INTEGRACIÓ DE PROCESSOS AMB MEMBRANES PER A LA

TREBALL FI DE GRAU

Grau en Enginyeria Química

INTEGRACIÓ DE PROCESSOS AMB MEMBRANES PER A LA

RECUPERACIÓ D’ANTIOXIDANTS DE RESIDUS

AGROALIMENTARIS

Memòria i Annexos

Autor: Maria Rosa Soler Ferrer Director: Xanel Vecino Bello Co-Director: José Luis Cortina Ponent: - Convocatòria: Juny 2019

Integració de processos amb membranes per a la recuperació d’antioxidants de residus agroalimentaris

i

Resum

La indústria agroalimentària genera grans quantitats de residus (16 milions de tones) i la seva gestió és

un problema que la comunitat científica està abordant. En entre ells, els residus de fruites i verdures

suposen un 56%, per tant són una matèria primera atractiva per a la seva revalorització. A més, els

residus de fruites i verdures són rics en antioxidants (polifenols) que tenen aplicacions nutricionals i en

la indústria cosmètica.

Per això, aquest projecte es va centrar en l'extracció de polifenols de dues matrius agroalimentàries

(pell de taronja i espinacs) mitjançant diferents tècniques d'extracció com ara extracció assistida per

ultrasons (UAE), extracció assistida per microones (MAE) i extracció amb líquid a pressió (PLE). Per

obtenir l'extracció òptima es van realitzar experiments amb diferents condicions de solvent

EtOH/H2O/HCl (40; 60; 80/ 59,9; 39,9; 19,9/ 0; 0,1; 0,5), temperatura (25, 80, 90, 120 ºC) i temps

d'extracció (5, 10, 15 i 30 min). D'altra banda, es va realitzar un experiment amb diferents processos

de membranes (filtres de microfiltració (MF) en format disc; filtres amb centrifugació; membranes de

nanofiltració (NF)) per a la possible separació d'aquests polifenols.

Un cop realitzats els experiments d'extracció es va determinar que la millor tècnica d'extracció de

polifenols per l'espinac és UAE amb condicions òptimes d'EtOH/H2O/HCl de 80/19,9/0,1 (v/v/v) i un

temps d'extracció de 30 min a temperatura ambient (25 ºC). Mentre que la millor tècnica d'extracció

per a la taronja va ser PLE amb condicions òptimes d'EtOH/H2O/HCl de 40/59,9/0,1 (v/v/v) a 80ºC i un

temps d'extracció de 10 min.

Es va separar l'àcid ferúlic utilitzant el filtre de microfiltració en format disc de 0,45μm i filtres amb

centrifugació, obtenint valors de rebuig entre el 70% i el 80% tant per a la barreja dels espinacs com

per la barreja de la taronja, però la millor separació es va obtenir amb la membrana de nanofiltració

TFCS (80,5%) per a la barreja de la taronja. A més, per a la barreja de la taronja, es va aconseguir separar

l'àcid 3,4-dihidroxibenzoico (en el corrent del permeat) en un 38,5% mitjançant la membrana de

nanofiltració TF-HR. També, la hesperidina i l'àcid ferúlic es van separar de la resta de polifenols (en el

corrent de rebuig) mitjançant la membrana NF-90 obtenint percentatges de rebuig de 77,0 i 82,8%,

respectivament. Per tant, en vista als resultats obtinguts, es va observar que amb aquests processos

de membranes és possible obtenir polifenols tant en el corrent de rebuig com en el corrent de permeat.

Això fa que aquests processos siguin versàtils i que es pugui centrar en un o en un conjunt de polifenols

en funció de l'aplicació industrial.

Memoria

ii

Resumen

La industria agroalimentaria genera grandes cantidades de residus (16 millones de toneladas) y su

gestión es un problema que la comunidad científica está abordando. En entre ellos, los residuos de

frutas y verduras suponen un 56%, por tanto son una materia prima atractiva para su revalorización.

Además, los residuos de frutas y verduras son ricos en antioxidantes (polifenoles) que tienen

aplicaciones nutricionales i en la industria cosmètica.

Por ello, este proyecto se centró en la extracción de polifenoles de dos matrices agroalimentarias (piel

de naranja y espinacas) mediante diferentes técnicas de extracción tales como extracción assistida por

ultrasonidos (UAE), extracción assistida por microondas (MAE) y extracción con líquido a presión (PLE).

Para obtener la extracción óptima se realizaron experimentos con diferentes condiciones de solvente

EtOH/H2O/HCl (40; 60; 80/ 59,9; 39,9; 19,9/ 0; 0,1; 0,5), temperatura (25, 80, 90, 120 ºC) y tiempo de

extracción (5, 10, 15 i 30 min). Por otra parte, se realizó un barrido con diferentes procesos de

membranas (filtros de microfiltración (MF) en formato disco; filtros con centrifugación; membranas de

nanofiltración (NF)) para la posible separación de estos polifenoles

Una vez realizados los experimentos de extracción se ha determinado que la mejor técnica de

extracción de polifenoles para la espinaca es UAE con condiciones óptimas de EtOH/H2O/HCl de

80/19,9/0,1 (v/v/v) y un tiempo de extracción de 30 min a temperatura ambiente (25 ºC). Mientras

que la mejor técnica de extracción para la naranja es PLE con condiciones óptimas de EtOH/H2O/HCl

de 40/ 59,9/0,1 (v/v/v) a 80ºC y un tiempo de extracción de 10 min.

Se ha separado el ácido ferúlico utilizando el filtro de microfiltración en formato disco de 0,45μm y

filtros con centrifugación, obteniendo valores de rechazo entre el 70% y el 80% tanto para la mezcla

de las espinacas como para la mezcla de la naranja, pero la mejor separación se ha obtenido con la

membrana de nanofiltración TFCS (80,5%) para la mezcla de la naranja. Además, para la mezcla de la

naranja, se ha conseguido separar el ácido 3,4-dihidroxibenzoico (en la corriente del permeado) en un

38,5% mediante la membrana de nanofiltración TF-HR. También, la hesperidina y el ácido ferúlico se

separaron del resto de polifenoles (en la corriente de rechazo) mediante la membrana NF-90

obteniendo porcentajes de rechazo de 77,0 y 82,8%, respectivamente. Por tanto, en vista a los

resultados obtenidos, se observó que con estos procesos de membranas es posible obtener polifenoles

tanto en la corriente de rechazo como en la corriente de permeado. Esto hace que estos procesos sean

versátiles y que se pueda centrar en uno o en un conjunto de polifenoles en función de la aplicación

industrial.


iii

Abstract

The agri-food industry generates large amounts of waste (16 million tons) and its management is a

problem that the scientific community is addressing. Among them, fruit and vegetable residues

account for 56%, so they are an attractive raw material for revaluation. In addition, fruit and vegetable

residues are rich in antioxidants (polyphenols) that have nutritional applications in the cosmetics

industry.

Therefore, this project focused on the extraction of polyphenols from two agri-food matrices (orange

peel and spinach) through different extraction techniques such as ultrasonic assisted extraction (UAE),

microwave assisted extraction (MAE) and presurized líquid extraction (PLE). To obtain the optimal

extraction, experiments were performed with different solvent conditions EtOH / H2O / HCl (40; 60;

80/ 59,9; 39,9; 19,9/ 0; 0,1; 0,5), temperature (25, 80, 90, 120ºC) and extraction time (5, 10, 15 and 30

min). On the other hand, a sweep was carried out with different membrane processes (microfiltration

filters (MF) in disc format, filters with centrifugation, nanofiltration membranes (NF)) for the possible

separation of these polyphenols

Once the extraction experiments have been carried out, it has been determined that the best

extraction technique for polyphenols for spinach is UAE with optimum conditions of EtOH / H2O / HCl

of 80 / 19.9 / 0.1 (v / v / v) and an extraction time of 30 min at room temperature (25 ºC). While the

best extraction technique for orange is PLE with optimal conditions of EtOH / H2O / HCl of 40 / 59.9 /

0.1 (v / v / v) at 80ºC and an extraction time of 10 min.

The ferulic acid has been separated using the microfiltration filter in 0.45μm disc format and filters with

centrifugation, obtaining rejection values between 70% and 80% for both the spinach mixture and the

orange mixture, but the best separation has been obtained with the nanofiltration membrane TFCS

(80.5%) for the orange mixture. Furthermore, for the orange mixture, 3,4-dihydroxybenzoic acid (in

the permeate stream) was separated by 38.5% by the nanofiltration membrane TF-HR. Also, hesperidin

and ferulic acid were separated from the rest of the polyphenols (in the reject stream) by the NF-90

membrane, obtaining rejection percentages of 77.0 and 82.8%, respectively. Therefore, in view of the

results obtained, it was observed that with these membrane processes it is possible to obtain

polyphenols both in the reject current and in the permeate stream. This makes these processes

versatile and can focus on one or a set of polyphenols depending on the industrial application.

Memoria

iv


v

Agraïments

Aquesta investigació ha estat recolzada pels projectes Waste2Product (CTM2014-57302-R) i R2MIT

(CTM2017-85346-R) i finançat pel Ministeri d’Economia i Competitivitat espanyol (MINECO) i el Govern

Català (2017-SGR-312), Espanya.

Per començar m’agradaria donar les gràcies a en José Luis Cortina per proposar-me la participació en

aquest projecte i tenir l’oportunitat de poder realitzar el Treball de fi de grau en un laboratori. Durant

aquests mesos he comptat amb l’ajuda i la guia de la Xanel Vecino Bello i la Mònica Reig Amat, vull

agrair-les la seva dedicació que m’ha facilitat molt la feina.

A continuació m’agradaria agrair a les persones que he conegut durant la primera part del projecte a

la UB com la Jordana Weggelar, la Beatrice Ferro i la Paulina Tapia. També vull agrair a la Dra. Mercè

Granados i al Dr. Xavier Saurina la seva ajuda durant la meva estada en els seus laboratoris.

En la segona part del projecte he tingut la sort de poder treballar amb gent que ja coneixia com la

Marta Parietti, el Carlos de la Parra, el Victor Vallès i l’Alexandra Roa, tots ells m’han animat en tot

moment i gràcies a ells la feina ha estat menys feixuga.

Durant tot el projecte hi ha hagut una persona al meu costat, la Maria Fernanda Montenegro, a ella li

vull agrair tot el suport que m’ha donat tant acadèmicament com personalment.

Per últim agrair el suport incondicional de la meva família i amics que m’animen a tirar endavant en

moments en els que jo mateixa penso que no puc, la seva confiança en mi sempre em fa seguir

endavant.

