INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

“PREDICCIÓN Y ANÁLISIS COMPUTACIONAL DE

NUEVAS INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS QUE

PARTICIPAN EN LA PATOGÉNESIS DE Helicobacter pylori”

T E S I S

Que para obtener el grado de:

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

Presenta:

ALDO SEGURA CABRERA

Reynosa, Tamaulipas, México, Junio del 2009

ÍNDICE

CONTENIDO ................................................................................................................................ PÁGINA

ABREVIATURAS ...................................................................................................................................... i

RELACIÓN DE CUADROS Y FIGURAS ............................................................................................... ii

RESUMEN ............................................................................................................................................... iv

ABSTRACT .............................................................................................................................................. vi

1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 1

2 ANTECEDENTES ................................................................................................................................. 3

2.1 Historia y características generales de Helicobacter pylori ................................................................. 3

2.2 La infección por Helicobacter pylori ................................................................................................... 3

2.2.1 Enfermedades producidas por Helicobacter pylori .......................................................................... 3

2.3 Aspectos moleculares de Helicobacter pylori ..................................................................................... 5

2.3.1 Genómica ................................................................................................................................... 5

2.3.2 Transcriptómica y proteómica ................................................................................................... 7

2.3.3 Interactómica ............................................................................................................................. 9

2.4 Métodos para la determinación de interacciones entre proteínas ...................................................... 11

2.4.1 Métodos experimentales .......................................................................................................... 12

2.4.1.1 Sistema de dos híbridos en levadura ............................................................................. 12

2.4.1.2 Purificación por afinidad en tándem acoplada a espectrometría de masas ............................. 14

2.4.1.3 Interacciones entre proteínas a nivel atómico ................................................................ 16

2.4.2 Métodos computacionales ....................................................................................................... 16

2.5 Bases de datos de interacciones entre proteínas ................................................................................ 20

2.5.1 BIND (Biomolecular Interaction Network Database) ............................................................. 21

2.5.2 DIP (Database of Interacting Proteins) ................................................................................... 21

2.5.3 MINT (Molecular INTeraction database) .............................................................................. 21

2.5.4 3did (3D interacting domains) ................................................................................................. 22

2.5.5 IntAct (IntAct database) .......................................................................................................... 22

2.5.6 HPRD (The Human Protein Reference Database) .................................................................. 22

2.6 Calidad de los métodos de determinación de interacciones entre proteínas ...................................... 23

3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................. 25

4 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................. 25

5 OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 26

5.1 Objetivo general ................................................................................................................................. 26

5.2 Objetivos específicos ......................................................................................................................... 26

6 HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 26

7 METODOLOGÍA ................................................................................................................................. 27

7.1 Obtención de las proteínas de participación conocida en la patogénesis (proteínas raíz) ................. 27

7.2 Construcción de la red de interacciones entre proteínas de H. pylori ................................................ 27

7.3 Predicción de nuevas interacciones y proteínas involucradas en la patogénesis de H. pylori ........................................................................................................................................................ 28

7.4 Análisis del papel de las predicciones en patogénesis ....................................................................... 29

8 RESULTADOS .................................................................................................................................... 30

8.1 Proteínas asociadas a motilidad y quimiotaxis .................................................................................. 34

8.2 Proteínas asociadas a la adaptación al medio ácido ........................................................................... 39

8.3 Proteínas asociadas al metabolismo del nitrógeno ............................................................................ 41

8.4 Proteínas asociadas con el sistema de secreción tipo IV ................................................................... 43

8.5 Proteínas asociadas con la respuesta a estrés ..................................................................................... 45

8.6 Proteínas asociadas a la síntesis de lipopolisacáridos ........................................................................ 45

9 DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 50

9.1 Proteínas asociadas a motilidad y quimiotaxis .................................................................................. 54

9.2 Proteínas asociadas a la adaptación al medio ácido ........................................................................... 57

9.3 Proteínas asociadas al metabolismo del nitrógeno ............................................................................ 60

9.4 Proteínas asociadas con el sistema de secreción tipo IV ................................................................... 61

9.5 Proteínas asociadas con la respuesta a estrés ..................................................................................... 63

9.6 Proteínas asociadas a la síntesis de lipopolisacáridos ........................................................................ 66

9.7 Interconexión entre agrupamientos de proteínas ............................................................................... 68

9.8 Limitaciones del estudio ................................................................................................................... 69

10 CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 71

11 RECOMENDACIONES ..................................................................................................................... 72

12 REFERENCIAS .................................................................................................................................. 73

13 GLOSARIO ...................................................................................................................................... 102

14 APÉNDICE ....................................................................................................................................... 106

i

ABREVIATURAS

3D: Tridimensional. ADN: Ácido desoxirribonucleico. ARN: Ácido ribonucleico. ATP: Adenosín trifosfato. BLAST : de las siglas en inglés, herramienta para la búsqueda del alineamiento local básico. COX: Ciclo oxigenasa. MALDI-MS : Espectrometría de masas, variante desorción/ionización láser asistida por matriz. MALT : Linfoma asociado a mucosa. NCBI : Centro Nacional para la Información Biotecnológica de EE.UU., por sus siglas en inglés. ORF: Marco de lectura abierto, por sus siglas en inglés. PIANA : Análisis de redes e interacciones entre proteínas, por sus siglas en inglés. RMN : Resonancia magnética nuclear. ROS: Especies reactivas de oxígeno. STRING: Herramienta de búsqueda para la recuperación de interacciones de genes/proteínas, por sus siglas en inglés. TAP-MS: Purificación por afinidad en tándem acoplada a espectrometría de masas, por sus siglas en inglés. Y2H: Sistema de doble híbrido en levadura, por sus siglas en inglés.

ii

RELACIÓN DE CUADROS Y FIGURAS

CONTENIDO ............................................................................................................................. PÁGINA

Cuadro1. Asociación entre el contexto funcional de proteínas (GUP) y su conocida función

en patogénesis .......................................................................................................................................... 31

Cuadro 2. Valores de GUP para cada una de la proteínas que integraron la red de

interacción y su probable asociación en patogénesis de H. pylori ........................................................... 32

Cuadro 3. Lista de proteínas candidato asociadas a quimiotaxis y motilidad ........................................ 35

Cuadro 4. Lista de proteínas candidato asociadas a adaptación al medio ácido .................................... 40

Cuadro 5. Lista de proteínas candidato asociadas al metabolismo del nitrógeno .................................. 42

Cuadro 6. Lista de proteínas candidato asociadas al sistema de secreción tipo IV ................................ 43

Cuadro 7. Lista de proteínas candidato asociadas a proteínas de respuesta a estrés .............................. 46

Cuadro 8. Lista de proteínas candidato asociadas a síntesis de lipopolisacáridos ................................. 48

Figura 1. Método de doble hibrido en levadura ...................................................................................... 14

Figura 2. Método de purificación por afinidad en tándem acoplado a espectrometría de

masas ........................................................................................................................................................ 15

Figura 3. Métodos computacionales de predicción de interacciones entre proteínas basados

en el contexto genómico .......................................................................................................................... 18

Figura 4. Construcción de la red de interacción a partir de las proteínas raíz obtenidas de la

base de datos MvirDB .............................................................................................................................. 27

Figura 5. Cálculo del GUP de una proteína, del valor predictivo positivo y la sensibilidad a

diferentes umbrales de GUP .................................................................................................................... 28

Figura 6. Red de interacción entre proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori ............................... 33

Figura 7. Agrupamiento de proteínas asociadas a la quimiotaxis y motilidad ....................................... 34

Figura 8. Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre las proteínas

CheA y CheY de E. coli ........................................................................................................................... 36

iii

Figura 9. Organización a nivel genómico de los genes fliF, fliG y fliH , respecto a los genes

candidato dxs y lepA ................................................................................................................................ 38

Figura 10. Agrupamiento de proteínas asociadas a la adaptación al medio ácido ................................. 39

Figura 11. Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre la proteína NikR

y el ADN de E. coli .................................................................................................................................. 40

Figura 12. Agrupamiento de proteínas asociadas a el metabolismo del nitrógeno ................................ 41

Figura 13. Agrupamiento de proteínas asociadas al sistema de secreción tipo IV ................................. 43

Figura 14. Agrupamiento de proteínas asociadas a la respuesta a estrés ................................................ 45

Figura 15. Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre la subunidad

alfa de la ADN polimerasa con TrxA, durante el proceso de reparación del ADN del

bacteriófago T7 ........................................................................................................................................ 47

Figura 16. Agrupamiento de proteínas asociadas a síntesis de lipopolisacáridos .................................. 48

iv

Predicción y análisis computacional de nuevas interacciones entre proteínas que

participan en la patogénesis de Helicobacter pylori

Resumen

La información de interacciones entre proteínas producto de experimentos a gran

escala en humano y otros organismos eucariotes ha sido de gran valor para la comprensión

a nivel de sistemas de diversos procesos biológicos. Sin embargo, en organismos

procariotes se dispone de limitada información sobre las interacciones entre proteínas;

siendo Helicobacter pylori (H. pylori) el primer organismo de este tipo estudiado a nivel de

las interacciones entre proteinas. Para contribuir al entendimiento de la participación de las

proteínas en la patogénesis de H. pylori, se construyó una red de interacción para 127

proteínas asociadas a patogénesis, combinado datos de interactomas obtenidos a nivel

experimental, predicciones de alta confiabilidad y análisis in silico. La red resultante

presentó un total de 330 proteínas con 1,271 interacciones. La predicción de nuevas

interacciones entre proteínas se realizó mediante los métodos de búsqueda de interólogos y

basados en el contexto genómico, en combinación con información derivada de

experimentos de los interactomas disponibles y minería de datos. Todas las proteínas

presentes en la red se agruparon de acuerdo a procesos celulares específicos, esto indica

que el análisis realizado esta en concordancia con la evidencia experimental disponible de

interacciones proteína-proteína. Para predecir nuevas proteínas patogénicas se realizó un

análisis del contexto funcional para cada una de las proteínas que integraron la red.

Cincuenta proteínas candidato se obtuvieron con valor predictivo positivo y sensibilidad

superior al 60%. El análisis in silico predice la asociación de las proteínas candidato con los

procesos de quimiotaxis y motilidad, adaptación al medio ácido, respuesta al estrés, sistema

de secreción tipo IV, síntesis de lipopolisacáridos y formación de biopelículas. Se demostró

la importancia del análisis computacional de redes de interacción para caracterizar la

posible función de proteínas hipotéticas o para explorar nuevas funciones de proteínas

conocidas. Así, se proponen funciones para 13 proteínas hipotéticas, para la proteína CheA,

para el regulador transcripcional Nik.R y para la superóxido dismutasa SodB. CheA es una

proteína de conocida función en quimiotaxis; en el presente estudio se determinó su posible

asociación con la exportación de proteínas flagelares durante el ensamblaje del flagelo y

v

con la formación de biopelículas, el cual es un proceso poco comprendido en el contexto de

la patogénesis de H. pylori. NikR fue asociada con la adaptación al medio acido y SodB

con la inhibición de la apoptosis de las células del hospedero. Finalmente, estas nuevas

interacciones proporcionan una base teórica para descubrir nuevos factores asociados a

patogénesis mediante su validación experimental y para el desarrollo de estrategias

terapéuticas novedosas.

vi

Computational prediction and analysis of novel interactions between proteins

involved in Helicobacter pylori pathogenesis

Abstract

Information on protein interactions produced by large-scale experiments in human

and other eukaryotic organisms has contributed to the understanding of biological processes

at system level. However, only a limited amount of interaction data is available for

prokaryotes, the main information was produced from Helicobacter pylori (H. pylori). To

better understand the participation of proteins in H. pylori pathogenesis, we built a protein

interaction network for 127 known proteins involved in H. pylori pathogenesis and

expanded the network by combining experimental interactome data, high confidence

predictions and in silico analysis. The resulting interaction network includes 1,271

interactions between 330 proteins. To predict protein–protein interactions, the interolog and

genomic context methods were used in combination with the information derived from

existing high-throughput interactome assays and data mining. All the proteins present in the

network were clearly located in different clusters, which resulted to have a correspondence

with specific cellular processes. This indicates that our analysis is reliable. To predict novel

pathogenic proteins an analysis of functional context for each protein was carried out. In

this network, 50 pathogenesis candidate proteins were identified with more than 60%

positively predictive value and sensitivity. The in silico analysis predicts the involvement of

candidate proteins in chemotaxis and motility, acid adaptation, response to stress, secretion

system type IV, lipopolysaccharides synthesis and biofilm formation. The importance of

computational analysis in protein interaction networks to characterize the possible function

of unknown proteins or to explore new function of known proteins was demonstrated.

These include 13 hypothetical proteins, the CheA protein, the transcriptional regulator

NikR and superoxide dismutase SodB. CheA, a known chemotactic protein, was shown to

be associated with protein exportation during flagellar assembly, and appears to be involved

in early biofilm formation; such process is still poor understood in the H. pylori

pathogenesis context. NikR was associated to acid adaptation and SodB has been involved

in the inhibition of host cell apoptosis. Finally, these new interactions provide a theoretical

basis for finding new factors in pathogenesis by further experimental validation and for the

development of novel therapeutic strategies.

1

1. Introducción

Las interacciones entre proteínas desempeñan un papel fundamental en varios

aspectos de la organización estructural y funcional de la célula, y van desde la formación de

estructuras macromoleculares y complejos enzimáticos, hasta la regulación y transducción

de señales (Pawson et al., 2000, 2002).

Actualmente, se cuenta con bases de datos que contienen información sobre

interacciones proteína-proteína obtenida mediante métodos experimentales, siendo el

sistema de doble híbrido en levadura y la purificación por afinidad acoplada a

espectrometría de masas los que han sido aplicados a escala genómica. Así mismo, estos

métodos sólo han logrado cubrir una pequeña fracción del proteoma de los organismos en

estudio. La compresión global de la interacción entre proteínas, como en el caso de

eucariotes, no ha alcanzado el mismo nivel de desarrollo para el caso de las bacterias.

Helicobacter pylori (H. pylori) es uno de los organismos mas estudiados a este nivel. Esta

bacteria, infecta a más del 50% de la población mundial y en México se estima que más del

66% de la población adulta está infectada con esta bacteria (Torres et al., 1998). La

infección por H. pylori es la principal causa de gastritis crónica, ulceras pépticas, y es

considerado un factor de riesgo para el desarrollo de adenocarcinoma gástrico y linfomas

gástricos (Montecucco et al., 2001; Peek y Blaser, 2002). A pesar de la importancia de H.

pylori como patógeno humano, queda mucho por aprender de su biología y los mecanismos

por los que causa enfermedad. Los resultados del mapa de interacción de las proteínas

determinado experimentalmente en H. pylori sólo cubren el 46% de su proteoma (Rain et

al., 2001), así mismo se estima que aproximadamente el 50% de estas interacciones son

falsos positivos y negativos, dadas las limitaciones actuales de las técnicas para su estudio

(Cusick et al., 2005). De esta manera, existe una gran cantidad y diversidad de

interacciones entre proteínas asociadas a patogénesis que no han sido determinadas en esta

bacteria. En el presente trabajo, mediante métodos computacionales, se integró información

derivada de las diferentes bases de datos de carácter público, la cual permitió predecir y

analizar interacciones entre proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori. El método parte

de la construcción de una red de interacciones entre proteínas a partir de una base de datos

de proteínas de asociación conocida a patogénesis. Analizando el contexto funcional de

cada una de las proteínas que integraron la red se identificaron nuevas interacciones y

2

proteínas asociadas a patogénesis. También se demuestra que este tipo de análisis puede ser

utilizado para visualizar en contexto diferentes procesos biológicos y para generar nuevas

hipótesis de acerca de la función y evolución de las proteínas; principalmente, las

hipotéticas y proteínas no caracterizadas funcionalmente. Finalmente, se proporciona una

lista de 50 proteínas candidato, la cual es evaluada mediante el uso de anotaciones

funcionales disponibles en bases de datos públicas y de la búsqueda en la literatura. Se

concluye discutiendo el papel de las predicciones en la patogénesis de H. pylori y las

limitaciones del presente estudio.

3

2. Antecedentes

2.1. Historia y características generales de Helicobacter pylori

En 1975, Colin y Jones observaron bacilos Gram negativos en el 80% de los

pacientes con úlcera gástrica. En 1983 Marshall y Warren hallaron bacilos con forma de

“S” en biopsias gástricas y las cultivaron usando técnicas para Campylobacter por lo que

los denominaron Campylobacter pyloridis. En 1987 Marshall y Godwin realizaron la

primera revisión de la nomenclatura denominándolo Campylobacter pylori; posteriormente,

mediante estudios filogenéticos se demostró que el microorganismo no pertenece al género

Campylobacter y se sugirió un género diferente; Helicobacter (Goodwin et al., 1989).

2.2. La infección por H. pylori

La infección por H. pylori es la infección bacteriana más común en el ser humano y

por lo menos la mitad de la población mundial está infectada. Su reservorio primario es el

estómago humano y su vía de transmisión no está completamente clara pero parece ser por

la ruta oral-oral y fecal-oral. La magnitud de la prevalencia esta relacionada con las

condiciones sanitarias y económicas, siendo más alta en los países subdesarrollados (Cave,

1997).

2.2.1. Enfermedades producidas por H. pylori

Todos los infectados con H. pylori desarrollan gastritis crónica, la cual es

asintomática. Solo el 20% tendrán una entidad clínica que incluye úlceras pépticas (15%),

cáncer gástrico (1-2%), linfoma gástrico (menos del 1%); por lo tanto la mayoría de los

infectados permanecen asintomáticos (Parkin et al., 1988; Nomura et al., 1994; Shimiyama

et al., 1997; Strobel et al., 1998; Weel et al., 1998; Ye et al., 1999). La aparición de estas

entidades clínicas depende de la interacción entre las características genéticas del huésped,

del medio ambiente y del genotipo infectante; actualmente no hay medios clínicos o de

laboratorio que identifiquen pacientes que podrían tener secuelas por la infección o

pacientes portadores asintomáticos.

En varias zonas a nivel mundial se ha demostrado que H. pylori es la principal causa

de ulcera péptica, siendo el 90% duodenales y hasta 80% gástricas; en otros países la

4

prevalencia puede disminuir como por ejemplo en EE.UU. debido a mayor consumo de

anti-inflamatorios no esteroideos (AINES); la evidencia demuestra que la erradicación del

agente causal reduce la recurrencia de ulceras pépticas (Cover et al., 1995; Everhart et al.,

2000). La proporción de adenocarcinomas gástricos atribuibles a H. pylori va desde el 60 a

90%, diversos estudios han documentado que H. pylori es la principal causa de este tumor

(Guarner et al., 1993; Kobayashi et al., 1993).

El cáncer gástrico es la segunda de las neoplasias más frecuentes del tubo digestivo

en todo el mundo y en México es la cuarta y quinta para el sexo femenino y masculino,

respectivamente (Parkin, 2004). Hasta el momento no se ha identificado que H. pylori

produzca mutaciones o carcinogénesis de manera directa, por lo tanto se considera que este

efecto lo realiza de manera indirecta estando relacionado con una fuerte respuesta

inflamatoria que se desencadena en el estómago infectado la cual se sigue por una serie de

cambios morfológicos y moleculares que pueden darse en el orden: gastritis crónica,

gastritis crónica atrófica, metaplasia intestinal, displasia y cáncer (Correa y Piazuelo, 2008).

Esta secuencia de cambios, sugiere que la inflamación crónica es un pre-requisito para el

desarrollo de tumores. La modulación de este proceso inflamatorio, puede determinar en

gran parte que se produzca o no un desenlace neoplásico. La diferencia entre estas dos

posibilidades es la secreción de ácido: los pacientes con úlcera duodenal presentan

secreción normal o aumentada de ácido, y los pacientes con úlcera gástrica, generalmente

presentan hipocloridia (Correa y Piazuelo, 2008).

