Interacciones Genéticas Sintéticas - FBMC · Identiﬁcar todos los genes, las proteínas y sus...

Interacciones Genéticas Sintéticas

Gen A(mutante)

Gen B(mutante)

Gen A (mutante)Gen B (mutante)

Monday, October 22, 12

No es suficiente para entender cómo vuelva el

avión

?

Identificar todos los genes, las proteínas y sus conecciones en un organismo es como tener la lista completa de las partes y del plano de un avión.

Luego de la reducción, la integración


Por qué estudiar interacciones genéticas sintéticas?

1- Para entender la “homeostasis molecular”

2- Para entender como el genotipo se traduce en fenotipo

3- Para entender cómo funciona la célula


Homeostasis molecular

Cómo interactúan los productos génicos (interactiones sintéticas)

Cómo se logra rubustez ante cambios ambientales o cambios genéticos.

Cómo es que una célula con aberraciones cromosómicas, no solo sobrevive sino que prolifera (cáncer)


Genotipo y fenotipo

Cómo se compensa la variabilidad genética (buffering). Es decir, cómo predecir en qué casos un gen mutado va a llevar a enfermedad y en qué casos no,etc.

Hay aproximadamente 1 SNP c/1000pb en el genoma humano

?


Geno%po''''(''''Feno%poAún'las'enfermedades'gené%cas'que'se'heredan'en'forma'mendeliana'

(causadas'por'un'gen)'se'heredan'en'forma'compleja,'cuan%ta%va

La'misma'mutación'%ene'efectos'diferentes'en'dis%ntos'hijos

Interacción*con*el*resto*del*geno0po


Geno%po''''(''''Feno%po

Ejemplo:'fenilcetonuria'(PKU)autosómica*+>*gen*PHA*(fenilalanina*hydroxilasa)*funciona*mal*o*nada

PHA5A104Dsuave

26%'ac%vidad'total

PHA5R154Nsevera

4%'ac%vidad'total

igual*catálisismás*proteína menos*proteína

estabilidad proteasas,'chaperonas

Interacción*con*el*resto*del*geno0posupresores

enhancers

modificadores


CanalizaciónWaddington 1942

tiempode desarrollo

celula en diferenciación

Destinos posiblesCómo se logra que sean tan discretos estos destinos, teniendo en cuenta la variabilidad ambiental/genética?


Canalization

(Buffering)

Distribución fenotípica

Frec

uenc

ia

Carácter en ambientefavorable

Carácter NO canalizado luego de perturbación (genética o ambiental)

Carácter canalizado luego de perturbación (genética o ambiental)

Jaroz&Lindquist, AnnRevGen2010


El problema de los organismos modelo

Endocriados escasa/nula variación alélica

No se ha explorado la complejidad de la variación natural


Interactoma(IP+MALDI)

2010

S.*cerevisiae

'Mucha'información

Chips*de*proteínas

2001

Cerveza*y*pan*(Babilonia,*Egipto)

6000+3000*a.C.******

Genoma*secuenciado

1996

**Chips*de*DNA

1997

Localizoma(fusión*a*GFP)

2003

Interactoma(SGA)

2004

'Hongo'unicelular

•'1996'función'asociada'a'30%'de'los'genes•'2011'aumentó'a'90%

11


Similitud'con'humanos

•*17%*de*los*genes*ortólogos*de*levaduras*están*asociados*a*enfermedades*humanas

•*Muchos*de*los*genes*de*humanos*están*representados*en*levaduras

Ventaja'de'levaduras

Levaduras**vs.**humanos

•*Menor*complejidad

•*6000*genes*vs.*25000

•*No*hay*splicing*alternaYvo*+>*menos*proteínas*

•*Mucha*información

•*Fácil*manipulación

•*Velocidad*de*trabajo

•*Económico

12


Tetradas(meiosis y esporulación)

Ciclo Vegetativo ciclo(mitótico)

Pseudohifas(crecimiento tipo filamentoso)

Shmoos(ciclo sexual)

dipliode

haploide

Ciclo de vida de S.cerevisiae

Pseudohifas(crecimiento tipo filamentoso)


