INGENIERÍA DE TEJIDOS
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Dra Alicia Lorenti
INGENIERÍA DE TEJIDOS
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Ingeniería de Tejidos
Es la aplicación de principios y métodos de la ingeniería y de las ciencias
biológicas, para el entendimiento de la relación estructura – función en
tejidos, y el desarrollo de sustitutos biológicos que restauren, mantengan o mejoren la función de dichos tejidos
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MEDICINABIOLOGÍA
INGENIERÍA
MATERIALES QUÍMICA
FÍSICA
CÉLULAS BIOMATERIALESMicroambiente
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Medicina Regenerativa
Desarrollo de terapias basadas en células, capaces de inducir la regeneración del órgano/tejido,
estimuladas por el microambiente que las
recibe
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Qué es lo que estimula la regeneración
�Las células implantadas por sí mismas
�Las células implantadas estimulan a las residentes a reparar el daño
�Las células implantadas secretan o estimulan la secreción de factores de crecimiento
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Ingeniería de tejidos
Construcciones implantables
Dispositivos extracorpóreosMatrices de soporte
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CÉLULASCómo elegir la mejor célula
�Capaces de realizar funciones diferenciadas
�Potenciales efectos adversos
�Disponibilidad
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Células stem Líneas celulares Células
primarias
Según el tipo celular
Células autólogas
Según su origen
Células homólogas Células
xenogeneicas
CÓMO ELEGIR LAS CÉLULAS
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Células Stem
Origen�Embrionarias�Embrionarias germinales�Adultas o somáticas
Potencialidad� Totipotenciales� Pluripotenciales� Multipotenciales� Potencialidad restringida
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Líneas Celulares
Son células inmortalizadas (humanas o animales)
�Transformadas por incorporación en su genoma de parte del genoma del virus SV-40
�Transformación espontánea
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Obtenidas a partir de:�Tumores�Tejidos normales
�Se desarrollan fácilmente
�Su potencial tumorigéniconunca puede ser descartado
Líneas Celulares
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Células primarias diferenciadasObtenidas a partir de tejidos funcionales
AISLAMIENTODigestión enzimáticaDisgregación mecánica
CentrifugaciónGradientes
Pasajes por columnasCell sorting
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Objetivo fundamental del cultivo:
estabilizar o mejorar la funcionalidad de las células diferenciadas
Células primarias diferenciadas
Aisladas y cultivadas
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Origen de las células primarias diferenciadas
Células humanas
Células animales
�Opción de elección
�Procuración limitada
�Riesgo de zoonosis
�Rechazo hiperagudo(Inmunoaislamiento)
�El cerdo es el animal de elección
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Células frescas vs células cultivadas
Células cultivadas >recuperación y reorganización celular
Células frescas<tiempo de preparación<gasto
>pérdida (apoptosis y anoikis)
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Remodelación
Síntesis
Regulación
CélulasMatriz
extracelular
Factores de crecimiento (locales y sistémicos)
Estructura tisular Ingeniería de
tejidos
Scaffolds p/ cultivo 3D
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Células aisladas
Cultivo in vitro(ambiente no fisiológico)
Formación de colonias o monocapa
Ausencia de organización tisular (3D)
Tejidos
Cuál es la respuesta???
Implante
Estímulos mecánicos, eléctricos,
estructurales, señales
Desorganización, ausencia de
función, muerte
La Ingeniería de Tejidos es sólo cultivo de células?
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Ingeniería de Tejidos
Naturales
Híbridos
SintéticosBIOMATERIALES
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�Dispositivos permanentes�Dispositivos temporarios (extra o intracorpóreos)
�Biocompatibilidad�Biodegradabilidad�Porosidad�Inmunogenicidad�Adhesión celular
BIOMATERIALES
�Fatiga�Fracturas�Toxicidad�Inflamación�No adaptacióna cambios
Algunas características
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Scaffolds prefabricados que permiten la migración y adhesión celular, la difusión de nutrientes, de factores de crecimiento y de
factores expresados
Vascularización del scaffold sembrado. Las células pueden morir antes de que se
produzca la angiogénesis
Estructuras capaces de desarrollar distintas funciones simultáneamente. Ejercer/soportar funciones mecánicas necesarias para el
funcionamiento celular
SOPORTES IDEALESScaffolds (andamios): Estructuras
tridimensionales
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Tipos de biomaterialesComponentes de la matriz extracelular Colágeno Elastina VitronectinaGlicosaminoglicanos: ác.hialurónico, condroitínsulfato, dermatan sulfato, heparan sulfato, keratan sulfato
Polímeros sintéticosPolihidroxiácidos: poliláctico (PLA), poliglicólico (PGA) y copolímeros
Poliacrilatos: poli-HEMA, poli-MMA
PolisacáridosQuitosan (citoesqueleto de crustáceos)
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APLICACIONES
Ingeniería de tejidos Medicina
regenerativa
Heridas
Músculo cardíaco, vasos, válvulas
Tejido osteoarticular
Sistema nervioso
Órganos bioartificiales
Aparato urinario
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INGENIERÍA DE TEJIDOSAPLICADA A REPARACIÓN DE
HERIDAS
Coagulación
Inflamación
Tejido de granulación
Remodelación
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CUAL ES EL PROBLEMA?