Memoria

vi


vii

Glossari

AcN: acetonitril

ASE: accelerated solvent extraction o extracció accelerada amb solvent

EtOH: etanol

HPLC: high performance liquid chromatography o cromatografia liquida d’alta resolució

LC: liquid chromatography o cromatografia líquida

MAE: microwave-assisted extraction o extracció assistida amb microones

MF: microfiltració

NF: nanofiltració

PLE: pressurized liquid extraction o extracció amb liquid pressuritzat

SFE: supercritical fluid extraction o extracció amb fluid supercrític

UAE: ultrasound-assisted extraction o extracció assistida amb ultrasons

UF: ultrafiltració

UV: ultravioleta

Memoria

viii


ix

Índex

RESUM ______________________________________________________________ I

RESUMEN __________________________________________________________ II

ABSTRACT __________________________________________________________ III

AGRAÏMENTS _______________________________________________________ V

GLOSSARI __________________________________________________________ VII

1 INTRODUCCIÓ _________________________________________________ 11

1.1 Objectius del treball ............................................................................................... 11

1.2 Abast del treball ..................................................................................................... 11

2 ESTAT DE L’ART ________________________________________________ 13

2.1 Polifenols ................................................................................................................ 13

2.2 Tècniques d´extracció de polifenols ...................................................................... 14

2.3 Separació de polifenols mitjançant processos de membranes ............................ 17

3 METODOLOGIA EXPERIMENTAL ___________________________________ 19

3.1 Reactius y materiales ............................................................................................. 19

3.2 Extracció de polifenols amb tècniques modernes ................................................ 20

3.2.1 Extracció assistida per ultrasons (UAE per les seves sigles en anglès) ................ 21

3.2.2 Extracció assistida per microones (MAE per les seves sigles en anglès) ............. 22

3.2.3 Extracció amb líquid pressuritzat (PLE per les seves sigles en anglès) ................ 23

3.2.4 Condicionament dels extractes de polifenols ...................................................... 24

3.3 Separació de polifenols amb processos de membranes ....................................... 24

3.3.1 Filtres de microfiltració en format disc ................................................................ 25

3.3.2 Filtració amb centrifugació ................................................................................... 25

3.3.3 Membranes de nanofiltració ................................................................................ 26

3.4 Anàlisis de polifenols amb HPLC ............................................................................ 26

3.5 Anàlisis de sucres amb espectrofotometria UV-VIS .............................................. 27

3.6 Esquema general .................................................................................................... 29

4 RESULTATS ____________________________________________________ 30

4.1 Extracció de polifenols ........................................................................................... 30

4.1.1 Extracció de polifenols amb UAE ......................................................................... 30

4.1.2 Extracció de polifenols amb MAE ......................................................................... 31

Memoria

x

4.1.3 Extracció de polifenols amb PLE ........................................................................... 34

4.1.4 Comparació de les tècniques d’extracció de polifenols ....................................... 36

4.2 Contingut de sucres dels extractes........................................................................ 37

4.3 Separació de polifenols amb processos de membranes ...................................... 38

4.3.1 Filtres de microfiltració en format disc ................................................................. 38

4.3.2 Filtres per centrifugació ........................................................................................ 42

4.3.3 Membranes de nanofiltració ................................................................................ 43

5 ANÀLISI DE L’IMPACTE AMBIENTAL ________________________________ 46

5.1 Residus experimentals ........................................................................................... 46

6 CONCLUSIONS _________________________________________________ 47

7 ANÀLISI ECONÒMICA ____________________________________________ 48

7.1 Cost experimental .................................................................................................. 48

7.2 Cost de personal .................................................................................................... 50

7.3 Cost total ................................................................................................................ 51

BIBLIOGRAFIA ______________________________________________________ 53


11

1 Introducció

1.1 Objectius del treball

L’objectiu principal d’aquest projecte és estudiar l’extracció y posteriorment l’avaluació dels factors

de separació de polifenols de residus de processament de fruites i verdures (ex. taronja i espinacs) fent

servir processos de filtració mitjançant membranes.

Per assolir l’objectiu principal caldrà assolir-ne d’altres associats:

- Optimitzar les condicions d’extracció de polifenols mitjançant diferents tècniques: extracció

assistida per ultrasons, extracció assistida per microones i extracció amb líquid pressuritzat.

- Quantificar els polifenols en extractes de residus taronja i espinacs mitjançant la tècnica de

cromatografia líquida d’alta resolució (HPLC).

- Determinar la quantitat de sucres en els extractes de taronja i espinacs mitjançant la tècnica

d’espectrofotometria ultraviolat/visible (UV/VIS).

- Estudiar el comportament de filtres de microfiltració en format disc, filtres amb centrifugació

i membranes de nanofiltració amb extractes de taronja i espinacs així com les seves condicions

de rebuig i permeat.

1.2 Abast del treball

Aquest projecte experimental, està emmarcat dins del projecte “Recuperación de Recursos de

Corrientes de Procesos Industriales Mediante Tecnologías Integradas de Membranas (R2MIT).

Financiat pel Ministeri d’Economia y Competitivitat. En el present estudi s’ha estudiat de forma

concreta la recuperació de polifenols en extractes de fruites i verdures, centrant-se en els residus de

dos matrius: taronja i espinacs. El projecte es dividirà en dos parts: l’avaluació i identificació de sistemes

d’extracció dels polifenols presents en residus de fruites i verdures, i la determinació preliminar dels

factors de separació d’aquests.

L’extracció es durà a terme amb tres tècniques diferents: extracció assistida amb microones, extracció

assistida amb ultrasons i extracció amb líquid pressuritzat. Amb aquestes tècniques s’estudia la relació

EtOH/H2O/HCl (40; 60; 80/ 59,9; 39,9; 19,9/ 0; 0,1; 0,5), temps (5, 10, 15) i temperatura (80, 90, 120).

Memoria

12

En l’extracció assistida amb ultrasons es fixarà la variable de la temperatura i per tant no s’estudiarà

l’efecte d’aquesta en la tècnica d’extracció. En extracció assistida amb microones es fixarà el

percentatge de solvent utilitzat i per tant l’efecte d’aquest no s’ha estudiarà. En extracció amb líquid a

pressió

Per la separació dels polifenols es realitzaran diversos assajos amb filtres de microfiltració en format

disc (0,1 µm; 0,22 µm; 0,45µm), filtres amb centrifugació i membranes de nanofiltració (Duracid, TFCS,

TFHR i NF 90). Per aquests experiments es necessitaran mescles sintètiques amb patrons simulant els

extractes de cada matriu, per determinar quina membrana és millor per a la recuperació de polifenols.


13

2 Estat de l’art

Aquesta part del treball explicarà inicialment què son els polifenols y les seves aplicacions. En una

segona part s’exposaran les diferents tècniques d’extracció, tradicionals i innovadores. Finalment es

presentaran els mètodes de separació dels polifenols amb tècniques de membranes.

2.1 Polifenols

En els últims 20 anys els polifenols han captat l’atenció de la comunitat científica gràcies a les seves

característiques antioxidants. Es troben presents principalment en plantes i se n’han pogut

caracteritzar més de 10000 [1]. Diferents estudis epidemiològics han determinat que una dieta rica en

polifenols pot millorar la salut en el cas de malalties cròniques com la diabetis, el càncer, malalties

coronaries [2] i malalties degeneratives com per exemple l’Alzheimer.

Els polifenols són substancies que contenen un o més d’un grup fenol. Aquesta característica química

principal influeix directament en la seva classificació, que depèn del nombre d’anells fenòlics que

contenen així com els elements que els uneixen entre sí. [3]

Les 4 classes en que es divideixen els polifenols són: àcids fenòlics, flavonoides, estilbens i lignans.

Figura 1. Tipus de polifenols: àcids fenòlics, flavonoides, estibens i lignans.

Els àcids fenòlics són components polifenòlics que es poden diferenciar segons si deriven de l’àcid

benzoic amb estructures de C1-C6 o de l’àcid cinàmic amb estructures de C3-C6.

Els flavonoides tenen una estructura de C6-C3-C6 amb pes molecular baix, les unitats de C6 són dos

anells aromàtics units per 3 carbonis que formen un heterocicle oxigenat, com es pot observar a la

Figura 1. Es divideixen en diversos subgrups depenent del heterocicle involucrat en l’estructura:

flavonols, flavones, isoflavones, flavanones, antocianidines i flavanols.

Memoria

14

Els estibens són hidrocarburs aromàtics que es troben en el vi de raïm (Vitis vinifera), cacauets (Arachis

hypogaea), sorgo (Sorghum bicolor) i moltes altres espècies d’arbres (Pinus i Picea)[4].

En els últims anys s’ha quantificat la presència de polifenols en fruites, vegetals, cereals i herbes. Els

polifenols més representatius en fruites i verdures com la taronja i els espinacs estan resumits en la

Taula 1.

Taula 1. Polifenols representatius en residus de taronja i espinacs.[5]

Residus Polifenols representatius Tipus de polifenol

Taronja Hesperidina

C28H34O15

flavonoide, flavanones

Naringenina

C15H12O5

flavonoide, flavanones

Kaempferol

C15H10O6

flavonoide, flavonols

Àcid Homogenístic

C8H8O4

àcids fenòlics, phenylacetic acids

Espinacs Luteolina

C15H10O6

flavonoide, flavones

Miricetina

C15H10O8

flavonoide, flavonols

Galat d’Etil (Gallic acid ethyl ester)

C9H10O5

àcids fenòlics, àcids hidroxibenzoic

2.2 Tècniques d´extracció de polifenols

La separació i purificació de polifenols dels residus és un procediment complicat degut a que les matrius

originals són normalment complexes [3].

En el procés d’extracció es tenen en compte paràmetres com el solvent, l’agitació, el temps d’extracció,

el rati solut/solvent i la temperatura. Alguns estudis han avaluat la polaritat dels components fenòlics,

ja que limita el solvent a utilitzar que normalment és orgànic com per exemple metanol, etanol,

acetona i acetat d’etil, o combinacions d’aquests amb aigua [5].

Hi ha diverses tècniques fisicoquímiques per tal de realitzar aquesta extracció. Les tècniques

tradicionals són extracció sòlid-líquid, en anglès supported liquid extraction (SLE), i extracció de reflux

escalfada [6]. Les tècniques modernes inclouen extracció amb fluids supercrítics, en anglès supercritical


15

fluid extraction (SFE), extracció assistida per ultrasons, en anglès ultrasound assisted extraction (UAE),

extracció assistida per microones, en anglès microwaved assisted extraction (MAE), i extracció amb

líquid pressuritzat o extracció accelerada per solvents, en anglès pressurized liquid extraction (PLE) o

acelerated solvent extraction (ASE), respectivamente.

La Taula 2 resumeix les avantatges i desavantatges de les tècniques d’extracció modernes.

Taula 2. Avantatges i desavantatges de les tècniques d'extracció.[6]

Tècnica Avantatges Desavantatges

Tecnologies

d’extracció

modernes

UAE - Simple i fàcil d’operar

- Eficient

- És difícil d’utilitzar

industrialment

MAE

- Ràpida i requereix

menys quantitat de

solvent

- Degradació de

components termolàbils

- Instrumentació cara

SFE

- Ràpida i segura, alta

selectivitat

- Evita l’oxidació de la

mostra en contacte amb

aire i no necessita filtració

- No es pot aplicar a

components polars

- Requereix instrumentació

complicada i cara

PLE

- Requereix de poca

quantitat de solvent

- Ràpida i segura

- Degradació de

components termolàbils

- Instrumentació cara

La polaritat dels polifenols complica l’extracció mitjançant SFE, per això les tècniques d’extracció

restants són les més utilitzades.

L’ UAE és una tècnica senzilla i econòmica ja que no necessita d’instruments costosos. Les ones

d’ultrasons són ones de so amb freqüències altes per sobre de la capacitat auditiva humana. Els equips

d’extracció per ultrasons treballen en un rang de freqüència d’ultrasons de 20 kHz a 2 MHz. Les ones

sonores tenen un fort impacte en medis elàstics com solvents líquids, teixit tou de parts de plantes,

etc. El medi canvia de forma en contacte amb les ones sonores i torna a la seva forma original en

absència d’aquestes [7]. En aquest mecanisme anomenat efecte de cavitació es formen bombolles de

cavitació en el medi de manera que quan milions d’aquestes bombolles col·lapsen alliberen energia

creant una pressió localitzada i zones de temperatura. D’aquesta manera es trenquen les parets de les

cèl·lules de la planta alliberant el contingut de la matriu al solvent [6].

Memoria

16

Les aplicacions de UAE són variades i en estudis recents s’ha estudiat l’influencia del temps d’extracció,

temperatura, concentració del solvent, rati de sòlid-líquid, mida de partícula, freqüència d’ultrasons en

matrius com la pell de mango [8], pell de kinnow [9], Clinacanthus nutans [10] i segó d'arròs hasemi

[11].

La MAE es basa en dos mecanismes [12]: el primer mecanisme es coneix com escalfament dielèctric,

causat per la rotació del moment dipolar. Les molècules giren segons el moment dipolar i es

distribueixen a l’atzar amb la freqüència de microones. Aquest moviment molecular fa que el solvent

s’escalfi. El segon mecanisme és la conducció iònica on els ions s’alineen amb el camp electromagnètic

com la radiació electromagnètica. La fricció entre el flux de ions i la resta del solvents es transforma en

calor. Depenent de la polaritat del solvent i la presència de ions en el solvent, tots dos mecanismes

poden ocórrer simultàniament. Aquesta tècnica utilitza l’efecte directe de l’energia de microones per

dividir l’analit de la mostra en el solvent. L’ús de solvents amb constants dielèctriques altes que

absorbeixen més energia de microones és necessari, ja que en cas contrari hi pot haver risc d’explosió

a causa de l’augment de la temperatura [6].

