+

Respuesta Inmune contra el

virus Dengue

Dr. Jesus Martinez Dr. Jesus Martinez BarnetcheBarnetcheDepartamento de Inmunología

Instituto Nacional de

Salud Pública

Centro de Investigación en Enfermedades

infecciosas

+ Dengue

� 2.5 mil millones de personas corren el riesgo de contraer la enfermedad

� Según la Organización Mundial de la Salud al año:

� 50 millones de casos

� 500 000 hospitalizaciones y 2.5% de los afectados mueren

� Situación en México

Shepard DS et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84(2);2011Guzman A., Istúriz RE. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010

http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Global_dengue_2008.pnghttp://www.dgepi.salud.gob.mx/denguepano/PANORAMAS_2012/Pano_dengue_sem52_2012.pdf

Semana epidemiológicaSemana 42

+ Dengue� Dengue es una enfermedad infecciosa causada por un

virus perteneciente a la familia Flaviviridae transmitida a los humanos por la picadura de mosquitos del género Aedes.

Dengue y dengue hemorrágico. OMS 2009Shepard DS et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84(2);2011

Guzman A., Istúriz RE. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Global_dengue_2008.png

CTVdB Management (2006). 00.026.0.01. Flavivirus. In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4. Büchen-Osmond, C. (Ed), Columbia University, New York, USA

Virus Familia Género

(+) ssRNA Flaviviridae Flavivirus

SSDDH

Enfermedad Severa

Fiebre por Dengue50 milliones casos/año

250,000-500,000 casos/año

DENV-1 DENV-2

DENV-3 DENV-4

+ Características clínicas4

Rothman A. Nature Reviews Immunology 11, 532-543. 2011; Murphy & Whitehead. Ann Rev Immunol. 2011

+

Modificada de Rothman A. Nature Reviews Immunology 11, 532-543. 2011

Ciclo viral

Endocitosis

Acidificación del endosoma

Traducción del genoma viral

Algunas NS1 expresadas en la membrana plasmática o

secretadas

Proteína E

Virión Maduro

Virión inmaduro

Proteína prMEnsamblaje de los

viriones

Formación de viriones maduros

Liberación de viriones maduros

Secreción de viriones inmaduros

DC-SIGN, GRP78/BiP, moleculas asociadas a CD14

+

Murphy & Whitehead. Ann Rev Immunol. 2011

Estructura del virión

+

Rothman A. Nature Reviews Immunology 11, 532-543. 2011

Proteína E

+

Murphy & Whitehead. Ann Rev Immunol. 2011

Proteína E: Variación estructural entre DENV3 y DENV2

+

Christian, et al. PNAS. 2013

Proteína E: Fusión endosomal

+Anticuerpos

Región VariableRegión constante

Schroeder HW, Jr., Cavacini L. 2010. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol 125: S41-52

+Respuesta a la infección

Moreno-Rodríguez J. Curso de Inmunología. 2012. CISEI INSP

Virus Dengue

Folículo

Linfocitos B Naive

Linfocitos T CD4+ Zona de linfocitos T

Células dendríticas foliculares

Linfocitos B de Memoria

Células PlasmáticasLinfocitos B

perifoliculares

Centro Germinal

Centro germinal de linfocitos B

Linfocitos TFH

1

2

3 Plasmablastos

Respuesta T-dependiente

Modificado de Goodnow et al., 2010

+

Modificada de Rothman A. Nature Reviews Immunology 11, 532-543. 2011

Endocitosis

Acidificación del endosoma

Traducción del genoma viral

Algunas NS1 expresadas en la membrana

plasmática o secretadas

Lísis dependiente de complemento

Potenciación mediada por anticuerpos

NeutralizaciónPotenciación mediada por anticuerpos

Anticuerpos espedíficos

anti- E

Anticuerpos espedíficos anti- pr-M

Anticuerpos espedíficos anti- NS1

Proteína E

Virión Maduro

Virión inmaduro

Proteína prMEnsamblaje de los

viriones

Formación de viriones maduros

Liberación de viriones maduros

Secreción de viriones

inmaduros

Respuesta de anticuerpos

DC-SIGN, GRP78/BiP, moleculas asociadas a CD14

+ Respuesta de Anticuerpos en una infección

por DENV

Koraka P, et al. J.Clin. Microbiol. 2001,39: 4332

IgM

IgA

IgG1

IgG3

IgG2IgG4

� IgM, IgG1 e IgG3

predominan durante

todo el curso de la

enfermedad

� IgA, IgG1, e IgG4 son

asociadas con el

desarrollo de DHF

+Respuesta cruzada de anticuerpos

Murphy & Whitehead. Ann Rev Immunol. 2011

+Anticuerpos anti- prM

� Neutralización pobre de anti-prM

� Sugiere que puede haber tres poblaciones de DENV:

1. Niveles relativamente altos de prM que son virus no infecciosos, pero que se puede volverse infecciosos en la presencia de Ac. anti-prM (potenciar la infección).