La mayoría de las cepas de H. pylori se pueden agrupar en dos fenotipos distintos

con base en la presencia o no de la isla de patogenicidad cag (cag-PAI, por sus siglas en

inglés), la cual es una región del ADN que contiene de 30 a 40 genes, que codifican

factores de virulencia, incluyendo el gen cagA, que codifica la proteína citotóxica CagA

(Cecini et al., 1996; Cover et al., 1995; Evans et al., 1998). Las cepas que expresan esta

proteína son altamente virulentas e inducen mayor producción de citoquinas inflamatorias

como la interleucina 8 (IL–8), e inducen simultáneamente proliferación y apoptosis celular

significativa (Pan et al., 1997; Rudi et al., 1998). Estas proteínas Cag son introducidas por

H. pylori en el interior de la célula epitelial, por un mecanismo secretor mediante el cual la

proteína es inyectada. En el citoplasma la proteína CagA es fosforilada, en grado variable, a

mayor fosforilación, mayor potencial oncogénico de la cepa de H. pylori (Odenbreit et al.,

5

2000; Stein et al., 2000). La proteína CagA fosforilada interactúa con diversas moléculas y

activan proteínas cinasas (Backert et al., 2001; Yamazaki et al., 2003). Cuando una persona

está infectada por H. pylori el riesgo de cáncer gástrico es de 2 a 3 veces mayor, pero si

tiene anticuerpos anti-Cag A el riesgo aumenta hasta 11 veces pudiendo aumentar hasta 20

veces dependiendo del grado de fosforilación. Más aún, si se combina con la alteración

genética del gen que codifica la síntesis de la interleucina 1-β (IL-1β), el riesgo puede

aumentar hasta 87 veces (Covacci et al., 1993; Manetti et al., 1995; Cover et al., 1995). La

IL-1β, es una citocina proinflamatoria y un muy potente inhibidor de la secreción de ácido

(100 veces más potente que el omeprazol) (Susuki et al., 2002; Graham et al., 2003).

2.3. Genómica funcional de H. pylori

2.3.1. Genómica

En la actualidad se ha determinado la secuencia del genoma completo de seis cepas de

H. pylori (acceso a Entrez Genome marzo 2009): 1) la cepa 26695 que fue aislada en el

Reino Unido de un paciente con gastritis (Tomb et al., 1997); 2) la cepa J99 aislada en

Estados Unidos de un paciente con úlcera duodenal (Alm et al., 1999); 3) la cepa HPAG1

aislada en Suecia de un paciente con gastritis atrófica crónica (Oh et al., 2006); 4) la cepa

Shi470, esta proviene de un aislado del antro gástrico de un paciente amerindio de Perú; 5)

la cepa P12, proviene de un aislado clínico de un paciente con úlcera duodenal; y 6) la cepa

G27, fue aislada de una endoscopia practicada a un paciente en Toscana, Italia (Baltrus et

al., 2009).

El cromosoma circular de la cepa 26695 contiene 1,667,867-pb, el de la J99

1,643,831-pb, el de la HPAG1 1, 596,366-pb, el de la Shi470 1,608,548-pb, el de la P12

1,673,813-pb y el de la G27 1,652,983-pb. El promedio en el contenido de G + C es del

39% en todas las cepas secuenciadas. La cepa HPAG1 presenta 43 genes que no son

detectables o están representados de manera incompleta en los genomas de J99 y 26695. De

estos 43 genes, tres tienen relación con sistemas de restricción-modificación de otras

especies bacterianas.

Los productos predichos de 15 de los 43 genes antes mencionados presentan alta

similitud con otras proteínas reportadas en las otras cepas de H. pylori; dos de estos ORFs

codifican para genes asociados con citotoxina cag localizados en una cag-PAI, otros cuatro

6

están relacionados con componentes de sistemas de restricción-modificación, finalmente

uno más está relacionado también con proteínas Cag (CagY), sin embargo se encuentra

localizado fuera de la isla de patogenicidad (Oh et al., 2006). CagY forma parte de una

estructura en forma de pili que es el núcleo del sistema de secreción tipo IV requerido para

la translocación de la proteína CagA en las células del epitelio gástrico; la introducción de

CagA lleva a la activación en cascada de una serie de cinasas que trae consigo cambios

morfológicos en las células del huésped e induce la producción de interleucina-8. Así

mismo, HPAG1 carece de 29 genes presentes en las otras dos cepas; cinco de éstos son

miembros de los sistemas de restricción-modificación, dos son miembros de la cag-PAI,

una proteína periférica de membrana, una integrasa/recombinasa putativa y se desconoce la

función de los otros 20. La mayoría de los genes de J99 y 26695 que están perdidos en

HPAG1 se localizan en las llamadas zonas de plasticidad. Los tres genomas contienen dos

copias de los genes 16S y dos juegos de los genes 5S-23S del ARN ribosomal;

adicionalmente la cepa 26695 contiene un gen extra del 5S ARNr. Del mismo modo, la

cepa G27 posee 58 genes que no están presentes en las cepas HPAG1, J99 y 26695. La

mayoría de estos genes específicos de G27 codifican para proteínas hipotéticas (Baltrus et

al., 2009).

Un análisis de sintenia de las cepas HPAG1, 26695 y J99 muestran que en contraste

a otras bacterias los genes ARNr de H. pylori no están situados continuamente en el

cromosoma, sugiriendo que su regulación es más compleja que la de otros procariotes. Los

tres genomas codifican para 36 especies de ARNs de transferencia, aparentemente

localizados en las mismas regiones del mapa cromosomal en las dos cepas. Otras

características que comparten las cepas son: ausencia de un origen de replicación

identificable, longitud promedio de secuencias codificables, de donde se han detectado

1536 ORFs para la cepa HPAG1, 1576 para 26695 y 1489 para J99 representando el 91%,

el 90% y el 90% del genoma respectivamente (Boneca et al., 2003).

7

2.3.2. Transcriptómica y proteómica

En la patogénesis de H. pylori, diversos factores externos influyen, entre los que

destaca el pH de las secreciones gástricas, el cual es esencial para el establecimiento y

colonización de la mucosa estomacal. Breves exposiciones de la bacteria a pH de 3.5

genera un incremento en la expresión de proteínas de choque térmico y de la colonización

estomacal; estos cambios en la fisiología bacteriana se consideran una respuesta a señales

fisicoquímicas a través de regulación génica (Tomb et al., 1997).

Allan et al., (2001) identificó genes diferencialmente expresados cuando la cepa

26695 fue expuesta a medios con pH 4.0 o pH 7.0. Entre los genes que incrementaron su

expresión a pH bajo fueron: cagA, HP0681 y HP1289 (únicos en H. pylori) los cuales

participan en el sistema de secreción tipo IV; así como también, genes que codifican para

enzimas involucradas en la síntesis de fosfolípidos y lipopolisacáridos. Por otra parte,

existen genes cuya expresión génica disminuye a pH bajo, este es el caso de genes que

codifican para proteínas involucradas en la síntesis de nucleótidos, proteínas flagelares y

proteínas periféricas de membrana. En otro estudio Ang et al., (2001) diseñaron un

dispositivo de microarreglos donde productos de PCR fueron fijados a una membrana;

representando 1543 ORFs de la cepa 26695. Este método fue utilizado para evaluar la

respuesta transcripcional global a las 48 hrs. de crecimiento a pH 5.5 o pH 7.2. Alrededor

de 53 ORFs fueron altamente expresados en ambas condiciones; sugiriendo que bajo

condiciones estresantes estos genes son esenciales en la fisiología bacteriana. Así mismo,

445 ORFs fueron expresados de manera estable en ambas condiciones sin variación

significativa. Esto implica que sus productos probablemente son necesarios para mantener

las funciones básicas en la célula bacteriana. A pH bajo, un total de 80 ORFs incrementaron

significativamente sus niveles de expresión, mientras que en otros 4 ORFs su expresión fue

suprimida. Los restantes 952 ORFs no fueron detectables bajo cualquiera de las

condiciones de pH.

Scott et al., (2007) sometió a H. pylori a una exposición crónica (10 días) en medio

ambiente gástrico y determinó el perfil de expresión génica. La comparación del

transcriptoma “in vitro” e “in vivo” a pH 7.4 reveló dos grupos de genes de función

conocida que incrementan al doble su expresión; tres de estos grupos responden tanto al

medio ácido “in vitro” como a la infección gástrica.

8

Otros investigadores han demostrado que la infección por H. pylori afecta el

equilibrio entre proliferación y apoptosis de las células epiteliales gástricas. En particular

H. pylori ha mostrado tener la capacidad de inducir la transcripción de la ciclina D1, uno de

los reguladores del ciclo celular de las células antes citadas (Hirata et al., 2001). Del mismo

modo, la proteína-1 de membrana de H. pylori ha mostrado capacidad de inducir la sobre

expresión del factor de necrosis tumoral alfa y producir tumores en ratones desnudos;

sugiriendo que este podría ser un mecanismo celular involucrado en el desarrollo de cáncer

gástrico (Suganuma et al., 2001). Otro sistema molecular que es inducido por H. pylori y

que ha mostrado tener relación con el cáncer gástrico es el sistema de la ciclo oxigenasa 2

(COX 2). El análisis de biopsias de 160 pacientes, 97 con dispepsia no ulcerosa (47

negativos y 50 positivos para H. pylori) y 63 con cáncer gástrico, fue realizado para evaluar

tanto la expresión de COX 2 como la proliferación celular y la apoptosis (Wambura et al.,

2002). En pacientes con dispepsia no ulcerosa y positivos para H. pylori, la expresión de

COX 2 fue significativamente más alta en los que los negativos. Por su parte las biopsias de

pacientes con cáncer gástrico presentaron una mayor expresión de COX 2, en las regiones

anatomicas que corresponden al cuerpo y antro gastrico, que los pacientes con dispepsia no

ulcerosa. Estos resultados sugieren que la expresión de COX 2 está asociada con la pérdida

de la integridad en el epitelio gástrico y por lo tanto participa en la carcinogénesis gástrica.

Por otra parte, después de la secuenciación de las cepas J99 y 26695, Jungblut et al., (2000)

realizaron un análisis comparativo del proteoma de H. pylori en las dos cepas antes citadas

y una más, cuyo genoma no ha sido secuenciado (cepa SS1). El análisis del perfil proteico

por 2D-PAGE reveló 1863 bandas para la cepa 26695, 1662 para la J99 y 1448 para SS1;

estos perfiles revelan alta variabilidad en los productos de expresión de cada cepa.

Posteriormente utilizando espectrometría de masas en la variante de desorción/ionización

láser asistida por matriz (MALDI-MS), mediante la cual se obtiene la huella digital de las

proteínas, se identificaron 152 proteínas, incluidos nueve factores de virulencia y 28

antígenos. Se confirmo la expresión de 27 ORFs hipotéticos y 6 ORFs desconocidos y se

observo que sólo un pequeño número de proteínas eran comunes para las cepas estudiadas.

Una aproximación similar fue realizada para caracterizar los subproteomas con el

fin de identificar proteínas importantes en la interacción huésped-patógeno (Backert et al.,

2005). Para ello se realizó el análisis de la composición de dos fracciones proteicas de H.

9

pylori; que corresponden a las proteínas solubles y la otra con las proteínas de la estructura

celular (incluidas las de membrana). Las 50 proteínas más abundantes en el análisis de 2D-

PAGE fueron identificadas mediante su huella digital por MALDI-MS. Numerosas

proteínas periféricas de membrana, 4 proteínas Cag, la citotoxina vacuolizante (VacA),

otros potenciales factores de virulencia y pocas proteínas ribosomales fueron identificadas

en la fracción de proteínas de la estructura celular. En contraste, la enzima catalasa (Kat A),

la gamma-glutamiltranspeptidasa (Ggt), y la proteína activadora de neutrófilos (NapA) se

encontraron exclusivamente en la fracción de proteínas solubles. La identificación de estos

subproteomas es de suma importancia para identificar nuevos factores de virulencia y

antígenos de potencial valor terapéutico o diagnóstico contra las infecciones causadas por

este patógeno.

2.3.3. Interactómica

Con la disponibilidad de la secuencia completa de genomas de varios organismos se

han desarrollado aproximaciones globales para un mejor entendimiento de las funciones de

las proteínas. Así, se han determinado varios mapas de interacción (interactomas) tanto para

eucariotes como en procariotes. El primer mapa de interacciones entre proteínas

determinado para un procarionte fue precisamente el de H. pylori (Rain et al., 2001). La

estrategia experimental fue el sistema de dos híbridos en levadura; se analizaron 261

proteínas contra una biblioteca compleja de fragmentos genómicos de la cepa 26695,

utilizando aproximadamente 10 millones de clonas. De manera general se encontraron más

de 1200 interacciones entre proteínas de H. pylori, cubriendo alrededor del 46.6% del

proteoma. Explorando el mapa de interacciones proteína-proteína se visualizaron diferentes

rutas celulares y se predijo la función de varias proteínas, éste es el caso de sistemas de

quimiotaxis. El genoma de H. pylori presenta tres homólogos de proteínas de E. coli que

están involucradas en rutas quimiotacticas (CheA, CheW and CheY) y proteínas tales como

TlpA similares a receptores de quimiotaxis (MCPs).

Los resultados mostraron que la proteína CheA interactúa con CheY y CheW; y los

distintos dominios interactuantes fueron identificados de manera precisa. El dominio de

CheA que se une a CheY precisamente traslapa con su dominio interactuante; esta

asignación se realizó mediante un estudio estructural del homólogo en E. coli (Welch et al.,

10

1998). El sitio de unión de TlpA para CheW fue localizado en un dominio susceptible de

metilación de una proteína conocida en E. coli, por lo tanto fue implicado en la

transducción de señales quimiotácticas.

El complejo ureasa también fue examinado. La actividad ureasa es esencial para la

patogenicidad de H. pylori y su síntesis requiere dos subunidades estructurales UreA y

UreB, y el producto de cuatro genes accesorios: ureE, ureF, ureG, ureH14; los respectivos

homólogos en E. coli juegan un papel importante en la incorporación de níquel (Cussac et

al., 1992). El mapa de interacción revela la conexión entre UreA y UreB, y una de las dos

interacciones homo-oligoméricas de las subunidades estructurales (UreA); el homodímero

UreB no fue detectado. Otra conexión fue observada entre proteínas accesorias UreH y

UreA mediante sus subunidades estructurales; esto es consistente con el presunto papel de

chaperona de UreH (Mobley et al., 1995). Un nuevo vínculo estructural fue encontrado

entre UreG y UreE. Adicionalmente a la proteínas accesorias, el operón ureasa codifica

para una proteína interna de membrana (UreI); esencial para la adaptación a pH ácido

(Skouloubris et al., 1998) y funcionan como un canal para urea dependiente de pH (Weeks

et al., 2000). El tercer dominio citoplasmático de esta proteína revela una interacción

potencial con la proteína ExbD involucrada en la transmisión de energía mediante fuerza

motora de protones a receptores fuera de la membrana celular.

La combinación de datos genómicos y proteómicos también ha permitido predecir la

función de las proteínas en el contexto de las redes de interacción. El proteoma de H. pylori

contiene un homólogo de la proteína HolB en E. coli. En E. coli esta proteína interactúa con

HolA para formar parte del núcleo de la ADN polimerasa (Dong et al., 1993). Los

resultados en el mapa de interacción de H. pylori muestra un alto puntaje de interacción

entre HolB y un polipéptido no caracterizado (HP1247). Un alineamiento entre HolA de E.

coli y HP1247 remarca similitud a nivel estructural. Así, tomando como referencia a HolA

le fue asignada una función similar a la proteína HP1247 en H. pylori. Varias de las

interacciones también fueron analizadas en el contexto de la estructura tridimensional de las

proteínas. La ARN polimerasa procariota está compuesta de un núcleo (α2ββ’) asociado

con un factor sigma. En H. pylori, las subunidades beta están fusionadas en un polipéptido

sencillo (RpoB). Uno de los dos factores sigma alternativos presentes en H. pylori

(HP1032) es similar a la proteína FliA de E. coli, la cual es necesaria para la transcripción

11

de genes involucrados en la biosíntesis del flagelo (Liu y Matsumura, 1995). De esta

manera se identificó de manera precisa una región de RpoB que interacciona con FliA de H.

pylori. Este trabajo es el único que se ha realizado a gran escala para H. pylori y ha

permitido la identificación de complejos que están presentes en otros organismos, por

ejemplo en E. coli y C. jejuni. Así mismo, se ha complementado el análisis a nivel de

secuencia para inferir homología y estudios de predicción de operones basados en la

localización de genes en el cromosoma. Finalmente, los dominios interactuantes

identificados fueron analizados en el contexto de la estructura tridimensional de las

proteínas. Precisamente, este tipo de análisis contextuales permitieron la asignación de

funciones para proteínas no caracterizadas, proporcionando materia prima para futuros

ensayos biológicos (Rain et al., 2001).

2.4. Métodos para la determinación de interacciones entre proteínas

Las interacciones entre proteínas desempeñan un papel fundamental en varios

aspectos de la organización estructural y funcional de la célula (Pawson et al., 2000; 2002).

Las interacciones entre proteínas básicamente pueden ocurrir en los siguientes niveles: i)

las que ocurren entre dominios de una misma cadena polipeptídica, ii) las que ocurren entre

dominios de diferentes cadenas polipeptídicas en proteínas multiméricas, y iii) las que

ocurren de manera transitoria en complejos formados entre proteínas independientes

(Teichmann et al., 2001).

Hasta la actualización correspondiente al 23 de marzo del 2009 en el Centro

Nacional para la Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI, por sus siglas en ingles) se

dispone de las secuencias de aminoácidos codificadas por 867 genomas secuenciados

completamente. Además, se dispone de un gran número de datos obtenidos a través de

microarreglos de ADN; e información sobre interacciones proteína-proteína obtenida

mediante los métodos de dos híbridos en levadura, la purificación por afinidad y los

microarreglos de proteínas acoplados a espectrometría de masas, cristalografía de rayos X,

co-inmunoprecipitación, resonancia magnética nuclear (RMN) y resonancia de plasmones

de superficie (BIAcore). No obstante la gran cantidad de información proporcionada por

estos métodos, debido a dificultades para su escalamiento sólo dos de ellos han sido

aplicados a escala genómica: el sistema de dos híbridos en levadura y la purificación por

12

afinidad acoplada a espectrometría de masas. Ejemplos de aplicación de estos métodos son

los mapas de interacción entre proteínas determinados para Saccharomyces cerevisiae (Uetz

et al., 2000; Ito et al., 2001; Gavin et al., 2002; Ho et al., 2002), Caenorhabditis elegans

(Walhout et al., 2000), Helicobacter pylori (Rain et al., 2001), Drosophila melanogaster

(Giot et al., 2003) y Campilobacter jejuni (Parish et al., 2007). Los resultados

proporcionados por estas aproximaciones de análisis global junto con la de experimentos a

pequeña escala han dado lugar a la creación de una amplia variedad de bases de datos, al

tiempo que la visión sobre la función de las proteínas ha evolucionado. Desde el punto de

vista clásico, la función de una proteína, está determinada por su acción local; mientras que

en un contexto sistémico la función de una proteína se define como el entramado de

interacciones con otras moléculas. Esta nueva forma de comprender a los sistemas

biológicos desde un punto de vista contextual es el objeto de estudio de la biología de

sistemas.

Análisis de genómica funcional han mostrado que la complejidad de los organismos

no depende del número de proteínas codificadas en sus genomas, sino del número de

interacciones entre ellas (Claverie, 2001). Así, la planta Arabidopsis thaliana, el nemátodo

Caenorhabditis elegans, la mosca Drosophila melanogaster y el ser humano poseen un

número similar de genes (25,498; 19,099; 14,100 y 30,000-35,000; respectivamente). Por

ello, la optimización y el desarrollo de métodos para predecir y analizar los detalles acerca

de las interacciones entre proteínas tanto a nivel atómico como a escala genómica sigue

siendo una de las áreas en constate desarrollo (Edwards et al., 2002; Jansen et al., 2002).

Una vez dilucidadas las redes de interacciones o “interactoma” en sistemas celulares

modelos, será posible el diseño de fármacos más específicos y la ingeniería de procesos

celulares (Serrano, 2007).