En la revisió del estat del art s’han trobat nombroses aplicacions utilitzant MAE per l’extracció de

polifenols d’aliments i diferents pars de plantes. Aquesta tècnica s’ha aplicat per l’extracció de

polifenols en matrius com fulles d’oliva [13], orujo de poma [14], així com de fulles fresques i seques

de Centella asiàtica [15]. Els diferents solvents més utilitzats per l’extracció de polifenols de plantes en

MAE són l’acetona, el metanol, l’etil acetat i l’aigua. S’han realitzat estudis per optimitzar aquesta

tècnica i el solvent utilitzat és etanol:aigua (EtOH:H2O) (1:1 v/v) en matrius com pell de llimona [16],

mandarina[17] i pinya [18].

La PLE, fa servir solvents orgànics a altes pressions i temperatures per sobre del seu punt d’ebullició

per aïllar l’analit d’una mostra sòlida. Les condicions esmentades contribueixen a la rapida penetració

del solvent en les cèl·lules de la planta prevenint la degradació dels polifenols [19]. PLE treballa sobre

el principi que el punt d’ebullició es proporcional a la pressió. Per aquest motiu s’incrementa la pressió

del sistema d’extracció abans d’arribar a aquesta temperatura, i mantenir la solució en estat líquid.

Diversos investigadors han determinat que la solubilitat dels productes químics, principalment

polifenols en líquids, s’incrementa amb l’extracció PLE [12].

En general l’extracció amb PLE es fa amb solvents com l’hexà, etanol i l’acetona que aguantin

temperatures entre 40-200 ºC i pressions entre 35 y 200 bar en períodes curts de temps entre 5 i 15

min [6]. La temperatura màxima d’extracció depèn del solvent i els polifenols ja que temperatures altes

poden degradar components actius i dissoldre’n d’altres importants [12]. A més l’elecció de solvents

és limitada, ja que han de tenir temperatures d’autoignició altes i menor corrosió de metalls a altes

temperatures [12].


17

La investigació d’aquesta tècnica s’ha dut a terme amb varies matrius i s’han obtingut bons resultats

amb EtOH:H2O (1:1 v/v) en polpa de poma [20], oli d’oliva [21].

2.3 Separació de polifenols mitjançant processos de membranes

Els processos amb membranes són tecnologies útils per a la recuperació i concentració de compostos

fenòlics de corrents de procés aquoses i alcohòliques que provenen del tractament de residus.[3]

Les membranes són barreres semipermeables que separen dos fases i restringeixen el pas dels

components de manera selectiva. Les membranes retenen uns components i en deixen passar d’altres

de manera que hi ha un corrent que és diluït i enriquit en certs components anomenat permeat i un

altre corrent denominat rebuig, que és concentrat i enriquit en uns altres [22]. En la Figura 2 s’observa

l’esquema general d’una membrana.

Figura 2. Esquema d'una membrana.

En les últimes dècades, per a la recuperació de polifenols, s’han utilitzat membranes on la força

impulsora és la pressió, es a dir que s’aplica un gradient de pressió hidrostàtica entre els dos costats de

la membrana que actua con una barrera permeoselectiva. És preferible treballar a concentracions

baixes per evitar la formació d’una capa de polarització, que pot crear problemes de selectivitat a la

membrana [3].

Aquestes membranes es poden classificar depenent de la pressió de transmembrana (TMP) que

requereixen i la mida dels porus o volum lliure: microfiltració (MF 0,1–5 µm, 1–10 bar), ultrafiltració

(UF, 0,5–100 nm, 1–10 bar), nanofiltració (NF 0,5–10 nm, 10–30 bar) i osmosis inversa (RO <0,5 nm,

35–100 bar). [23]

Les membranes interactuen fisicoquímicament amb els polifenols de diferents maneres depenent del

material del que estan constituïdes [3]. Els materials utilitzats són polimèrics o ceràmics, aquest treball

analitza el comportament dels polifenols en les membranes polimèriques.

Memoria

18

Els diferents polímers emprats en membranes són [3]: acetat de cel·lulosa (CA), eters de cel·lulosa

(mescla), poliacrilonitril (PAN), poliamida (aromàtic, alifàtic) (PA), poliimida (PI), polisulfona (PS),

polietersulfona (PES), poli clorur de vinil (PVC), polièteretercetona (PEEK), policarbonat (PC), polièster

(PE), polipropilè (PP), politetrafluoroetilè (PTFE) poli (difluorur de vinilidè) (PVDF).

En les membranes polimèriques, per augmentar el flux de l’alimentació s’utilitza un tipus de membrana

(Thin film composite, TCF) que consisteix en una capa fina d’un polímer dens sobre una capa gruixuda

d’una pel·lícula de suport microporosa. D’aquesta manera s’obté una membrana anisotròpica amb una

capa superior que separa les molècules segons la mida i una capa inferior amb una funció de suport

[24].

Una part important de la comunitat investigadora està interessada en la recuperació de polifenols amb

membranes, a continuació s’expliquen alguns articles en aquest camp.

Laorko et al. [25] van treballar amb suc de pinya utilitzant MF (mida de porus de 0,1 i 0,2 mm). En els

dos casos no es va notar efectes en el pH, l’acidesa o la quantitat de sucres però es van eliminar

completament els sòlids en suspensió i microorganismes. El permeat amb un major contingut total de

polifenols 93.4% es va obtenir amb la membrana de 0,2 nm.

En un altre estudi [26], l’extracció de polifenols de llavors de raïm obtingut es va utilitzar una relació de

solvents EtOH:H2O (50%:50%) amb un 0,2 g/ml de rati sòlid-liquid. Aquest extracte es va tractar amb

una membrana UF i mida de porus 0,22 µm, es va recuperar un 11,4% de polifenols del pes total de les

llavors de raïm. Aquesta membrana va donar millor resultat de polifenols totals que la membrana de

0,45 µm, amb una mida de porus més gran.

Giacobo et al. [26] van utilitzar membranes de UF amb un pes molecular de tall (en anglès molecular

weigh cut off, MWCO) de 1 a 10 kDa a condicions de 15 bar per a la separació de polisacàrids i polifenols

en lies de vi. Van obtenir que el rebuig era menor en la membrana de 10 kDa (50%) que en la de 1 kDa

(60%), però en les dues membranes es rebutjava més del 77% dels polisacàrids, de manera que

quedaven separats dels polifenols. També van veure que el rebuig de polifenols augmentava

linealment a mesura que s’incrementava la pressió.

B. Díaz-Reinoso et al. [28] van investigar el tractament d’extractes aquosos de fulles de Castanea sativa,

i van veure que membranes de 5 i 10 kDa PES no mostraven preferència de rebuig de proteïnes per

sobre de polifenols. Comparant els resultats de rebuig de les membranes de 5 kDa, aquestes

presentaven un major rebuig que la membrana de 10 kDa. Aquestes diferències es van atribuïr al

diferent material de les membranes, però també la interacció dels polifenols amb la superfície de la

membrana.


19

Arsuaga et al [29] van avaluar l’influència de l’adsorció de polifenols de una membrana de TCF-PA

(NF90, Dow/Filmtec) en el comportament de retenció d’aquesta. L’hidrofobicitat dels components

amb pesos moleculars per sota del MWCO de la membrana (200 Da) va ser un paràmetre important

per determinar la retenció de solut.

3 Metodologia experimental

3.1 Reactius y materiales

En l’extracció de polifenols s’han utilitzat els següents solvents:

- Acetonitril HPLC (AcN), Fisher Scientific

- Etanol HPLC (EtOH), Merck

- Aigua purificada amb un equip Milli-Q, Merck Millipore

- Àcid Fòrmic (98-100% w/w), Merck

- Àcid clorhídric (32% w/w), Merck

Per l’anàlisi dels extractes amb HPLC s’han utilitzat diferents patrons. A continuació s’exposa una llista

dels patrons i el seu proveïdor:

- Del proveïdor TCI Chemicals: 2-(3,4-dihidroxiphenil) etil alcohol; Catequina; Miricetina;

Resveratrol.

- Del proveïdor Sigma Aldrich: 2-(4-hidroxiphenil) etanol; àcid 2,5-Dihidroxibenzoic; 3,4-

Dihidroxibenzaldehid; Àcid 3,4-Dihidroxibenzoic; àcid 4-Hydroxybenzoic; àcid Cafeic; àcid

Clorogènic; Epicatequina; Gal·lat d’ Etil; àcid Ferúlic; àcid Gàl·lic; Naringenina; àcid p-cumaric;

Quercetina; Rutina hidratada; àcid Siringic.

- Del proveïdor Chengdu Biopurify Phytochemicals: Apigenina i àcid Caftàric.

- Del proveïdor Glentham Life Sciences: Hesperidina i Kaempferol.

- Del proveïdor Extrasynthese: àcid Homogentisic.

- Del proveïdor Carbosynth: Luteolina.

Per l’anàlisi de sucres dels extractes s’han utilitzat:

- D(+)-Glucosa, Panreac

- Àcid Sulfúric (95-97% w/w), J.T.Baker

- Fenòl (≈99%), Sigma Aldrich

Memoria

20

Per la separació de los polifenols s’han utilitzat las següents membranes:

- Filtres de microfiltració en format disc: 0,1 µm (Sartorius Stedim Biotech), 0,22 µm (Filter Lab),

0,45 µm (Sartorius Stedim Biotech)

- Filtres amb centrifugació (Merck Millipore)

- Membranes de NF: Duracid (GE), TFCS i TF-HR (KMS - Fluid Systems) i NF 90 (Dow-Filmtec).

3.2 Extracció de polifenols amb tècniques modernes

Es treballa amb dues matrius que són residus agroalimentaris: la taronja i els espinacs. Per obtenir

aquests residus s’han processat aquestes fruites i verdures extraient el suc en el cas de la taronja i els

residus sòlids obtinguts (pell de taronja i fulles d’espinacs), s’han congelat a una temperatura de -20C

en tubs Falcon com es mostra en la Figura 3 per evitar la seva degradació.

Figura 3. Residus congelats de taronja i espinacs.

Les tres tècniques estudiades en aquest projecte són: UAE, MAE y PLE. En aquestes s’han estudiat

diferents paràmetres d’operació com: diferents condicions de solvent (mescla d’etanol, aigua y àcid

clorhídric), temperatura i temps d’extracció. En la Taula 3 es mostra, com a resum, les variables

estudiades en cada tècnica.

Taula 3. Resum de les variables estudiades en cada tècnica.

Paràmetres UAE MAE PLE

Relació de solvent

EtOH/H2O/HCl

(v/v/v).

40 EtOH/60 H2O/0 HCl 40 EtOH/59,9 H2O/0,1 HCl 40 EtOH/59,5 H2O/0,5 HCl

60 EtOH/40H2O/ 0 HCl 60 EtOH/39,9H2O/ 0,1 HCl 60 EtOH/39,5H2O/ 0,5 HCl

80 EtOH/20 H2O/ 0 HCl 80 EtOH/19,9 H2O/ 0,1 HCl 80 EtOH/19,5 H2O/ 0,5 HCl

60/39,9/0,1 40/59,9/0,1 i

60/39,9/0,1

Temperatura (ºC) 25 90 i 120 80


21

Temps (min) 30 5 i 15 10 i 15

A continuació es desenvolupa amb més detall el procediment experimental dut a terme per cada

tècnica d’extracció.

3.2.1 Extracció assistida per ultrasons (UAE per les seves sigles en anglès)

L’extracció de polifenols assistida per ultrasons es realitza amb l’equip de bany d’ultrasons Branson

5510, com s’observa en la Figura 4. El procediment d’extracció és el següent:

- Les mostres de taronja i espinacs es descongelen fins a estar a temperatura ambient (25 ºC).

- Es pesa 1 g de mostra en un tub Falcon de 50 mL.

- S’afegeixen 20 mL d’una mescla de EtOH/H2O/HCl (v/v/v).

- Les mostres es mesclen amb un agitador vòrtex durant 1 minut.

- S’introdueixen els tubs al bany d’ultrasons durant 30 minuts a temperatura ambient (25 ºC).

- Un cop finalitzada l’extracció les solucions es transfereixen a tubs Falcon per el seu posterior

condicionament.

Figura 4. Equip d'ultrasons Branson 5510.