M

G1

S

G2Metafase

Anafase

Telofase


Hoepfner et al, MCB 2000(Philippsen lab, Suiza)

10 min/sec

Dinámica nuclear durante el ciclo celular(histona H4, Hhf2-GFP)


Hoepfner et al, MCB 2000(Philippsen lab, Suiza)

Jakobs et al JCS 2003(Stefan W Hell lab, Alemania)

GFP-Tub1

20 min/sec

mls-GFP

Dinámica de los microtúbulos y la mitocondria


Genética: Perturbar para entender cómo funcionan los organismos ->

“ingeniería reversa”

? tomar un objeto/sistema que no sé cómo funcionadesarmarlotestear como funciona sacando/cambiando partesderivar los principios generales del “diseño”hacer otro con el mismo principio, igual o mejor

Ingeniería


Cuán informativas son las mutaciones únicas?

El ~20% de los genes en S.cerevisiae son esenciales.

Gen esencial: su deleción impide el crecimiento en medio rico con glucosa

y el resto?


Distribución de “tasas de crecimiento máximo” entre 750 cepas knock out en medio completo (YPD).

Datos de Jasnos & Korona (Evolution 2009)

wt


Distribución de “coeficientes de selección” entre las cepas knock out viables en medio completo (YPD).

©2010 by The Royal Society

Datos de Steinmetz et al. (Nature Genetics 2002)


http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/277/1687/1459.full#ref-21

http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/277/1687/1459.full#ref-21

• Muchas de las proteínas no son necesarias en la condición donde se testeó el fitness

• S.cerevisiae es robusta a perturbaciones genéticas/ambientales y eso se debe a redundancia a nivel génico y de sistema

Otras explicaciones (más probables)

!Combinar perturbaciones genéticas!

Una posible explicación: S.cerevisiae usa sólo el 20% del genoma

BufferingHipótesis:

los mecanismos de bufferinggenético se solapan con los

mecanismos de buffering ambiental


El problema con hacer perturbaciones combinadas es que es combinatorial

200 screens genómicos/mesLaboratorio de Charlie Boone (Synthetic Genetic Array technology)

Consideremos la levadura, ~6000 genes

~18 million pares ~ 1010 triples

Es indispensable usar técnicas “High throughput”


Tecnologías experimentales para estudiar interacciones genéticas

• Synthetic Genetic Arrays (SGA)

• Epistatic Mini Array Profiles (EMAP)

• Diploid-based Synthetic Lethality Analysis with Microarrays (dSLAM)

• Genetic Interaction Mapping (GIM)

• Combinatorial RNAi-based screens

(Para colonias: yeast, bacteria)

(Microarray-based, or colony yeast)

(Worm, Drosophila, mammalian systems)

Tong, A.H.Y. et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science 294, 2364-2368 (2001).Schuldiner et al: Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell 2005, 123(3):507-519.Pan et al.: dSLAM analysis of genome-wide genetic interactions in Saccharomyces cerevisiae. Methods 2007, 41(2):206-221. Decourty et al.: Linking functionally related genes by sensitive and quantitative characterization of genetic interaction profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(15):5821-5826.Lehner et al. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nat Genet 2006, 38(8):896-903.


Cuántos “screens” ya hechos...

• Levaduras– S. cerevisiae:

• >5 million dobles– S. pombe:

• ~200k dobles• E. coli

• ~100k dobles• Worm

• ~75k dobles• Human

• Algunos estudios de pequeña escala


• Technología: Como medir interacciones (con foco en levadura)?

• Analisis: Qué podemos aprender?


Robots

Laboratorio de Charlie Boone (U. Toronto)


http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg

Tong et al, Science, 2001.

SGA: synthetic genetic analysis






http://www.sciencemag.org/content/vol294/issue5550/images/large/se4810028001.jpeg




! Crecimiento residual (círculos amarillos) es donde hay interacción letal/enferma

! bni1 + bnr1 y bni1 + cla4 dobles KO son inviables (no forman colonias)

! bni1 + bud6 doble KO tienen un defecto sintético de crecimiento (enfermas, flechas amarillas).


