de las levaduras, lo cual está dado por el hecho de que estos grupos son mucho más resistentes a condiciones ambientales estresantes; entre las que predominan baja actividad de agua, bajos valores de pH por el uso de ácidos orgánicos como preservantes químicos, bajos valores de temperatura y uso de antimicrobianos y otros inhibidores naturales y sintéticos. Existe otro problema que incrementa

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la aparición de contaminaciones en alimentos y bebidas por levaduras, y son el uso de tecnologías modernas de elaboración que utilizan condiciones de procesamiento menos exigentes para mantener el sabor, olor y color naturales, con el propósito de consumir productos cada vez más sanos, existe una tendencia a reducir el uso de preservantes y a la producción de alimentos bajos en calorías, en los cuales no existen elevadas concentraciones de solutos, que reducen la actividad de agua (aw) ejerciendo el efecto preservante, por lo que se favorece la aparición de levaduras contaminantes en siropes y concentrados de frutas y vegetales. Es justo destacar que el grupo de levaduras que se asocia perjudicialmente a los alimentos es muy reducido: alrededor del 25 % de las especies identificadas y de éstas, un número muy bajo de forma dañina. Las levaduras asociadas a alimentos se clasifican en: no perjudiciales y alteradoras. Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas que han sido procesados y empacados según las Normas de Buenas Prácticas para producción, manejo y empaque de los alimentos. Las fuentes de obtención de alimentos ya sean animales o vegetales han desarrollado mecanismos naturales para protegerse del ataque de microorganismos en general, los cuales están dados en parámetros intrínsecos tales como el pH, humedad, contenido nutricional y producción de sustancias antimicrobianas naturales, que forman parte de los tejidos y pueden permanecer de forma activa en alimentos frescos. La actividad contaminante de las levaduras sobre alimentos puede inhibirse por dos vías; mediante la aplicación de métodos físicos con actividad bactericida, entre los que se destacan la esterilización por calor a presión y por filtración y por la aplicación de condiciones ambientales desfavorables con efecto bacteriostático, tales como disminución de la aw, bajos valores de pH y temperatura.

OBJETIVOS

Comprender el rol que cumple el ambiente y manipuladores en la condición de los alimentos así como en el centro de salud ocupacional.

Establecer la importancia de la educación sanitaria en la protección de los productos alimenticios así como la limpieza y desinfección de ambientes de trabajo.

Capacitación respecto la higiene, BPM o GMP y las placas operativas de manipulación y procesamiento de alimentos.

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FUNDAMENTO TEORICO

CRECIMIENTO MICROBIANO EN SUPERFICIES

Las superficies suelen tener considerable importancia como hábitat microbiano debido a que adsorben nutrientes. En el microambiente de una superficie, las concentraciones de nutrientes pueden ser muy superiores a las de toda la solución. Como consecuencia, la concentración de microorganismos que crecen en una superficie suele ser mayor que la concentración de los que viven en el agua.Los portaobjetos sirven de superficies experimentales sobre las cuales se adhieren y crecen los microorganismos. Si se sumergen un portaobjetos en un hábitat microbiano, se le deja durante un tiempo y luego se examina al microscopio, se hace evidente la importancia de las superficies para el crecimiento de los microorganismos. Sobre dichas superficies se desarrollan rápidamente microcolonias, de la misma manera que lo hacen en las superficies naturales. La velocidad de crecimiento de microorganismos adheridos a una superficie en la naturaleza puede medirse mediante el examen microscópico periódico de portaobjetos sumergidos.La superficie de adherencia puede ser también un nutriente, como ocurre con las partículas de materia orgánica, donde los microorganismos adheridos catabolizan los nutrientes directamente de la superficie de la partícula. El material procedente de las plantas muertas, por ejemplo, es colonizado muy pronto por los microorganismos del suelo, y mediante técnicas sencillas de tinción se detectan poblaciones microbianas adheridas a la superficie sólida.

Biofilmes: estructura

Los microorganismos crecen incluidos en biofilmes. Son microcolonias revestidas de células bacterianas adosadas a una superficie mediante polisacáridos adhesivos excretados por las propias células. Los biofilmes atrapan nutrientes para el crecimiento de las poblaciones microbianas y ayudan a impedir el desprendimiento de las células que crecen sobre las superficies expuestas a corrientes de líquido. Los biofilmes presentan típicamente numerosas capas de microorganismos, cada una de las cuales pueden ser observadas por microscopía láser confocal.La comunicación célula a célula es esencial en el desarrollo y mantenimiento de un biofilme. La adherencia de una célula a una superficie es una señal para la expresión de genes específicos de un biofilme. Estos genes codifican proteínas que codifican proteínas que sintetizan moléculas que actúan como señales para la unión célula a