Memoria

22

3.2.2 Extracció assistida per microones (MAE per les seves sigles en anglès)

L’extracció de polifenols assistida per microones es realitza amb l’equip ETOHS E de Milestone que es

pot observar en la Figura 5.

Figura 5. Equip d'extracció per microones.

El procediment per l’extracció és el següent:


- Es pesa 1 g de mostra en un recipient de MAE exposat en la Figura 6.

- S’afegeixen 20 mL d’una mescla de 60 EtOH/39,9 H2O/0,1 HCl (v/v/v).

- Es col·loquen els tubs en l’equip de microones.

- Es programa l’equip a una temperatura (90 i 120) que es controla amb una sonda introduïda

en un dels recipients, així com el temps d’extracció (5 i 15)


condicionament.

Figura 6. Recipient de MAE amb la peça necessària per col·locar-lo dins l'Equip


23

3.2.3 Extracció amb líquid pressuritzat (PLE per les seves sigles en anglès)

L’extracció de polifenols amb líquid pressuritzat es realitza amb l’Equip Dionex ASE 350 que s’observa

a la Figura 7.

Figura 7. Equip d'extracció amb PLE.

El procediment per l’extracció és el següent:


- Es pesa 1 g de mostra i 2 g de terra diatomea (per homogeneïtzar la mescla) en un vas de

precipitats.

- La mescla es traspassa a un morter per homogeneïtzar-la.

- Un cop homogeneïtzada es passa la mescla a una cel·la de PLE d’acer inoxidable de 5 mL amb

l’ajuda d’un embut, en la Figura 8 s’observa el material.

- Es pressiona la mescla amb un punxó i es tanquen totes les cel·les.

- Es col·loquen les cel·les a l’equip de PLE.

- El solvent de EtOH/H2O/HCl (v/v/v) es col·loca en una de les ampolles.

- Es crea un mètode amb les condicions de temperatura 80 ºC i el temps d’extracció (10 i 15

min) durant 1 cicle, és a dir sense esgotar el solvent.

- A la part inferior de l’equip es col·loquen tubs de PLE on es recollirà d’extracte.


condicionament.

Figura 8. Material per la col·locació de la mostra en la cel·la de PLE.

Memoria

24

3.2.4 Condicionament dels extractes de polifenols

Un cop finalitzada l’extracció amb les diferents tècniques es condicionen els extractes pel seu posterior

anàlisis amb HPLC. El procediment és el següent:

- Es centrifuguen les mostres durant 5 minuts a 3.500 rpm.

- Els extractes es filtren amb filtres de 0,45 µm i 0,22 µm (Macherey Nagel) en la Figura 9 i es

guarden en vials opacs en nevera a 4ºC per analitzar posteriorment.

Figura 9. Material de filtració: filtres de 0,22 µm i 0.45 µm i xeringa.

3.3 Separació de polifenols amb processos de membranes

Un cop obtinguts els extractes, es realitzen assajos de separació amb tecnologia de membranes amb

les mescles de patrons estàndard que simulen els extractes originals de les mescles d’espinacs i taronja.

En el cas dels espinacs s’utilitza una mescla amb 7 patrons de polifenols que s’anomena E (Taula 4). En

el cas de la taronja, per facilitar el posterior anàlisis amb HPLC, es reparteixen els patrons de polifenols

en dos mescles segons el temps de retenció d’aquests, evitant així solapaments en els pics. Les dos

mescles de la taronja (T) s’anomenen T1 i T2.

Taula 4. Mescla de patrons de polifenols d’espinacs i de taronja a aproximadament 20 ppm

E T1 T2

ac. 4-hidroxibenzoic ac. 4-hidroxibenzoic ac. Cafèic

ac. Vaníl·lic ac. Vaníl·lic ac. p-Cumàric

Rutina Rutina ac. 3,4-dihidroxibenzoic

ac. p-Cumàric Naringenina ac. Ferúlic

ac. 3,4-dihidroxibenzoic ac Siringico Hesperidina

ac. Ferúlic

Hesperidina


25

Per determinar l’eficàcia de la separació amb membranes es calcula el percentatge de rebuig (% R)

amb l’Ec. 1.

%𝑅 =𝐶𝐴 − 𝐶𝑃

𝐶𝐴

Ec. 1

3.3.1 Filtres de microfiltració en format disc

Per realitzar aquesta separació s’utilitza un equip de filtració de vidre que treballa amb el buit que

s’observa en la Figura 10 i consta de 3 parts que es poden separar.

Figura 10. Equip de filtració de vidre.

En la part central de l’equip es col·loca el filtre. S’assegura que l’equip està tancat mitjançant una pinça

que manté les 3 parts unides. A continuació es connecta l’equip a la línia de buit del laboratori i amb

una pipeta automàtica s’aboquen 5 mL de mescla en la part superior de l’equip. Finalment es recupera

el filtrat en l’erlenmeyer i aquest es transfereix a un tub d’assaig de 15 mL per analitzar posteriorment

amb HPLC.

Aquest assaig es duu a terme amb 3 filtres diferents de 0,1, 0,22 i 0,45µm i es repeteix 2 vegades per

filtre i mostra (E, T1 i T2).

3.3.2 Filtració amb centrifugació

Aquest assaig es realitza amb unitats de filtres en tubs Falcon com s’observa en la Figura 11.

S’introdueixen 4 mL de mescla al tub i es tanca. Posteriorment es centrifuga a 2700 rpm fins que tota

la mescla travessa el filtre. Es transfereix el permeat a un tub d’assaig de 15 mL per analitzar

posteriorment amb HPLC.

Memoria

26

Aquest assaig es duu a terme amb 1 tub falcon per mescla (E, T1 i T2) i es repeteix 2 vegades.

Figura 11. Filtre per centrifugadora

3.3.3 Membranes de nanofiltració

S’utilitza un equip que aguanta altes pressions de fins a 10 Pa que es pot observar en la Figura 12.

Figura 12. Equip de filtració per membranes.

El funcionament d’aquest equip consisteix en introduir 3 mL de mescla per la part superior i connectar-

lo a la línia de N2 per obtenir la pressió necessària per a que la mescla travessi la membrana. Es

necessita un vas de precipitats per recollir el permeat que surt per la part inferior de l’aparell.

Aquest assaig es duu a terme amb 4 membranes diferents: Duracid, TFCS, TFC-HR i NF 90. Aquestes

membranes es posen en remull 24 hores amb aigua Milli-Q abans d’utilitzar-les per eliminar impureses

d’aquestes i treballar amb una superfície neta.

Aquest assaig es repeteix 2 vegades per membrana i mostra (T2).

3.4 Anàlisis de polifenols amb HPLC

L’equip d’HPLC utilitzat és un cromatògraf Agilent Series 1100 amb una bomba quarteraria, sistema

d’injecció i una matriu de díodes detectors es pot observar en la Figura 13.


27

Figura 13. Equip d’HPLC

Per l’analisis amb HPLC dels extractes s’ha utilitzat una columna Kinetex C18 (100 mm x 4,6 mm de

diametre i 2,6 m mida de particula). La fase mòbil esta composta per una fase aquosa A, aigua Milli-

Q amb 0,1% d’àcid fòrmic i una fase orgànica B, AcN.

En l’extracció de polifenols el cromatògraf tarda 35 minuts en analitzar utilitzant un flux de 1 mL min-1

i un volum d’injecció de 5 µL. L’HPLC té un sistema de bombeig que utilitza el gradient d’elució mostrat

en la Taula 5.

Taula 5. Gradient de elució

Temps (min) 0 25 27 29 29,2 35

Percentatge de Fase orgànica B 5% 50% 90% 90% 5% 5%

Per determinar la quantitat de polifenols en els extractes cal injectar en HPLC patrons de polifenols a 1

ppm. Mitjançant el temps de retenció d’aquests patrons es detecten els polifenols en els extractes, per

quantificar-los es mesura l’area total que ocupen els pics. La detecció dels pics s’ha dut a terme a

longituds d’ona de 280, 310 i 370 nm en l’espectre UV.

3.5 Anàlisis de sucres amb espectrofotometria UV-VIS

Per analitzar el contingut de sucres en els extractes de polifenols s’ha utilitzat el mètode colorimètric

fenol-sulfúric [30].

El procediment és el següent:

- S’introdueix 1 mL de mostra en un tub d’assaig de 15 mL.

- S’afegeix 1 mL de fenol (5% en volum).

- S’afegeixen 5 mL de àcid sulfúric (95-97%).

Memoria

28

- Es tanquen els tubs d’assaig, s’agiten suaument i es deixen reposar durant 10 minuts.

- Les mostres s’agiten prèviament a introduir-les en un bany d’aigua a 30 ºC durant 20 minuts

como s’observa en la Figura 14.

Figura 14. Mostres de sucres en bany a 30ºC

L’equip utilitzat per l’anàlisi és el Specord 200 Plus 1,4 nm es pot veure en la Figura 15, un

espectrofotòmetre de doble feix on s’especifica la longitud d’ona a la qual es vol mesurar, en aquest

cas la longitud d’ona d’absorció de la glucosa 490 nm. S’introdueix un blanc (1 mL d’H2O, 1 mL de fenol

5% i 5 mL d’H2SO4) en una cubeta, aquest s’utilitza per restar les interferències que pot tenir la matriu

de fenol i H2SO4. En una altra cubeta s’analitzen les mostres una per una, de manera que l’absorbància

del blanc es restarà a la de les mostres per obtenir l’absorbància deguda als sucres.

Figura 15. Espectofotòmetre Specord 200.

Per realitzar aquest anàlisis s’utilitza com a patró la glucosa. Es parteix d’una dissolució mare de 1000

ppm amb la que es realitza una corba de calibrat (500, 200, 150, 100, 50, 10, 25, 5, 2,5 i 1 ppm) que

permet extrapolar els valors d’absorbància dels extractes per obtenir la concentració total de sucres.


29

3.6 Esquema general

En la Figura 16 s’observa un esquema general de la metodologia experimental d’aquest treball.

Figura 16. Esquema general: extracció i separació de polifenols

Memoria

30

4 Resultats

4.1 Extracció de polifenols

4.1.1 Extracció de polifenols amb UAE

La optimització de les condicions de la UAE es basa en les següents condicions experimentals:

percentatge d’etanol (40, 60, i 80%), percentatge d’HCl (0; 0,1; 0,5%) amb un temps d’extracció

constant de 30 minuts prèviament estudiat per Altemimi et al. [31].

En la Taula 6 descriuen els resultats obtinguts amb UAE pels espinacs i la taronja. Es pot veure el valor

mitjà de l’àrea total del cromatograma a 310 nm entre els temps de retenció 2,2 i 17,9 dels patrons.

Taula 6. Resultats extracció amb UAE.

Per tenir una extracció eficient es necessita un solvent adequat on la polaritat del solvent variï segons

la concentració d’alcohol. Els solvents orgànics com el etanol són comunament utilitzats per l’extracció

de polifenols de fruites i verdures i un solvent àcid augmenta l’extracció [6].

En la matriu d’espinacs es pot veure que les condicions on l’eficiència d’extracció augmenta és amb

80/19,9/0,1 (EtOH/H2O/HCl v/v/v) amb una àrea total de polifenols de 692 47.

En la taronja s’observa que les condicions on l’eficiència d’extracció augmenta és amb 60/39,9/0,1

(EtOH/H2O/HCl v/v/v) amb una àrea total de polifenols de 1370 337. Es pot veure que la taronja té

el doble de polifenols totals que els espinacs.

Experiment % EtOH % HCl Àrea de pics (mitja s)

(Espinacs)

Àrea de pics (mitja s)

(Taronja)

1 40

0 596 147 807 104

2 0,1 667 27 100 13

3 0,5 526 255 394 35

4 60

0 404 40 1086 125

5 0,1 404 275 1370 337

6 0,5 486 123 1040 542

7 80

0 317 74 1228 153

8 0,1 692 47 482 99

9 0,5 689 28 941 359


31

En els cromatogrames de la Figura 17 i Figura 18, s’observa que en l’extracte d’espinacs hi ha diversos

polifenols identificats com: l’àcid 4-hidroxibenzoic, l’àcid p-cumàric, l’àcid ferúlic i l’hesperidina. En

l’extracte de la taronja se n’han identificat d’altres com l’àcid siringic i la rutina.

