INTRODUCCION

El taller de Actualización en Histología, tiene como finalidad afianzar los conocimientos básicos en esta área específica de la Biología. El curso tiene como propósito que el estudiante adquiera los conceptos y el entrenamiento necesario para el procesamiento, identificación e interpretación de los tejidos animales. Asimismo, se busca promover en el alumno el desarrollo de juicio crítico para evaluar y producir preparaciones histológicas con fines científicos y educativos. Dicho taller, está destinado a los alumnos de las Carreras de Ciencias Biológicas que hayan aprobado la asignatura Morfología Animal.

OBJETIVOS

• Analizar los fundamentos de las principales técnicas histológicas e histoquímicas aplicadas en el estudio de los tejidos animales.

• Adquirir destrezas y habilidades en el manejo de materiales e instrumental para la realización de preparaciones histológicas de rutina

. • Establecer asociaciones estructurales-tintóreas en cada uno de los tejidos analizados.

• Correlacionar las características estructurales de los tejidos animales con sus correspondientes funciones.

• Reconocer los criterios histológicos utilizados en el diagnóstico diferencial.

• Transferir los conocimientos histológicos a la resolución de situaciones problemas simuladas.

• Desarrollar juicio crítico para evaluar y producir imágenes histológicas reales y virtuales.

• Valorar que un adecuado entrenamiento y formación en el campo de la Histología, es parte del conocimiento básico que debe tener un Biólogo.

• Apreciar que la Histología es una herramienta importante en el futuro quehacer profesional del Biólogo.

La histotecnología es una subespecialidad de la tecnología médica de

laboratorio;  una disciplina que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de

manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de los seres vivos 

La Histotecnología es la disciplina que estudia los fundamentos científicos y la aplicación de técnicas que abarcan desde la obtención de la muestra biológica, hasta su transformación en un preparado histológico. Los procedimientos establecidos permitirán la preparación del material para ser observado al microscopio (óptico o electrónico) y analizar sus características topográficas, estructurales y tintóreas, según corresponda. El preparado deberá reunir ciertas cualidades, ya que posee un valor intrínseco (además de extrínseco) por la información que de él se puede obtener. Deberá ser representativo del tejido en estudio y haberse respetado los pasos indispensables para su realización, de modo que refleje con la mayor fidelidad posible, las características buscadas en la muestra biológica. En lo que respecta al cuidado de la salud lo

más común es ayudar al patólogo a determinar cuando un paciente tiene un cáncer

FUNDAMENTOS GENERALES PARA EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO DE LOS TEJIDOS

Una técnica histológica es un conjunto de operaciones a las que se somete una muestra biológica a fin de posibilitar su estudio al microscopio. El examen al microscopio óptico se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar a impresionar nuestro órgano visual, después de haber pasado por las distintas lentes del aparato. Por esa causa, el material de estudio debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes mediante una serie de operaciones que se describirán a continuación. El proceso abarca desde el momento en que se toma el material hasta que el preparado puede observarse. PASOS: 1.

1) Toma de material.2) Fijación3) Deshidratación4) Preparación para la inclusión5) Inclusión6) Modelado del bloque – catalogación7) sección con el micrótomo extendido de los cortes – pegado8) Coloraciones: de rutina o especiales

HISTOTECNOLOG

IA

MUESTRA DE TEJIDO

Obtención de la Muestra De acuerdo a la procedencia de los tejidos y la finalidad de su estudio es posible distinguir entre material histológico y material anatomo-patológico. Se denomina material histológico a toda muestra de tejidos obtenida de un individuo o animal sano (o experimentalmente sometido a un determinado tratamiento) con la finalidad de investigar su estructura normal y/o los cambios producidos en la morfología como consecuencia de algún tratamiento. El material anatomo-patológico está constituido por muestras procedentes de individuos o animales enfermos utilizadas para el diagnóstico y/o la investigación etiológica (origen-causa) de la enfermedad.