2.4.1. Métodos experimentales

2.4.1.1 Sistema de doble híbrido en levadura (Y2H)

El desarrollo de la técnica de Y2H se fundamenta en que activadores

transcripcionales eucariotas tienen al menos dos tipos de dominios, uno que se une

directamente a la región promotora (dominio de unión al ADN) y otro que activa la

13

transcripción (dominio de activación). Se ha demostrado que la separación del dominio de

unión (BD) y del dominio de activación (AD) da como resultado una inactividad

transcripcional, la cual es restablecida si el BD se asocia físicamente con un AD (Fields y

Song, 1989). Así, un segmento de ADN que codifica para una proteína de interés es

fusionado al respectivo que codifica para un BD (construcción cebo o carnada). Un

procedimiento similar es utilizado para crear una quimera que incluye un segmento

codificante para otra proteína de interés fusionado a un AD (construcción presa). Ambas

construcciones son clonadas por separado en vectores de expresión e introducidas en una

célula de levadura. Una vez expresadas las proteínas fusionadas y si éstas interaccionan el

factor transcripcional podrá ensamblarse, activando la transcripción de un gen reportero

(Figura 1). Los sistemas Y2H más ampliamente utilizados son los basados en GAL4/LexA,

donde GAL4 controla la expresión del gen LacZ que codifica para la beta-galactosidasa.

Para realizar un escaneo a nivel genómico dos variantes del sistema Y2H han sido

desarrolladas: escaneo basado en una matriz y escaneo sobre una biblioteca. En la primer

variante de las antes mencionadas, se crea una matriz de clonas “presa”, donde cada clona

expresa una proteína “presa” particular en un pocillo de una placa de reacción. Entonces,

cada proteína “cebo” es acoplada sobre un arreglo de clonas “presa” y aquellas donde dos

proteínas interaccionan son seleccionadas en base a la expresión de un gen reportero y a su

posición en la placa de reacción. En la segunda variante, cada “cebo” es escaneado contra

una biblioteca que contiene segmentos al azar de cADN u ORFs. Así, aquellas proteínas

que interaccionan serán seleccionadas por su capacidad de crecer sobre sustratos

específicos y caracterizadas mediante secuenciación. Las principales ventajas del método

Y2H son: rapidez y sencillez, detección de interacciones transitorias y que es realizado in

vivo.

14

Figura 1. Método de doble híbrido en levadura.

Sin embargo el método también presenta desventajas, entre ellas: interferencia entre

los dominios fusionados, detección de interacciones uno a uno dejando de lado los efectos

cooperativos, su capacidad de detectar interacciones transitorias la hace susceptible de

uniones inespecíficas, los procesos de modificación post-traduccional y de plegamiento

pueden variar entre la levadura y otros organismos. Esto hace difícil escanear proteínas de

mamíferos y de procariontes mediante Y2H, así como también proteínas de membrana. Se

pueden utilizar diferentes técnicas de análisis in vitro para validar los resultados de Y2H

pueden (Shoemaker y Panchenko, 2007).

2.4.1.2. Purificación por afinidad en tándem acoplada a espectrometría de masas

(TAP-MS)

Este método consiste en la generación de una construcción que incluye un segmento

génico que codifica para una proteína de interés con un segmento que codifica para la

etiqueta TAP. Una etiqueta TAP está formada por la proteína A de Staphylococcus con

dominios de unión para inmunoglobulina G (IgG), y un péptido de unión a calmodulina

separado por un sitio de rompimiento para la proteasa del virus del tabaco (Rigaut et al.,

1999; Puig et al., 2001). Posteriormente, la construcción se expresa en una célula de

15

levadura donde esta puede formar complejos con otras proteínas. En el primer paso de la

purificación, la proteína A se une a IgG que se encuentra fija a una matriz; después se

procede a realizar un lavado para eliminar los contaminantes, se adiciona la proteasa y se

rompe la unión entre la proteína A y la matriz de IgG. El producto del primer paso es

posteriormente eluido mediante su incubación con perlas cubiertas de calmodulina en

presencia de calcio; nuevamente se realiza un lavado y los complejos formados con la

proteína de interés, son purificados bajo condiciones nativas, por lo tanto, manteniendo la

integridad del complejo. Los componentes del complejo formado son resueltos por 2D-

PAGE, digeridos enzimáticamente por proteasas y los fragmentos son identificados

mediante espectrometría de masas (Figura 2). La principal ventaja de este método es su

capacidad para determinar complejos multiproteicos, a diferencia de Y2H donde sólo

resuelve interacciones uno contra uno, dejando de lado los efectos cooperativos. Entre las

desventajas del método se encuentran: sólo se detectan interacciones estables, por lo cual

las transitorias no se detectan, la proteína no se expresa en el momento de la lisis y

finalmente, la interferencia del TAP-cassette en la interacción (Shoemaker y Panchenko,

2007).

Figura 2. Método de purificación por afinidad en tándem acoplado a espectrometría de masas.

16

2.4.1.3. Interacciones entre proteínas a nivel atómico

La información a nivel atómico más detallada de las interacciones entre proteínas

puede ser proporcionada por la cristalografía de rayos X y espectroscopía de resonancia

magnética nuclear, pero el número de complejos determinados por estas técnicas sigue

siendo bajo (Tong et al., 2001). Al mismo tiempo, la caracterización en tiempo real de

interacciones entre proteínas in vivo puede ser alcanzada mediante técnicas

espectroscópicas, las cuales requieren la adición de una marca fluorescente a la proteína de

interés (Lippincott-Schwartz y Patterson, 2003; Piehler, 2005). Otro método efectivo para

determinar interacciones entre ligandos solubles y receptores inmovilizados sobre una placa

de oro es la llamada resonancia de plasmones de superficie (Cooper, 2003; Karlsson, 2004).

Recientemente, se han desarrollado nuevos métodos para analizar la interacción entre

proteínas a nivel atómico. Éste es el caso de la microscopía de fuerza atómica (Yang et al.,

2003) y de técnicas fluorescentes, que son capaces de caracterizar cambios

conformacionales en las proteínas durante la interacción (Margittai et al., 2003).

2.4.2. Métodos computacionales

En el análisis funcional de un genoma, un paso crítico es la comprensión de las

interacciones entre las proteínas que codifica (Eisenberg et al., 2000). Por ello se ha

desarrollado un conjunto de métodos teóricos para abordar el problema de la predicción de

interacciones entre proteínas a partir del análisis de sus secuencias, de información de los

genomas y de datos cristalográficos de complejos macromoleculares. De manera general,

los métodos utilizan como hipótesis que si se conoce el modo de interacción entre dos

proteínas o dos dominios de proteínas, cualquier interacción que pueda ocurrir entre

proteínas homólogas involucra contactos del mismo tipo (Teichmann et al., 2001). Sin

embargo, existen algunos casos en los que proteínas homólogas poseen diferentes modos de

interacción. Por ejemplo, la enzima nucleótido difosfato quinasa se presenta en la

naturaleza en forma de hexámero o tetrámero dependiendo de la especie (Morera et al.,

1994).

El reconocimiento proteína-proteína está determinado por las propiedades físicas y

químicas de la superficie interfacial, la cual ha sido caracterizada en términos de su

geometría (tamaño, forma y complementariedad) y de su naturaleza química (tipo de grupo

17

químico y aminoácido, hidrofobicidad, interacciones electrostáticas y enlaces por puente de

hidrógeno). El análisis de las superficies de contacto entre proteínas o región interfacial

tuvo sus inicios con el trabajo de Chothia y Janin (1975). A partir de ese año y hasta la

fecha, siguen apareciendo diferentes trabajos sobre el tema (Janin y Chothia, 1990;

Lawrence y Colman, 1993; Jones y Thornton, 1997; Chakrabarti y Janin, 2002; Headd et

al., 2007; Yan et al., 2008).

Se han desarrollado métodos que utilizan la información contenida en los genomas

o también llamados métodos basados en el contexto genómico, entre los principales están:

fusión génica, perfiles filogenéticos y vecindad génica. Por ejemplo, un evento de fusión

génica representa la fusión física de dos genes relacionados a nivel funcional y separados

físicamente, para producir un solo gen multifuncional (Figura 3). Dandekar et al., (1998)

utilizaron la información asociada a la conservación del orden de genes ortólogos y la

arquitectura de operones en 6 genomas de procariotas y 3 de arqueas. Con este método, se

identificaron para cada genoma alrededor de 100 proteínas involucradas en interacciones

físicas directas previamente descritas a nivel experimental. El método desarrollado por

Pellegrini et al. (1996), denominado perfiles filogenéticos, se basó en la co-evolución de

proteínas que interactúan, dicho de otra manera presencia-ausencia de genes ortólogos en

genomas diferentes. Si el patrón de proteínas ortólogas (presencia-ausencia) se conserva en

organismos de la misma especie, se debe probablemente a que una de las proteínas no

puede ejercer su función sin la otra (Figura 3). Huynen et al. (2000) aplicaron este método

al genoma de Mycoplasma genitalium, prediciendo 34% de los pares como interactuantes y

un 29% adicional pertenecientes a la misma vía metabólica o proceso funcional. Así

mismo, métodos basados en la fusión de dominios se fundamentan en la hipótesis de que

cuando dos proteínas A y B contienen dominios homólogos a dominios diferentes de una

tercera proteína en otro organismo, pero A y B no son homólogas entre sí, entonces A y B

interaccionan (Marcotte et al., 1999; Enright et al., 1999).

18

Figura 3. Métodos computacionales de predicción de interacciones entre proteínas basados en el

contexto genómico. (A) Representación del método de vecindad génica para 8 genomas completos, mostrando

un par de genes (marcados con color rojo y azul) que están físicamente próximos en los 8 genomas. Además,

se muestra en un par de genomas un evento de fusión génica entre dos genes (marcados en color amarillo y

azul claro). (B) Representación de perfiles filogenéticos de los genes de la representación previa. Los tres

pares de genes tienen los mismos patrones de co-ocurrencia en los 8 genomas, por tanto, sus productos

podrían interaccionar físicamente. (C) Representación de dos alineamientos de secuencias para un par de

familias de proteínas, se muestran las regiones conservadas marcadas en color rojo y azul, respectivamente.

Para cada familia de proteínas, mutaciones co-relacionadas (marcadas en color verde) están presentes en sub-

arboles idénticos, indicando que estos sitios podrían estar involucrados en interacciones entre proteínas de

cada una de estas familias.

La limitación de los métodos basados en el contexto genómico radica en que sólo

son aplicables a genomas secuenciados completamente, para tener la certeza de la ausencia

de genes específicos; por otro lado son aplicables solamente en bacterias, donde el orden de

los genes es una característica relevante; y por último dependen de la calidad del

alineamiento múltiple de las proteínas en estudio (Valencia y Pazos, 2002).

19

En 2001, se desarrolló un método de predicción de patrones de secuencia

característicos, observados con regularidad, en pares de proteínas cuya interacción ha sido

comprobada de forma experimental (Sprinzak y Margalit, 2001). Una de las proteínas posee

un patrón de secuencia característico, definido en la clasificación InterPro (Apweiler et al.,

2001), y la otra proteína que interacciona un segundo patrón característico. A este conjunto

de pares de patrones característicos se les denominaron patrones de secuencia

correlacionados.

Wojcik y Schächter (2001) combinaron métodos de búsqueda de similitud de

secuencia y agrupamiento de secuencias (“clustering”) con la información contenida en las

bases de datos acerca de dominios en interacción proteína-proteína. Este método se ha

empleado para predecir el mapa de interacción de proteínas en la bacteria Escherichia coli,

utilizando la información previa del mapa de interacción de H. pylori. Pazos y Valencia

(2001, 2002) combinaron información a nivel de secuencia y genómica para calcular las

distancias evolutivas entre proteínas que pertenecen a familias relacionadas y para calcular

la correlación de mutaciones entre posiciones de un alineamiento múltiple de secuencias.

Esta idea se basa en observaciones previas que indican una correspondencia entre los

árboles filogenéticos de familias de proteínas interactuantes no homólogas (ejemplo: la

insulina y receptor para insulina). Este método se ha aplicado a gran escala, utilizando

67,000 pares de proteínas de E. coli, de los cuales 2,742 fueron predichos correctamente. Se

ha desarrollado un método similar al anterior; en éste se alinean árboles filogenéticos,

representados por matrices, para definir proteínas específicas involucradas en interacciones.

Este método se ha aplicado a más de 18 familias de proteínas con resultados satisfactorios

(Ramani y Marcotte, 2003).

Lu et al. (2002) desarrollaron un método denominado MULTIPROSPECTOR que

se basa en la metodología conocida con el nombre de modelaje por hilvanado (del inglés

“threading”). Esta metodología es utilizada para la predicción de estructura cuaternaria, y

consta de dos fases. Una primera fase ejecuta el método de “threading” PROSPECTOR,

para generar un conjunto de estructuras 3D potenciales de la proteína en estudio. En una

segunda fase, re-evalúan la compatibilidad de las estructuras 3D generadas con las

estructuras molde que forman parte de complejos cristalográficos determinadas

experimentalmente. El método fue evaluado utilizando un conjunto de 40 homodímeros, 15

20

heterodímeros y 69 monómeros, explorados contra una selección de 2,478 estructuras

representativas del banco de datos de proteinas (PDB, por sus siglas en inglés). El método

predijo correctamente 36 homodímeros, 15 heterodímeros y 65 monómeros. Además, se

evaluaron todas las posibles interacciones para proteínas de levadura, de un total de 2,865

predicciones utilizando MULTIPROSPECTOR (Lu et al., 2002), 1,138 están documentadas

en la base de datos de interacciones entre proteínas (DIP, por sus siglas en inglés).

Sprinzak et al., (2003) propusieron un método para evaluar la exactitud de los datos

experimentales sobre interacciones proteína-proteína obtenidos por el método de doble

híbrido. Estos investigadores sugieren que el 50% de las interacciones proteína-proteína

identificadas en la levadura S. cerevisiae corresponden a casos positivos y que el número

total de interacciones para este organismo oscila entre 10,000 y 16,600 interacciones.

Por último, Goffard et al. (2003) desarrollaron el método IPPRED para predecir

interacciones entre proteínas basado en la similitud de secuencias amino acídicas. Para

inferir las interacciones entre proteínas IPPRED utiliza el programa BLAST (Altschul et

al., 1990), datos experimentales documentados en la base de datos BIND (Bader et al.,

2003) y en la literatura científica. Además, IPPRED está disponible a través de una

interfase en el sitio de internet http://cbi.labri.fr/outils/ippred/.

2.5. Bases de datos de interacciones entre proteínas

Para documentar y describir las interacciones entre proteínas, se ha creado un grupo

de bases de datos que incluyen toda la información obtenida por los diferentes métodos

experimentales descritos anteriormente. A continuación se describe de manera general las

principales bases de datos, concentrando la atención en el tipo de datos que contienen y

cómo accederlas.

21

2.5.1. BIND (Biomolecular Interaction Network Database)

http://bond.unleashedinformatics.com/

Esta base de datos, documenta interacciones moleculares que incluyen proteína-

proteína, proteína-ARN, proteína-ADN, proteína-moléculas pequeñas, complejos

moleculares, y vías metabólicas. Los datos experimentales obtenidos por doble-híbrido,

espectrometría de masas, cristalografía, bibliotecas de fagos se incluyen en esta base de

datos (Bader et al., 2003). Actualmente (marzo 2009), BIND documenta 158,489

interacciones, y 3,705 complejos.

2.5.2. DIP (Database of Interacting Proteins)

http://dip.doe-mbi.ucla.edu

Esta base de datos, documenta interacciones moleculares, proteína-proteína,

determinadas experimentalmente por los métodos de doble-híbrido, inmunoprecipitación,

ensayos de bloqueo con anticuerpos monoclonales y anotaciones extraídas de la literatura

científica, entre otros. DIP está implementada como una base de datos relacional, la cual se

define como aquella en donde todos los datos visibles al usuario están organizados

estrictamente como tablas de valores, y en donde todas las operaciones de la base de datos

operan sobre estas tablas. En DIP la base de datos relacional esta formada por cuatro tablas.

Una primera con información sobre las proteínas, una segunda sobre interacciones proteína-

proteína, una tercera que describe detalles sobre los experimentos, y la cuarta tabla contiene

la lista de todas las referencias en Medline. DIP permite la representación visual de las

interacciones así como navegar a través de la red de interacciones proteicas mediante

internet (Xenarios et al., 2001; 2002). Hasta marzo del 2009 el número de proteínas

contenidas en DIP ascendía a 20,728 y el número de interacciones a 57,684.

2.5.3. MINT (Molecular INTeraction database)

http://cbm.bio.uniroma2.it/mint/index.html

MINT contiene información sobre complejos moleculares, interacción entre

dominios, modificaciones enzimáticas de las proteínas interactuantes, constantes de unión y

otros datos cinéticos. Toda la información contenida en MINT es “curada” de manera

22

manual por expertos, y está organizada en una base de datos relacional (Zanzoni et al.,

2002). Actualmente (marzo 2009), MINT tiene documentadas 110,164 interacciones.

2.5.4. 3did (3D interacting domains)

http://gatealoy.pcb.ub.es/3did/

Esta base de datos permite explorar los detalles de interacciones entre dominios

derivados de estructuras tridimensionales (Stein et al., 2005). Para cada dominio, se

proporciona una vista de todas sus interacciones con otros dominios. En algunos casos se

muestran comparaciones estructurales entre las superficies interfaciales de dominios

interactuantes, revelando la variación de interacciones entre pares de familias de dominios.

InterPreTS es un servicio en línea asociado a 3did que predice interacciones entre dominios

basado en la similitud a nivel de secuencia con proteínas de una base de datos de dominios

interactuantes (Aloy y Russell, 2003). Hasta marzo del 2009, 3did tiene documentadas

115,559 interacciones.

2.5.5. IntAct (IntAct database)

http://www.ebi.ac.uk/intact/site/index.jsf

La principal meta de este proyecto es proporcionar un repositorio público con

información referente a interacciones proteína-proteína derivadas experimentalmente

(Kerrien et al., 2007). La base de datos hace un uso extensivo de vocabularios controlados,

los cuales permiten obtener una descripción consistente con los detalles experimentales que

fueron utilizados para generar la información. Para soportar búsquedas generalizadas, estos

vocabularios tienen una estructura jerárquica y dentro de lo posible, son utilizados sistemas

de referencia tales como la base de datos de taxonomía del NCBI o la base de datos de

Ontologías génicas (GO). Actualmente (marzo 2009), IntAct tiene documentadas 189,082

interacciones.

2.5.6. HPRD (The Human Protein Reference Database)

http://www.hprd.org/

HPRD contiene información que ha sido manualmente curada para la mayoría de las

proteínas del ser humano (Peri et al., 2003). Información concerniente a proteínas

23

involucradas con enfermedades humanas es anotada y enlazada a la base de datos de

herencia mendeliana en humanos (OMIM database). El NCBI proporciona un enlace a

HPRD a través de su bases de datos de proteínas de humano (Entrez gene y RefSeq). La

base de datos despliega información sobre las funciones de las proteínas de humano,

incluyendo: interacciones proteína-proteína, modificaciones post-traduccionales, relaciones

enzima-sustrato y asociaciones con enfermedades. Toda la información es “curada” de

manera manual por expertos a través de análisis bioinformáticos de las secuencias de las

proteínas. Actualmente (marzo 2009), HPRD tiene documentadas 38,167 interacciones.

2.6. Calidad de los métodos de determinación de interacciones entre proteínas

El método estándar para evaluar la calidad de las interacciones detectadas a nivel

experimental se basa en que se debe detectar la misma interacción por diferentes métodos

(Schwikowski et al., 2000). Por ejemplo en S. cerevisiae, se han determinado a nivel

experimental y de manera independiente varios interactomas, lo que ha producido un total

de 80,000 interacciones. Sin embargo, sólo 2,400 interacciones fueron comunes a todos los

interactomas de S. cerevisiae (von Mering et al., 2002). Existen varias explicaciones para

esto; posiblemente los métodos no han alcanzado aún su máximo desarrollo; varios de estos

métodos producen una gran cantidad de falsos positivos y negativos, y algunos otros

presentan problemas para ciertos tipos de interacciones. Cada uno de los métodos para

determinar las interacciones entre proteínas, producen una distribución de interacciones

única con respecto a las categorías funcionales de las mismas. Estas diferencias en la

cobertura sugieren que los métodos presentan debilidades y fortalezas. Así, los métodos de

purificación de complejos resuelven pocas interacciones para proteínas involucradas en

transporte y en recepción de señales, debido posiblemente a que estas fracciones del

proteoma por lo general son ricas en proteínas de membrana, las cuales son difíciles de

purificar. Similarmente, el sistema de Y2H, a diferencia de otros métodos, difícilmente

detecta interacciones entre proteínas involucradas en el proceso de traducción (von Mering

et al., 2002).