SGA: synthetic genetic analysisY se evalúa el crecimiento…

















































































































http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpgRepaso Meiosis

Analizar las tétradas no es más que observar el resultado de la meiosis.

El diploide es 2n: tiene 2 cromosomas de cada uno de los 16pero el ADN se duplica antes de empezar la meiosis, de modo que hay 2 cromosomas con 2 cromátidas idénticas.

En profase I los cromosomas se alinean y ocurre recombinación homóloga.

Luego, durante la primera división meiótica se separan los cromosomas homólogos

En la segunda división se separan las cromátidas hermanas, cada espora representa esencialmente, una cromátida

Profase I

Anafase I

Meiosis II







Las interacciones sintéticas letales identifican pathways o complejos

Función esencial

Respuesta esencial

Función esencial

Pathways paralelos Subunidades de complejos

Prevención del daño o respuesta a él

daño

Interacciones sintéticasQué clase de relaciones entre genes se pueden

detectar?






Una medida quantitativa de interacción genética

Fitness esperado

Epistasis negativa

Epistasis Positiva

observada esperada

observadaMonday, October 22, 12

Synthetic Genetic Array

SGA cuantitativo

Fitness esperado

Epistasis negativa

Epistasis Positiva

observada esperada

observada

midiendo el tamaño de las colonias


Michael Costanzo,1,2* Anastasia Baryshnikova,1,2* Jeremy Bellay,3 Yungil Kim,3 Eric D. Spear,4Carolyn S. Sevier,4 Huiming Ding,1,2 Judice L.Y. Koh,1,2 Kiana Toufighi,1,2 Sara Mostafavi,1,5

Jeany Prinz,1,2 Robert P. St. Onge,6 Benjamin VanderSluis,3 Taras Makhnevych,71,2 1,2 1,2 1,2 1,2 Franco J. Vizeacoumar, Solmaz Alizadeh, Sondra Bahr, Renee L. Brost, Yiqun Chen,Murat Cokol,8 Raamesh Deshpande,3 Zhijian Li,1,2 Zhen-Yuan Lin,9 Wendy Liang,1,2

Michaela Marback,1,2 Jadine Paw,1,2 Bryan-Joseph San Luis,1,2 Ermira Shuteriqi,1,2

Amy Hin Yan Tong,1,2 Nydia van Dyk,1,2 Iain M. Wallace,1,2,10 Joseph A. Whitney,1,5

Matthew T. Weirauch,11 Guoqing Zhong,1,2 Hongwei Zhu,1,2 Walid A. Houry,7 Michael Brudno,1,5

12 13 13 8 2,10 Sasan Ragibizadeh, Balázs Papp, Csaba Pál, Frederick P. Roth, Guri Giaever,Corey Nislow,1,2 Olga G. Troyanskaya,14 Howard Bussey,15 Gary D. Bader,1,2

Anne-Claude Gingras,9 Quaid D. Morris,1,2,5 Philip M. Kim,1,2 Chris A. Kaiser,4 Chad L. Myers,3† Brenda J. Andrews,1,2† Charles Boone1,2†

Science 20

10

5.4 millones de pares(>75% de todos los genes con perfil cuantitativo de interacciones genétics)

~170 000 interacciones genéticas!procesos biológicos similares se agrupan juntosconexiones entro TODOS los procesos biológicos

el “paisaje” genético da claves sobre la acción de drogas y sirve para identificar targets.

intensa pleiotropía funcional

1712 genes contra toda la colección de knock outs no esenciales

The Genetic Landscape of a Cell


Distribución+global+de+interac2onsNú

mero

de

pare

s

Neg: ~110k, Pos: ~60k

observada

Grado de interacción genética


Vista global 2D de la red de interacciones en yeast

Array*genes

Que

ry*gen

es~*1800*x*4000*genes*(~6*million)*pairs*

nega%ve posi%ve


RAD55RAD57RAD51RAD54RAD52

RAD5

5RA

D57

RAD5

1RA

D54

RAD5

2

REV7

REV1

REV3

RAD55RAD57RAD51RAD54RAD52

Interacciones dentro de complejos/

pathways

Interacciones Entre pathways

(compensatorias)

