Instructivo para detección de alérgenos

ALERT® Peanut Allergen

ESPECIFICACIONES DE PRODUCTOControl previsto: 5 ppm de cacahuateTiempo aproximado de la prueba: 30 minutosPruebas por kit: 20

ALERT® para el cacahuate, está destinado para el análisis cualitativo de residuos de proteína de cacahuate en los productos alimenticios, en las superficies ambientales y enjuagues de limpieza.

OBJETIVOConocer la presencia de residuos de alérgenos en los enjuagues de limpieza en las superficies ambientales, así como en el producto terminado.

PRINCIPIO DE LA PRUEBAALERT® para alérgenos de cacahuate, es un ensayo inmunoenzimático (S-ELISA) de captura. La prueba es un ensayo Elisa de sándwich la proteína de cacahuate es extraída de una muestra de campo utilizando una solución salina bufferada (PBS) mediante agitación constante en un baño de agua caliente seguida por centrifugación o filtración. La proteína extraída es transferida a unos pozos recubiertos con anticuerpos de captura, donde la proteína se une a los anticuerpos durante la incubación. Cualquier proteína que no se unió se elimina con un lavado y se agrega un segundo anticuerpo (detector), que está ligado a una enzima. El anticuerpo detector se une a la proteína que se ligo previamente. Después de un segundo lavado, se agrega el substrato. El color se desarrolla como resultado de la presencia del anticuerpo del anticuerpo detector ligado. Se agrega una solución inhibitoria (STOP) y el color resultante en la solución es observado. Un color azul indica muestras fuertemente positiva. Un color rojo indica cacahuate escaso o ausente.

DEFINICIONES

ALÉRGENOS: Son proteínas del alimento que pueden crear una respuesta inmune en individuos susceptibles. Si se ingieren pueden causar severas alergias, vomito, diarrea, dificultad para respirar, inflamación de la boca y la lengua y descenso rápido de la presión sanguínea.

ANTICUERPOS: Es una proteína producida por el sistema inmunitario del cuerpo cuando detecta sustancias dañinas, llamadas antígenos.

ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO: Es un  inmuno-ensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo

ENZIMA: proteína que cataliza las reacciones bioquímicas del metabolismo. Las enzimas actúan sobre las moléculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares.

POZO: Recipientes pequeños de plástico con antígenos pre-contenidos. SOLUCIÓN BUFFER: Soluciones que ante la adición de un ácido o base

son capaces de reaccionar oponiendo la parte de componente básica o ácida para mantener fijo el pH. 

SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN: Solución empleada para separar un producto orgánico de una mezcla de reacción o para aislarlo de sus fuentes naturales.

SUSTRATO: Molécula sobre la que actúa una enzima.

MATERIALES

Micropozos Recubiertos

Con Anticuerpos

Gotero Etiqueta Amarillo Control

Cacahuate (5 Ppm)

Gotero Etiqueta Azul Conjugado De Anticuerpos

(Con Etiqueta De Enzima)

Gotero Etiqueta Verde

Sustrato K-Blue®

Gotero Etiqueta

Roja Solución

Inhibitoria (Red Stop)

Goteros Vacíos No

Etiquetados Para Muestra

Con Punta

Bolsas De Disolvente De Extracción De

Polvo Seco (Pbs De 10

Mm) (1 Bolsa- 1 Litro

Solución Extracción)

Frasco De Concentrado De Solución

Buffer (tamponado)

De Lavado (Pbs-Tween

De 10 Mm) (1 Fraso- 1 Litro

Solución Buffer De Lavado)

Muestra De 50 G De Aditivo

De Extracción

Cuchara Plástica De Medición

Juego de Extracción de Alérgenos (producto Neogen ALERT) Licuadora de alta velocidad con un vaso de 250 mL o recipientes

desechables de 250 mL. Báscula con capacidad de pesar + 0.1 g Baño maría agitado. (60° C + 1°) Termómetro. Papel filtro Whatman # . Dos frascos de 1 L para preparar soluciones de lavado y de extracción. Toallas de papel absorbente. Marcador a prueba de agua. Botella de lavado. Agua destilada o desionizada. Temporizador.