Otro enfoque para validar la interacciones combina la información que brindan

métodos experimentales independientes con datos 3D obtenidos por cristalografía de rayos

X (Edwards et al., 2002). Siguiendo esta línea de razonamiento, la integración de diferentes

24

bases de datos o diferentes métodos, contribuirá a validar las anotaciones en las mismas

(Gerstein et al., 2002). Un ejemplo de ello lo constituye el método propuesto por Tong et

al. (2002) que consistió en combinar la metodología de despliegue en fagos (“phage

display”) con Y2H. Primeramente, mediante una biblioteca de fagos, se realizó una

búsqueda de secuencias consenso en proteínas de levadura capaces de unirse a dominios de

reconocimiento de péptidos desplegados en la superficie de cada fago. Como resultado de

esta búsqueda se obtiene un entramado de interacciones que conecta a proteínas que poseen

una secuencia consenso con aquellas que poseen dominios de reconocimiento específico

para esas secuencias, a la vez, define sitios de unión en algunas de las proteínas. Un

segundo entramado de interacciones se obtiene de la búsqueda de proteínas que

interaccionan con los dominios de reconocimiento de las secuencias consenso, utilizando el

método de doble-híbrido. Este método ha sido aplicado en la búsqueda de proteínas que

interactúan con dominios SH3; estos dominios se encuentran principalmente en proteínas

involucradas en vías de señalización.

25

3. Planteamiento del problema

El conocimiento del contexto de las interacciones de una proteína es crucial para

comprender las funciones celulares. Sin embargo, los métodos experimentales para

determinar a gran escala las interacciones entre proteínas sólo cubren una pequeña fracción

del proteoma de una célula bajo condiciones específicas. En el mismo contexto, para el

caso de las bacterias, incluido H. pylori, la compresión del papel biológico de las

interacciones entre proteínas no ha alcanzado el mismo nivel de desarrollo como en el caso

de organismos eucariontes, como el humano y la levadura S. cerevisiae. Más aún, para

microorganismos patógenos de humano poco se sabe acerca del papel que juegan en la

patogénesis las interacciones entre proteínas.

4. Justificación

En muy pocas especies bacterianas, incluyendo a H. pylori, se han analizado las

interacciones entre proteínas a nivel global. H. pylori es la bacteria que más personas

infecta en el mundo. En México el 66% de la población adulta está infectada con esta

bacteria. La infección por H. pylori es la principal causa de gastritis crónica, ulceras

pépticas y adenocarcinoma gástrico, también produce linfomas gástricos asociados

amucosa (MALT), anemia ferropénica, y actualmente es tema de discusión que sea la causa

de por lo menos el 50% de los casos de púrpura trombocitopénica idiopática. Dada la

importancia de la H. pylori como patógeno, es necesario comprender los mecanismos

moleculares por los que causa enfermedad. En este sentido, los resultados del mapa de

interacción entre proteínas de H. pylori sólo cubren el 46% de su proteóma, así mismo se

estima que aproximadamente el 50% de los resultados obtenidos en experimentos de

interactómica son falsos positivos o falsos negativos. De tal manera que existe una amplia

cantidad y diversidad de información por confirmar y explorar, a fin de elucidar algunas de

las interacciones entre proteínas asociadas a patogénesis que no han sido determinadas en

esta bacteria. La construcción de un modelo de la red interacciones entre proteínas

asociadas a patogénesis de H. pylori revelará información detallada acerca de los procesos

celulares activados por este patógeno durante el proceso de infección. Entre las posibles

aplicaciones prácticas de este trabajo están la identificación de potenciales blancos para el

diseño racional de fármacos y vacunas, la ingeniería de procesos celulares y el desarrollo de

nuevas estrategias de tratamiento.

26

5. Objetivos

5.1. General

Identificar nuevas interacciones entre proteínas de participación conocida en patogénesis de

H. pylori.

5.2. Específicos

� Construir in silico una red de interacciones, a partir de proteínas que se conoce que

participan en la patogénesis de H. pylori.

� Identificar nuevas interacciones de proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori.

� Predecir nuevas proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori.

� Analizar el papel de las interacciones predichas en la patogénesis de H. pylori.

� Proponer una lista de proteínas candidato con probable asociación a patogénesis de

H. pylori.

6. Hipótesis

“El análisis de redes de interacción entre proteínas permite asignar funciones adicionales a

proteínas de función patogénica conocida y, predecir nuevas proteínas con probable

asociación a patogénesis de H. pylori”.

27

7. Metodología

7.1. Obtención de las proteínas con participación conocida en la patogénesis (proteínas

raíz)

De la base de datos MvirDB (http://mvirdb.llnl.gov/) se obtuvieron todas aquellas

proteínas con participación conocida en la patogénesis de H. pylori. Esta base de datos

contiene información sobre proteínas que funcionan como toxinas, factores de virulencia y

resistencia a los antibióticos (Zhou et al., 2006).

7.2. Construcción de la red de interacciones entre proteínas de H. pylori

Mediante el sistema de análisis STRING (von Mering et al., 2009) y a partir de las

proteínas raíz se obtuvo una red de interacciones. Los parámetros para la generación de la

red fueron: Active Prediction Methods (Neighborhood, Gene Fusion, Co-occurrence, Co-

expression, Text mining, Experiments y Databases); confidence score (0.7=high

confidence); network depth (1) y edge scaling factor (80%). Esta configuración implica la

obtención de una red de interacciones con un alto nivel de confiabilidad (Figura 4).

Figura 4: Construcción de la red de interacción a partir de las proteínas raíz obtenidas de la base de datos

MvirDB. Las proteínas raíz son introducidas en STRING, el cual construye la red a partir de las citadas

proteínas mediante la adición de sus compañeros de interacción directos.

28

7.3. Predicción de nuevas interacciones y proteínas involucradas en la patogénesis de

H. pylori.

Una vez obtenida la red de proteínas involucradas en la patogénesis, se obtuvo para

cada una de las proteínas el grado de unión a patogénesis (GUP). El GUP de una proteína

es igual al número de proteínas raíz con las cuales interacciona (Figura 5), excluyendo a la

misma proteína (Aragues et al., 2008).

Posteriormente, para evaluar el nivel de probabilidad estadístico del GUP como

indicador de asociación a patogénesis, se realizó el cálculo del valor predictivo positivo y la

sensibilidad a diferentes umbrales de GUP (GUP≥0, ≥1 y ≥5). El valor predictivo positivo

es igual al número verdaderos positivos entre los positivos. La sensibilidad es igual al

número de verdaderos positivos entre la suma de falsos negativos y verdaderos positivos.

En este contexto y dando un umbral de GUP= N, positivos serán proteínas con GUP ≥ N.

Verdaderos positivos serán proteínas que se conoce que están involucradas en la

patogénesis. Falsos negativos serán proteínas que se conoce que están involucradas en la

patogénesis cuyo valor de GUP es menor de N (Figura 5). El análisis estadístico fue

realizado mediante una tabla de contingencia 2X2 y prueba de X2.

Por último, utilizando el GUP de cada una de las proteínas se predijeron nuevas

proteínas involucradas en la patogénesis de H. pylori.

Figura 5: Cálculo del GUP de una proteína, del valor predictivo positivo y la sensibilidad a diferentes

umbrales de GUP. El GUP de una proteína es igual al número de proteínas raíz con las cuales interacciona,

excluyendo a la misma proteína. El cálculo del GUP involucra tres pasos: i) se crea una base de datos de

proteínas de conocida asociación a patogénesis (proteínas raíz); ii) se crea una red de interacción a partir de

29

las proteínas raíz; y iii) se calcula el GUP para cada una de las proteínas presentes en la red de interacciones.

En el ejemplo proporcionado, se observa que proteínas con un alto valor de GUP son más probables a estar

asociadas a patogénesis en comparación a aquellas con bajos valores de GUP.

7.4. Análisis del papel de las predicciones en la patogénesis

El análisis funcional de las predicciones se realizó mediante la búsqueda de

anotaciones en las bases de datos Uniprot (The UniProt Consortium, 2008), Pfam

(pfam.sanger.ac.uk) y con el sistema de minería de datos iHop (Hoffmann y Valencia,

2004).

En lo que respecta al análisis de propiedades funcionales a nivel de redes de

interacción, éste fue realizado mediante el software Cytoscape (Shannon et al., 2006) y sus

complementos MCODE (Bader y Hogue, 2006) y BINGO (Maere et al., 2005).

30

8. Resultados

El análisis de redes de interacción entre proteínas es una de las principales

aproximaciones en la caracterización funcional de las proteínas, ya que permite asignar

funciones a proteínas aún no descritas o nuevas funciones a proteínas conocidas. En el

presente trabajo, mediante el análisis de redes de interacción entre proteínas, se realizó la

predicción de nuevas interacciones entre proteínas involucradas en la patogénesis de H.

pylori. Este análisis se sostiene en la hipótesis de que dentro de una red de interacción,

aquellas proteínas que están involucradas en un mismo proceso biológico tienden a

presentar alta conectividad entre ellas. Por lo tanto, proteínas de H. pylori que

interaccionan, de manera frecuente, con aquellas de conocida participación en su

patogénesis son probablemente proteínas que también están involucradas en dicho proceso.

En contraste, con aquellas proteínas que presentan pocas o nulas interacciones con

proteínas de participación conocida involucradas en la patogénesis. El sistema de análisis

STRING 8.0 (Jensen et al., 2009) fue utilizado para construir una red de interacciones a

partir de proteínas de participación conocida en la patogénesis (denominadas proteínas

raíz). STRING ejecuta una serie de algoritmos de predicción basados en contexto genómico

y transfiere interacciones determinadas, a nivel experimental, de organismos modelo hacia

otras especies, mediante la ortología de las respectivas proteínas (interólogos). Los

resultados arrojados por STRING, además de contener interacciones directas, también

incluye interacciones funcionales (indirectas). Es decir, proteínas que comparten algún

sustrato, proteínas que se regulan entre sí a nivel transcripcional y proteínas que participan

en un complejo multi-proteico. Así, en el presente estudio STRING fue capaz de detectar

interacciones entre proteínas asociadas a patogénesis que previamente ya habían sido

descritas mediante experimentos bioquímicos en H. pylori y otras bacterias. Este es el caso

del complejo ureasa, del sistema de transporte ExbD-ExbB-TonB, del sistema de motilidad

y quimiotaxis, y del sistema de secreción tipo IV; todos ellos actúan como complejos multi-

proteicos. Estos ejemplos ilustran las capacidades analíticas del sistema de análisis antes

citado. STRING, en su versión número ocho, incluye información de 2.5 millones de

proteínas pertenecientes a 630 organismos (Jensen et al., 2009).

El conjunto de proteínas de participación conocida en la patogénesis de H. pylori

(proteínas raíz) fue obtenido de la base de datos MvirDB (http://mvirdb.llnl.gov/). Esta base

31

de datos incluye proteínas o genes asociados a toxinas y factores de virulencia. La

información de esta base de datos proviene de revisión de literatura y de información

contenida en otras bases de datos. La lista final del total de proteínas obtenidas de MvirDB

fue de 127 proteínas. Posteriormente, la lista de proteínas raíz fue introducida a STRING.

En 15 proteínas, STRING no encontró interacciones de alta confiabilidad, por lo tanto se

eliminaron. La red resultante cuenta con un total de 330 proteínas y 1,271 interacciones.

Para cada una de las proteínas que integraron la red, se realizó un análisis para determinar

la asociación entre su contexto funcional (GUP) y su conocida función en patogénesis. Este

tipo de análisis ha mostrado ser útil para determinar la asociación de proteínas o genes con

cáncer (Aragues et al., 2008). Los resultados mostraron que el GUP de las proteínas fue un

buen parámetro para predecir si una proteína está asociada a patogénesis de H. pylori. El

nivel de probabilidad estadístico del indicador fue evaluado mediante una prueba de X2

(Cuadro 1). Posteriormente, utilizando el GUP de cada una de las proteínas se predijeron

nuevas proteínas involucradas en la patogénesis de H. pylori con valor predictivo positivo y

sensibilidad por encima del 60%, con respecto al GUP (Cuadro 2). Con estos resultados la

red inicial fue filtrada y se obtuvo una red final de 712 interacciones entre 153 proteínas

involucradas en la patogénesis de H. pylori, de las cuales 50 corresponden a proteínas

candidato (Figura 6). Así, la red de interacciones obtenida está compuesta de proteínas de

participación conocida en la patogénesis de H. pylori y sus compañeros directos de

interacción.

Cuadro 1. Asociación entre el contexto funcional de proteínas (GUP) y su conocida función en patogénesisa.

Proteínas con GUP ≥ 0

Proteínas con

GUP ≥ 1

GUP ≥ 0 vs. GUP ≥ 1

Proteínas con

GUP ≥ 5

GUP ≥ 1 vs. GUP ≥ 5

Proteínas asociadas a patogénesis

127

101

76.04 > 3.84

X2 cal > X2tab (1 gl, 0.05)

54

70.44 > 3.84

X2 cal > X2tab (1 gl, 0.05)

aLa evaluación se realizó comparando proteínas con GUP ≥ 0, GUP ≥ 1 y GUP ≥ 5. El valor de probabilidad (p) de la prueba X2 indica diferencia estadística entre el conjunto de proteínas con GUP ≥0 y aquellas con GUP ≥ 1 y GUP ≥ 5.

32

Cuadro 2. Valores de GUP para cada una de la proteínas que integraron la red de interacción y su probable asociación en la patogénesis de H. pylori. Los valores predictivo positivo y sensibilidad se obtuvieron con relación al GUP.

GUP

No. de proteínas: total /(proteínas raíz)

Valor predictivo positivo (%)

Sensibilidad (%)

≥0 330 (127) 12 100 ≥1 317 (101) 32 80 ≥2 139 (79) 60 61 ≥3 91 (68) 75 53 ≥4 68 (58) 85 45 ≥5 60 (54) 90 42 ≥10 43 (41) 95 32

Mediante los complementos MCODE (Bader y Hogue, 2006) y BiNGO (Maere et

al., 2005), incorporados en el programa Cytoscape (Shannon et al., 2006) y el sistema de

minería de datos iHOP (http://www.ihop-net.org), se realizó el análisis de la red de

interacción entre proteínas para determinar la probable función de proteínas candidato

asociadas con patogénesis en H. pylori. El complemento MCODE permite detectar regiones

dentro de una red de interacción de proteínas muy conectadas ó agrupadas. En general,

estas regiones corresponden a complejos multi-proteicos o vías celulares asociadas con un

proceso biológico en particular (Figura 6). El análisis realizado con MCODE resultó en un

total de seis agrupamientos de proteínas; cada uno de los cuales está asociado con un

proceso de patogénesis en particular. Este resultado permitió ademas, corroborar la

hipótesis de que las proteínas asociadas con un proceso biológico en particular tienden a

presentar alta conectividad entre ellas. Además, los agrupamientos de proteínas fueron

analizados mediante el complemento BiNGO; el cual fue utilizado con el objetivo de

determinar términos y anotaciones de ontología génica (GO terms, por sus siglas en inglés).

Los términos de ontología génica (términos GO) representan un conjunto de vocabularios

controlados (ontologías) para describir un gen o atributos de un producto génico en

términos de su proceso biológico, de sus componentes celulares y su función molecular

(The Gene Ontology Consortium, 2000). Actualmente, para un gen o proteína la gran

mayoría de las bases de datos biológicas incluyen, en algún apartado, la anotación de sus

términos de ontología génica. Esto facilita la búsqueda de información funcional

33

estableciendo un tipo de anotación estándar para un producto génico presente en diferentes

bases de datos.

Figura 6: Red de interacción entre proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori. Cada nodo representa una proteína y cada enlace entre dos proteínas representa una interacción entre sí mismas. Las proteínas en color rojo corresponden a las proteínas raíz y las marcadas en verde, a las proteínas candidato. También se muestran los agrupamientos de proteínas producidos por MCODE; cada uno es marcado con un color que corresponde al tipo de proceso biológico asociado a patogénesis.

Como se observa en la Figura 6, los agrupamientos de proteínas obtenidos se

corresponden con procesos celulares especificos asociados a patogénesis de H. pylori. A

continuación se describen las interacciones de las proteínas candidato dentro de cada

agrupamiento.

34

8.1. Motilidad y quimiotaxis

El agrupamiento de proteínas asociado a motilidad y quimiotaxis está constituido

por 13 proteínas candidato de un total de 45 proteínas (Figura 7).

Figura 7: Agrupamiento de proteínas asociadas a la quimiotaxis y motilidad de H. pylori. Las

proteínas en color verde corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color rojo, a proteínas candidato. El análisis realizado con BINGO indica que el agrupamiento de proteínas, además

de estar enriquecido con términos GO para los procesos biológicos asociados con en el

ensamblaje del flagelo y quimiotaxis, también lo están aquellos asociados síntesis de

tiamina. La presencia de este último grupo de términos es inesperada ya que aparentemente

no existe alguna relación funcional entre la quimiotaxis, motilidad y síntesis de vitaminas

del complejo B. En el cuadro 3 se enlistan las 13 proteínas candidato correspondiente a este

agrupamiento de proteínas.

35

Cuadro 3. Lista de proteínas candidato asociadas a quimiotaxis y motilidad en H. pylori.

Gen/proteína

Descripción

Código de acceso en UniProt

Valor predictivo positivo (VPP)

cheA

Histidín quinasa

O25153

95%

ylxH

Proteína de unión al

ATP

O25678

95 %

dxs

Transferasa.

O25121

87 %

lepA

Proteína de unión al

GTP, factor de elongación.

O25122

75%

ileS

Isoleucina-tARN

sintetasa.

P56456

75%

murB

UDP-N-

acetilmuramato deshidrogenasa.

O25963

75%

thiF

Proteína para síntesis

de tiamina.

O25494

60%

HP0356

Proteína hipotética.

O25123

60%

HP0813

Proteína hipotética.

O25493

60%

HP0817

Proteína hipotética.

O25495

60%

HP0114

Proteína hipotética.

O24936

60%

HP1029

Proteína hipotética.

O25673

60%

HP0245

Proteína hipotética.

P64657

60%

En este agrupamiento de proteínas, al menos cuatro proteínas candidato comparten

patrones de interacción con proteínas involucradas en el ensamblaje del flagelo o

quimiotaxis. Por ejemplo, la proteína CheA, interacciona con las proteínas CheV, CheW,

CheY, MotA, MotB, FliM, FliG, FliA, FlhF, FlhA y FlhB. Este alto número de

36

interacciones de CheA se ve reflejado en un alto valor predictivo positivo (Cuadro 3). CheA

es una conocida proteína de los denominados sistemas de dos componentes. Estos sistemas

de proteínas están asociados con la transducción de señales en organismos procariotes y

cumplen funciones en el proceso de quimiotaxis. Así, las interacciones de CheA con CheV,

CheW y CheY, eran esperadas, ya que de las cuatro proteínas se conoce su papel en la

quimiotaxis. Además, algunas de sus interacciones ya han sido determinadas a nivel

experimental en otros procariotes (Figura 8). Sin embargo, las interacciones con las otras

proteínas raíz no eran esperadas, ya que la mayoría están asociadas con el proceso de

exportación de proteínas que conduce al ensamblaje del flagelo.

Figura 8: Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre las proteínas CheA y CheY

de E. coli. Código de acceso a la base de datos PDB: 1EAY. La proteína marcada con el color verde corresponde a CheY y la marcada en color naranja a la proteína CheA (McEvoy et al., 1998).

Las proteínas candidato YlxH, Dxs y ThiF pertenecen a un grupo de proteínas

asociadas con la síntesis de vitaminas del complejo B y las tres presentan interacciones con

algunas de las proteínas raíz citadas. En el caso de la proteína YlxH, ésta interacciona con

las mismas proteínas que CheA. A excepción de CheW, CheV y CheY, las cuales están

asociadas, de manera específica, con quimiotaxis. YlxH es una proteína de unión al ATP y

está asociada con síntesis de Vitamina B12. Existe escasa información acerca de la función

que desempeña esta proteína.

Las proteínas candidato Dxs y ThiF interaccionan con las proteínas raíz FliG, FliH y

FliF y MotA y MotB, respectivamente. El análisis de las anotaciones de Dxs y ThiF en

UniProt revela que son proteínas asociadas a la síntesis de vitaminas del complejo B. las

37

proteínas raíz con las cuales interaccionan Dxs y ThiF participan tanto en la exportación de

proteínas para el ensamblaje del flagelo como en la generación de un gradiente de protones

necesario para la rotación flagelar.