D’acord amb diversos estudis d’extracció de polifenols amb UAE de residus citrics (incluint la taronja)

també van identificar àcid ferúlic, àcid p-cumàric, rutina i àcid 4-hidroxibenzoic [17][32].

Figura 17.Cromatograma d'un extracte (UAE) d'espinacs. 1: àcid 4-Hidroxibenzoic, 2: àcid p-Cumàric, 3:l’àcid Ferúlic i 4:Hesperidina.

Figura 18. Cromatograma d'un extracte (UAE) de taronja. 1: àcid 4-Hidroxibenzoic, 2: àcid Vaníllic, 3: àcid Siríngic, 4: àcid p-

Cumàric, 5: àcid Ferúlic, 6: Rutina, 7: Hesperidina

4.1.2 Extracció de polifenols amb MAE

Segons estudis previs del grup s’ha fixat la composició del solvent en 60/39,9/0,1 (EtOH/H2O/HCl

v/v/v), tot i així s’ha avaluat l’efecte de la temperatura (90 ºC i 120 ºC) amb temps d’extracció de 5 i 15

min.

-10

-5

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30

Ab

sorb

ànci

a (m

AU

/g)

Temps (min)

310 nm

1

2 34

-10

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20 25 30

Ab

sorb

ànci

a (u

AU

/g)

Temps (min)

310 nm

12

34

56

7

Memoria

32

En les Taula 7 i Taula 8 es descriuen els resultats obtinguts amb MAE pels espinacs i la taronja,

respectivament. Es pot veure el valor mitjà de l’àrea total del cromatograma a 310 nm entre els temps

de retenció 2,2 i 17,9 dels patrons. Per determinar el grau de millora d’aquesta tècnica es calcula un

percentatge respecte a UAE.

Taula 7. Resultats extracció de espinacs amb MAE

Taula 8. Resultats extracció de taronja amb MAE

L’extracció de polifenols de mostres d’espinacs durant 5 minuts empitjora a mesura que s’augmenta

la temperatura de 90ºC (780 20) a 120ºC (640 110) això podria ser a causa de la degradació de

components a temperatures altes. Quan s’augmenta el temps d’extracció a 15 min s’observa un

comportament anàleg (630 110 i 560 5 per 90 ºC i 120 ºC, respectivament). L’augment del temps

d’extracció no comporta millores, sinó que provoca una disminució en l’extracció de polifenols,

probablement causada per algun tipus de degradació de la mostra.

Bouras et al. [33] van veure que en l’extracció de polifenols d’escorça d’Alzina es produeix degradació

com més temps i a més temperatura esta exposada la matriu. En el seu estudi conclouen que a 100ºC

i amb un temps d’extracció de 10 min l’extracció de polifenols no disminueix.

En la matriu d’espinacs es pot veure que les condicions on l’extracció de polifenols augmenta és amb

temperatura 90ºC i una extracció durant 5 min obtenint una àrea total de polifenols de 780 20.

D’altra banda, l’extracció de polifenols de mostres de taronja durant 5 min incrementa a mesura que

augmenta la temperatura (4100 160 i 5000 400 per 90ºC i 120ºC, respectivament), no s’observa

Experiment EtOH

(%) Temperatura (ºC)

Temps

(min)

Àrea de pics

(mitja s)

MAE/UAE

(%)

15

60

90 5 780 20 116

16 15 630 110 94

17 120

5 640 110 95

18 15 560 5 84

Experiment EtOH

(%) Temperatura (ºC)

Temps

(min)

Àrea de pics

(mitja s)

MAE/UAE

(%)

15

60

90 5 4100 160 273

16 15 4200 180 279

17 120

5 5000 400 326

18 15 6700 400 440


33

degradació en els compostos polifenolics. Quan s’augmenta el temps d’extracció a 15 min s’observa

un comportament anàleg (4200 180 i 6700 400 per 90ºC i 120ºC, respectivament), però en aquest

cas millora significativament.

Per tant es pot determinar que en la matriu de taronja les millors condicions d’extracció de polifenols

són amb temperatura 120ºC i una extracció durant 15 min obtenint una àrea total de polifenols de

6700 400.

Amb la relació de percentatge entre MAE i UAE es pot veure que la primera és millor ja que dona valors

per sobre del 100% en tots els casos, això por ser degut a que en el bany d’ultrasons l’energia no és

homogènia i això fa que la cavitació no es produeixi correctament, com van determinar Hayat et al.

[17] en residus de pell de mandarina.

Garofulić et al. [34] van estudiar l’extracció de Prunus cerasus amb MAE en un rang de temperatures

de 50 a 70 ºC i temps d’extracció de 5 a 12 min. Van determinar que a temperatura moderada de 60

ºC i temps d’extracció de 9 i 12 min l’extracció de polifenols totals dels extractes era 0.98 ± 0.04 i 1.13

± 0.05 mg/g de mostra respectivament, augmentant el temps d’extracció millorava l’extracció de

polifenols. Anàlogament a una temperatura 70 ºC temps d’extracció de 5 i 12 min l’extracció de

polifenols totals dels extractes era 1.10 ± 0.05 i 1.28 ± 0.06 mg/g de mostra respectivament, de manera

que augmentant la temperatura s’obtenen més polifenols.

En els cromatogrames de la Figura 19 i Figura 20 s’observa que en l’extracte de MAE d’espinacs hi ha

varis polifenols identificats com: la rutina, l’àcid p-cumàric, l’àcid ferúlic i l’hesperidina. En l’extracte de

MAE de taronja n’hi ha d’altres com l’àcid siríngic i l’apigenina.

Figura 19. Cromatograma de l’extracte òptim (MAE) d'espinacs. : 1: àc. p-Cumàric, 2: àc. Ferúlic, 3: Rutina, 4: Hesperidina

-5

0

5

10

15

20

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

sorb

ànci

a (m

AU

)

Temps (min)

310 nm1

2

3

4

Memoria

34

Figura 20. Cromatograma de l’extracte òptim (MAE) de taronja 1: àc. Siríngic, 2: àc. p-Cumàric acid, 3: Hesperidina, 4:

Apigenina.

4.1.3 Extracció de polifenols amb PLE

Segons estudis previs del grup s’ha fixat la temperatura de treball en 80ºC. Les composicions de solvent

estudiades són 40/59,9/0,1 i 60/39,9/0,1 (EtOH/H2O/HCl v/v/v) amb temps d’extracció de 10 i 15 min.

En la Taula 9 i Taula 10 es descriuen els resultats obtinguts amb UAE pels espinacs i la taronja,

respectivament. Es pot veure el valor mitjà de l’àrea total del cromatograma a 310 nm entre els temps

de retenció 2,2 i 17,9 dels patrons. També s’observa el %PLE/UAE, agafant UAE de referència per saber

quina relació hi ha entre les dos tècniques i poder determinar quina és millor.

Taula 9. Resultats extracció de espinacs amb PLE

Experiment EtOH

(%) Temperatura (ºC) Àrea de pics (mitja s)

PLE/UAE

(%)

1 40 80

3600 400 123

4 60 3600 300 121

Taula 10. Resultats extracció de taronja amb PLE

Experiment EtOH (%) Temperatura (ºC) Àrea de pics (mitja s) PLE/UAE

(%)

1 40 80

8000 400 471

4 60 11500 200 676

Com es pot veure en la Taula 9, l’extracció d’espinacs es manté constant amb l’augment del

percentatge d’etanol de 40 a 60% amb valors de 3600 400 i 3600 300, respectivament. En canvi

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25

Ab

sorb

ànci

a (m

AU

)

Temps (min)

310 nm

1 2

3 4


35

l’extracció de taronja com es pot veure en la Taula 10 millora amb l’augment del percentatge d’etanol

de 40 a 60% amb valors de 8000 400 i 11500 200, respectivament.

En la Figura 21 i Figura 22 s’observen els resultats d’extracció en funció del temps d’extracció.

Es pot determinar que en el cas de taronja, tenint en l’extracció durant 15 min s’obté una àrea de 8298

mUA més gran que en l’extracció durant 10 min on s’obté una àrea de 7739 mUA, per tant el temps

d’extracció òptim en aquesta matriu és 15 min. En la matriu d’espinacs el temps d’extracció òptim és

10 min ja que s’obté més quantitat de polifenols 3379 mUA que en l’extracció a 15 min.

Figura 21. Resultats temps d'extracció amb PLE de taronja (T)

Figura 22. Resultats temps d'extracció amb PLE d’espinacs

E. Vázquez et al. [35] van realitzar extracció d’espinacs amb PLE utilitzant com a solvent hexà a dues

temperatures diferents 100 i 150 ºC i un temps d’extracció de 10 min. Van concloure que a 100ºC

s’obtenia un percentatge d’extracció més baix 4,26% que 7.16% a 150ºC.

7200

7400

7600

7800

8000

8200

8400

8600

10 15

Àre

a cr

om

ato

gram

a (m

UA

)

Temps (min)

3200

3250

3300

3350

3400

3450

10 15

Àre

a cr

om

ato

gram

a (m

UA

)

Temps (min)

Memoria

36

Lozano et al. [21] van estudiar l’extracció de residus d’oli d’oliva amb PLE utilitzant com a solvent

EtOH:H2O amb un rang de temperatures de 40 a 175 ºC. La millor extracció va ser amb condicions de

EtOH:H2O (50:50 v/v) i a temperatura de 120 ºC.

Machado et al. [36] van realitzar l’extracció de residus de Rubus fruticosus L. amb PLE utilitzant com a

solvent EtOH: H2O (50:50 v/v) a temperatures de 60, 80 i 100 ºC amb un temps d’extracció de 30 min.

Van determinar que les millors condicions d’extracció eren 100 ºC amb un percentatge d’extracció de

6,33%.

4.1.4 Comparació de les tècniques d’extracció de polifenols

Per proposar una metodologia eficient per l’extracció de polifenols de residus agroalimentaris, es

comparen les tres tècniques UAE, MAE i PLE. La Taula 11 exposa les condicions òptimes d’extracció de

cada tècnica segons la matriu.

Taula 11. Condicions optimes d'extracció de polifenols amb UAE, MAE i PLE

Matriu Tècnica Condicions òptimes

Espinacs

UAE EtOH/H2O/HCl 80/19,9/0,1 (v/v/v) i 30 min

MAE EtOH/H2O/HCl 60/39,9/0,1 (v/v/v), 90ºC i 5 min

PLE EtOH/H2O/HCl 40/59,9/0,1 (v/v/v), 80ºC i 10 min

Taronja

UAE EtOH/H2O/HCl 60/39,9/0,1 (v/v/v) i 30 min

MAE EtOH/H2O/HCl 60/39,9/0,1 (v/v/v), 120ºC i 15 min

PLE EtOH/H2O/HCl 60/39,9/0,1 (v/v/v), 80ºC i 15 min

En els espinacs el percentatge de solvent i el temps d’extracció òptims varien segons la tècnica

utilitzada, i les temperatures optimes són més baixes que en el cas de la taronja (80 i 90 ªC). En la

taronja la relació EtOH/H2O/HCl és la mateixa per totes les tècniques i el millor temps d’extracció és 15

min, i las temperatures optimes són més altes que en el cas dels espinacs (80 i 120 ºC).

Per la matriu d’espinacs en la Figura 23 no s’observen grans diferències entre els resultats de les

diferents tècniques, PLE és la tècnica on s’obtenen més polifenols però tenint en compte que la tècnica

més simple és UAE, aquesta seria la tècnica més apropiada. UAE és una tècnica innovadora per

l’extracció de residus d’espinacs, ja que redueix la quantitat de solvent en comparació amb tècniques

convencionals i també disminueix el temps d’extracció, això fa que sigui una alternativa amb un cost

baix, baix consum energètic i un impacte ambiental baix [31] en comparació a la tècnica de PLE.


37

Figura 23. Extracció de polifenols en espinacs amb UAE, MAE i PLE

Per la matriu de taronja en la Figura 24 s’observa que la tècnica més eficient per l’extracció de

polifenols és PLE seguida de MAE. Contràriament Nayak et al. [34] han determinat que per l’extracció

de polifenols de pell de taronja la millor tècnica es MAE però el solvent utilitzat és acetona i no etanol.