�Grandes superficies
�Úlceras crónicas
CUAL FUE EL PRIMER PLANTEO?
CULTIVO DE EPIDERMIS
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CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA
1967 – Flaxman y col. Células disgregadas enzimáticamente
1950 – Parshley y col. Cultivo por explantos
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1975 – Rheinwald y Green. Introducen EGF y feeder-layer. Perspectivas terapéuticas: logran amplificar el cultivo y crecer keratinocitos sin sobrecrecimiento de fibroblastos
1968 – Karasek y col. Primer implante en conejos
CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA
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Función de EGF y feeder-layer
Feeder-LayerEGF
Metabólicamenteactivos
No proliferativosSe une a receptores
de membrana> capacidad formadora de colonias
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1990´s – Distintos sustratos: dermis/epidermis
2000´s – Células stem epidérmicas
1987 – Pittelkow y col. Cultivo sin feeder-layerni suero.
CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA
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CULTIVO IN VITRO CON FEEDER-LAYER
OBJETIVOS
1- Inhibir la proliferación de fibroblastos dérmicos
2- Aumentar la capacidad formadora de colonias de queratinocitos
3- Subcultivar para amplificar
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POR QUÉ FEEDER-LAYER
Los fibroblastos aportan
Colágeno Factores de crecimiento
Fibronectina Proteoglicanos
Laminina
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Por qué si y por qué no
feeder-layer
SI: Aporta factores de crecimiento
NO: Son células transformadas
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Se puede cultivar sin feeder-layer y sin suero (vaca loca) ?
Se han desarrollado medios de cultivo específicos para
queratinocitos
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Método de Pittelkow
Dos etapas
Cultivo sin feeder-layer y sin suero
Proliferación Diferenciación
EstratificaciónAumento del número de células
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Fragilidad de las láminas de queratinocitospor ausencia de soporte dérmico
Mayor sensibilidad a infecciones y pérdida por roces
Dermis + Epidermis
Obtención de cultivos de queratinocitos con posibilidades terapéuticasLogros
CULTIVO DE QUERATINOCITOS SIN SUSTRATOS DÉRMICOS
Problemas
Cuál es la tendencia actual
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SOLUCIONES
Ingeniería de tejidos
Cultivo de queratinocitos
Cultivo de fibroblastos
Matricestridimensionales
Estructuras compuestas
Dermiscadavérica
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Láminas para cultivo in vitro de queratinocitos
Membrana de ácido hialurónico
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Láminas para cultivo in vitro de fibroblastos
Membrana de ácido hialurónico
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Piel artificial(Burke y Yannas, 1980)
INTEGRA ®
�Epidermis temporaria de siliconas (Silastic) sobre esponja de colágeno (Tipo I)-
glicosaminoglicano (condroitín-6-sulfato, dermatan-sulfato, ác.hialurónico).
�El Silastic se reemplaza por cultivo de epidermis
autóloga
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Membrana de ácido poliglicólico sobre malla tridimensional de nylon
DERMAGRAFT®
Sembrado con fibroblastos de neonatos humanos (alogeneicos)
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Fibroblastos humanos Colágeno
tipo I
Día 0 Día 6
Keratinocitoshumanos
Estrato córneo
Día 20
Empaquetamiento y envío
Estructura bicapa con células alogeneicasAPLIGRAF®
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Dermis humana liofilizada ALLODERM®
�Procedente de donantes (AATB)�Eliminación de epidermis y células dérmicas
(Procedimiento AlloDerm®) �Sus componentes son colágeno, elastina,
proteoglicanos, canales vasculares y matriz bioactiva intacta.
�Se eliminan los antígenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad I y II.
�Se liofiliza y criopreserva
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Resección tangencial
DERMIS CADAVÉRICA Y EPIDERMIS CULTIVADA (Cuono, 1987)
DermisEpidermisCobertura con
homoinjerto
Resección dehomoepidermis ycolocación decultivo de piel
Cultivo
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� Láminas de colágeno
�Hidrogeles: gelatina, poli-HEMA
OTRAS ALTERNATIVAS
�Sustratos basados en quitina
�Geles de fibrina
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MEDICINA REGENERATIVA E INGENIERÍA DE TEJIDOS
EN ENFERMEDADES CARDÍACAS
El corazón adulto es un órgano pos-mitótico. Sus células son terminalmente
diferenciadas
No tiene capacidad regenerativa, ni en condiciones fisiológicas ni después de una
injuria
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¿EXISTE UN NUEVO DOGMA?