Las proteínas candidato IleS y MurB interaccionan con las proteínas raíz FliQ y

FliL. Las dos últimas proteínas raíz pertenecen a la región estructural del cuerpo basal del

flagelo. Las proteínas de esta región tienen función estructural y en la exportación de

proteínas para el ensamblaje del flagelo. IleS es una proteína que participa en la síntesis de

proteínas, evitando la agregación incorrecta de amino ácidos por el tARN. Por su parte,

MurB es una proteína que participa en síntesis de péptido glicano y está relacionado tanto

en la degradación como en la síntesis de la pared celular (Benson et al., 1996).

Las proteínas LepA y HP0356 interaccionan con FliF, FliG y FliH. Estas últimas

son proteínas de membrana que constituyen parte del sistema de rotación flagelar

participando en la exportación de proteínas para el correcto ensamblaje del flagelo. El

análisis de secuencia de HP0356 mostró que corresponde a una proteína hipotética de la

cual no se dispone de información. En el caso de LepA, no se conoce su función con

certeza en bacterias; el análisis de su secuencia revela la presencia de una familia de

dominios relacionados con la síntesis de proteínas y con la unión a los ribosomas,

dependiente de GTP (accesos de Pfam: PF00679, PF00009, PF03144 y PF06421). A nivel

genómico, LepA tiene una disposición estructural de vecindad con proteínas flagelares y

con la proteína candidato Dxs. Sin embargo, esta disposición estructural sólo se observó en

algunas especies del género Helicobacter, Bacillus, Geobacillus y Oceanobacillus. De tal

manera, que la citada organización a nivel genómico de LepA con proteínas flagelares

podría ser una característica única de pocos géneros bacterianos (Figura 9). Esto es

importante, considerando que aquellos genes que guardan una relación de vecindad en el

genoma, tienden a codificar proteínas que interaccionan o que están asociadas al mismo

proceso biológico (Dandekar et al., 1998).

38

Figura 9: Organización a nivel genómico de los genes fliF, fliG y fliH , respecto a los genes

candidato dxs y lepA. Imagen modificada del sistema de información para patógenos microbianos de EE. UU. (NMPDR, por sus siglas en inglés).

Las proteínas candidato HP0813 y HP0817 son proteínas hipotéticas que

interaccionan con las proteínas raíz MotA y MotB. Estas últimas proteínas están asociadas

con la membrana celular y participan en el proceso de flujo de protones que genera el

torque del flagelo. El análisis de secuencia de estas proteínas hipotéticas sólo reveló

información para la proteína HP0813, la cual presenta un dominio tipo beta-lactamasa

(accesso de PFAM número: PF00753), asociados a la resistencia a los antibióticos.

HP0114 corresponde a una proteína hipotética que interacciona con las proteínas

FlaB y SpsE. FlaB es el componente minoritario del filamento flagelar. Esta región se

encuentra conectada al gancho flagelar, constituido por las proteínas FlgK y FlgL y es la

que realiza el trabajo hidromecánico necesario para la propulsión. Por su parte, SpsE

pertenece a otro agrupamiento de proteínas asociadas con la síntesis de polisacáridos. De

esta manera HP0114 establece un vínculo entre dos agrupamientos de proteínas sin

aparente relación funcional.

De las proteínas hipotéticas HP1029 y HP0245 no se dispone de información. Por lo

tanto, la única probable asociación funcional con este agrupamiento estaría determinada por

sus patrones de interacción. HP1029 interacciona con FliM y FliY, proteínas que

constituyen el llamado “complejo switch” que es el regulador del rotor flagelar. HP0245

interacciona con las proteínas FlgK y FlgL. Ambas proteínas pertenecen a la región

estructural conocida como gancho del flagelo. Se requieren de nuevos estudios para

corroborar la asociación de estas proteínas hipotéticas.

A manera de resumen, en este agrupamiento algunas de las interacciones

encontradas no eran esperadas debido a su aparente carencia de significado biológico. Este

39

el caso de proteínas asociadas a síntesis de vitaminas del complejo B y aquellas

involucradas en el proceso de traducción durante la síntesis de proteínas. Mientras que otras

interacciones eran esperadas, como es el caso de proteínas asociadas específicamente con

quimiotaxis o en el caso de proteínas raíz que dadas sus características estructurales

necesitan estar ancladas a la pared celular.

8.2. Adaptación al medio ácido

El agrupamiento de proteínas asociado a adaptación al medio ácido está constituido

por 4 proteínas candidato de un total de 18 proteínas (Figura 10).

Figura 10: Agrupamiento de proteínas asociadas a la adaptación al medio ácido de H. pylori. Las proteínas marcadas en color rojo corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color verde, a proteínas candidato.

El análisis realizado con BINGO sugiere que este agrupamiento de proteínas está

enriquecido con términos GO para los procesos asociados a catálisis de la arginina y

metabolismo de la urea, síntesis de lipopolisacáridos asociados a la pared celular. Del

mismo modo que en el agrupamiento anterior, la presencia de éste último grupo de términos

GO es inesperada, ya que aparentemente no existe una asociación funcional entre el sistema

de adaptación al medio acido y componentes estructurales de la pared celular.

40

Cuadro 4. Lista de proteínas candidato asociadas a adaptación al medio ácido de H. pylori.

Gen/proteína

Descripción

Código de acceso en UniProt Valor predictivo positivo

(VPP)

nikR

Regulador transcripcional

dependiente de níquel.

O25896

87%

glmM

Fosfoglucosamina

mutasa.

P25177

60 %

csrA

Regulador del

almacenamiento de carbono.

O25983

60 %

smpB

Proteína de unión al

tmARN.

O25985

60%

La proteína NikR es un factor de transcripción dependiente de níquel (Figura 11).

NikR interacciona con NixA, UreA, ExbD1 y ExbB1. NixA es una proteína de membrana,

encargada de la importación del níquel al interior de la célula. UreA corresponde a una de

las subunidades de la enzima ureasa; responsable de la adaptación al medio ácido. Por su

parte, ExbD1 y ExbB1 son proteínas que forman un complejo con la proteína TonB. Este

complejo de proteínas se encarga, mediante un gradiente de protones, de la movilización de

complejos que contienen níquel (Schauer et al., 2008).

Figura 11: Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre la proteína NikR y el

ADN de E. coli. Código de acceso a la base de datos PDB: 2HZV. La proteína marcada con el color verde corresponde a NikR y la estructura marcada en color naranja al ADN.

41

Por su parte, la proteína GlmM interacciona con UreA y UreB, ambas forman la

estructura básica del complejo ureasa. GlmM es una enzima de la familia de las

fosfohexosas mutasas. Estas enzimas son importantes en la producción de intermediarios

durante la síntesis de péptido glicano de la pared celular (Jolly et al., 1999).

Las proteínas candidato CsrA y SmpB interaccionan con las proteínas del tipo

ExbB2 y ExbD2 que forman un complejo con TonB. La función de este complejo ya fue

citado anteriormente. CsrA pertenece a una familia de proteínas de unión al ARN que actúa

sobre la traducción de genes y/o sobre la estabilidad de los transcritos. El mecanismo

mediante el cual CsrA activa o suprime la expresión de determinados genes aún no se

conoce. SmpB es una proteína de unión al tmARN. El complejo SmpB-tmARN es

fundamental en un proceso conocido como trans-traducción, el cual es un mecanismo

utilizado por las bacterias para el aseguramiento de la calidad de la síntesis de proteínas

(Keiler et al., 1996; Dulebohn et al., 2007; Moore y Sauer, 2007; Keiler, 2008).

Por último, en este agrupamiento sobresalen interacciones que relacionan al

complejo ureasa con estructuras asociadas a la pared celular, y remarca el papel que podrían

desempeñar una serie de reguladores a nivel transcripcional y traduccional, alterando la

expresión de genes necesarios para la adaptación al medio ácido.

8.3. Metabolismo del nitrógeno

El agrupamiento de proteínas asociado a metabolismo del nitrógeno está constituido

por 7 proteínas candidato de un total de 9 proteínas (Figura 12).

Figura 12: Agrupamiento de proteínas asociadas a el metabolismo del nitrógeno de H. pylori. Las proteínas marcadas en color rojo corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color verde, a proteínas candidato.

El análisis con BINGO reveló términos de ontología génica asociados a la síntesis

de glutamina y la síntesis de compuestos nitrogenados. En el cuadro cinco se enlistan las

42

siete proteínas candidato para este agrupamiento de proteínas.

Cuadro 5. Lista de proteínas candidato asociadas al metabolismo del nitrógeno de H. pylori.

Gen/proteína

Descripción

Código de acceso en UniProt Valor predictivo positivo

(VPP)

speA

Arginina

descarbolixasa.

O25176

75 %

aspB

Aspartato amino

transferasa.

O25383

75%

murI

Glutamato racemasa.

P56068

60%

ggt

Gama glutamil tranpeptidasa.

O25743

60%

gltx1

Glutamil-tARN

sintetasa.

P96551

60%

gltx2

Glutamil

Glutaminil-tARN sintetasa.

O25360

60%

HP0056

Delta-1-pirrolina-

5-carboxilato deshidrogenasa.

O24897

60%

Las proteínas candidato en este agrupamiento interaccionan en su totalidad con

GlnA y GdhA, que corresponden a la glutamina sintetasa y glutamato deshidrogenasa.

GlnA y GdhA son clave en el metabolismo del nitrógeno. Además, la proteína candidato

SpeA interacciona con la proteína RocF, la cual corresponde al agrupamiento de adaptación

al medio ácido (Figuras 1, 4 y 6). Esta interacción tendría significado biológico ya que se

conoce que el metabolismo del nitrógeno está directamente relacionado con la adaptación al

medio ácido (Ver discusión). El análisis de las anotaciones disponibles en la base de datos

UniProt revela que las proteínas candidato Ggt, HP0056, AspB, MurI y SpeA están

asociadas con el metabolismo del glutamato, y GltX1 y GltX2 estan asociadas con la

adición del glutamato al tARN. El glutamato es amino ácido clave en el metabolismo del

nitrógeno de H. pylori.

En este agrupamiento, a diferencia de los anteriores, se observa una mayor

uniformidad funcional de las proteínas que lo constituyen. Sobresaliendo el papel que juega

43

el glutamato en el metabolismo del nitrógeno y su interconexión con la adaptación al medio

acido.

8.4. Sistema de secreción tipo IV

El agrupamiento de proteínas asociado al sistema de secreción tipo IV está

constituido por 8 proteínas candidato de un total de 42 proteínas (Figura 13).

Figura 13: Agrupamiento de proteínas asociadas al sistema de secreción tipo IV de H. pylori. Las proteínas marcadas en color verde corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color rojo, a proteínas candidato.

El análisis con BINGO identificó términos de ontología génica asociados con la

patogénesis, conjugación bacteriana y transporte de moléculas. En el cuadro 6 se enlistan

las 8 proteínas candidato para este agrupamiento de proteínas.

Cuadro 6. Lista de proteínas candidato asociadas al sistema de secreción tipo IV de H. pylori.

Gen/proteína

Descripción

Código de acceso en UniProt Valor predictivo positivo

(VPP)

trbI

Proteína del sistema de

secreción tipo IV, relacionada con VirB10.

O24883

92 %

hopQ

Proteína de membrana

externa.

O25791

87%

HP1342

Proteína de membrana

externa.

O34523

75%

HP0439

Proteína hipotética.

O25187

75%

44

HP0040

Proteína hipotética.

O24881

75%

HP0922

Proteína de membrana

externa.

O25579

60%

HP0120

Proteína hipotética.

O24939

60%

HP0066

Proteína hipotética.

O24906

60%

En primer lugar, las proteínas candidato HopQ y HP1342 corresponden a proteínas

de la membrana externa de H. pylori. Ambas proteínas interaccionan con las proteínas raíz

Cag3, CagS, VacA y CagA, las cuales están asociadas directamente a patogénesis. Por

ejemplo, se conoce que CagA y VacA son potentes cito-toxinas capaces de alterar la vías de

señalización de las células del hospedero (Censini et al., 1996; Akopyants et al., 1998;

Blomstergren et al., 2004).

Del mismo modo, las proteínas candidato HP0922, HP0066 y HP0120 presentan

patrones de interacción similares a HopQ y HP1342. HP0922, HP0066 y HP0120,

presentan interacciones con las proteínas de membrana externa BabA y Omp1, las cuales

son adhesinas conocidas en H. pylori. Además, HP0922, HP0120 y HP0066 interaccionan

por separado con CagA, Cag3 y VacA, respectivamente.

Por otro lado, existe un grupo de proteínas candidato que comparten algunos

patrones de interacción. Tal es el caso de las proteínas HP0040, HP0439 y TrbI. Las tres

proteínas interaccionan con HP0017 y HP0459. Además, TrbI interacciona con Cag5,

CagE, VirB11 y TraG. Estas últimas proteínas raíz, al igual que HP0017 y HP0459,

participan durante el ensamblaje del sistema de transferencia horizontal de genes. HP0040

y HP0439 son proteínas hipotéticas. El análisis de la secuencia de HP0439 revela la

presencia de dominios del tipo VirB8. Este tipo de dominios están presentes en proteínas

trans-membranales que constituyen componentes primarios del sistema de transporte de

ADN (Kumar y Das, 2001).

A manera de resumen, en la figura 7 se observa que este agrupamiento presenta tres

subgrupos. El subgrupo más denso e interconectado corresponde en su totalidad a proteínas

raíz que conforman la estructura básica del sistema de secreción tipo IV encargado de la

45

inyección de cito-toxinas. Otro subgrupo de proteínas que comparte patrones interacción

corresponde a adhesinas y cito-toxinas. El último subgrupo está constituido por proteínas

asociadas a transferencia horizontal de genes. Este agrupamiento de proteínas muestra una

organización estructurada, donde cada subgrupo corresponde a funciones particulares del

sistema de secreción tipo IV.

8.5. Proteínas de respuesta a estrés.

El agrupamiento de proteínas asociado a respuesta a estrés está constituido por 7

proteínas candidato de un total de 16 proteínas (Figura14).

Figura 14: Agrupamiento de proteínas asociadas a la respuesta a estrés de H. pylori. Las proteínas marcadas en verde corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color rojo, a proteínas candidato.

El análisis con BINGO sugiere que este agrupamiento de proteínas está enriquecido

con términos GO en procesos biológicos asociados a metabolismo de ácidos nucleicos,

síntesis de macromoléculas, metabolismo de especies reactivas de oxígeno, interconversión

entre nucleótidos y nucleósidos, así como al metabolismo de ribonucleótidos. En el cuadro

7 se enlistan las ocho proteínas candidato.

46

Cuadro 7. Lista de proteínas candidato asociadas a proteínas de respuesta a estrés de H. pylori.

Gen/proteína

Descripción Código de acceso en UniProt Valor predictivo positivo (VPP)

sodB

Superóxido dismutasa.

P43312

87 %

rpsB

Proteína ribosomal S2 (30S).

P56009

75%

groL

Chaperonina.

P42383

60%

ndk

Nucleósido difosfato

quinasa.

P56075

60%

ADNE

Subunidad alfa de la ADN polimerasa III.

P56157

60%

nrdA

Ribonucleotido difosfato

reductasa.

P55982

60%

uvrC

Endonucleasa.

P56428

60%

La proteína candidato SodB corresponde a la proteína superóxido dismutasa, de la

cual se conoce su función en los sistemas celulares de destoxificación. SodB interacciona

con las proteínas raíz SecA, TsaA, Pfr, IscS y Tpx. De igual forma, GroL y Ndk, que

corresponden a una chaperona molecular y una nucleósido quinasa, interaccionan con las

proteínas raíz TsaA y TrxA, respectivamente.

Las proteínas raíz TrxA y TrxB pertenecen a la familia de las tiorredoxinas. Las

proteínas candidato UvrC, NrdA y DnaE interaccionan con estas proteínas raíz.

Igualmente, DnaE interacciona con la proteína raíz LpxB. El análisis de la secuencia de

UvrC muestra la presencia de dominios asociados a la reparación del daño del ADN; NrdA

es una proteína que provee los precursores necesarios para la síntesis de ADN y DnaE

corresponde a la subunidad alfa de la ADN polimerasa III (Figura 15), la cual muestra

actividad exonucleasa de 3’a 5’; importante en la reparación del daño al ADN (Beard et al.,

2001).

47

Figura 15: Estructura cristalográfica donde se observa la interacción entre la subunidad alfa de la

ADN polimerasa con TrxA, durante el proceso de reparación del ADN del bacteriófago T7. Código de acceso a la base de datos PDB: 1SKR. La proteína marcada con el color verde corresponde a la ADN polimerasa y la estructura marcada en color naranja a la proteína TrxA.

La proteína candidato RpsB interacciona con las proteínas raíz SecA, FliR y FliA,

las cuales están asociadas a la exportación de proteínas flagelares. RpsB es una proteína

ribosomal encargada de la regulación de la traducción. Aunque sorprende la interacción de

RpsB con las proteínas raíz antes citadas, ya que parece carecer de significado biológico,

diversos estudios en otras bacterias demuestran que RpsB se produce bajo condiciones de

estrés (Jurgen et al., 2001).

Resumiendo, este agrupamiento presenta proteínas candidato con funciones

presuntivas en concordancia con las de las proteínas raíz de este agrupamiento. Entre las

que destacan aquellas asociadas con la reparación del daño al ADN, con la respuesta al

estrés oxidativo y síntesis de proteínas. Mecanismos clave para la sobrevivencia de este

patógeno en ambiente hostil, como lo es el epitelio gástrico.

48

8.6. Síntesis de lipopolisacáridos

El agrupamiento de proteínas asociado a lipopolisacáridos está constituido por 11

proteínas candidato de un total de 20 proteínas (Figura 16).

Figura 16: Agrupamiento de proteínas asociadas a síntesis de lipopolisacáridos de H. pylori. Las proteínas marcadas en color verde corresponden a proteínas raíz y las marcadas en color rojo, a proteínas candidato.

El análisis con BINGO sugiere que este agrupamiento de proteínas esta enriquecido

con términos GO para procesos biológicos asociados a síntesis de lípidos, metabolismo de

carbohidratos, polisacáridos y lipopolisacáridos. En el cuadro 8 se enlistan las nueve

proteínas candidato para este agrupamiento de proteínas.

Cuadro 8. Lista de proteínas candidato asociadas a síntesis de lipopolisacáridos de H. pylori.

Gen/proteína

Descripción

Código de acceso en UniProt Valor predictivo positivo

(VPP)

spsC

Transferasa.

O25130

92%

kdtA

Transferasa.

O25611

75 %

rfaD

Epimerasa.

O25530

75%

HP0102

Proteína hipotética.

O24928

75%

HP0277

Ferredoxina.

O25054

60%

hldE

Transferasa.

O25529

60%

algC

Pirofosforilasa.

O25865

60%

galU

Epimerasa.

O25363

60%

49

flaA1

Epimerasa.

O25511

60%

gmhA

Isomerasa.

O25528

60%

HP1570

Proteína hipotética.

O26090

60%

La proteína candidato SpsC interacciona con las proteínas raíz NeuA, RfbD,

HP0043, WbpB y NolK. Del mismo modo, la proteína candidato HP0102 interacciona con

RfbD, HP0043 y NolK. SpsC corresponde a una proteína con actividad amino transferasa y

HP0102 a una proteína hipotética. Todas las proteínas raíz que interaccionan con SpsC y

HP0102 están asociadas a la síntesis de polisacáridos; en particular con la síntesis de un

componente estructural del antígeno O, la cual es una molécula importante en la virulencia

bacteriana (Stroeher et al., 1995; Rashid et al., 2003).

Las proteínas candidato KdtA y HP0277 interaccionan con las proteínas raíz RfaC,

CoaD. Además, KdtA interacciona con la proteína raíz LpxB. KdtA es una enzima con

actividad transferasa. Las proteínas raíz con las cuales interacciona KdtA están relacionadas

con la síntesis de una estructura llamada núcleo de oligosacárido necesaria para el anclaje

de lipopolisacáridos a la membrana celular. HP0277 corresponde a una ferredoxina. Este

tipo de proteínas confieren resistencia al estrés oxidativo, mediante la reducción de

diferentes tipos de peróxidos a su correspondiente alcohol (Wood et al., 2003).

Por otro lado, un grupo de proteínas candidato comparte algunos patrones de

interacción. Este el caso de la proteínas candidato GmhA, HldE, RfaD, GalU y AlgC.