Figura 24. Extracció de polifenols en taronja amb UAE, MAE i PLE

4.2 Contingut de sucres dels extractes

S’analitza el contingut de sucres en els extractes amb condicions optimes d’extracció para les espinacs

(E) i la taronja (T) i s’obtenen els resultats que s’observen en la Figura 25.

0

1000

2000

3000

4000

5000

UAE MAE PLE

Ch

rom

ato

gram

are

a (m

UA

)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

UAE MAE PLE

Ch

rom

ato

gram

are

a (m

AU

)

Memoria

38

Figura 25. Resultats contingut de sucres en E i T amb les condicions òptimes d'extracció estudiades.

S’observa que en MAE i PLE la taronja té 6269 mg/L i 6284 mg/L de sucres, respectivament, més sucres

que els espinacs que tenen 607 mg/L i 555 mg/L i en UAE totes dues matrius tenen al voltant de 4000

mg/L. En la taronja les tècniques d’extracció de polifenols en les que els extractes tenen més sucres

són PLE i MAE per igual amb concentracions d’aproximadament 6200 ppm en canvi amb UAE el

contingut de sucres en l'extracte es veu reduït casi a la meitat 3965 ppm. En els espinacs passa el

contrari que amb la taronja, la tècnica d'extracció de polifenols amb més contingut de sucres és UAE

amb una concentració de 4163 ppm seguit molt per sota per 607 ppm a MAE i 555 ppm a PLE.

4.3 Separació de polifenols amb processos de membranes

S’han realitzat tres assajos diferents i en tots ells es fixa un objectiu de rebuig del 70%, és a dir que el

70% no travessa la membrana i queda concentrat.

4.3.1 Filtres de microfiltració en format disc

En la Figura 26 s’exposen els resultats de la separació de polifenols de espinacs amb filtres de

microfiltració en format dic de mesures de 0,1, 0,22 i 0,45 µm.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

UAE MAE PLE

Co

nce

ntr

ació

(m

g/L)

E

T


39

Figura 26. Resultats de la separació de polifenols de la mescla E amb filtres de 0,1, 0,22 i 0,45 µm.

En la mescla d’espinacs s’observa que amb els tres filtres els polifenols es retenen en la membrana

aproximadament amb el mateix percentatge de rebuig. Es pot veure que en els filtres de 0,1 i 0,22 µm

els que més es rebutgen són l’àcid p-cumàric i l’hesperidina amb percentatges 96,7/96,9% i 71,4/73,5

% respectivament. En el cas del filtre de 0,45 µm els que més es rebutgen són l’àcid p-cumàric i l’àcid

ferúlic amb percentatges de rebuig de 96,1 i 73,1 %.

L’àcid 4-hidroxibenzoic es rebutja amb percentatges baixos entre 10 i 15%, també és el cas de l’àcid

vaníl·lic amb percentatges entre 20 i 25%, la rutina no es rebutja.

En la Figura 27 s’exposen els resultats de la separació de polifenols de la taronja amb filtres de

microfiltració en format disc de mesures de 0,1, 0,22 i 0,45µm.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% R

eb

uig

Polifenols

0,1

0,22

0,45

Memoria

40

Figura 27. Resultats de la separació de polifenols de la mescla T amb filtres de 0,1, 0,22 i 0,45 µm

En la mescla de taronja s’observa que el percentatge de rebuig segons el filtre és més variable que en

la mescla de taronja. Es pot veure que en els filtres de 0,1 i 0,45 µm es rebutja majoritàriament l’àcid

ferúlic amb un 70,7 i 70.3%, respectivament; mentre que en el cas del filtre de 0,22µm es rebutja la

naringenina amb un 70,3%. Com en el cas de la taronja hi ha polifenols que es rebutgen en

percentatges per sota del 70%, és el cas de l’àcid vaníl·lic, l’àcid siríngic, l’àcid cafèic, l’àcid p-cumàric,

l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic i l’hesperidina amb percentatges entre el 40 i 60% també amb percentatges

per sota del 10% hi ha l’àcid 4-hidroxibenzoic i la rutina, aquest últim polifenol no es rebutja.

Si s’observen les dues mescles conjuntament es pot determinar que tot i tenir en la mescla d’espinacs

els mateixos polifenols que en la mescla de la taronja en aquesta ultima hi ha tres polifenols més

(naringenina, àcid siríngic i àcid cafèic), característics d’aquesta matriu. Aquest fet determina un canvi

en el comportament general dels polifenols amb els filtres i s’observa que els polifenols que mantenen

el comportament en totes dues mescles, són l’àcid ferúlic amb un percentatge de rebuig més del 70%

i amb percentatges per sota de l’objectiu de rebuig (70%) l’àcid 4-hidroxibenzoic al voltant del 10%,

l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic al voltant del 50%, la rutina amb un 0%.

Això pot estar determinat pels pesos moleculars d’aquests polifenols que s’observen a la Taula 12 i

l’efecte estèric que es dona quan el volum ocupat per part d’una molècula impedeix que una altra part

de la mateixa reaccioni. Per exemple, la rutina és un dels polifenols que té un pes molecular (PM) alt

de 610,52 g/mol, en comparació amb els altres PM que estan compresos entre 130 i 300 g/mol

exceptuant l’hesperidina, que té un pes molecular de 610,56 g/mol molt semblant al de la rutina i

coincideix que en les mescles l’hesperidina està en una concentració tres vegades més alta que la

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% R

eb

uig

Polifenols

0,1

0,22

0,45


41

rutina, per tant la rutina travessa la membrana i està en el permeat (100%) i l’hesperidina també

permea amb valors entre 30 i 50% depenent del filtre, un percentatge més baix a causa d’aquesta

competència entre els dos.

Taula 12. Pes molecular dels polifenols

Nom PM (g/mol) Fórmula

àc. 4-hidroxibenzoic 138,12 C7H6O3

àc. 3,4-dihidroxibenzoic 154,12 C7H6O4

àc. p-cumàric 164,16 C9H8O3

àc. vaníl·lic 168,15 C8H8O4

àc. cafèic 180,16 C9H8O4

àc. ferúlic 194,18 C10H10O4

àc siríngic 198,17 C9H10O5

naringenina 272,25 C15H12O5

rutina 610,52 C27H30O16

hesperidina 610,56 C28H34O15

Valorant tots els resultats es determina que el filtre de microfiltració que compleix millor les

expectatives en les dos matrius és el filtre de 0,45 µm, en la Figura 28 es descriu el de la mescla

d’espinacs i de taronja amb aquest filtre.

Figura 28. Diagrama del filtre de microfiltració de 0,45 amb valors de rebuig i permeat en les mescles E i T.

Observant el diagrama es determina que en el cas de la mescla d’espinacs els polifenols que

compleixen l’objectiu de rebuig (> 70%) són l’àcid p-cumàric (96%) i l’àcid ferúlic (73%). D’altra banda,

amb valors d’entre el 70 i el 100% de permeat es troben l’àcid vaníl·lic, l’àcid 4-hidroxibenzoic i la rutina,

i amb valors per sota del 50% de permeat com l’àcid 3,4 dihidroxibenzoic i l’hesperidina.

Memoria

42

En el cas de la mescla de taronja el polifenol que compleix l’objectiu de rebuig és l’àcid ferúlic (70%)

tots els altres travessen la membrana i s’obtenen percentatges de permeat del 100% en els casos de

l’àcid 4-hidroxibenzoic i la rutina. Els polifenols amb valors de permeat entre el 50 i el 65% són l’àcid

cafèic, l’àcid siríngic i l’àcid vaníl·lic. I els polifenols restants tenen percentatges per sota del 50% de

permeat i són l’àcid 3,4- dihidroxibenzoic, l’àcid p-cumàric, la naringenina i l’hesperidina.

Per tant el filtre de 0,45µm es pot utilitzar per separar l’àcid ferúlic dels altres polifenols per la mescla

de taronja, metre que en el cas de la mescla d’espinacs es pot utilitzar per separar l’àcid ferúlic i l’àcid

p-cumàric dels altres polifenols.

Nawaz et al. [37] van optimitzar l’extracció de llavors de raïm amb membranes Millipore type GS 0,22

µm i Millipore Type HA 0,45 µm. Van veure que amb la membrana de 0,22 µm s’obtenien millors

resultats que amb la membrana de 0,45 µm ja que la membrana amb mida de porus més petita

rebutjava més partícules i soluts que no interessava recuperar. Amb la membrana de 0,22 µm van

recuperar un 11,4% de polifenols del total del pes de les llavors de raïm.

4.3.2 Filtres per centrifugació

En la Figura 29 s’exposen els resultats de la separació de polifenols de les matrius d’espinacs i taronja

amb filtres per centrifuga.

Figura 29. Diagrama filtre per centrifuga amb valors de rebuig i permeat en les mescles E i T.

Observant el diagrama en el cas de la mescla d’espinacs s’obté un percentatge de rebuig d’àcid ferúlic

(79,0%) que compleix amb l’objectiu de l’assaig. En el permeat queden polifenols amb percentatges de

73,7 i 84,4% com l’àcid vaníl·lic i l’àcid 4- hidroxibenzoic, respectivament. Amb un percentatge de

permeat del 62,2% s’obté la rutina. La resta de polifenols s’obtenen amb percentatges de permeat per

sota de 50% com es el cas de l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic, l’àcid p-cumàric i l’hesperidina.

Observant el diagrama en el cas de la mescla de taronja els polifenols que compleixen l’objectiu de

rebuig són l’acid ferúlic (75,2%) i l’àcid vaníl·lic (72,9%). Tots els altres polifenols, travessen la

membrana i s’obté un percentatge de permeat del 100% en el cas de l’àcid siríngic, a continuació amb

aproximadament un 91,5% la rutina. Els polifenols que tenen percentatges de permeat entre el 50 i el


43

65% són l’àcid cafèic, l’hesperidina i l’àcid 4-hidroxibenzoic. I amb valors de permeat per sota del 50%

hi ha l’àcid 3,4- dihidroxibenzoic, l’àcid p-cumàric i la naringenina.

Aquest tipus de filtre per centrifugació són bons candidats per separar l’àcid ferúlic dels altres

polifenols en el cas de la mescla de espinacs, però en el cas de la mescla de la taronja aquest polifenol

estaria amb combinació de l’àcid vaníl·lic.

4.3.3 Membranes de nanofiltració

Aquest assaig es realitza únicament amb la mescla de taronja, concretament T2, que es la mescla que

conté l’àcid ferúlic (polifenol que en els altres dos assajos s’ha aconseguit separar) amb quatre

polifenols (àcid cafèic, àcid p-cumàric, àcid 3,4-dihidrocibenzoic i hesperidina).

A continuació s’exposen diagrames de les diferents membranes (Duracid, TFCS, TF-HR i NF 90) per

determinar el rebuig i el permeat de cadascuna d’elles. Em la Taula 13 s’observen les característiques

de les membranes utilitzades.

Taula 13. Característiques de les membranes

Membrana Duracid TFCS TF-HR NF 90

Tipus TFC poliamida TFC poliamida TFC poliamida TFC poliamida

Màxima

temperatura

45 ºC 45 ºC 45 ºC 45 ºC

Màxima pressió 4137 kPa 2410 kPa 4140 kPa 4100 kPa

MWCO 150-200 Da 200 Da 200 Da 200-400 Da

En la Figura 30 es descriu el diagrama de la membrana Duracid. En aquesta membrana el

comportament de la mescla de taronja segueix el patró anterior, en el rebuig amb lleugerament més

del 70% queda l’àcid ferúlic i tots els altres polifenols es troben en el corrent del permeat amb

percentatges d’entre el 40 i el 60%.

Figura 30. Diagrama membrana Duracid amb valors de rebuig i permeat en la mescla T2

Memoria

44

En la Figura 31 es descriu el diagrama de la membrana TFCS. En aquesta membrana el comportament

de la mescla de taronja es anàleg al de la membrana Duracid però en el rebuig queda l’àcid ferúlic un

80,5% bastant més per sobre que en la anterior membrana i tots els altres polifenols es troben en el

corrent del permeat amb percentatges d’aproximadament el 40%.