Los tejidos para estudio histológico se obtienen habitualmente a partir de:

a- autopsias: en medicina el término se aplica al conocimiento de la causa de la muerte. Mediante el procedimiento de autopsia se realizan manipulaciones instrumentales sobre el cadáver con el propósito de obtener muestras de órganos y tejidos e investigar la causa del fallecimiento. Este método también recibe la denominación de necropsia.

b- biopsias: es una porción de tejido obtenida de un individuo vivo para su estudio histológico o anatomo-patológico. Las biopsias tienen como objetivo fundamental el diagnóstico de una patología que no se ha podido diagnosticar por los métodos clínicos habituales.

c- extendidos citológicos: es un conjunto de células independientes procedentes de un tejido y extendidas sobre un portaobjeto formando una capa delgada y que permite su observación microscópica. Ejemplos: frotis de sangre, tejidos hematopoyéticos y exfoliación (o raspado) de mucosas.

Fases en la obtención de material animal:

En un estudio histológico descriptivo o experimental la muestra, generalmente, procede de un animal normal o control y de animales problemas, según los casos. Si es posible debe extraerse de un ejemplar vivo y anestesiado. En caso contrario, cuando el animal está muerto, el o los órganos deberán obtenerse lo más rápidamente posible después de la muerte.

Para la extracción de los órganos se requiere tener conocimientos anatómicos específicos que permitan establecer estrategias de disección, conservación y tratamiento posterior del tejido.

En la técnica histológica muchos componentes se pierden durante los sucesivos pasos. Aquellos que perduran son en su mayoría moléculas grandes que no se disuelven con facilidad en especial después de aplicar el fijador. Las macromoléculas que forman complejos con otras moléculas de gran tamaño, son las que mejor se conservan en un corte: Ej.: - Ácidos nucleicos asociados con una proteína (nucleoproteína).- Proteínas intracelulares del cito esqueleto que forman complejos con otras proteínas.- Proteínas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras moléculas vecinas similares, a través de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colágenas) y los fosfolípidos de las membranas.

Muestreo:

En cuanto la sangre deja de llevar oxígeno y de extraer el anhídrido carbónico de los tejidos, las enzimas comienzan a actuar y producen la autolisis de las células que los componen.

Las propias estructuras moleculares son deformadas y es lo que precisamente se debe evitar. Los tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:

- Las glándulas exocrinas y endocrinas lo más rápidamente posible.

- El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min. Post-mortem.

- Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no más allá de los 30 min.

- Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben extraerse más allá de 60 min. Postmortem.

Identificación del Material:

Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano, mientras en el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lápiz las indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso. Esto es necesario cuando las muestras son numerosas, pues facilitará su reconocimiento.

Las muestras de órganos no deben exceder un volumen de 1x 1x1 cm3 y se requiere efectuar secciones profundas, en lo posible no tangenciales, para incluir los constituyentes anatómicos normales como por ej. Cápsula, corteza, médula, etc. La cantidad de líquido fijador en el que se embeba la pieza debe superar aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.

FIJACIÓN:

Consiste en la preservación del tejido del deterioro provocado por la autolisis y putrefacción derivada de la muerte celular.

La autolisis es el proceso en el cual, después de la muerte, se produce la auto digestión enzimática debido a la salida del contenido lisosómico de la célula. Se denomina putrefacción al efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas sobre los tejidos. Los microrganismos que originan esta acción son de carácter saprófito y complementan el efecto lítico de la autolisis hasta conseguir la total destrucción celular. Ambos procesos están influidos tanto por la naturaleza del tejido considerado como por la temperatura existente en el medio donde se encuentra el tejido. Así, por ejemplo los tejidos ricos en enzimas digestivas (estómago, páncreas) o que contienen una importante flora bacteriana (intestino) sufren estos fenómenos con mayor intensidad.

Con la fijación del tejido, no sólo se interrumpen los procesos de degradación postmortem, sino que además se intenta conservar la arquitectura y composición tisular lo más próxima posible a como se encontraba en el organismo vivo.

El proceso de fijación es muy importante en histotecnología, ya que errores en el mismo, no pueden ser corregidos, generando artificios (desgarros, retracciones) que dificultan el diagnóstico.