GmhA, HldE, RfaD interaccionan con las proteínas raíz RfbD y RfaC, las cuales están

relacionadas con el sistema de exportación del antígeno O. Además, RfaD y HldE

interaccionan con HP0043. GalU y AlgC también interaccionan con HP0043 y, además,

con GalE. GmhA, HldE y RfaD presentan funciones de isomerasa, transferasa y epimerasa,

respectivamente. Del mismo modo, GalU y AlgC presentan funciones de epimerasa y

pirofosforilasa.

Las proteínas candidato FlaA1 y HP1570 interaccionan con las proteínas raíz NeuA

y SpsE, las cuales están asociadas con la síntesis de lipopolisacáridos de superficie. FlaA1

corresponde una proteína con actividad epimerasa y HP1570 a una proteína hipotética.

Finalmente, este agrupamiento presenta un conjunto de proteínas que presentan

50

funciones relacionadas con la síntesis de polisacáridos, específicamente con la síntesis del

antígeno O y del núcleo de oligosacárido. Estas últimas son moléculas importantes en la

estructura y función de los lipopolisacáridos de superficie.

9. Discusión

Desde que Warren y Marshall (1983), asociaron por primera vez a H. pylori con la

aparición de ulceras gástricas, pasando por la era genómica y post-genómica; diversos

estudios han proporcionado información respecto a las proteínas y/o genes que son

esenciales durante el proceso de patogénesis de H. pylori. Sin embargo, las funciones

celulares que resultan de la interacción entre las proteínas requieren de ser investigadas

desde una perspectiva holística, es decir el estudio de la biología de sistemas (Aloy y

Russel, 2006; Aloy, 2007). Así, la construcción de redes de interacción entre proteínas es un

punto de partida en el entendimiento de los sistemas celulares. En el caso particular de H.

pylori, las redes de interacción entre proteínas se han investigado mediante métodos

experimentales. Este estudio ha permitido el análisis de aproximadamente el 50% del

proteoma de H. pylori (Rain et al., 2001). En el presente trabajo, se realizó un análisis, a

nivel de sistemas, de la red de interacción entre proteínas asociadas a patogénesis de H.

pylori. Para construir la red de interacción de proteínas se utilizó de una base de datos de

proteínas de función conocida asociada a patogénesis de H. pylori (proteínas raíz).

Inicialmente, a partir de las proteínas raíz se construyó una red de interacción entre

proteínas solamente tomando en cuenta las interacciones reportadas en el interactoma

determinado a nivel experimental por Rain, et al., (2001). El procedimiento anterior se

realizó con el objetivo de determinar la cobertura de la información a nivel experimental de

interacciones entre proteínas disponible para las proteínas raíz. Los resultados obtenidos de

este análisis revelaron una baja cobertura (50%) de interacciones; es decir, a nivel

experimental sólo se dispone de datos de interacciones entre proteínas para el 50% de las

proteínas raíz. En vista de lo anterior se procedió a realizar las predicciones para el restante

50% de proteínas raíz que carecen de datos de interacción a nivel experimental. Las

predicciones fueron realizadas con el programa PIANA, el cual implementa el método de

los interólogos (Aragues et al., 2006); sin embargo, nuevamente los resultados no fueron

satisfactorios; alcanzándose una cobertura del 56%. Esto aún sin descontar que se estima

51

que el 50% de las interacciones reportadas por el método de Y2H son falsos positivos y

negativos; esto es debido a la limitación propia de la metodología (von Mering et al.,

2003). En concordancia a lo reportado por Aragues et al., (2008) con esta baja cobertura no

fue posible aplicar el método de análisis del contexto funcional para cada una de las

proteína que integran una red de interacción (GUP).

Diversos estudios sobre métodos para la determinación de interacciones entre

proteínas a nivel experimental y computacional, sugieren que la mejor manera de

incrementar la cobertura y calidad de un estudio de interactómica es a través de la

combinación de diferentes métodos (Schwikowski et al., 2000; Edwards et al., 2002; von

Mering et al., 2002). Por lo tanto, esta situación remarcó la necesidad de incluir más

métodos de predicción para mejor la cobertura y de encontrar una forma de evaluar la

calidad de las interacciones. El sistema de análisis STRING cumplió con todos los

requerimientos antes citados (Jensen et al., 2009). STRING contiene interacciones entre

proteínas que han sido determinadas a nivel experimental por estudios a gran escala y de

baja escala (interacciones físicas directas). Ejemplos de los primeros, son los resultados

producidos por los ensayos de tipo Y2H y TAP-MS. Los segundos corresponden a los

experimentos clásicos de bioquímica y genómica, reportados de manera individual. Por otro

lado, STRING también predice interacciones indirectas; es decir, proteínas que comparten

vía metabólica o proceso celular específico, proteínas co-reguladas a nivel transcripcional y

proteínas que participan en un complejo multi-proteico. Tomando en cuenta toda esta

información, STRING realiza predicciones mediante el método de los “interólogos”.

Además, utiliza la información contenida en una gran cantidad de genomas secuenciados

completamente y realiza predicciones basadas en el contexto genómico. Los métodos

basados en el contexto genómico son idóneos cuando se requiere predecir interacciones

entre proteínas de organismos procariotes ya que se fundamentan en el orden y contenido

de los genes dentro de un genoma; ambas propiedades son una característica distintiva de

los genomas de estos organismos (Valencia y Pazos, 2002). Por ejemplo, los genes vecinos

en varios genomas (operones potenciales) tienden a codificar proteínas que interaccionan

entre sí. Finalmente, STRING es capaz de determinar con probabilidad estadística la

interacción entre las proteínas mediante la implementación de una función de puntaje. Con

la aplicación de los métodos y filtros citados se logró obtener una red de interacciones entre

52

proteínas con alta cobertura (88%) y confiabilidad de probabilidad estadística (puntaje de

STRING=0.7).

La red de interacción entre proteínas resultado del presente estudio cumple con las

siguientes funciones. Cerca del 40% del genoma de H. pylori aún no está anotado (Boneca

et al., 2003). Entre los principales objetivos de los proyecto sobre los interactomas es

predecir la función de proteínas hipotéticas y proteínas sin función asignada. La red de

interacción entre proteínas resultado del presente estudio cumple con este objetivo ya que

ofrece indicios de probables funciones de proteínas hipotéticas derivadas su interacción con

proteínas de función conocida asociada a patogénesis de H. pylori. Esto es, asociación de

función por “culpabilidad” (Figura 5). Este método fue inicialmente desarrollado para

predecir la posible asociación entre proteínas con cáncer (Aragues et al., 2008). Existen

otros métodos basados en la teoría de grafos que intentan asignar funciones o papeles

biológicos a las proteínas que integran una red de interacciones (Yook et al., 2004). Este

último tipo de métodos han permitido determinar que las redes biológicas adoptan una

organización deacuerdo a la ley de potencias, a este tipo de organización se le conoce como

“libre de escala” (Barabási y Oltvai, 2004). En una red “libre de escala”, existen nodos

(proteínas en este estudio) que concentran una gran cantidad interacciones y otros que

presentan pocas; es por ello que a los primeros se les conoce como “focos de la red”.

Generalmente, para poder caracterizar la organización de una red se realiza el

cálculo de una serie de parámetros, conocidos como parámetros de la topología de la red.

Entre los que destaca el conocido como “grado del nodo”, este parámetro hace referencia al

número total de conexiones que presenta un nodo dentro de una red de interacción, por lo

cual es muy útil para caracterizar a los focos de la red. Esto último es importante debido a

que el análisis del interactoma de S. cerevisiae ha demostrado que los focos de la red de

interacción corresponden a genes esenciales, y que su afectación puede resultar letal para el

organismo (Barabási y Oltvai, 2004). A pesar de la importancia del cálculo de los

parámetros topológicos de una red de interacción, en el presente trabajo éstos no fueron

calculados por las siguientes razones: Primero, uno de los algoritmos de predicción

utilizado por STRING se basa en el conocimiento previo. En este algoritmo, para cada

proteína introducida en STRING, realiza una búsqueda en la literatura, de manera que si

encuentra algún reporte donde se mencione la interacción con otra proteína, STRING la

53

toma como verdadera. Así tendríamos que en una red de interacción construida a base de

datos “curados”, como en el caso del algoritmo citado, se esperaría que aquellas proteínas

sobre las cuales la comunidad científica ha puesto mucho interés sean las que presenten un

mayor número de interacciones. Hoffmann y Valencia, (2003) reportan que en el

interactoma de S. cerevisiae no hay una correlación entre el “grado del nodo” y el numero

de citas en la literatura para 380 genes. De esta manera se justifica la omisión del cálculo de

parámetros topológicos de la red de interacción obtenida en el presente estudio, ya que de

haberlo hecho se podría llegar a conclusiones erróneas; por ejemplo, asignar erróneamente

a una proteína como esencial en la patogénesis de H. pylori solamente basados en su

número total de interacciones. Segundo, Aragues et al., (2008) demuestran

estadísticamente, que el “grado del nodo” no es un buen indicador para predecir la función

de una proteína y que el método basado en el análisis del contexto de una proteína dentro

de una red de interacción no es influenciado por el uso de datos “curados”. Todo este

conjunto de observaciones justifican el uso de la metodología empleada en éste estudio.

A continuación, para cada agrupamiento de proteínas se discuten los resultados

obtenidos en el presente trabajo.

54

9.1. Motilidad y quimiotaxis

Uno de los aspectos fundamentales de la infección de H. pylori es su capacidad de

moverse a través de la capa mucosa del lumen gástrico para así poder acceder a la

superficie del epitelio gástrico. El tránsito hacia el epitelio gástrico está dirigido por la

búsqueda de un nicho que le proporcione los nutrientes y condiciones necesarias para la

proliferación. Este movimiento dirigido requiere de la quimiotaxis y motilidad. Para ello un

conjunto de proteínas actúan de manera concertada ensamblando estructuras o participando

en cascadas de señalización. Este es el caso de la proteína candidato CheA; de la cual es

conocido su papel en los sistemas de transducción de señales en bacterias. Específicamente,

CheA interactúa con CheW y CheV, se auto-fosforila y transfiere su grupo fosfato a CheY.

Esto se traduce en una señal para los motores flagelares, modificando la dirección

rotacional del flagelo. Sin embargo, en el presente estudio se determinó que CheA

interacciona con un grupo de proteínas asociadas a la exportación de proteínas flagelares

para el ensamblaje del flagelo. Estas nuevas interacciones de CheA no han sido estudiadas

previamente, por lo cual podrían indicar una nueva función para esta proteína. Existen en la

literatura científica, dos artículos que soportan algunas de las nuevas interacciones descritas

para CheA. Por ejemplo, en un estudio de proteómica diferencial en C. jenuni sugiere que

CheA, FlhA y FliA (estas dos últimas son proteínas flagelares) son indispensables durante

proceso de formación de biopelículas (Kalmokoff et al., 2006). Un hallazgo similar fue

descrito en Aeromonas spp (Kirov et al., 2004). Ambos trabajos reportan el papel de estas

proteínas durante las primeras etapas de la formación de biopelículas. El aumento de la

expresión de estas proteínas podría relacionarse con la necesidad de exportación de otras

proteínas flagelares necesarias para el ensamblaje del flagelo, con la formación de una

matriz tridimensional que facilitaría el contacto célula-célula o como un componente de

matriz extracelular. Esto es fundamental dada la evidencia de que H. pylori es capaz de

formar biopelículas en la mucosa gástrica del hospedero (Carron et al., 2006; Cellini et al.,

2008). De esta manera, se sugiere una probable función reguladora de CheA en la

exportación de proteínas flagelares durante las primeras etapas de la formación de las

biopelículas en H. pylori.

Por otro lado, en este agrupamiento se encontró que las proteínas candidato YlxH,

ThiF y Dxs, presentan dominios asociados con la síntesis de vitaminas del complejo B. La

55

proteína YlxH presenta interacciones con algunas de la proteínas con las que interacciona

CheA, con excepción de CheW y CheV. Aunque existe poca información de la proteína

YlxH, el análisis de su secuencia con el programa BLASTp resultó con una similitud del

63% (valor E de 3 x 10-63) y un mismo contenido de dominios funcionales con la proteína

FlhG de C. jejuni, de acuerdo al acceso en la base de datos PFAM: PF01656. FlhG

pertenece a una familia de reguladores esenciales para la síntesis proteínas asociadas al

ensamblaje del flagelo. Por ejemplo, existe evidencia de que el homólogo de FlhG (FleN)

en P. aeruginosa regula a nivel transcripcional el número de flagelos (Dasgupta et al., 2000

y 2003). Esto sugiere que YlxH podría ser un homólogo de FlhG, con función similar en H.

pylori. Las proteínas candidato Dxs y ThiF interaccionan con proteínas relacionadas con la

exportación de proteínas flagelares y con proteínas generadoras del torque flagelar.

Posiblemente estas proteínas candidato proporcionen moléculas o intermediarios que sean

útiles en la producción de co-factores en la síntesis de proteínas flagelares. Así, estos

patrones de interacción sugieren un vínculo entre proteínas relacionadas con la síntesis de

vitaminas del complejo B, la quimiotaxis y la exportación de proteínas para el ensamblaje

del flagelo.

Otro hallazgo importante en este agrupamiento de proteínas fue la presencia de

proteínas candidato asociadas con el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Este

fue el caso de las proteínas IleS y LepA. Por ejemplo, en E. coli, LepA se ha asociado a la

síntesis de proteínas de membrana; específicamente, con la fidelidad del proceso de

traducción (Qin et al., 2006; Youngman y Green, 2007). Así mismo, su homólogo en S.

cerevisiae, ha mostrado que es capaz de unirse, de manera GTP dependiente, a los

ribosomas mitocondriales y funcionar como un factor asegurador de la fidelidad de la

síntesis de proteínas mitocondriales, principalmente de aquellas asociadas con la formación

de complejos de la cadena transportadora de electrones (Bauerschmitt, et al., 2008). Esta

última observación es fundamental considerando que uno de los primeros eventos del

ensamblaje del flagelo involucra la inserción de FliF y proteínas relacionadas en la

membrana plasmática para constituir la base del motor flagelar. Posteriormente, FliG, que

corresponde a la principal proteína del rotor, se ensambla sobre la base constituida por FliF

y el proceso prosigue hasta que el ensamblaje del motor se completa. Una vez que se han

constituido las estructuras básicas del flagelo (sistema motor y de exportación), se inicia el

56

proceso de exportación de proteínas para ir ensamblando las estructuras distales del flagelo.

El paso inicial en la exportación de proteínas flagelares consiste en la formación de un

macrocomplejo de proteínas que involucra a las proteínas FliH y FliI. El macrocomplejo,

posteriormente se acopla a las compuertas del sistema de exportación localizado en la base

del flagelo y facilita la entrada de las proteínas para ser exportadas. Diversos estudios

reportan que, en ausencia de FliH, no es posible el acoplamiento a las compuertas del

sistema de exportación; así FliH es esencial en el proceso. Así mismo, mutantes de fliG y

fliF en H. pylori son incapaces de realizar la exportación necesaria para el correcto

ensamble del flagelo (Allan et al., 2000). Estos mecanismos de revisión a nivel traducción

serían fundamentales como un paso previo a la exportación de proteínas que ensamblarían

al flagelo. Este conjunto de evidencias sugiere que IleS y LepA podrían estar asociadas en

la regulación y aseguramiento de la fidelidad de la síntesis de las proteínas FliQ y FliL,

FliF, FliG y FliH, respectivamente; las cuales son clave en las etapas iníciales del proceso,

de ensamblaje y funcionamiento del flagelo.

La proteína candidato MurB interacciona con proteínas asociadas al cuerpo basal

del flagelo. Esta estructura anatómica es la encargada de anclar el flagelo a las envolturas

celulares, da soporte al sistema de exportación de proteínas y al rotor flagelar. MurB es una

proteína que participa en síntesis de péptidoglicanos y está relacionada tanto en la

degradación como en la síntesis de la pared celular. Esto es fundamental considerando que

las proteínas que pertenecen al cuerpo basal del flagelo deben estar ancladas a nivel de la

capa de péptidoglicano. Por lo tanto, dadas las características funcionales de MurB se

sugiere que está asociada con la inserción y anclaje de las proteínas del cuerpo basal del

flagelo.

Para la proteína candidato HP0813 se determinó la presencia un dominio con

actividad beta-lactamasa. La base de datos 3DID, reporta que en varias estructuras

cristalográficas este tipo de dominios, además de participar en la resistencia a los

antibióticos, interacciona con dominios de proteínas relacionadas con el transporte

electrónico a través de la membrana celular y con el reconocimiento de proteínas de la

membrana celular. Acceso a la anotaciones de estos dominios en la base de datos PFAM:

PF00258 y PF01473, respectivamente. Este conjunto de evidencias sugiere que HP0813

podría contribuir, junto con MotA y MotB, en la generación de torque necesario para la

57

rotación flagelar.

La proteína candidato HP0114 parece interaccionar con proteínas del gancho

flagelar y con una proteína asociada a la síntesis de polisacáridos. Estas interacciones que

presenta HP0114 podrían actuar como un vínculo entre proteínas relacionadas con la

síntesis de polisacáridos y proteínas del filamento flagelar. Esto es fundamental

considerando que tanto el ensamblaje del flagelo, como la fuerza rotacional de

desplazamiento implican que las proteínas de dichas estructuras estén glicosiladas para

funcionar de manera óptima. Por ejemplo existe evidencia experimental donde mutantes de

C. jenuni carentes de los genes asociados a glicosilación de las flagelinas presentan

fenotipos no motiles (Guerry et al., 2006; McNally et al., 2006).

Por último, dada la importancia que juega el flagelo en el proceso de colonización y

persistencia de la infección por H. pylori, este agrupamiento de proteínas sugiere una

interconexión entre los sistemas de quimiotaxis, exportación y motilidad. De tal manera

que H. pylori asegura un proceso de síntesis de proteínas fidedigno, principalmente de las

que son indispensables en las primeras etapas del ensamblaje del flagelo.

9.2. Adaptación al medio ácido

La adaptación al medio ácido es la capacidad de H. pylori de mantener el pH peri-

plasmático cercano a la neutralidad; permitiendo que en el citoplasma se mantengan valores

de pH fisiológicos. Varios genes asociados a la adaptación del medio ácido son requeridos

por H. pylori para colonizar modelos animales. Principalmente, genes asociados con la

síntesis de ureasa (Weeks et al., 2000; Mollenhauer-Rektorschek et al., 2002; Marcus et al.,

2005).

Entre los resultados obtenidos para este agrupamiento de proteínas, destaca la

proteína candidato NikR, la cual interacciona con proteínas asociadas con la enzima ureasa

y con el metabolismo del níquel. Es conocido que NikR es un regulador transcripcional

asociado con la homeostasia del níquel. El níquel juega un papel importante en la

colonización y persistencia de H. pylori. De manera específica, el níquel funciona como co-

factor de la enzima ureasa. La enzima se encarga, en gran parte, de la adaptación al medio

ácido. Sin embargo, aunque este metal es esencial para la sobrevivencia de H. pylori, a gran

concentración puede resultar tóxico para la bacteria. Por lo tanto, es necesario un control de

58

su importación. Diversos estudios sugieren que a alta concentración de níquel, NikR es

capaz de unirse a la región promotora de nixA, ureA y del operón exbB-exbD-tonB. Esto

produce dos fenómenos: en primer lugar, se suprime la producción de nixA y de exbB-

exbD-tonB y, simultáneamente, la importación de níquel y se activa la transcripción de ureA

para la utilización de este metal (Abraham et al., 2006; Dosanjh et al., 2007; Zambelli et

al., 2008). Mientras este trabajo estuvo en progreso, un estudio indica que, además de la

función homeostática del níquel, la actividad de NikR está directamente ligada a cambios

en el pH (Li y Zamble, 2009). Así, la inclusión de NikR en este agrupamiento de proteínas

se soporta de manera experimental constituyendo una prueba ciega para dichas

predicciones. La conclusión de las observaciones sugiere que NikR es un regulador

transcripcional con función preponderante en la adaptación al medio ácido y

consecuentemente en patogénesis de H. pylori.