Figura 31. Diagrama membrana TFCS amb valors de rebuig i permeat en la mescla T2

En la Figura 32 es descriu el diagrama de la membrana TF-HR. En aquesta membrana el comportament

de la mescla de taronja molt diferent al de les anteriors membranes (Duracid i TFCS), en el rebuig

queden la majoria dels polifenols amb percentatges de rebuig del 92% para el cas de l’àcid ferúlic, 83%

para l’hesperidina i lleugerament per sobre del 70% com es el cas de l’àcid cafèic i l’àcid p-cumàric. En

el corrent del permeat queda separat l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic amb un 38,5%. Aquest tipus de

membrana és bona candidata per separar l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic dels altres polifenols.

Figura 32. Diagrama membrana TF-HR amb valors de rebuig i permeat en la mescla T2

En la Figura 33 es descriu el diagrama de la membrana NF-90. En aquesta membrana el comportament

de la mescla de taronja es semblant al de les membranes Duracid i TFCS però en el rebuig queden

separats l’àcid ferúlic amb un 82,8% i a diferència de les altres membranes també és rebutja

l’hesperidina amb un 77,0%. En el corrent del permeat queden la resta de polifenols amb percentatges

de permeat d’aproximadament el 40%.


45

Figura 33. Diagrama membrana NF-90 amb valors de rebuig i permeat en la mescla T2

Es determina que per la separació total de l’àcid ferúlic dels altres polifenols la membrana TFCS és la

òptima ja que obté un percentatge de rebuig (80,5%) més alt que la membrana Duracid (72,2%). Aquest

polifenol es trobaria en la corrent de rebuig.

Per la separació total de l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic la membrana optima és la TF-HR ja que aquest

queda separat en el corrent del permeat (38,5%).

També es possible separar l’hesperidina (77,0%) i l’àcid ferúlic (82,8%) dels altres polifenols en el

corrent del rebuig amb la membrana NF-90. Si es volgués separar aquests dos polifenols s’hauria de

passar la mescla obtinguda per una altra tipus de membrana fins aconseguir tenir-los separats.

Lopez-Muñoz et al. [28], van avaluar el rebuig de polifenols en membranes NF 90 i TFC-HR. El rebuig

de polifenols (fenol, hidroquinona, catecol i resorcinol) de la membrana NF 90 va ser més baix (al

voltant de 30 i 40%) comparat amb el rebuig de la membrana TFC-HR (75% fenol i 85% polifenols).

Aquest fet es va atribuir a que la membrana NF 90 era més hidròfuga que la TFC-HR i això contribuïa a

l’absorció de la mostra en la membrana.

Cassano et al. [38], van recuperar polifenols de residus de l’oli d’oliva en el permeat amb processos de

UF. Amb un segon pas amb membranes de NF (NF 90) van aconseguir un corrent de rebuig amb més

de 85 mg/L de polifenols amb PM baixos i un permeat esgotat de polifenols.

Mello et al. [39], en el tractament de extractes de pròpolis aquosos i amb etanol van utilitzar la

membrana NF 90. El rebuig d’àcid cafèic i àcid ferúlic en la fase aquosa (89% i 100%, respectivament)

va ser més alt que el rebuig mesurat en l’extracte amb etanol (75% i 88%).

Memoria

46

5 Anàlisi de l’impacte ambiental

Donat el contingut ambiental del projecte centrat en la potencial valorització i recuperació de recursos

de residus d’origen agro-alimentari, un estudi del impacte ambiental del procés no es possible en

aquest moment. Aquest estudi nomes ha cobert la avaluació de la etapa d’extracció i de la potencial

separació de polifenols. Per tant, aquest capítol es centra en l’anàlisi dels residus generats en la

realització de la part experimental del projecte.

5.1 Residus experimentals

En aquest projecte s’han generat principalment residus sòlids. Per dur a terme la part experimental

s’han general residus com: guants, puntes de pipetes, xeringues, filtres per xeringues, membranes,

filtres disc, tot aquest material és d’un sol ús i per tant són residus inevitables per a dur a terme la

investigació, tots ells s’aboquen al bidó de sòlids absorbents contaminants.

Pel que fa als residus líquids, la única part en la que se n’han generat ha sigut en l’anàlisi de sucres dels

extractes. Aquests residus contenen una mescla de H2SO4 i fenol que caldrà tractar diluint, neutralitzant

la mescla i abocant-la en el bidó d’àcids i solucions àcides.

Durant la realització dels experiments d'aquest treball ha estat comú usar materials d'un sol ús, com

les xeringues, filtres o puntes de pipeta, a l'hora de preparar les mostres per a la seva posterior anàlisi

en cromatografia líquida o per espectrofotometria d’absorció molecular. A pesar que en els laboratoris

presents en el Departament d'Enginyeria Química al Campus del Besos de la EEBE (UPC) o del

Departament de Química Analítica de la Universitat de Barcelona (UB) es fomenti sempre que es pugui

la reutilització d'alguns materials, com són les ampolles de plàstic, no obstant això en els materials

prèviament vists esmentats no ha estat possible.


47

6 Conclusions

S’ha determinat que per l’extracció de polifenols de residus d’espinacs la tècnica recomanada a utilitzar

és l’extracció assistida amb ultrasons obtenint una àrea total de polifenols de 2972 mUA amb

condicions de EtOH/H2O/HCl de 80/19,9/0,1 (v/v/v) i extracció durant 30 min a temperatura ambient

(25ºC). Per l’extracció de polifenols de residus de taronja la tècnica més eficient és l’extracció amb

líquid pressuritzat obtenint una àrea total de polifenols de 11472 mUA amb condicions de

EtOH/H2O/HCl de 40/59,9/0,1 (v/v/v) a 80ºC durant un temps d’extracció de 10 min.

El contingut de sucres en els extractes de taronja és molt alt amb valors de 3965, 6269, 6285 mg/L per

UAE, MAE i PLE, respectivament, comparat amb la quantitat de sucres en els extractes d’espinacs 4163,

608 i 555 mg/L per UAE, MAE i PLE. El contingut de sucres varia segons la tècnica d’extracció utilitzada.

La separació de polifenols amb membranes ha estat satisfactòria però complexa ja que el

comportament dels polifenols amb cada membrana ha estat diferent. S’ha separat de l’àcid ferúlic

utilitzant un filtre de microfiltració en format disc de 0,45 µm i filtres amb centrifugació obtenint valors

de rebuig bons entre el 70% i el 80% (en les mescles d’espinacs i taronja), però la millor separació s’ha

obtingut amb un 81% de rebuig en la membrana TFCS (amb la mescla de taronja). A més, amb la mescla

de taronja, s’ha aconseguit separar en el corrent del permeat l’àcid 3,4-dihidroxibenzoic mitjançant la

membrana TF-HR amb un 39%. També es possible separar l’hesperidina i l’àcid ferúlic dels altres

polifenols en el corrent de rebuig de la membrana NF-90 amb percentatges de 77% i 83%,

respectivament.

Aquest estudi de la separació de polifenols dut a terme amb mescles sintètiques obre camí per a

accions futures en l’aplicació de membranes amb extractes reals de taronja i espinacs gràcies als bons

resultats obtinguts.

Memoria

48

7 Anàlisi Econòmica

En aquest apartat s’inclou el pressupost desglossat i es divideix en 3 seccions: cost experimental, cost

de personal i cost total.

7.1 Cost experimental

En aquesta secció s’exposen els costos associats a la part experimental com el cost dels equips,

materials i reactius.

En la Taula 14 el cost dels equips utilitzats aquest depèn del cost inicial de l’equip, el temps d’us i la

vida útil per calcular l’amortització dels equips.

Taula 14. Costos d'equips

Equip Cost Equip (€) Temps d’us (anys) Vida útil (anys) Cost €

Ultrasons 815 0,25 10 20,4

Microones 31.000 0,25 15 516,7

Equip PLE 24.000 0,25 10 600,0

HPLC 49.600 0,33 10 1636,8

Espectrofotòmetre UV-VIS 8.400 0,125 10 105,0

Equip Filtració 200 0,125 5 5,0

Balança analítica 376 0,25 10 9,4

Total 2893,2

Per saber el cost dels reactius serà necessari saber la quantitat utilitzada en els experiments i el preu

de cadascun d’ells i s’exposa en la Taula 15.

Taula 15. Cost reactius [40][41][42]

Reactiu Quantitat Preu Cost (€)

EtOH 1,6 L 34,4 €/L 55

Aigua Milli-Q 1,3 L 1 €/L 1,3

HCl 0,005 L 22,98 €/L 0,1

Terra Diatomea 0,025 Kg 59,9 €/Kg 1,5

H2SO4 0,2 L 31,02 €/L 6,2

Fenol 0,005 Kg 76,5 €/Kg 0,4

Glucosa 0,0002 Kg 62,72 €/Kg 0,01


49

Total 64,6

El cost del material de laboratori s’exposa en la Taula 16 i a continuació el cost de les mostres en la

Taula 17.

Taula 16. Cost material de laboratori [42]

Material Unitats (u) Preu (€/u) Cost (€)

Falcon 15 mL 18 0,34 6,20

Falcon 50 mL 18 0,34 6,06

Matràs aforat 50 mL 3 20,65 61,95

Matràs aforat 100 mL

2 23,05 46,10

Matràs aforat 10 mL 6 14,55 87,30

Tubs 15 mL 58 0,19 11,02

Pipeta de vidre

25mL

1 13,59 13,59

Pipeta de vidre 20mL

1 8,81 8,81

Pipeta de vidre 5mL 1 7,58 7,58



Vas precipitats 50mL

1 4,70 4,70

Vas precipitats 500mL

2 7,7 15,40

Vas precipitats 1L 1 12,1 12,10

Vial 2 mL 100 0,0998 9,98

Puntes de pipeta 50 0,05 2,50

Xeringa 10mL 50 0,40 19,95

Filtre xeringa 0,22 µm 100 0,57 57,43

Filtre xeringa 0,45 µm 100 1,54 154,00

Total 535,41

Taula 17. Cost mostres [43]

Mostres Quantitat (Kg) Preu (€/Kg) Cost (€)

Taronja 2 1 2

Espinacs 2 1,2 2,4

Total 4,4

Memoria

50

Per realitzar els assajos de separació s’han generat uns costos de membranes exposats en la Taula 18.

Taula 18. Costos membranes [42]

Membranes Proveïdor Unitats (u) Preu (€/u) Cost (€)

Filtre de microfiltració en

format disc 0,1 µm

Sartorius Stedim Biotech

6 1,33 7,98


format disc 0,22 µm Filter Lab 6 1,62 9,72


format disc 0,45 µm

Sartorius Stedim Biotech

6 1,90 11,40

Filtre amb centrifugació

Merck Millipore 3 13,11 29,18

DURACID GE 1 131,35 (5 u) 26,27

TFCS KMS - Fluid Systems 1 150,00 (5 u) 30,00

TF-HR KMS - Fluid Systems 1 150,00 (5 u) 30,00

NF90 Dow-Filmtec 1 131,45 (5 u) 26,27

Total 170,82

7.2 Cost de personal

Per calcular el cost de personal (P), es té en compte el salari brut anual (SBA) i el cost de la seguretat

social (SS). Aquests costs es calculen amb la Ec. 2.

𝐶𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑜𝑛𝑎𝑙 (€) = 𝑃 (ℎ · 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑜𝑛𝑎) ·𝑆𝐵𝐴 + 𝑆𝑆 (

€𝑝𝑒𝑟𝑠𝑜𝑛𝑎 · 𝑎𝑛𝑦)

(ℎ

𝑎𝑛𝑦)

Ec. 2

El XVI Acord General de la Industria Química [44] defineix 8 grups professionals. Les responsabilitats

associades als grups pertanyents a aquest projecte es descriuen a continuació.

Grup professional nº 5: requerit per coordinar i supervisar l'execució de diverses tasques. Inclou

tasques que no involucren ordres, sinó que també tenen un contingut intermedi d'activitat intel·lectual

i relacions humanes. Exemple: responsable o autor del projecte Taula 19.

Grup professional nº 7: inclou funcions que involucren activitats complexes amb un alt grau

d'exigència, autonomia i responsabilitat. Direcció d'un conjunt de funcions que requereixen

coneixements tècnics o professionals especialitzats. Exemple: director del projecte Taula 20.