2. Densidad intermedia de prM en la superficie que puede infectar, y son susceptibles a la neutralización en un titulo alto de Ac.

3. Niveles bajos de prM o ausentes en la superficie que normalmente no serían susceptibles de neutralización.

� Asociarse a las formas graves de dengue.

10 - a 800 vx

<80%

Rodenhuis-Zybert IA. et at. PLOS Phatogens. 2010;6(1)Dejnirattisai W. et al. Sciencie 2010;328(745)

+Potenciación mediada por anticuerpos

� Propuesta por Halstead en 1977

� Infección primaria se desarrollan Ac serotipo específicos

� Segunda infección por otro serotipo

Activa otros sistemas (coagulación, la fibrinólisis y el

complemento)

Daño en el endotelio vascular

Favorece los fenómenos hemorrágicos, con la fuga de líquidos al espacio intersticial y fenómenos de descompensación hemodinámica desde leves hasta el choque profundo

Modificado de Whitehead SS. Nat Rev Microbiol. 2007;5(7):518-28.

+ Respuesta masiva y rápida de plasmablastos durante la Fase Aguda de la infección por Dengue.

Wrammert J. Rapid and massive virus-specific plasmablast responses during acute dengue virus infection in humans. J Virol. 2012 Mar;86(6):2911-8

La inducción masiva de plasmablastos de sangre

periférica corresponde al 30% de los linfocitos totales.

La respuesta es DENV específica.

La estructura clonal y la diversidad del repertorio de linfocitos B en respuesta a la

infección por Dengue.

Un mes después de la resolución de la infección

los niveles de plasmablastos regresan a su estado basal.

+ Respuesta de anticuerpos en Dengue

Whitehead SS. Nat Rev Microbiol. 2007;5(7):518-28. Sallusto et al. Cell Host Microbe. 2010 Sep 16;8(3):271-83

Rodenhuis-Zybert IA. et at. PLOS Phatogens. 2010;6(1)Dejnirattisai W. et al. Science 2010;328(745)

Rothman A. Nat. Rev. Inmunnology. 2011

�Genoma viral 11Kb

� 3 proteínas estructurales (E, prM y C)

� 7 proteínas no-estructurales

(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5)

Neutralización

Formas graves de la enfermedad

+ Respuesta de linfocitos T ante el virus Dengue

+Respuesta de Linfocitos T contra DENV

21

+

Análisis estructural y funcional

del repertorio de anticuerpos

en pacientes con Dengue

Clásico y Dengue Hemorrágico

Elizabeth Ernestina Godoy Lozano, M.Sc. Elizabeth Ernestina Godoy Lozano, M.Sc.

Estudiante de Doctorado en Ciencias en la Salud PúblicaÁrea de concentración en Enfermedades infecciosas

Departamento de Inmunología

Instituto Nacional de

Salud Pública

Centro de Investigación en Enfermedades

infecciosas

+Objetivo principal

� Comparar la estructura clonal en el repertorio de linfocitos B en pacientes con Dengue Clásico y Dengue Hemorrágico

1. Descripción del repertorio de anticuerpos en DC y DH.

2. Comparación del repertorio de individuos que tuvieron DC y DH.

3. Identificación de anticuerpos con capacidad neutralizante

específica.

23

24

Hipótesis� Durante la infección aguda, el repertorio de linfocitos B es modificado

por la selección clonal y señales co-estimulatorias

� Duante la fase aguda existen diferencias clonales en el repertorio de linfocitos B que correlacionan con las formas clínicas de la enfermedad.

Día 4-7 ………………….. 6 meses después

Fase aguda Fase de post-convalescencia

Expansión clonal

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

1. Descripción del repertorio de anticuerpos en DC y DH.

2. Comparación del repertorio de individuos que tuvieron DC y DH.

3. Identificación de anticuerpos con capacidad neutralizante específica.

Objetivos

+ Metodología26

Día 4-7 ………………….. 6 meses después

Fase Aguda Fase post-convalescente

Suero• Serotipo (RT-qPCR)

• Titulos de neutralización (RVP DENV1-4)

RNAcDNA de la región variable de IgG VH(5’ RACE)

Secuenciación masiva

(GS FLX Titanium 454-ROCHE)

ImmunediveRsity

(Pipeline)

Asignación clonal e idiotípica

Caracterización de la diversidad

Índice de Shannon

DHn=10

DCn=10

Controles

n=10Etapa 1

Diagrama de Flujo ImmunediveRsity

FIN

INICIO

Seq.sff

Filtros de Calidad

Filtros de sec. Línea germinal

Humano

BD Ratón

BD Humano

sí

no

Agrupación por “Idiotipo”

sí

IgBLAST

HMMERno

Agrupación por rearreglo

Agrupación por Grupo Clonal

Parámetros

Parámetros

•Índices de diversidad•Rarefacción

•Visualizaciones del Repertorio

•Análisis de mutación•Comparación Grupos Clonales compartidos

Recorte de anclas

Etapa 2

+

Controles

DHDC

• Reclutamiento de

voluntarios

• Veracruz

28

* Semana epidemiologica 41 2013

n=21

Secuenciados 7

n=7

Secuenciados 2

n=10

Secuenciados 10

N/D. not determined

Se observaron altos títulos de neutralización en la fase aguda

de la enfermedad.