Igualmente, la proteína candidato GlmM interacciona con las subunidades

estructurales del complejo ureasa (UreA-UreB). Aparentemente esta interacción entre

GlmM y UreA-UreB carece de significado biológico, ya que GlmM corresponde a una

enzima asociada a la síntesis de péptido glicano de la pared celular. Además, estudios

realizados en E. coli y S. gordonii sugieren que GlmM participa en el ciclo celular

bacteriano y en la formación de biopelículas (Shimazu et al., 2008). Esta asociación

funcional de GlmM es también soportada por los resultados de este trabajo, ya que GlmM

interacciona con FtsH, una proteína asociada con el citoesqueleto y ciclo celular bacteriano

(resultados no mostrados). Recientemente, se ha reportado a nivel experimental el

interactoma del complejo ureasa en H. pylori. Una de las conclusiones de este trabajo fue

que existe una relación entre el complejo ureasa con proteínas del citoesqueleto y del ciclo

celular bacteriano (Stingl et al., 2008). Estos hallazgos sugieren que tal vínculo esta dado

por la necesidad de crear un compartimento celular que contenga una fracción del complejo

ureasa, facilitando sus actividades en respuesta al pH ácido. A la luz de las observaciones,

se sugiere que GlmM, en conjunto con proteínas que conforman el citoesqueleto

bacteriano, contribuye a la generación un compartimento capaz de contener al complejo

ureasa, facilitando la entrega de sustratos al mismo.

Nuevamente, se presentan proteínas candidato asociadas con el proceso de

traducción en la síntesis de proteínas. Este es el caso de CsrA y SmpB, las cuales

59

interaccionan con proteínas raíz asociadas con el transporte de moléculas a través de la

membrana celular. Por ejemplo, en C. jejuni se demostró que CsrA es esencial para la

sobrevivencia bajo estrés, para la formación de biopelículas y para la invasión de células

del hospedero (Fields y Thompson, 2008). Esta evidencia soporta el papel de CsrA en este

agrupamiento de proteínas, considerando que el medio ambiente ácido por si mismo genera

condiciones de estrés. Adicionalmente, estudios en E. coli, Y. pseudotuberculosis y S.

entérica, demuestran que CsrA actúa como un regulador de genes asociados con virulencia

(Cerca y Jefferson, 2008; Heroven et al., 2008; Kerrinnes et al., 2008).

Por su parte, la proteína candidato SmpB participa en el proceso conocido como

trans-traducción. En bacterias este proceso ha sido estudiado a detalle con el fin de entender

los mecanismos de control de calidad del flujo de la información genética (Keiler et al.,

1996; Dulebohn et al., 2007; Moore y Sauer, 2007; Keiler, 2008). La trans-traducción es un

mecanismo utilizado para rescatar ribosomas secuestrados por mARNs carentes de señales

de terminación apropiadas, por tanto, incapaces de reanudar el proceso de traducción. En

consecuencia, la trans-traducción disminuye el número de cadenas defectuosas de mARN y

además, es utilizada para adicionar a proteínas incompletas, amino ácidos que funcionan

como etiquetas, útiles para la degradación de estas proteínas defectuosas. A pesar de que

este mecanismo ha sido estudiado a detalle, se desconocen muchos aspectos relacionados

con su papel biológico específico. Estudios en cepas de E. coli, Salmonella o Synechocystis

con defectos en la trans-traducción, resultaron ser hipersensibles al efecto de los

antibióticos (Vioque y de la Cruz, 2003; Luidalepp et al., 2005). Deficiencias en la trans-

traducción afecta la habilidad de S. typhimurium de colonizar ratones y de sobrevivir dentro

de los macrófagos (Baumler et al., 1994). Una cepa de Y. pseudotuberculosis con defectos

en la trans-traducción, resultó ser no virulenta en un modelo de infección murino (Okan et

al., 2006).

Del mismo modo que para NikR, durante el desarrollo de este trabajo se publicó un

estudio donde se demuestra que la proteína candidato SmpB es esencial para H. pylori.

Entre los principales resultados de este trabajo se destaca que las afectaciones al gen smpB

producen una disminución de la división celular y que smpB aumenta su expresión en

condiciones de pH bajo, similares a las encontradas a nivel gástrico. Al igual que en NikR,

esta evidencia soporta la validez de la metodología empleada en el presente trabajo.

60

Csra y SmpB, interaccionan con el sistema de transporte constituido por las

proteínas ExbB2, ExbD2 y TonB, su función ya fue citada. Existe evidencia que demuestra

que la estabilidad de TonB es dependiente de la presencia de proteínas del tipo ExbB y

ExbD. Por ejemplo, en E. coli, cuando estas dos últimas proteínas están ausentes, la vida

media de TonB disminuye como producto de su degradación (Lucchetti-Miganeh, et al.,

2008). Esta observación sugiere que CsrA y SmpB, bajos condiciones de pH acidas,

regulan la producción de las proteínas del tipo ExbB y ExbD y, por lo tanto, del transporte

de sustratos por TonB.

En resumen, este agrupamiento de proteínas se evidencia su función en las distintas

redes de regulación, en la modulación de cambios conductuales a nivel celular y en la

expresión de factores de virulencia necesarios para la persistencia y colonización de H.

pylori en su hospedero.

9.3. Metabolismo del nitrógeno

El proceso de asimilación de nitrógeno es esencial para la síntesis de biomoléculas,

tales como amino ácidos, purinas, pirimidinas y amino glucósidos. Las bacterias obtienen el

nitrógeno principalmente de moléculas inorgánicas donde el amoniaco es el compuesto

requerido para el anabolismo del nitrógeno. GlnA y GdhA son las enzimas que participan

en tal proceso. Específicamente, catalizan la condensación del glutamato y amoniaco para

producir glutamina (Eisenberg et al., 1987). Existe evidencia que sugiere que mutaciones

del gen glnA son letales para H. pylori (Garner et al., 1998). En B. subtilis mutaciones de

gltX también resultaron letales para la bacteria (Gagnon et al., 1994). Además, existen

estudios que asocian a GlnA con virulencia de varios patógenos de humanos. Este es caso

de M. tuberculosis, donde GlnA ha mostrado ser esencial para sobrevivencia dentro de los

macrófagos (Tullius et al., 2003) y de S. pneumoniae, que tiene función durante el proceso

de adherencia e invasión (Kloosterman et al., 2006).

Al igual que las proteínas raíz GlnA y GdhA, se sugiere que las proteínas candidato

de este agrupamiento están involucradas con el metabolismo del glutamato. Por ejemplo,

Ggt cataliza la ruptura del glutatión liberando el grupo glutamil que será utilizado por GlnA

y/o GdhA en la síntesis de glutamato. HP0056 oxida a la prolina para producir directamente

glutamato y AspB cataliza la conversión de aspartato a glutamato. MurI está asociada con

61

la síntesis de intermediarios de la pared celular a partir del glutamato. GltX1 y GltX2,

ambas corresponden a glutamil-tARN sintetasas y están asociadas con la síntesis de

proteínas.

Dado que el amoniaco es la principal fuente inorgánica para la obtención de

nitrógeno, existe un vínculo entre el agrupamiento de proteínas asociado a adaptación al

medio ácido y con el agrupamiento de proteínas asociado con el metabolismo del

nitrógeno. Como ya se mencionó, el complejo ureasa degrada la urea para producir dióxido

de carbono y amoniaco. Una parte del amoniaco realiza función de tampón mientras que el

restante es convertido a amonio para ser utilizado en el metabolismo del nitrógeno.

Además, existe otra fuente de amoniaco para la hidrólisis de urea. Esta vía alterna está

asociada con la degradación del amino ácido arginina. Las enzimas responsables de tal

proceso son la arginasa (RocF) y la arginina descarboxilasa (SpeA). Esta última es una de

las proteínas candidato de este agrupamiento de proteínas. Del mismo modo para el

complejo ureasa, la acción de RocF está asociada con la adaptación de H. pylori al medio

ácido, mientras que, SpeA se le ha asociado con el equilibrio del pH intracelular. Las

figuras 6 y 7 resumen el vínculo entre los agrupamientos de proteínas citados y las

proteínas RocF y SpeA. Estas últimas, tienen como función la regulación del pH y

suplementan parte del amoniaco necesario para el óptimo funcionamiento de este

agrupamiento de proteínas.

Por último, este agrupamiento de proteínas da evidencia de la interrelación entre

diferentes sistemas metabólicos, así como también de redundancia biológica que produce

vías alternas para mantener los niveles celulares de glutamato y, por tanto, de la

homeostasia celular que contribuye a la patogénesis de H. pylori.

9.4. Sistema de secreción tipo IV

Muchas cepas de H. pylori contienen la isla de patogenecidad Cag (Cag-PAI, por

sus siglas en inglés), cuyos genes codifican para la mayoría de los componentes del sistema

de secreción tipo IV (Odenbreit, 2005). La presencia de tal isla ha sido asociada con la

virulencia de las cepas de H. pylori (Cover y Blaser, 1999).

En este agrupamiento se identificaron proteínas candidato que interaccionan con

proteínas de función conocida como adhesinas. Este es el caso de las proteínas candidato

62

HopQ, HP1342, HP0922, HP0066 y HP0120. El análisis de las anotaciones disponibles en

la base datos UniProt para estas proteínas candidato sugiere que su localización sub-celular

está asociada con la membrana externa de H. pylori. De manera particular, el análisis de la

secuencia de HP0922 revela la presencia de un grupo de dominios relacionado con la

familia de cito-toxinas de la familia VacA, acceso en PFAM: PF03797, PF02691 y

PF03077. El mismo análisis para la secuencia de HP0066 demuestra la presencia de

dominios de la familia FtsK/SpoIIIE. En E.coli y B. subtilis, las proteínas que contienen

estos dominios participan en la regulación de su ciclo celular y en la transferencia de ADN

inter-cromosómico (Begg et al., 1995; Wu y Errington, 1994). La proteína HP0120

corresponde a una proteína hipotética de la cual sólo se dispone información acerca de su

patrón de interacción, por lo tanto, se requiere de mayores estudios de función para sostener

la predicción.

Las proteínas raíz que interaccionan con las proteínas candidato citadas participan

en tres procesos de la patogénesis de H. pylori. Las proteínas raíz Cag3 y CagS están

asociadas con en el sistema de secreción tipo IV (T4SS), el cual es clave en la secreción e

inyección de cito-toxinas. BabA y Omp1 son proteínas de la membrana externa que

funcionan como adhesinas contribuyendo con el proceso de fijación al epitelio gástrico del

hospedero y VacA es una potente cito-toxina. En el caso de las proteínas raíz CagA y VacA

(cito-toxinas), ambas se introducen en las células del epitelio gástrico. La introducción de

estas cito-toxinas produce cambios en las células gástricas, desde producción de una

respuesta inflamatoria, mediada por la liberación de citoquinas, hasta inducción de

apoptosis celular (Censini et al., 1996; Akopyants et al., 1998; Blomstergren et al., 2004).

Así mismo, se ha documentado que aquellos pacientes que portan cepas de H. pylori con

algunas de las cito-tóxinas y adhesinas citadas anteriormente presentan daño gástrico

severo y son un factor de riesgo para desarrollo de cáncer y ulcera gástrica (Warburton et

al., 1998; Umit et al., 2009).

Estas observaciones sugieren una probable función de HP0922 como cito-toxina,

HP0066 en la transferencia horizontal de genes y de HopQ, HP1342 y HP0120 como

adhesinas. Así mismo, es importante considerar que las proteínas de la membrana externa

son, por lo general, inmunogénicas y, por lo tanto, son un blanco en el desarrollo de

vacunas y de métodos específicos de diagnóstico.

63

Las proteínas candidato HP0040, HP0439 y TrbI comparten algunos patrones de

interacción con proteínas raíz asociadas a la transferencia horizontal de genes. HP0040 y

HP0439 corresponden a proteínas hipotéticas que presentan dominios del tipo VirB9 y

VirB8, respectivamente; ambos tipos de dominio están asociados a estructuras que

participan en la conjugación bacteriana. Por ejemplo, se ha documentado que en A.

tumefaciens, las proteínas que presentan dominios del tipo VirB8 interaccionan con

componentes estructurales del sistema conjugación bacteriana, como son VirB9 y VirB10

(Kumar y Das, 2001). En el caso de TrbI, su homólogo en A. tumefaciens, aunque no es

esencial, incrementa, de manera significativa, la eficiencia del proceso de conjugación

bacteriana (Alt-Morbe et al., 1996). Por lo tanto, se sugiere una función similar de TrbI con

la de su homólogo en A. tumefaciens.

A manera de resumen, considerando la localización sub-celular y el análisis de la

función de las proteínas raíz con las interaccionan las proteínas candidato, se sugiere que

estas últimas podrían estar asociadas al proceso de conjugación bacteriana, de adhesión y

del proceso de inyección de cito-toxinas que alteran la homeostasis de las células del

epitelio gástrico. Además, de acuerdo a la actividad cito-toxica de algunas de estas

proteínas candidato, su presencia en determinadas cepas podría estar asociada a la

intensidad del daño que producen en el epitelio gástrico del hospedero, siendo un factor de

riesgo para desarrollo del cáncer gástrico.

9.5. Proteínas de respuesta a estrés

El estrés oxidativo es un problema experimentado por cualquier ser vivo. La

reducción parcial del oxígeno molecular por la auto-oxidación de flavoproteínas genera una

mezcla de radicales superóxido y de peróxido de hidrógeno (Imlay, 2003). Estos

compuestos son la principal fuente para la producción de especies reactivas de oxígeno, las

cuales son capaces de alterar la función de las proteínas y la estructura del ADN (Imlay y

Linn, 1988; Imlay, 2003). H. pylori es una bacteria microaerofílica vulnerable a los efectos

tóxicos del superóxido, por tanto, debe de contar con mecanismos de destoxificación

eficaces que le permitan colonizar un medio ambiente con condiciones de estrés, tal como

el epitelio gástrico.

64

Entre los resultados obtenidos para este agrupamiento destaca la presencia de las

proteínas candidato SodB, GroL y Ndk. La mayoría de las proteínas raíz con las cuales

interaccionan estas proteínas candidato, a excepción de SecA, presentan actividad

antioxidante. SecA corresponde a una proteína asociada a translocación de macromoléculas

a través de la membrana celular. Así, la interacción entre SodB y SecA es fundamental

considerando que ya se ha demostrado que SodB es secretada por H. pylori. Aunque su

función en la fracción extracelular no está bien documentado, se sugiere que ésta participa

en el proceso de patogénesis (Backert et al., 2005). Por ejemplo, en M. tuberculosis existe

evidencia de que SodB se secreta y es capaz de inhibir la muerte celular programada en las

células infectadas del hospedero (Edwards et al., 2001; Hinchey et al., 2007). Por su parte,

en E. coli y C. jejuni, los homólogos de GroL y Ndk han sido asociadas a proteínas de

repuesta a estrés. En particular, GroL previene alteraciones del plegamiento de las proteínas

y Ndk repara el ADN (Goswami et al., 2006; Klancnik et al., 2006). Además, se ha

demostrado, mediante estudios de proteómica diferencial, que GroL está sobre-producida

en H. pylori cuando infecta las células del epitelio gástrico (Backert et al., 2005). Una

posible explicación a este comportamiento de GroL podría estar relacionado con las etapas

iníciales de la infección. Cuando H. pylori infecta el epitelio gástrico se desencadena una

respuesta inflamatoria de tipo inmunológico. Durante este proceso, puede liberarse al

medio, una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (Bagchi et al., 1996; Nardone et

al., 2004). Por lo tanto, H. pylori debe ser capaz de adaptarse a tales condiciones de estrés.

En estudios proteómicos previos se ha documentado que GroL se secreta por H. pylori y su

presencia en la fracción extracelular se ha asociado con la producción de interleucina 8 (Lin

et al., 2005). Esta citoquina, además de coadyuvar con el funcionamiento del sistema

inmune, se caracteriza por producir inflamación de los tejidos. Esto es fundamental

considerando que uno de los procesos en el establecimiento y persistencia de H. pylori

sobre el epitelio gástrico es la inducción de una respuesta inflamatoria crónica. Así, GroL

sería una proteína fundamental para la persistencia de la infección por H pylori.

Las proteínas candidato UvrC, NrdA y ADNE interaccionan con las proteínas raíz

TrxA y TrxB; las cuales están asociadas a mantener el equilibrio oxido-reducción de la

célula. Existe evidencia que demuestra que la actividad catalítica de NrdA se facilita por la

acción reductora de TrxA y TrxB (Gallardo-Madueño et al., 1998). Por su parte, LpxB es

65

capaz de generar enlaces glucosídicos. Tomando en conjunto las observaciones anteriores,

es posible visualizar una maquinaria completa capaz de producir componentes asociados a

síntesis de ADN; sugiriendo que UvrC, NrdA y DnaE conforman un grupo de proteínas

encargadas de la reparación del daño del ADN.

Por otra parte resalta la presencia de una proteína candidato asociada a regulación

de la traducción. Este es el caso de la proteína RpsB que interacciona con proteínas

asociadas al sistema de exportación de proteínas relacionadas con el ensamblaje del flagelo.

Por ejemplo, en un análisis proteómico de B. subtilis, se ha observado que junto con otras

proteínas de estrés, la presencia de RpsB está aumentada (Jürgen et al., 2001). Del mismo

modo, en Listeria monocytogenes y Bifidobacterium longum, se ha documentado que RpsB

está aumentada bajo condiciones de estrés por alta concentración de NaCl y bilis (Duché et

al., 2002; Sánchez et al., 2005). Esta última observación permite explicar la interacción de

RpsB con las proteínas flagelares FliA y FliR. Durante su tránsito por el tracto

gastrointestinal H. pylori debe tolerar y resistir condiciones de estrés causado por la bilis.

La presencia de bilis es una condición desfavorable para la motilidad de H. pylori. En

consecuencia, el sistema flagelar debería de funcionar aún en respuesta al estrés causado

por la bilis. Posiblemente, RpsB facilita, bajo estas condiciones de estrés, la síntesis de las

proteínas que son importantes para el ensamblaje de las estructuras básicas del flagelo. Por

otra parte, aunque la interacción de RpsB con SecA (esta última proteína ya fue citada),

pareciera carecer de relación funcional, en un estudio proteómico de las proteínas

secretadas por H. pylori, se documentó una gran cantidad de proteínas ribosomales sin

función conocida pero esto sugiere probable función en patogénesis (Backert et al., 2005).

Por lo cual, SecA podría facilitar la exportación RpsB al medio extracelular. Estas

observaciones sugieren que RpsB podría regular bajo condiciones de estrés la síntesis de

proteínas que son útiles para el ensamblaje de estructuras celulares.

Este agrupamiento demuestra que es un grupo de proteínas cuya función permite a

H. pylori sobrevivir bajo una variedad de condiciones de estrés. Es por esto que H. pylori es

hábil para sobrevivir bajo condiciones adversas y persistir en la mucosa gástrica. Por lo

tanto, es interesante conocer cómo funcionan los mecanismos de respuesta a estrés de H.

pylori, lo cual es clave en el entendimiento del mecanismo de persistencia y patogénesis de

dicho patógeno.

66

9.6. Síntesis de lipopolisacáridos

La presencia de lipopolisacárido (LPS) es una de las principales características

distintivas de las bacterias Gram (-) y la serología de estas moléculas ha sido un

procedimiento de rutina para la diferenciación dentro de una especie bacteriana. El LPS es

una molécula abundante en superficie celular y funciona como barrera de protección contra

agentes externos. Una molécula de LPS está constituida por tres elementos básicos: el

lípido A el cual esta embebido en la cara externa, de la membrana externa de la bacteria; el

núcleo de oligosacárido, que funciona como una región de enlace entre las dos caras de la

membrana externa y finalmente el antígeno O que es un determinante serotipo-específico,

presente como una unidad polimérica extendiéndose lejos de la superficie celular. Todas las

proteínas raíz y candidato de este agrupamiento presentan funciones relacionadas con la

síntesis de los componentes básicos del LPS, antes citados.

Por ejemplo, en V. cholera, RfbA, RfbD y RfbE, son proteínas homólogas en H.

pylori de HP0043, RfbD y de la proteína candidato SpsC, respectivamente. RfbA, RfbD y

RfbE participan en la síntesis de perosamina, un componente básico del lipopolisacárido

que constituye al antígeno O y en la síntesis de la matriz de lipopolisacárido que produce

una colonia de bacterias con morfología rugosa específica (Stroeher et al., 1995; Rashid et

al., 2003). La proteína raíz NolK también está asociada con la síntesis del antígeno O en E.

coli (Wang et al., 2006). Mientras que en el complejo Mycobacterium avium se ha

documentado que las proteínas homólogos de RfbD y de la proteína candidato HP0102

están involucrados en la síntesis de lipopolisacáridos de superficie (Miyamoto et al., 2007).