Positivo Negativo

Función esencial

(reparación del ADN)

Matriz de interacción

Interpretación en formato lógico

enzimas de síntesis de

ADN translesión

enzimas que reparan ADN


Un+mapa+mul2escala

Nivel*Global

Nivel*Proceso

Nivel*Pathway/complejo


Gene ontology (GO)Una sistema de organización de la información de los genes para poder informaticarla

Es “tratable” en forma computacional, ya que usa palabras estandar

Para cada gene describe 3 dominios:

Componente celular

Función molecular

Proceso biológico


F� factor

Fus3

Pheromone Pathway

Cytoplasma

Nucleo Ste12

Ste7

Kss1

PPKss1

Ste5

PP

Fus3Fus3

MAPKKKMAPKKMAPK

Ste18Ste2

Gpa1 Ste4 Cdc24

Ste20

Ste50

Cdc24Cdc42

Ste11

Genes respondedoresApareamiento


Ejemplo'GO

Fus3Molecular Function

Manually curated•! MAP kinase activity (IDA)

High-throughput•! protein kinase activity (IDA)

Biological Process

Manually curated•! cell cycle arrest (IMP)•! invasive growth in response to glucose limitation (IMP)•! negative regulation of MAPK cascade (IPI)•! negative regulation of transposition, RNA-

mediated (IMP)•! pheromone-dependent signal transduction involved in

conjugation with cellular fusion (IDA)•! protein phosphorylation (IDA)

High-throughput•! protein phosphorylation (IDA)

Cellular Component

Manually curated•! cytoplasm (IDA)•! mating projection tip (IDA)•! nucleus (IDA)

High-throughput•! mitochondrion (IDA)

http://yeastgenome.org








http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/GO/goTerm.pl?goid=4707


http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/redirect.pl?source=locus.fpl&url=http://www.geneontology.org/GO.evidence.shtml%22%20%5Cl%20%22ida








http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/redirect.pl?source=locus.fpl&url=http://www.geneontology.org/GO.evidence.shtml%22%20%5Cl%20%22imp








http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/redirect.pl?source=locus.fpl&url=http://www.geneontology.org/GO.evidence.shtml%22%20%5Cl%20%22ipi

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/redirect.pl?source=locus.fpl&url=http://www.geneontology.org/GO.evidence.shtml%22%20%5Cl%20%22ipi





































http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpgLas interacciones genéticas

conectan funciones

42

Tong&Boone Science 2004

Cada nodoes un atributo de GO(hay ~300 000 atributos)

Cada línea conectora (edge)representa interacciones genéticas entre gene






Las interacciones entre pathways y complejos de complejos son MONOcromáticas


Los “hubs” de redes genéticas

El 10% hubs connect ~ al 40% de todas las interacciones

Distribución de grados de conexión

Número de interacciones (%)

Frac

ción

de

gene

s

HUBs

en general muestrandefectos aún comodeleción simple


Propiedades de los HUBs

Se expresan más

Están más conservados

Menos duplicados, etc.

Evolucionan más lento (dN/dS)-> restricción evolutiva


Genes muestran sesgo respecto del tipo de interacciones que tienen

Distribución de interaccciones

Positivas/negativas

Traducción, procesamiento de

rRNA y degradacion de

mRNAs

Ciclo celular!

Frac

ción

de

gene

s

Positivos:negativos


Segregación'cromosómica/Nocodazole

Replicación'DNA'&'repación/Hydroxiurea'

Glycosilación'&'pared'celular/Tunicamicina

Se+puede+usar+el+mapa+para+iden2ficar+targets+de+drogas


Como se pueden usar las interacciones genétcias para estudiar/tratar enfermedades?