51

Taula 19. Cost Autor

Autora Quantitat (h) Sou (€/h) Sou (€) Cost (SS) Cost (€)

Cerca i lectura bibliogràfica

50 11,52 576 3317,76 3893,76

Experimentació en laboratori

390 11,52 4492,8 3317,76 7810,56

Resultats 80 11,52 921,6 3317,76 4239,36

Redacció memòria

80 11,52 921,6 3317,76 4239,36

Total 10229,76

Taula 20. Cost Direcció

Directores Quantitat (h) Sou (€/h) Sou (€) Cost (SS) Cost (€)

Direcció projecte 80 16,38 1310,4 262,08 1736,28

7.3 Cost total

En aquest apartat es resumeixen en la Taula 21 el cost experimental i el cost del personal. Finalment el

cost total del projecte és de 15634,46€.

Taula 21. Cost Total

Cost total Tipus Cost (€)

Cost experimental

Cost equips 2893,24

Cost reactius 64,55

Cost material 535,41

Cost mostres 4,40

Cost membranes 170,82

Subtotal 3668,42

Cost personal Cost Autora 10229,76

Cost Directores 1736,28

Subtotal 11966,04

Total 15634,46


53

Bibliografia

[1] S. Quideau, D. Deffieux, C. Douat-casassus, and L. Pouysøgu, “Natural Products Plant Polyphenols : Chemical Properties , Biological Activities , and Synthesis ** Angewandte,” pp. 586–621, 2011.

[2] H. N. Siti, Y. Kamisah, and J. Kamsiah, “The role of oxidative stress , antioxidants and vascular in fl ammation in cardiovascular disease ( a review ),” Vascul. Pharmacol., vol. 71, pp. 40–56, 2015.

[3] A. Cassano, G. De Luca, C. Conidi, and E. Drioli, “Effect of polyphenols-membrane interactions on the performance of membrane-based processes. A review,” Coord. Chem. Rev., vol. 351, pp. 45–75, 2017.

[4] C. Parage et al., “Structural, Functional, and Evolutionary Analysis of the Unusually Large Stilbene Synthase Gene Family in Grapevine,” Plant Physiol., vol. 160, no. 3, pp. 1407–1419, 2012.

[5] C. W. I. Haminiuk, G. M. Maciel, M. S. V. Plata-Oviedo, and R. M. Peralta, “Phenolic compounds in fruits - an overview,” Int. J. Food Sci. Technol., vol. 47, no. 10, pp. 2023–2044, 2012.

[6] X. U. Cong-cong, W. Bing, P. U. Yi-qiong, T. A. O. Jian-sheng, and Z. Tong, “Advances in extraction and analysis of phenolic compounds from plant materials,” Chin. J. Nat. Med., vol. 15, no. 10, pp. 721–731, 2017.

[7] F. Chemat and M. K. Khan, “Ultrasonics Sonochemistry Applications of ultrasound in food technology : Processing , preservation and extraction,” Ultrason. - Sonochemistry, vol. 18, no. 4, pp. 813–835, 2011.

[8] M. N. Safdar, T. Kausar, and M. Nadeem, “Comparison of ultrasound and maceration techniques for the extraction of polyphenols from the mango peel,” 2017.

[9] M. N. Safdar, T. Kausar, S. Jabbar, A. Mumtaz, K. Ahad, and A. A. Saddozai, “ScienceDirect Extraction and quantification of polyphenols from kinnow ( Citrus reticulate L .) peel using ultrasound and maceration techniques,” J. Food Drug Anal., vol. 25, no. 3, pp. 488–500, 2016.

[10] Y. Qun, L. Chuan, D. Zhenhua, L. Bing, D. Weiwen, and S. Feifei, “Ultrasonic microwave-assisted extraction of polyphenols, flavonoids, triterpenoids, and vitamin C from Clinacanthus nutans ,” Czech J. Food Sci., vol. 35, no. No. 1, pp. 89–94, 2017.

[11] A. Ghasemzadeh, H. Z. E. Jaafar, A. S. Juraimi, and A. Tayebi-Meigooni, “Comparative evaluation of different extraction techniques and solvents for the assay of phytochemicals and antioxidant activity of hashemi rice bran,” Molecules, vol. 20, no. 6, pp. 10822–10838, 2015.

[12] P. Panja, “Green extraction methods of food polyphenols from vegetable materials,” Curr. Opin. Food Sci., vol. 23, pp. 173–182, 2017.

[13] Z. Rafiee, M. Aalami, N. Resources, M. Khomeiri, and N. Resources, “Microwave-assisted

Memoria

54

extraction of phenolic compounds from olive leaves ; a comparison with maceration,” no. April, 2011.

[14] T. S. Ballard, “Optimizing microwave-assisted extraction of phenolic antioxidants from red delicious and jonathan apple pomace,” vol. 38, pp. 571–582, 2015.

[15] B. Hiranvarachat, S. Devahastin, and S. Soponronnarit, “Original article Comparative evaluation of atmospheric and vacuum microwave- assisted extraction of bioactive compounds from fresh and dried Centella asiatica L . leaves,” no. 2008, pp. 750–757, 2015.

[16] F. Dahmoune, L. Boulekbache, K. Moussi, O. Aoun, and G. Spigno, “Valorization of Citrus limon residues for the recovery of antioxidants : Evaluation and optimization of microwave and ultrasound application to solvent extraction,” Ind. Crop. Prod., vol. 50, pp. 77–87, 2013.

[17] K. Hayat, X. Zhang, H. Chen, S. Xia, C. Jia, and F. Zhong, “Liberation and separation of phenolic compounds from citrus mandarin peels by microwave heating and its effect on antioxidant activity,” Sep. Purif. Technol., vol. 73, no. 3, pp. 371–376, 2010.

[18] P. Sebatian, K. Nenas, and G. Mikro, “Microwave-assisted extraction of phenolic compound from pineapple skins : the optimum operating condition and comparison with soxhlet extraction,” vol. 21, no. 3, pp. 690–699, 2017.

[19] N. P. Kelly, A. L. Kelly, and J. A. O’Mahony, “Strategies for enrichment and purification of polyphenols from fruit-based materials,” Trends Food Sci. Technol., vol. 83, no. November 2018, pp. 248–258, 2019.

[20] H. Wijngaard and N. Brunton, “The optimization of extraction of antioxidants from apple pomace by pressurized liquids,” J. Agric. Food Chem., vol. 57, no. 22, pp. 10625–10631, 2009.

[21] J. Lozano-Sánchez, M. Castro-Puyana, J. A. Mendiola, A. Segura-Carretero, A. Cifuentes, and E. Ibáñez, “Recovering bioactive compounds from olive oil filter cake by advanced extraction techniques,” Int. J. Mol. Sci., vol. 15, no. 9, pp. 16270–16283, 2014.

[22] E. Conde, B. D. Reinoso, M. J. González-Muñoz, A. Moure, H. Domínguez, and J. C. Parajó, “Recovery and Concentration of Antioxidants from Industrial Effluents and from Processing Streams of Underutilized Vegetal Biomass,” Food Public Heal., vol. 3, no. 2, pp. 69–91, 2013.

[23] L. Bazinet and A. Doyen, “Antioxidants, mechanisms, and recovery by membrane processes,” Crit. Rev. Food Sci. Nutr., vol. 57, no. 4, pp. 677–700, 2017.

[24] A. F. Ismail, M. Padaki, N. Hilal, T. Matsuura, and W. J. Lau, “Thin film composite membrane - Recent development and future potential,” Desalination, vol. 356, pp. 140–148, 2015.

[25] A. Laorko, Z. Li, S. Tongchitpakdee, S. Chantachum, and W. Youravong, “Effect of membrane property and operating conditions on phytochemical properties and permeate flux during clarification of pineapple juice,” J. Food Eng., vol. 100, no. 3, pp. 514–521, 2010.

[26] A. Giacobbo, A. M. Bernardes, and M. N. de Pinho, “Sequential pressure-driven membrane operations to recover and fractionate polyphenols and polysaccharides from second racking wine lees,” Sep. Purif. Technol., vol. 173, pp. 49–54, 2017.


55

[27] B. Díaz-Reinoso, A. Moure, H. Domínguez, and J. C. Parajó, “Membrane concentration of antioxidants from Castanea sativa leaves aqueous extracts,” Chem. Eng. J., vol. 175, no. 1, pp. 95–102, 2011.

[28] B. Díaz-Reinoso, N. González-López, A. Moure, H. Domínguez, and J. C. Parajó, “Recovery of antioxidants from industrial waste liquors using membranes and polymeric resins,” J. Food Eng., vol. 96, no. 1, pp. 127–133, 2010.

[29] J. M. Arsuaga, M. J. López-Muñoz, and A. Sotto, “Correlation between retention and adsorption of phenolic compounds in nanofiltration membranes,” Desalination, vol. 250, no. 2, pp. 829–832, 2010.

[30] M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and F. Smith, “Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances,” pp. 350–356.

[31] A. Altemimi, R. Choudhary, D. G. Watson, and D. A. Lightfoot, “Ultrasonics Sonochemistry Effects of ultrasonic treatments on the polyphenol and antioxidant content of spinach extracts,” Ultrason. - Sonochemistry, vol. 24, pp. 247–255, 2015.

[32] B. Nayak et al., “Comparison of microwave, ultrasound and accelerated-assisted solvent extraction for recovery of polyphenols from Citrus sinensis peels,” Food Chem., vol. 187, pp. 507–516, 2015.

[33] M. Bouras, M. Chadni, F. J. Barba, N. Grimi, and O. Bals, “Optimization of microwave-assisted extraction of polyphenols from Quercus bark,” Ind. Crop. Prod., vol. 77, pp. 590–601, 2015.

[34] I. Elez Garofulić, V. Dragović-Uzelac, A. Režek Jambrak, and M. Jukić, “The effect of microwave assisted extraction on the isolation of anthocyanins and phenolic acids from sour cherry Marasca (Prunus cerasus var. Marasca),” J. Food Eng., vol. 117, no. 4, pp. 437–442, 2013.

[35] E. Vázquez, M. R. García-risco, L. Jaime, G. Reglero, and T. Fornari, “The Journal of Supercritical Fluids Simultaneous extraction of rosemary and spinach leaves and its effect on the antioxidant activity of products,” J. Supercrit. Fluids, vol. 82, pp. 138–145, 2013.

[36] A. P. D. F. Machado, J. L. Pasquel-Reátegui, G. F. Barbero, and J. Martínez, “Pressurized liquid extraction of bioactive compounds from blackberry (Rubus fruticosus L.) residues: A comparison with conventional methods,” Food Res. Int., vol. 77, pp. 675–683, 2015.

[37] H. Nawaz, J. Shi, G. S. Mittal, and Y. Kakuda, “Extraction of polyphenols from grape seeds and concentration by ultrafiltration,” Sep. Purif. Technol., vol. 48, no. 2, pp. 176–181, 2006.

[38] A. Cassano, C. Conidi, L. Giorno, and E. Drioli, “Fractionation of olive mill wastewaters by membrane separation techniques,” J. Hazard. Mater., vol. 248–249, no. 1, pp. 185–193, 2013.

[39] A. N. Negrão Murakami et al., “Concentration of phenolic compounds in aqueous mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil) extract through nanofiltration,” LWT - Food Sci. Technol., vol. 44, no. 10, pp. 2211–2216, 2011.

[40] “ITW Reagents.” [Online]. Available: https://www.itwreagents.com/iberia/es/home. [Accessed: 22-May-2019].

Memoria

56

[41] “Sigma-Aldrich.” [Online]. Available: https://www.sigmaaldrich.com/spain.html. [Accessed: 22-May-2019].

[42] “Fisher Scientific: Lab Equipment and Supplies.” [Online]. Available: https://www.fishersci.es/es/es/home.html. [Accessed: 22-May-2019].

[43] P. Garcia-Salas, A. Morales-Soto, A. Segura-Carretero, and A. Fernández-Gutiérrez, “Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples,” Molecules, vol. 15, no. 12, pp. 8813–8826, 2010.

[44] “XIX-Convenio-General-de-la-Industria-Quimica-para-2018-2019-y-2020.” .


57

INTEGRACIÓ DE PROCESSOS AMB MEMBRANES PER A LA

Documents

Transcript of INTEGRACIÓ DE PROCESSOS AMB MEMBRANES PER A LA