Indicios de mitosis de miocitos en zonas peri-infarto y remotas (índice mitótico 0,08% y 0,03% respectivamente)
Beltrami A y col.NEJM 2003
El corazón tendría capacidad de regeneración
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WANTED! The best cell for cardiacregeneration
J Am Coll Cardiol 2004
REGENERACIÓN CARDÍACA
Terapias basadas en células
Qué células?
![Page 47: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/47.jpg)
TIPOS DE CÉLULAS DEL MIOCARDIO ADULTO
Endoteliales(revestimiento)
Musculares lisas(pared de vasos)
Cardiomiocitos(componente contráctil)
Fibroblastos (proteínas de matriz)
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Activación de metaloproteinasas
y mRNAs(TGFβ1,FGF2)
ISQUEMIA
Necrosis coagulativa
Infiltración de células
inflamatorias
REMODELACIÓN
FIBROSIS
cardiomiocitos, endoteliales, músculo liso, fibroblastos
Pérdida de función
Patologías isquémicas
![Page 49: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/49.jpg)
�Mioblastos esqueléticos�Células stem cardíacas�Células stem extracardíacas
QUÉ CÉLULAS SE ESTÁN USANDO
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USO DE CÉLULAS STEM DE MÉDULA ÓSEA
�Transdiferenciación a cardiomiocitos, células endoteliales y músculo liso
�Miocardio de novo, función contráctil, arterias, arteriolas y venas
Orlic y col. Nature 2001
�Población de células Lin- ckit+ de médula ósea implantadas en zonas peri-infarto
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CELULAS STEM EXTRACARDIACAS
Los trabajos de Orlic no pudieronser reproducidos
Bel y col.Circulation 2003, Balsam y col.Nature 2004,Murry y col.Nature 2004
� Heterogeneidad de células usadas
� Los tejidos musculares estriados tienen autofluorescencia
� Los tejidos necróticos tienen aumentada esa autofluorescencia (acumulación de lipofuscina, pigmentos derivados de la sangre, flavinas)
� Leucocitos derivados de MO pueden ser confundidos con células stem
� Protocolos de aislamiento e identificación noestandarizados ni reproducibles fácilmente
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Haematopoietic stem cells adopt maturehaemopoietic fates in ischaemicmyocardium. Nature, 2004
Haematopoietic stem cells do nottransdifferentiated into cardiac myocytesin myocardial infarcts. Nature, 2004
Fusion of bone-marrow-derived cellswith Purkinje neurons, cardiomyocytes
and hepatocytes. Nature, 2003
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MEDICINA REGENERATIVA EN CORAZÓN
�Resultados no contundentes�No siempre son reproducibles�Células stem cardíacas: difíciles de aislar
y cultivar�Células cardíacas adultas no se reproducen
in vitro�Implante de células de músculo esquelético
asociado a arritmias�Células stem extracardíacas no siempre
retenidas en el lugar de implante
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Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, andchallenges.
�Siembra de células sobre una estructura sintética biodegradable�Siembra de células sobre tejido humano procesado�Repoblación in-vivo de sustratos implantados, por células endógenas circulantesResultados modestos
Mendelson K y col.Ann Biomed Eng. 2006
The cardiovascular tissue-reactor: a novel device for the engineeringof heart valves
Desarrollo de un biorreactor por transformación in vitro de válvulas porcinas en humanas. Remoción total de las células porcinas por tripsinización, y siembra con células vasculares humanas
Karim N y col.Artificial Organs 2006
DESARROLLO DE VÁLVULAS CARDÍACAS
![Page 55: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/55.jpg)
Perfusion-decellularized matrix: using nature´splatform to engineer a bioartificial heart
Ott H. Nature Medicine 2008
DESARROLLO DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL
Requisitos�Arquitectura del corazón�Constituyentes celulares apropiados�Función de bomba
![Page 56: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/56.jpg)
PEG
Triton X-100
SDS
![Page 57: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/57.jpg)
![Page 58: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/58.jpg)
![Page 59: INGENIERÍA DE TEJIDOS](https://reader031.fdocuments.co/reader031/viewer/2022012510/61882aac156d5a7e6e3872d6/html5/thumbnails/59.jpg)
�Estructura acelular con geometría intacta�Contenido normal de colágeno I y III, laminina y
fibronectina�Resembrado con células cardíacas y endoteliales�Colocado en un biorreactor, bajo ambiente cardíaco
fisiológico, con estimulación eléctrica: función de bomba
Resultados de este desarrollo
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Desarrollo de estructuras del aparato génitourinario
�Vejiga�Uréter�Uretra
Ingeniería de Tejidos aplicado a otros órganos/tejidos
Desarrollo de estructuras del sistema músculo esquelético
�Cartílago�Hueso
�Tendones y ligamentos