Mensaje: Las interacciones genéticas nos revelan vulnerabilidades ocultas, que se pueden explotar

Supongamos que:

(1) gen humano A, y gen B tienen interacción genética (son sintéticos letales)

(2) mutationes en A están asociadas al cáncer

Célula tumoral

Célula normal

A

A

+ B(diseño de droga que

inhiba a B)

AB

AB

Célula muere!

Célula vive


BRCA1: supresor tumoral de cancer de mama

Mutantes BRCA1 son completamente dependientes de PARP1 (poly ADP ribosa polymerase)

PARP1 no es esencial para la función de la célula normal

=> Un inhibidor de PARP1 ya está en ensayos clínicos Maxwell et al. Molecular Cancer (2008).

~25,000 synthetic letales entre ortólogos humanos

Ejemplo real:


Highlights IG en levaduras

Inmensa cobertura, casi toda la célula explorada

Las IG revelan funciones -> GO vs IG

Las IG revelan cómo se conectan las funciones entre sí GO1 <-> IG <-> GO2

Vía las IG, se puede estudiar la accion de drogas y diseñar nuevas -> investigación translacional

El análisis de las IG globales permite un nivel de abstracción mayor al molecular -> biología de sistemas


Determinación de la concentración externa de

feromona

d αa


Las cascadas de MAP kinasas en S.cerevisiae

54

α factorHiper-osmolaridad Stress a la pared celular:

hipo-osmolaridadtemperatura

MAPKKK

MAPKK

MAPK

MAPKKK

MAPKK

MAPK


Mission Control La respuesta a feromona lleva a una decisión

sobre el destino celular

Nolan et al, MBC 2006

MATa cells express GFPMATα cells express DsRed

a α

a factor

α factor

Cigotaa/α

Arresto en G1

shmoo

Antes

durante

Después


Mission Control

sin gradiente de α factor con gradietne de α factor

Buscando al compañero

Segall PNAS 1993


Mission Control Encontrar al compañero es un problema de

contar con la información correcta

concentración de feromona externad αa

Gradiente

Información sobre:

Distancia

Dirección

El único sensor es el receptor de feromona


Mission Control

Dos determinationes para realizar

highmediumlow

concentration determination gradient direction determination


La#ruta#de#respuesta#a#feromona#en#S.cerevisiae

antes durante

•Arresto'del'ciclo'celular'en'G1'(START)•Cambios'morfológicos'(shmoo)•Inducción'de'genes'de'apareamiento


Bar1

Sst2

Msg5

Cdc28

Cln2

Dinámica de la activación de la ruta de respuesta a feromona (feedbacks y escalas de tiempo)

Rápido fb (sec)

Lento fb positivo (min)

Lento fb negativo

Far1 -P


La respuesta transcripcional a α factor es estable en el tiempo

factor (nM)

PPR

M1-

mC

herry

(A.U

.)

10-1 100 101

400

800

1200

time EC50 dEC50 nHill dnHill 45.00000 3.63000 0.43000 1.12000 0.17000 60.00000 3.69000 0.34000 1.11000 0.13000 96.00000 4.97000 1.17000 1.04000 0.24000 131.00000 4.43000 0.32000 1.08000 0.08770 178.00000 3.49000 0.43000 1.04000 0.16000 207.00000 3.30000 0.21000 1.24000 0.11000

Tim

eGustavo Pesce


Curva dosis respuesta

YFP signal

α−factor (M)10

00 b

ound

mol

ecul

es /

cell

EC50

Alta concentraciónBaja concentración


factor (nM)

Res

pons

e (%

of m

axim

um)

0.01 0.1 1 10 100 10000

20

40

60

80

100

0.01 0.1 1 10 100 10000

20

40

60

80

100

Transcription 170 minF binding

La curva de unión de α factor al receptor y la curva de respuesta transcripcional están alineadas (Dose Response Alignment o DoRA)

YFP signal


Efectos de desalinear la curva dosis respuesta

Sys

tem

resp

on

se (%

max.)

0

100

Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13

ba

Path

way

ou

tpu

t (%

max.)

0

100

Receptor occupancy (% max.)

0 100

d

Path

way

ou

tpu

t (%

max.)