Tipos de fijación:

En función de las características del estudio microscópico que se vaya a realizar, se distinguen dos tipos de fijación.

a) fijación citológica o histológica: Intenta conservar la estructura de células y tejidos, sin considerar los cambios moleculares de los componentes bioquímicos.

b) fijación histoquímica: Intenta conservar la composición molecular y bioquímica de los tejidos más que los detalles morfológicos de los mismos.

Clasificación de los fijadores:

De acuerdo a la acción que ejercen sobre los tejidos se clasifican en químicos y físicos. Los fijadores químicos son los más empleados y dentro de estos, en la práctica rutinaria, el 9 formaldehído, formalina o formol es el de uso más extendido ya que cumple con la mayor parte de las características que debe reunir un buen fijador. También es muy común el uso de mezclas fijadoras formadas por la combinación de dos o más sustancias con compatibilidad química, cada uno de los cuales es por si solo insuficiente para dar una fijación que responda a todas las exigencias. Entre los más usados se halla el líquido de Bouin

Características fundamentales que debe poseer un fijador:

• Capacidad para bloquear la autolisis. Este efecto del fijador depende principalmente de su poder para producir la desnaturalización de las proteínas, de modo que la actividad enzimática del tejido quede paralizada. Además debe tener un efecto antimicrobiano que impida la acción bacteriana desencadenante de la putrefacción.

• Penetrar rápidamente al tejido.

• No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determinen anomalías en su estructura. Es decir, evitar la difusión de elementos constitutivos del tejido durante y después de la fijación

• Favorecer la inclusión, corte y coloración posteriores del material biológico.

Reglas generales a considerar en el empleo de líquidos fijadores:

• Para evitar la autolisis, el tejido debe ser colocado lo más rápidamente posible en el líquido fijador.

• La selección del fijador depende del tejido a estudiar, fundamentalmente de las fuerzas químicas que interactúan para mantener su estructura.

• El tejido debe estar seccionado en láminas de 0.5-1cm de espesor máximo. Calor Frío Desecación Físicos Químicoscos Oxidantes Reductores Acetona Ácido Acético Acido Pícrico Tretróxido de Osmio Formaldehído Paraldehído Etanol Metanol FIJADORES 10

• Asegurar la permanencia de las muestras en el nivel medio del volumen del fijador para que dicho reactivo actúe homogéneamente por todas las caras de la muestra.

• El volumen del fijador está dependiendo del volumen de la muestra. En general, la relación entre el volumen del fijador y el de la muestra de tejido es de 10:1 (el volumen del fijador es 10 veces mayor que el ocupado por la pieza).

• La presión osmótica del líquido fijador y la del tejido deben ser equivalentes.

• El pH del fijador debe aproximarse al pH fisiológico

• El tiempo de fijación es específico para cada fijador.

Técnicas de fijación:

En la práctica existen básicamente dos modos para fijar un material dado.

a) Fijación por inmersión: se realiza sumergiendo un pequeño trozo de tejido en el fijador inmediatamente después de haber sido extraído.

b) Fijación por Perfusión: En este tipo de fijación el líquido fijador se inyecta a través del sistema circulatorio, mientras el animal permanece adormecido bajo efecto de narcóticos.

Detención de la fijación

Una vez transcurrido el tiempo de fijación deseado es preciso detener la fijación rápidamente, ya que una acción muy prologada de estos agentes perjudica en general la coloración ulterior de los cortes y hasta podría alterar la estructura histológica.

El fijador que rodea la pieza puede ser eliminado por lavado en:

a- agua corriente de 2 a 24 h. b- alcohol: Las piezas que han estado en alcohol, ácido pícrico o formol, se llevan

directamente al alcohol 70 u 80º llevándose así a cabo el lavado y el inicio de la deshidratación.