Probeta graduada de 150 mL.

PRECAUCIONES

1. Las muestras previstas para probar contenido de cacahuate, se deberán de extraer por separado de las muestras para probar alérgenos de otros alimentos. Los aditivos de extracción para cada tipo de prueba, están diseñados específicamente para el alérgeno del alimento objetivo.

2. Los componentes del kit ALERT® para alérgenos de cacahuate, como son controles y reactivos de extracción, pueden contener uno o más de los siguientes materiales potencialmente alérgicos: leche, proteína de huevo, proteína de cacahuate o proteína de soya. Si es alérgico a cualquiera de estos compuestos, tenga precaución al utilizar éste producto.

3. Refrigere el kit entre 2-8 °C cuando no esté en uso. No congele el kit. 4. Antes de su uso, permita que el kit alcance la temperatura ambiente

(18-30° C)5. No utilice los componentes del kit después de la fecha de vencimiento.6. No mezcle los reactivos de un kit con un número de lote, con los de otro

número de lote.7. No corra más de 6 pozos por prueba.8. Sólo utilice los tiempos de incubación específicos. Otros tiempos pueden

dar resultados poco precisos.

DESARROLLO

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

1. Solución de extracción: Prepare la solución de extracción agregando una bolsa del disolvente de extracción, 10mM PBS, a 1 L de agua destilada. Revuelva para mezclar completamente. Cubra y refrigere las porciones no utilizadas a 2-8 °C.

2. Solución buffer de lavado: Prepare la solución buffer de lavado, vertiendo todo el concentrado de bufferado (tamponado) de lavado, en un frasco vacío de 1 L. Enjuague el recipiente del concentrado de tamponado con agua destilada, y vierta en el frasco de 1L, para asegurar que se utilice todo el concentrado. Llene el frasco de 1L con agua destilada adicional y revuelva para asegurar que quede bien mezclado. Cubra y refrigere las porciones no utilizadas 2-8° C.

*Nota: Deseche las porciones no utilizadas de la solución de extracción y de tamponado de lavado cuando haya usado completamente el kit.

3. Pozos de anticuerpos: Mantenga los pozos sellados en la bolsa de papel metalizado hasta que se necesiten. Retire los pozos de la bolsa de papel metalizado solamente hasta que se hayan extraído las muestras, y que esté listo para empezar el procedimiento de la prueba.

PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS

La muestra que se pruebe, se deberá moler y mezclar completamente antes de proceder con el procedimiento de extracción.

1. Prepare la solución de extracción, como se describe en la preparación de soluciones.

2. Caliente la solución de extracción a 60° C.3. Obtenga una muestra representativa. Si la muestra es de tamaño de

partícula más grande, macerarla a un tamaño de partícula más fina.4. Transfiera 5 g de muestra o 5mL de muestra líquida, a un frasco de

plástico desechable o a un vaso de licuadora de 250 mL.5. Agregue una cucharada rasa de aditivo de extracción de cacahuate al

frasco /vaso de la muestra.6. Vierta 125 mL de la solución de extracción a 60° C frasco /vaso de la

muestra y tápelo.7. Extraiga agitando (150 rpm) en un baño maría a 60° C, durante 15

minutos. Retire el frasco del baño. Alternativa: Batir a velocidad alta durante 2 minutos.

8. Deje reposar el material durante 5 minutos. Nota: En algunos casos, se requerirá filtrar para lograr un sobrenadante libre de material suspendido. Filtre el extracto vertiendo cuando menos 5 mL a través de un papel filtro Whatman # 4.

9. Use una pipeta para transferir aproximadamente 1 mL del sobrenadante (la porción superior de líquido del extracto) a un frasco de muestras con gotero. Enseguida, etiquete y coloque la punta del gotero en el frasco.

10.Empiece el procedimiento de la prueba una vez que la muestra se haya enfriado a temperatura ambiente (cuando menos 15 minutos).

PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN PARA HISOPOS AMBIENTALES

1. Preparar la solución de extracción como se describe en las notas de procedimiento.

2. Prepare la solución de trabajo combinado 125 mL de la solución de extracción en un contenedor separado y agregue una cuchara del aditivo para el alérgeno. Prepare una solución de trabajo fresca diariamente. Nota: Prepare 125 mL de solución de trabajo por cada 25 hisopos ambientales.

3. Precaliente la solución de trabajo a 60° C. Agite el recipiente para disolver el aditivo.

4. Colecte la muestra con un hisopo, usando uno de los siguientes métodos:

Para superficies secas: Abra un nuevo hisopo y remójelo con la solución de extracción. Frote un área de 10 cm x 10

cm usando una técnica cuadricular. (No humedezca los hisopos con la solución de trabajo).

Para superficies húmedas: Abra un nuevo hisopo y frótelo en un área de 10 cm x 10 cm usando una técnica de cuadricular. No humedezca el hisopo antes de su uso.

5. Regrese el hisopo a su tubo original una vez efectuada la muestra. Recuerde de marcar cada tubo.

6. Retire el hisopo del tubo, y adicione 5 mL de solución de trabajo a 60° C al tubo. Mezcle colocando el hisopo en el tubo y agite durante 2 minutos en la mano (invirtiendo el tubo).

7. Retire el hisopo del tubo.8. Coloque un nuevo punto de gotero en el tubo. La solución en el tubo

ahora sirve como una muestra. Nota: Tenga cuidado al invertir el tubo, un poco de líquido puede gotear.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Antes de usarlos, permita que el kit y todos los reactivos se lleven a temperatura a,biente (18-30° C)

1. Retire  un  pozo  para  cada  muestra  que  se  va  a  probar,  más  1  poza  para  el   control  y colóquelos en una superficie plana.

2. Mezcle cada reactivo revolviendo el gotero antes de usarlo.3. Añada al primer pozo 3 gotas del gotero control, con etiqueta amarilla. Añada 3 gotas de 

cada extracto de muestras a un pozo respectivamente e identifíquelos con el marcador indeleble. Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrás los pozos sobre una superficie plana.

Control S1

S2 S3

S4 S5

4. Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30° C).5. Agite para sacar el contenido de los pozos. Con un frasco de lavado lleno con solución 

buffer de lavado, llene cada pozo y agite para sacar el contenido. Repita 5 veces el lavado. Retire el excedente del lavado volteando el pozo de cabeza y golpeando vigorosamente los pozos con una toalla desechable.

6.  Añada a cada pozo 3 gotas del gotero de conjugado con etiqueta azul. Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrás los pozos sobre una superficie plana.

7. Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30° C).8. Agite para sacar el contenido de los pozos. Con un frasco de lavado lleno con solución 

buffer de lavado, llene cada pozo y agite para sacar el contenido. Repita 5 veces el lavado. Retire el excedente del lavado volteando el pozo de cabeza y golpeando vigorosamente los pozos con una toalla desechable.

9. Añada a cada pozo 3 gotas del gotero de sustrato con etiqueta verde. Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrás los pozos sobre una superficie plana.

10. Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30° C).11.Añada a cada pozo 3 gotas del gotero de solución inhibidora con etiqueta roja. Mezcle 

durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrás los pozos sobre una superficie plana. Los resultados están listos para ser interpretados.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Compare visualmente el  color  de un pozo de muestra (S1,  S2,  S3,  etc.)  con el  color  del  pozo control. Si el pozo de muestras tiene MÁS COLOR AZUL que el pozo de control, la muestra resulta POSITIVA para contaminación de cacahuate de más de 5 ppm. 

Si el pozo de muestras tiene MENOS COLOR AZUL O MÁS COLOR ROJO  que el pozo de control, la muestra contiene menos de 5 ppm de contaminación de cacahuate.  

REFERENCIA

http://www.neogen.com/FoodSafety/pdf/ProdInfo/A-Peanut.pdf