0

100

Receptor occupancy (% max.)0010


Receptor occupancyPathwayoutput (P)

Sys

tem

resp

on

se (%

max.)

0

100

c

Receptor occupancy

Misalignedpathwayoutput

Path

way

ou

tpu

t (%

max.)

0

100

Receptor occupancy (% max.)0 100

Path

way

ou

tpu

t (%

max.)

0

100


fe

Sin DoRa

DoRA mejora la capacidad de

distinguir inputs

Sys

tem

resp

onse

(%

max.)

0

100


ba

Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100


0 100

d P

ath

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100




Sys

tem

resp

onse

(%

max.)

0

100

c

Receptor occupancy


Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100


Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100


fe

Con DoRA


Sys

tem

resp

on

se (%

max.)

0

100


ba

Path

way

ou

tpu

t (%

max.)

0

100


0 100

d

Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100




Sys

tem

resp

onse

(%

max.)

0

100

c

Receptor occupancy


Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100


Path

way

outp

ut

(% m

ax.)

0

100


fe

con DoRA sin DoRA

sin DoRA se amplifica el ruido

Efectos de desalinear la curva dosis respuesta


input

signalingsystem

output

signal

signaltuning

b

input

signalingsystem

output

signal

a

Dos modos extremos para alinear las curvas dosis respuesta

Requiere un ajuste fino muy preciso de las tasas de las reacciones y el resto de los parámetros del sistema

Tolera desvíos internos, ya que el feedback puede ajustar el output al input

Con control por feedbackSin control por feedback

20 40 60 80 100

0

40

80

120

input

Response

20 40 60 80 100

0

40

80

120

response

20 40 60 80 100

0

40

80

120

response

20 40 60 80 100

0

40

80

120

response

20 40 60 80 100

0

40

80

120

response


M 0 1 1.5 2.5 3.5 5 7 10 12.5 15Time after stimulation (min)

51 kDa

37 kDa

Kss1

Kss1-P

Fus3

Fus3-P

Dinámica de fosforilación de la MAPK

67

0 5 10 15Time (min)

0.000

0.015

0.030

0.005

0.010

0.015

0.000 phos

phoK

ss1

inte

nsity

/tota

l Kss

1 in

tens

ity

phos

phoF

us3

inte

nsity

/tota

l Fus

3 in

tens

ityFus3Kss1


Sys

tem

out

put (

% m

ax.)

0

50

100 Receptor occupancy (calculated)

Fus3 phosphorylation

Pathway output P

Pheromone (M)10-11 10-10 10-9 10-8 10-710-13 10-12 10-6

La curva D-R medida a nivel de la fosforilación de la MAPK también se alinea con la ocupación del

receptor

68

YFP signal


0 5 10 150

25

50

75

100

125

150

Rel

ativ

e Fu

s3 p

hosp

hory

latio

n (%

) pher + Fus3 inhpherFus3 inh

fus3-as2

Time (min)

+inh

-inh

La caída en la señal depende de la actividad de Fus3(feedback negativo)

0 5 10 15Time (min)

0.000

0.015

0.030

0.005

0.010

0.015

0.000 phos

phoK

ss1

inte

nsity

/tota

l Kss

1 in

tens

ity

phos

phoF

us3

inte

nsity

/tota

l Fus

3 in

tens

ity

Fus3Kss1


pheromone

Ste2

Ste7Ste11

Fus3

Ste5

Ste20Sst2

Fus3 P

Ste18Ste4Gpa1

70

Nor

mal

ized

Fus

3 ph

osph

oryl

atio

n (%

)

0

50

100

Pheromone (M)10-11 10-10 10-9 10-8 10-710-13 10-12

Fus3 inhibitedFus3 not inhibited

El alineamiento requiere un feedback negativo que se origina en Fus3

Yu et al., Nature 2008Monday, October 22, 12

Interacciones Genéticas Sintéticas - FBMC · Identiﬁcar todos los genes, las proteínas y sus...

Documents

Transcript of Interacciones Genéticas Sintéticas - FBMC · Identiﬁcar todos los genes, las proteínas y sus...