INCLUSION: La observación microscópica requiere en la mayoría de los casos que el material de estudio sea muy delgado con el objetivo que los elementos que lo constituyen se encuentren en un solo plano focal. Este método exige por un lado la realización de cortes delgados, de pocas micras de espesor y de grosor uniforme, para lo cual se emplean aparatos especiales llamados micrótomos. La forma de lograr que las muestras fijadas adquieran la consistencia más favorable y uniforme, consiste en incorporar al seno mismo del tejido, una sustancia sólida que sirva de sostén a los componentes histológicos y que permita obtener cortes aptos para su observación al microscopio. Estas sustancias se denominan medios de inclusión.

Diferentes sustancias han sido empleadas como medios de inclusión. La gelatina, el poli etilenglicol empleadas en soluciones acuosas pueden penetrar muestras hidratadas. Otras, como la parafina y la celoidina que no son solubles en agua, requieren para poder penetrar una deshidratación previa de las piezas y un tratamiento posterior con un reactivo miscible de los medios de inclusión.

También, pueden emplearse como medios de inclusión resinas acrílicas o epoxídicas, que permiten obtener secciones mucho más delgadas que en parafina, con la posibilidad de distinguir detalles estructurales más finos. Generalmente son los medios de inclusión empleados en microscopía electrónica de transmisión y en el estudio de muestras óseas sin descalcificar de gran dureza (dientes).

Deshidratación:

Los tejidos contienen grandes cantidades de agua tanto intra como extracelular, la que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. La deshidratación puede realizarse por métodos químicos o físicos (criodesecación). En el primer caso se emplea un reactivo anhidro ávido de agua como la acetona, el alcohol etílico, metílico, butílico, etc.

En los métodos de rutina el agente más utilizado es el alcohol etílico, el cual establece una unión lo suficientemente fuerte con las moléculas de agua para extraerlas del tejido.

En la práctica y para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando preferentemente, alcoholes de graduación creciente (Para la preparación de las soluciones ver ANEXO I):

En la práctica de laboratorio de este taller se seguirán los pasos que se indican en el ANEXO II. Los procedimientos que se describen a modo de ejemplo, son los que se emplean en términos generales. Estos pueden variar según las necesidades y propósitos de cada operador y/o laboratorios.

Las piezas se envuelven en gasa a manera de bolsitas o se colocan en cassettes plásticos de deshidratación. Luego se introducen en frascos anchos y de cierre hermético, dejándolas suspendidas en el seno del líquido deshidratante cuyo volumen debe ser diez veces superior al de la muestra.

Los tiempos de permanencia en cada alcohol dependerán del tamaño de la pieza. Se recomienda 1 hora en cada reactivo deshidratante si el espesor de la muestra es de 0.5- 1 cm.

Las condiciones esenciales de un buen agente deshidratante son:

1- No debe alterar la estructura tisular 2- Ser soluble en el reactivo intermediario 3- Actuar rápidamente 4- El endurecimiento de los tejidos debe ser mínimo

Una vez retirada la muestra del alcohol absoluto es necesario efectuar una desalcoholización. Es decir, el alcohol de los tejidos debe ser reemplazado por un líquido (solvente) que sea soluble en parafina con la que se impregnará el tejido. Los solventes 70º, 80º, 96º y 100º absoluto (2 baños) FIGURA 3. Deshidratación en cassette 13 utilizados son el xileno o xilol, benceno, tolueno y butilo. El más indicado es el xilol por su rápida acción, porque endurece poco los tejidos y se elimina fácilmente del medio de inclusión. Además, tiene la particularidad de alterar el índice de refracción de la muestra y la torna ligeramente translúcida. A este paso de la técnica se la denomina aclaramiento o diafanizarían. Para realizarlo, las piezas se trasladan a un frasco con xilol que contenga un volumen aproximadamente 30 veces superior. Si al introducir las piezas en el solvente se observa que éste se vuelve opalino, significa que la deshidratación no ha sido incompleta. En ese caso, se recomienda volver al alcohol absoluto.

El aclaramiento concluye cuando las muestras se han vuelto diáfanas y trasparentes, entonces, pueden pasarse a una solución mezcla de xilol-parafina. En la práctica, suelen utilizarse los siguientes baños de aproximadamente 1 hora de duración cada uno:

Alcohol absoluto+ xilol (1:1) y dos baños de xilol puro.