Para el caso de la interacción entre WbpB y la proteína candidato SpsC, existe

evidencia de que en P. aeruginosa y B. pertussis, sus proteínas homólogos, participan en la

síntesis de un raro trisacárido que se incorpora al antígeno O, confiriéndole a estos

patógenos resistencia a la acción lítica del complemento y, por consecuencia, facilita el

proceso de colonización del hospedero (Harvill et al., 2000; Westman et al., 2008).

Las proteínas candidato KdtA y HP0277 comparten patrones de interacción; ambas

interaccionan con las proteínas raíz RfaC y CoaD. Ademas, Kdta interacciona con la

proteínas raíz LpxB. La interacción de KdtA con las proteínas raíz antes citadas, podría

soportarse considerando que en E. coli, K. pneumoniae y S. enterica se ha demostrado que

KdtA, RfaC y CoaD, en conjunto, participan en la síntesis de un oligosacárido que forma

67

parte del núcleo del lipopolisacárido, estructura asociada al anclaje del lipopolisacárido con

la membrana celular (Heinrichs et al., 1998; Izquierdo et al., 2002). LpxB corresponde a

una enzima asociada a síntesis del lípido A. La interacción entre KdtA y LpxB es clave

considerando que el núcleo de oligosacárido, ya citado, está unido al lípido A que permite

el anclaje de la molécula de lipopolisacárido a la membrana celular (Whitfield et al., 1997).

Por su parte, la proteína candidato HP0277 corresponde a una ferredoxina; este tipo de

proteínas están asociadas con la respuesta al estrés oxidativo. La interacción de HP0277

con las proteínas raíz antes citadas podría explicarse, considerando que diversos estudios

sugieren que bajo estrés oxidativo, los diferentes constituyentes estructurales lipídicos

pueden tener serias alteraciones comprometiendo la integridad de la célula bacteria. Este

puede ser caso de los fosfolípidos de la membrana celular que pueden ser oxidados por

radicales libres, llevando a una desestabilización de la bicapa lipídica y, por consiguiente,

de una disfunción de la membrana celular (Hazell y Graham, 1990; Khulusi et al., 1995;

Sun et al., 2003). Considerando lo anterior, podría proponerse que HP0277 contribuye para

evitar la degradación de los diferentes productos lipídicos sintetizados por RfaC y CoaD,

manteniendo así la integridad celular.

Otras proteínas candidato que podrían desempeñar una función similar a la

propuesta para KdtA son GmhA, HldE, RfaD, GalU y AlgC. La evidencia que podría

sostener la predicción de las interacciones para las proteínas candidato antes mencionadas

parte de estudios que demuestran que en E. coli, N. meningitidis y S. typhimurium, las

proteínas homólogos de GmhA, HldE, RfaD, HP0043 y RfaC están asociadas a la síntesis

del núcleo del lipopolisacárido (Sirisena et al., 1992; Shih et al., 2001; Kneidinger et al.,

2002). Del mismo modo, en A. ferrooxidans se ha asociado a los homólogos de GalU y

GalE con la producción de exolipolisacáridado involucrado en la formación de biopelículas

(Barreto et al., 2005). Por su parte, AlgC está implicada en la síntesis del núcleo del

lipopolisacárido en P. aeruginosa (Kooistra et al., 2003).

Las proteínas candidato FlaA1 y HP1570 interaccionan con las proteínas raíz NeuA

y SpsC. Se ha documentado en C. jejuni que PseF y PseC, proteínas homólogas en H.

pylori de NeuA y SpsC, respectivamente, participan en la glicosilación de las flagelinas del

filamento flagelar y que las mutantes carentes de los genes asociados a glicosilación de las

flagelinas presentan fenotipos no motiles (Guerry et al., 2006; McNally et al., 2006).

68

Estudios realizados en A. hydrophila y C. jejuni sugieren que las proteínas homólogos de

FlaA1, NeuA y SpsE participan activamente en la glicosilación de proteínas flagelares

(Guerry et al., 2006; Canals et al., 2007). En C. jejuni, se ha observado que tal glicosilación

está asociada a un fenómeno llamado auto-aglutinación a su vez asociado a la formación de

biopelículas en las células del epitelio intestinal (Guerry, 2007). Así mismo, en C. jejuni se

ha demostrado, a nivel experimental, que existe una interacción física entre las proteínas

ortólogos de HP1570 y NeuA (Parrish et al., 2007). Por tanto, se sugiere que las proteínas

candidato FlaA1 y HP1570 podrían estar asociadas a glicosilación de proteínas flagelares.

Por último, este agrupamiento de proteínas remarca la importancia de las proteínas

involucradas en síntesis del antígeno O y de los lipopolisacáridos de superficie en H. pylori

cuya función está asociada a una respuesta inflamatoria del epitelio gástrico y con la

evasión del sistema inmune. Además, se estable un vínculo entre este agrupamiento de

proteínas y el que corresponde al ensamblaje del flagelo mediante glicosilación de las

flagelinas, proteínas clave para la actividad hidrodinámica del flagelo.

9.7. Interconexión entre agrupamientos de proteínas

La red de interacción entre proteínas del presente estudio, demuestra varios

agrupamientos entre proteínas, cada uno representando un sistema asociado a proceso

especifico durante el proceso de patogénesis de H. pylori. No obstante esta especificidad, la

interconexión entre dichos agrupamientos no ha sido estudiada. En este estudio se

demuestra la interconexión entre el sistema que conforman las proteínas flagelares y el

sistema de síntesis de polisacáridos (Figura 6). Esta relación está dada por la modificación

postraduccional de las flagelinas (glicosilación) lo que les permite ensamblar

metaestructuras (ver discusión para este agrupamiento). Del mismo modo, se determinó una

interconexión entre el sistema de adaptación al medio ácido y el metabolismo del nitrógeno

(Figura 6). Estos dos sistemas forman un bucle que se auto-regula. Por ejemplo, la urea es

producto final del metabolismo de la arginina y otros amino ácidos. Posteriormente, la urea

puede ser desdoblada por la enzima ureasa produciendo CO2 y amoniaco para funcionar

como tampón. Ambos sistemas están asociados a la liberación y asimilación del amoniaco,

por lo tanto contribuyen a la manutención del balance del nitrógeno en H. pylori. Estas

interconexiones de los sistemas dan evidencia de la redundancia inherente a los sistemas

69

biológicos permitiendo vías o caminos alternos para un mismo proceso biológico;

manteniendo la homeostasia celular.

9.8. Limitaciones del estudio

La red de interacción de proteínas del presente estudio tiene limitaciones. Se

combinaron datos de interacción entre proteínas a nivel experimental y predicciones a nivel

computacional. Esta combinación de métodos proporciona una mayor cobertura pero

también se deben considerar sus posibles fallas. Por ejemplo, en el caso de los ensayos de

doble híbrido en levadura no son 100% verificables, ya que un alto número de interacciones

putativas no pueden ser confirmadas por otros métodos (falsos positivos). Además, se ha

observado que interacciones entre proteínas confirmadas por varios métodos difícilmente

podrían ocurrir en la naturaleza puesto que las proteínas que participan en dicha interacción

están confinadas a espacios u organelos celulares diferentes. Este último tipo de

interacciones se denominan falsos positivos biológicos (Cusick et al., 2005). Por otro lado,

los falsos negativos pueden presentarse por varias causas, entre las que destaca la alteración

del plegamiento de la proteína producto de la fusión y por diferentes mecanismos de

modificación postraduccional en la levadura, etc.

La purificación por afinidad en tándem es otro método utilizado para caracterizar

interactomas. Sin embargo, al igual que el sistema de doble híbrido en levaduras las

limitaciones son una pobre cobertura del proteoma del organismo en estudio (Cusick et al.,

2005). Por ejemplo, los interactomas caracterizados de S. cerevisiae (Uetz et al., 2000; Ito

et al., 2001), C. elegans (Li et al., 2004) y H. pylori (Rain et al., 2001) presentan una

cobertura del proteoma de cerca del 15%, 5% y 47%, respectivamente. Esto sin considerar

los probables falsos positivos y negativos. Por tal motivo, para varios organismos modelo

se han caracterizado varios mapas de interacción entre proteínas para validar tales

interacciones.

Por su parte, los métodos in silico también tienen limitaciones ya que la gran

mayoría de los aquí utilizados se basan en la identificación de señales evolutivas. Sin

embargo podrían existir proteínas que carecen, o que no se pueden detectar dichas señales.

Así mismo, la mayoría de los métodos computacionales, basados en el contexto genómico,

no distinguen entre una interacción física o funcional. Otra limitación es que el alto nivel de

70

confiabilidad aplicado durante el filtrado de las interacciones entre proteínas, obtenidas por

STRING, es muy astringente. Esto es, STRING considera que una interacción entre

proteínas es confiable si existen varias fuentes de información o métodos que la soporten.

Por lo cual, las interacciones de proteínas verdaderas poco documentadas o soportadas por

varios métodos (experimental o computacional) son ignoradas. Por lo tanto, la red de

interacción entre proteínas aquí propuesta muy probablemente no representa el total de las

proteínas asociadas a patogénesis de H. pylori. En consecuencia, las predicciones deben de

ser validadas a nivel experimental.

71

10. Conclusiones

En el presente trabajo se construyó una red de interacción entre proteínas a partir de

una base de datos de proteínas con función conocida asociada a patogénesis de H. pylori.

Esto permitió, identificar y priorizar un conjunto de nuevas interacciones y proteínas

asociadas a patogénesis de H. pylori.

El análisis a nivel de sistemas resultó en nuevas funciones para algunas proteínas ya

caracterizadas. Este es el caso de CheA, NikR y SodB. CheA está asociada a exportación de

proteínas flagelares para el ensamblaje del flagelo y participa durante las primeras etapas

del desarrollo de las biopelículas. NikR es una proteína reguladora maestra de un conjunto

de genes clave asociadas a adaptación al medio acido. SodB, además de presentar actividad

antioxidante, se secreta para inhibir la muerte celular programada de las células del

hospedero.

El análisis de la red de interacción entre proteínas del presente predecir nuevas

proteínas con probable asociación a patogénesis y nuevas hipótesis susceptibles de ser

validadas a nivel experimental. Entre las nuevas proteínas se identificó a un grupo de

proteínas candidato asociadas a regulación del proceso de traducción en la síntesis de

proteínas. Estas proteínas están presentes en todos los agrupamientos de proteínas, con la

excepción del sistema de proteínas de secreción tipo IV y el de la síntesis de

lipopolisacáridos. Estas proteínas aparecen justo en aquellos agrupamientos de proteínas

que son esenciales en las primeras etapas de la infección, sugiriendo que son necesarias

para un control de calidad de la síntesis de proteínas durante el proceso de patogénesis de

H. pylori.

Por último, el análisis de la red de interacción entre proteínas da evidencia de las

estrategias evolutivas del patógeno para desarrollo y persistencia del proceso infeccioso.

Así mismo, demuestra que varios de los procesos biológicos asociados a patogénesis de H.

pylori no son independientes. Por el contrario, están interconectados generando un sistema

redundante capaz de modificarse para responder a diferentes estímulos del medio ambiente.

72

11. Recomendaciones

Una vez concluido el presente estudio, se considera interesante investigar sobre

otros aspectos relacionados con las interacciones entre proteínas de H. pylori y, por lo tanto,

se recomienda:

• Extender los análisis expuestos en esta tesis al estudio de otros procesos biológicos

de H. pylori.

• Mejorar el método de predicción basado en el contexto funcional mediante la

inclusión de otros tipos de información experimental, por ejemplo información

estructural de regiones interfaciales derivadas de complejos proteicos depositados

en la base de datos PDB.

• Evaluar si existen diferencias a nivel de interacción entre proteínas de las seis cepas

de H. pylori de las que se dispone su genoma completo.

• Finalmente, seleccionar algunas de las proteínas candidato propuestas y realizar su

validación experimental.

73

12. Referencias

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102

13. Glosario

Ácido desoxirribonucleico (ADN): molécula que almacena la información genética.

Amino ácido: unidad monomérica fundamental de las proteínas.

Ácido ribonucleico (ARN): molécula que transmite información genética. Además cumple

con funciones estructurales y de acoplamiento en la maquinaria de traducción de la

informacion.

ARN mensajero: molécula de ARN, copia de un gene, que lleva la información desde el

genoma hasta donde se realiza la traducción.

Bioinformática: disciplina científica emergente que utiliza tecnología de la información

para organizar, analizar y distribuir información biológica con la finalidad de responder

preguntas complejas en biología.

Conformación: arreglo espacial que adopta una molécula, en virtud de los diferentes

ángulos de rotación que pueden adquirir sus enlaces químicos.

Dominio de una proteína: se refiere a una unidad estructural independiente de otras

cadenas en la misma proteína, generalmente es el responsable de las características

funcionales, evolutivas y de plegamiento de las proteinas.

Enzima: proteína con actividad catalítica, es decir; que acelera una reacción química

específica sin destruirse en el proceso. Las moléculas blanco de una enzima se denominan

sustratos.

Eucarionte: organismo con núcleo organizado y cromosomas. Forma parte de un gran

grupo que difiere de los procariontes (las bacterias y organismos similares) que carecen de

núcleo. Existen diferencias fundamentales entre la organización genética de uno y otro

103

grupo.

Genoma: término que denota a todo el material genético de un organismo vivo. En un ser

humano, por ejemplo, se refiere a todas las secuencias de todos los cromosomas de una

célula.

In vitro : se refiere a condiciones experimentales en las que no existen células u organismos

vivos. Condiciones dadas en portaobjetos microscópicos, tubos de ensayo, etcétera

In vivo : se refiere a condiciones experimentales que incorporan células u organismos vivos.

In silico: se referiere a experimentos hechos con el uso de computadoras, por ejemplo

simulaciones o predicciones.

Interactoma: se refiere al conjunto total de interacciones entre las proteínas dentro de un

organismo.

Molécula: conjunto de átomos unidos unos con otros por enlaces fuertes. Es la expresión

mínima de un compuesto o sustancia química. Trabajar con estas entidades primordiales

justifica el uso del término “molecular” para denominar diversas áreas de la investigación

en biología. (Entidad química constituida por la unión de varios átomos. Es la expresión

mínima de un concepto químico. Una macromolécula puede estar constituida.por miles o

hasta millones de átomos, típicamente enlazados en largas cadenas.)

Mutagénesis: proceso por el cual se inducen cambios en el material genético de un

organismo. El proceso puede ser espontáneo o inducido.

Nucleótido: unidad fundamental de los ácidos nucleicos. Constituida por una base

nitrogenada, un azúcar y un fosfato.

Organelo: estructura intracelular especializada en una función determinada, como el

104

núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, los ribosomas, etcétera.

Proteína: polímero constituido por una hebra o cadena lineal de unidades llamadas

aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de una proteína determina su estructura y su

función. Las proteínas son los productos primarios codificados por los genes, encargadas de

organizar la actividad bioquímica celular.

Proteoma: el término describe el conjunto total de proteínas expresadas por un genoma

completo, incluyendo las modificadas después de la traducción.

Replicación: proceso por el cual las moléculas de ADN se duplican, generando dos copias

iguales a partir de una sola. El proceso requiere la separación de las dos hebras de la

molécula original.

Ribosoma: organelo encargado de manufacturar proteínas, de acuerdo con las instrucciones

del ADN (presentes en el ARN mensajero). Es un agregado de proteínas y ARN, llamado

ribosomal.

Sintenia: es la localización conservada de genes en posiciones equivalentes en especies

relacionadas.

Sitio activo: zona de una enzima con la que se asocia el sustrato y donde se induce su

transformación química para dar un producto. Los sitios activos frecuentemente son

hendiduras en la superficie de las enzimas.

Sustrato: sustancia o molécula con la que interacciona una enzima, transformándose en

productos.

Traducción: proceso por medio del cual se lee la secuencia de codones del ARN y se

elabora una cadena de proteína, con la secuencia correspondiente, de acuerdo con el código

genético.

105

Transcripción: proceso por el que un gene se expresa, mediante la síntesis de un ARN que

contiene la misma secuencia del gene.

Transcriptoma: el término se refiere al estudio de los perfiles de expressión de todos los

genes presentes en el genoma. Los estudios de expresión sugieren pistas sobre la función de

los genes. Aunque son muchos los métodos para estudiar el transcriptoma el más utilizado

es el microarray de ADN, que permite el análisis simultáneo de la expresión de miles de

genes.

Transducción de señal: frase que se aplica al proceso por el cual una señal molecular (por

ejemplo, la presencia de una hormona en el medio extracelular) es convertida en una

respuesta (por ejemplo, generación de un compuesto en el medio intracelular). Esta

respuesta puede ser después amplificada o atenuada y, a su vez, dar origen a otro evento de

transducción de señal.

Transformación: procedimiento que permite introducir, directamente a células vivas,

moléculas de ADN. Existen varios procedimientos que pueden lograr este objetivo:

tratamiento con calcio, descarga eléctrica, pistolas génicas, etcétera.

106

14. Apéndice

Lista de las 127 proteínas raíz obtenida de la base de datos MvirDB.

Número

Nombre común

Número de acceso en UniProt

1 HP0037 O24878 2 HP0043 O24884 3 rfbD O24885 4 nolK O24886 5 ureH Q09067 6 ureG Q09066 7 ureF Q09065 8 ureE Q09064 9 ureI Q09068 10 ureB P69996 11 ureA P14916 12 flaB Q07911 13 bcp P55979 14 rfaJ O24967 15 hcpD O24968 16 fliR O24978 17 spsE O24980 18 nifU O25009 19 hcpE O25021 20 dps P43313 21 flgI O25028 22 rfaC O25056 23 amiE O25067 24 HP0017 O24862 25 HP0317 O25086 26 flgH O25092 27 neuA O25093 28 fliF O25118 29 fliG O25119 30 fliH O25120 31 galE O25127 32 gdhA P55990 33 tpx O25151 34 cheW O25152

107

35 HP0019 O24864 36 HP0616 O25337 37 HP0393 O25154 38 nifS O25161 39 HP0441 O25189 40 HP0459 O25206 41 glnA P94845 42 cag1 O25257 43 cag5 O25260 44 virB11 Q7BK04 45 cag-Z O25261 46 cag8 O25263 47 cagT P97245 48 cagS P97227 49 cag16 O25270 50 cag17 O25271 51 cag20 O25274 52 cag22 O25276 53 cagE Q48252 54 cagA P55980 55 fliN O25306 56 flaA P0A0S1 57 pfr P52093 58 wbpB O25390 59 HP0686 O25395 60 feoB O25396 61 fliD P96786 62 fliS O25448 63 flhB P56416 64 secA O25475 65 hpaA P55969 66 HP0807 O25487 67 motA P65410 68 motB P56427 69 trxA P66928 70 trxB P56431 71 lpxB O25537 72 flgE P50610 73 HP0876 O25543 74 vacA P55981 75 flgD O25565 76 fur O25671 77 fliY O25674

108

78 fliM O25675 79 flhF O25679 80 flhA O06758 81 cheY P71403 82 nixA Q48262 83 tly O25718 84 flgK O25744 85 gluP O25788 86 amiF O25836 87 exbB O25897 88 exbD O25898 89 tonB O25899 90 rocF O25949 91 HP1400 O25950 92 fliQ P0A0S3 93 fliI O07025 94 trbB O25965 95 exbB2 O25986 96 exbD2 P64101 97 coaD O26010 98 fliE P67708 99 flgC O26080 100 ceuE O26082 101 tsaA P21762 102 iscS O25008 103 cag7 O25262 104 omp13 O25355 105 alpA O25570 106 HP0913 O25571 107 cag10 O25265 108 cag11 O25266 109 cag14 O25268 110 cag18 O25272 111 cag21 O25275 112 cag24 O25277 113 cag3 O25258 114 cag4 O25259 115 cag9 O25264 116 cagC O25278 117 cagI O25273 118 cagP O25269 119 babA O25840 120 fliP O25394

109

121 fliA O25676 122 flaG O25094 123 flgG O26104 124 omp1 Q1CVE6 125 HP0651 O25366 126 HP0725 O25218 127 traG O25652