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célula y el inicio de la formación de polisacárido. En Pseudomonas aeruginosa, notable formadora de biofilmes, las moléculas que actúan como señal son compuestos denominados homoserina lactonas. A medida que se van acumulando, estas moléculas actúan como agentes quimio tácticos que atraen células de P. aeruginosa mediante un mecanismo denominado percepción de quorum (quorum sensing), dando lugar al desarrollo del biofilme. P. aeruginosa interviene en la fibrosis quística, enfermedad debida a la formación de un biofilme en los plumones, cuyos síntomas son parecidos a la neumonía.

Biofilmes: consecuencias y control

El desarrollo de biofilmes tiene implicaciones significativas en la salud humana y en diversas industrias (p. ej., en la industria alimentaria o cosmética). En el cuerpo, las células bacterianas de un biofilmes se encuentran protegidas ante ataques del sistema inmunitario y los antibióticos, y otros agentes antimicrobianos, suelen fracasar en el intento de penetrar en el biofilme. Además en la fibrosis quística, los biofilmes aparecen en diversas alteraciones dentales, entre ellas la periodontitis, en la formación de cálculos en el riñón, en la tuberculosis, en la legionelosis y en infecciones por Staphylococcus. Los implantes médicos son también, por desgracia, medios excelentes para el desarrollo de biofilmes. Entre ellos se incluyen los catéteres urinarios, así como las implantes alargo plazo tales como las articulaciones artificiales. Se estima que en Estados Unidos, 10 millones de personas al año sufren infecciones por biofilmes debidas a implantes u otros procedimientos médicos intrusivos. Los biofilmes son la razón de que la rutina en la higiene dental sea tan importante. La placa dental es un biofilme típico y contiene bacterias productoras de ácido responsables de la caries dental.En la industria, los biofilmes pueden reducir el flujo de agua, aceite o cualquier otro líquido que circule a través de tuberías y acelerar la corrosión del propio tubo. También inician la degradación de los objetos sumergidos, tales como componentes estructurales de plataformas petrolíferas, barcos e instalaciones costeras. La calidad del agua potable puede verse afectada por los biofilmes que se forman en los conductos de distribución, algunos de los cuales, en Estados Unidos, tiene de 50 a 100 años. Aunque las bacterias que se encuentran en los conductos de agua son en su mayoría inocuas, si algunas patógenos consiguieran colonizar el biofilme, la cloración estándar podría ser insuficiente para matarlos. La liberación periódica de células puede llevar a brotes de enfermedad. Existe preocupación por la posibilidad de que Vibrio cholerae, el agente causante del cólera, pueda ser dispersado de esta manera.

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El control de biofilmes requiere un gran esfuerzo y hasta el momento sólo se dispone de un repertorio limitado de instrumentos para combatirlos. La industria dedica miles de millones cada año al tratamiento de tuberías y otras superficies para mantenerlas limpias de biofilmes. En la estrategia de lucha contra estos invasores, se incluye el descubrimiento de nuevos antibióticos capaces de penetrar en ellos y fármacos que interfieren en la comunicación intracelular y la consecuente formación de biofilmes. En este último aspecto hay una clase de productos químicos, las furanonas, que en las pruebas experimentales han dado resultados alentadores. Como las furanonas son compuestos estables y no tóxicos para los humanos, también pueden tener aplicación como agentes antibiofilme en medicina.

METODOLOGÍAMateriales a usarse en los experimentos

Placas Petri Tubos de ensayo

Mechero Bunsen Balanza analítica

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Espátula de drigalsky Incubadora

Torundas Baño María

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Pipeta

Reactivos usados en los experimento

10 mL de agua peptonada (0.1 %) +

Tween 80 (1%)10 mL de agua

peptonada al 0.1 %.

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Agar TSA

Agar ENDO

Agar m – Enterococos

Agar Manitol – saladoAgar Sabouraud Dextrosa

(4%)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL1. Método del hisopo o torundas (Swab)

1. Humedecer los hisopos estériles en 10 mL de agua peptonada + tween 80.

2. Elegir una superficie de muestra (o área de muestreo) y delimitarla con la plantilla de aluminio.

3. Tomar el primero de tres hisopos a usar y frotar la superficie con una inclinación de 30° en líneas verticales.

4. Seccionar la porción del hisopo que contiene la muestra para sumergirla en 10 mL de agua peptonada.

5. Tomar un segundo hisopo y proceder a frotar esta vez en líneas horizontales.

6. Repetir el paso 4.7. Tomar el tercer hisopo y

frotar ahora de forma oblicua (de esta manera

se asegura cubrir gran parte del área delimitada).