+ 29

Mattia K, Puffer BA, Williams KL, González R, Murray M, et al. (2011) Dengue Reporter Virus Particles for Measuring Neutralizing Antibodies against Each of the Four Dengue Serotypes. PLoS ONE 6(11): e27252. d

+La diversidad clonal e idiotipica VH en pacientes con Dengue es más alta que en los controles.

30

E.Godoy-Lozano.Data unpublished

Grupos Clonales Idiotipos VH

Contro

ls

DFA

DFC

DHFA

DHFC

4

5

6

7

8

Condition

Sha

nnon

Inde

x

*

Contro

ls

DFA

DFC

DHFA

DHFC

4

5

6

7

8

Condition

Sha

nnon

Inde

x

*Co

AcuCo

ControlesAgudaPost-convalescente

Co

AcuCo

ControlesAgudaPost-convalescente

p<0.05 p<0.05

Condición Condición

Cont

role

s

DCA

DCPC

DHA

DHPC

Cont

role

s

DCA

DCPC

DHA

DHPC

31

* La diversidad clonal en la fase aguda de la enfermedad es más alta.* La diversidad clonal es mayor en pacientes con DC que en pacientes con DH.* La diversidad clonal en la fase post-convalescente no regresa a los niveles de los controles sanos.

1000200030

004000500

0600070008000900

0100

0011000120001300014000150001600

01700

0180001900020000210002200023

000240002500026000270

0028000290

0030000

0

500

1000

1500

2000

2500

Sampling (Number of sequences)

Num

ber o

f Clo

nal G

roup

s

10002000300040005000600070008000900010000110001200013000140001500016000170001800019000200002100022000230002400025000260002700028000290003000031000

0

500

1000

1500

2000

2500

Sampling (Number of sequences)

Num

ber o

f Clo

nal G

roup

s

E.Godoy-Lozano.Data unpublished

Dengue Clásico Dengue Hemorrágico

*

*

*

Agudo

Post-convalescente

Controles

Agudo

Post-convalescente

Controles

p<0.05

p<0.05

Muestreo (número de secuencias) Muestreo (número de secuencias)

+ Respuesta policlonal en DC y DH en la fase aguda comparada con individuos sanos.

32

Número de mutaciones no-sinónimas

- +

Fase Aguda

Fase Post-convalescente

Control

DC DH

DC DH

+ Se observa un grupo de Familias VH que es más diversa en los pacientes con Dengue que en el grupo control.

33

E.Godoy-Lozano.Data unpublishedFamilia VH

Dengue

Controles

Índice de Shannon por Familia VH

+Resumen

� Análisis de la tercera corrida de secuenciación que incluye a 5 pacientes con DH y 1 DC.

� Validación experimental (Producción de mAb’s, ensayos de neutralización y potenciación de los 4 serotipos)

34

Siguientes pasos…

� La diversidad clonal en la fase aguda es más alta comparada con la fase post-convalescente y el grupo control.

� Observamos que la diversidad durante la fase de post-convalescencia no regresa a los niveles del grupo control después de seis meses.

� Observamos más diversidad en un grupo particular de familias VH que correlaciona con las formas clínicas de la enfermedad.

+ Agradecimientos

� INSP (Cuernavaca, Mor, Mex)

� Jesús Martínez Barnetche

� Juan Mauricio Téllez Sosa

� Rosa Elena Gómez

� Hugo Carlos Sámano

� Javier Valdés Alemán

� Marbella Ovilla

� Bernardo Cortina Ceballos

� Andrés Aguilar

� Integral Molecular (Filadelfía, USA)

� Benjamin Doranz

� David Tucker

� Silver Rodríguez

� Manu Mabila

� Kimmie Matias

� Alex Cameron

� Kristen Khale

� Jen Pfaff

� Este proyecto se lleva a cabo con el apoyo financiero de CONACyT (CB-2009-01/133765).

� Universidad Veracruzana (Veracruz, Ver, Mex)

� Héctor Vivanco Cid

35

� InDRE (México, DF, Mex)

� Mauricio Vázquez Pichardo

� Claudia Rosales

� Alma Núñez