8. Repetir el paso 4.9. Agitar el tubo con las

tres secciones durante 20’ (este proceso se lleva a cabo para realizar la revivificación de los microrganismos).

10. Tomar 0.1 mL del agua con las muestras, para cada medio de cultivo a incubar: Agar TSA, ENDO, m-Enterococos, Manitol Salado y Sabouraud Dextrosa (4%).

11. Incubar a 35 – 37 °C por 48 h (con placas invertidas) a todos los medios menos el agar Sabouraud.

12.El agar Sabouraud se incubará a 20 – 24 °C (temperatura ambiente)

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por 5 días, con las placas sin invertir.

2. Control de manipuladores

1. Elegir como superficie de muestra la mano de un compañero.

2. Humedecer un hisopo esterilizado en 10 mL de agua peptonada + tween 80.

3. Frotar la superficie externa e interna (la palma), las zonas entre los dedos, las yemas de los dedos y las uñas.

4. Seccionar la porción del hisopo que contiene la muestra para sumergirla en 10 mL de agua peptonada.

5. Agitar el tubo con la sección del hisopo durante 20’.

6. Tomar 0.1 mL del agua con las muestras, para cada medio de cultivo a incubar: Agar TSA, ENDO, m-Enterococos, Manitol Salado y Sabouraud Dextrosa (4%).

7. Incubar a 35 – 37 °C por 48 h (con placas invertidas) a todos los medios menos el agar Sabouraud.

8. El agar Sabouraud se incubará a 20 – 24 °C (temperatura ambiente) por 5 días, con las placas sin invertir.

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3. Control de ambientes

1. Elegir una zona estratégica para exposición de los agares al aire.

2. Colocar los medios indicados en dichas zonas.

3. Abrir las tapas y exponer los agares por 15’.

4. Cerrar las tapas.5. Incubar las placas para

bacterias a 35 – 37 °C por 48 h (invertidas).

6. Incubar las placas para hongos a 20 – 24 h por 5 días (sin invertir).

OBSERVACIONES/RESULTADOSManipuladores

Bacterias:

Medio Número de colonias

Características

Agar TSA 148 Colonias cremas amarillentas, circulares.

Agar Manitol salado

9 Colonias cremas blanquecinas

Agar m-Enterococos

0 -

Agar Endo 0 -

Hongos y levaduras:

Medio Sabouraud

Numero de mohos y/o levaduras

Características

Mohos 1 pequeñoLevaduras - blanquecino

Superficies

Bacterias:

Medio Número de Características

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coloniasAgar TSAAgar Manitol salado

0 -

Agar m-Enterococos

0 -

Agar Endo 0 -

Hongos y levaduras:

Medio Sabouraud

Numero de mohos y/o levaduras

Características

Mohos 1 pequeñoLevaduras 1 Color anaranjado

Ambiente

Bacterias:

Medio Número de colonias

Características

Agar TSA incontable Colonias diseminadas por la superficie.

Agar Manitol salado

5 Colonias cremas blanquecinas

Agar m-Enterococos

0 -

Agar Endo 0 -

Hongos y levaduras:

Medio Sabouraud

Numero de mohos y/o levaduras

Características

Mohos 8 Blancos y verdosos, medianos y chicos

Levaduras 7 Blanquecinas y verdosas

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DISCUSION Y CONCLUSIONES

Hubo crecimiento, lo que significa que hay hongos el ambiente lo cual nosotros no lo percibimos al igual que las levaduras.

El ambiente del laboratorio no se puede decir que es estéril debido a los resultados de las muestras lo cual indica que cualquier prueba microbiana en el laboratorio puede que nno sea muy precisa.

Aprendimos el método del hisopado o torundas, control de manipuladores y control de ambientes detalladamente.

En los resultados obtenidos según las tablas de los límites máximos permisibles las manos de muestra están contaminadas. En cuanto a la superficie demuestra que existe contaminación por enterococos por bacterias heterótrofas (> limite RAM).

RECOMENDACIONES

Tener cuidado con los hisopo, estos no deben ser contaminados. Diseminar cerca del mechero para evitar que se contamine. Desinfectar la espátula de Durham antes de diseminar las

muestras en lo agares. Tener siempre el control microbiológico del medio donde

laboramos. Manejar con cuidado los instrumentos de vidrio.

BIBLIOGRAFIA Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas

bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo ll, Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.

Alonso Urmeneta y otros. Manual Práctico de Microbiología. Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas

bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo l, Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.

ANEXOS

Galería

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