INTRODUCCIÓN

La histoquímica es la aplicación de reacciones químicas y bioquímicas en la técnica histológica, con el fin de localizar y determinar de manera científica ciertas sustancias o su actividad.En todas estas reacciones o bien se tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan químicamente con ella, como es el caso del PAS.Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o poli aldehídos). Los polisacáridos son glúcidos formados por la unión de muchas moléculas de monosacáridos (más de 10). Entre los polisacáridos además de los polisacáridos simples como el glucógeno destacan los polisacáridos complejos

HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA

Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de análisis empleado. En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).

La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales pesados, sustancias orgánicas moléculas de depósito y otras sustancias

Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos en las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos insolubles que son coloreados o electro densos y visibles por el MO y el ME.

HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA

A. PRINCIPIOS BÁSICOS.

1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.

Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por medio de la fijación del tejido.

– Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias hidrosolubles como el glucógeno.

– Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico.

Los fijadores más utilizados son:

– Formaldehído para el MO.

– Glutaraldehído para el ME.

2. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión .

3 .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO QUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. 

En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.En este caso se puede medir dicha sustancia con un histofotómetro.

B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLE HISTOQUÍMICAMENTE.

1. IONES

IÓN DETERMINACIÓN

HIERRO – EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERRO- CIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro férrico.– Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los tejidos .

FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reacción se usa para el estudio del hueso.

2. LÍPIDOS.

Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN NEGRO. Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy liposolubles y débilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnóstico de enfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares.

3. ÁCIDOS NUCLÉICOS.

ÁCIDO NUCLÉICO

DETERMINACIÓN

DNA Se usa la reacción de FEULGEN que consiste :

– Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar.

– El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso) reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo.

Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del núcleo.

RNA Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.

4. PROTEÍNAS.

Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos.

– Reacción de aminobenceno.

– Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como las histonas y protaminas.

5. POLISACÁRIDOS.

Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. En el caso de ser un polímero, antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los azucares.

La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). El ácido oxida a los azucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la presencia de:

– Glucógeno en el hígado y músculo.

– Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.

– Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.

– Glucoproteínas.

Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.

6. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes.

7. ENZIMAS. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática.

ENZIMA DETERMINACIÓN

FOSFATASA ÁCIDA

Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .

La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble.Después se añade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado.

Se usa para localizar lisosomas.

DESHIDROGENASAS

Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.

Se usa para detectar mitocondrias.

PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos, transfiriendo iones hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se reduce.

Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA.

Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopía se suele usar la excitación con luz ultravioleta.

1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.

– Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A, riboflavina(B2) y las porfirinas.

– Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que se une a los ácidos nucléicos:

– DNA: fluorescencia verde amarillenta.

– RNA: fluorescencia roja amarillenta.

Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).

2. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).

Sirve para identificar proteínas especificas. Se basa en la reacción Ag-Ac. Al Ac se le puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la método más usado para la detección de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.

PREPARACIONES PERMANENTES

Describiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para el estudio al microscopio óptico. Con este instrumento los objetos se examinan por transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente (mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”, sin fijar y teñir, como sucede en las preparaciones permanentes.

Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son:

1º. Fijación

2º. Inclusión

3º. Corte con microtomo

4º. Coloración

A. FIJACIÓN.

– Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular.

– Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.

– Tiene por fin endurecer los tejidos, volviéndolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la técnica histológica.Hay que conservar la morfología y la composición química de los componentes de los tejidos.

– Suele durar unas 12 horas.

La fijación puede ser realizada por procesos:

MÉTODO CARACTERÍSTICAS

FÍSICO – Calor, como en bacterilogía.

– Frió, como en el criostato.

QUÍMICO (uso de fijadores que inmovilizan las proteínas de los tejidos).Es la más usada en Histología.

Fijadores:

– Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitan proteínas.

– Formaldehído, tetraóxido de osmio y glutaraldehído apenas causan coagulación y se usan en ME.

Mezclas fijadoras:

– Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial

– Liquido de HELLY: dicromato potásico/cloruro de mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las proteínas son las principales responsables de la estructura celular y se degrada después de la muerte celular.

Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de:

– Glutaraldehído.

– Tetraóxido de osmio.

B. INCLUSIÓN.

– Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes suficientemente finos.

– Las sustancias más usadas para este fin son:

– GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.

– RESINA EPOXI para la ME.

Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la inclusión:

TRATAMIENTO CARACTERÍSTICAS

DESHIDRATACIÓN Se extrae el agua de los tejidos con baños de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%).

ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN

Sustitución del etanol por un liquido miscible en etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que dejan a la pieza translúcida.

INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN

– Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC en el interior de una estufa.

– Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina.

– Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar.

– Inconvenientes:

– Destruyen muchas enzimas

– Eliminan compuestos liposolubles

C. CORTE CON MICROTOMO.

– Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obteniéndose cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y después se llevan a un portaobjetos.

– Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material se incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.

– El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgánicos los eliminan. Usa nieve carbónica para congelar el tejido.

– CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material patológico.

El criostato es también muy útil en histoquímica , pues no inactiva las enzimas, pero dificulta la difusión de las moléculas.

– MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. Se congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.

D. COLORACIÓN.

– Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables unos de otros.

– Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.

– La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.

– Los componentes de los tejidos pueden ser:

SUSTRATO COLORANTE EJEMPLOS

BASÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes básicos).

BÁSICO (azul de toluidina y azul de metileno, hematoxilina).

Nucleoproteínas y glicoproteínas ácidas.

ACIDÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes ácidos).

ÁQCIDO (orange G, eosina y la fuschina ácida).

Proteínas básicas del citoplasma.

La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica histológica.

OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los componentes a los que se unen.

TÉCNICA COMPONENTES

NÚCLEO

CITOPLASMA

FIBRAS COLÁGENAS

FIBRAS ELÁSTICAS

RETICULINA

Hematoxilina-eosina

Hematoxilina

Azul – – Irregular –

Eosina – Rosa Rosa Irregular –

Hematoxilina férrica

Negro – – – –

Tricromo Masson

Fuchina-ácida y Panceau

– Rojo – – –

Verde luz – – Verde – –

Fuchina-resorcina

Fuchina y resorcina

– – – Púrpura –

Impregnación argéntica

Sales de plata

– – Castaño – Negro

Los factores que influyen en la tinción son:

– Pureza y concentración del colorante.

– pH y temperatura.

– Tiempo.

E. METACROMASIA.

Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul de toluidina, se modifica el color azul por unión al tejido, pasando a púrpura. A este fenómeno se le denomina metacromasia.

Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos, como el azul de toluidina y tionina. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados cromotropos, son principalmente:

– Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo.

– Nucleoproteínas.

F. MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS.

Las técnicas de tinción pueden ser:

– VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. Se inyecta al animal vivo.

– SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células o tejidos que permanecen vivos después de ser separados del organismo.

Ejemplos:

– El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis.

– El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.

– El verde jano tiñe las mitocondrias.

– La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio de la formación del hueso.

G. CRIOFRACTURA.

Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactos producidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). Sirve para el examen de cortes ultrafinos.

Fases:

1º. Congelar el tejido a temperatura muy baja.

2º. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muy baja temperatura y en alto vacío, así se elimina el agua por sublimación. La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas estructuras de los tejidos.

3º. Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de carbono.

4º. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un aspecto sombreado.

5º. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por una sustancia que no ataque el molde (ácido fuerte, hipoclorito sódico).

6º. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al

Introducción.

Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) surgen en los años 50 como herramienta para la detección de antígenos celulares. Una idea simple y elegante que amplió la capacidad de diagnóstico de la Anatomía Patológica. Utilizadas de forma rutinaria en Patología Humana desde hace años, su uso aparece más restringido en Patología Veterinaria, siempre mucho más limitada por factores económicos. Sin embargo, de forma progresiva y especialmente debido a la mejora de los tratamientos oncológicos, su demanda se va generalizando.

El objetivo de la técnica es detectar, amplificar y hacer visible un antígeno determinado (generalmente una proteína). Para la detección específica se emplean anticuerpos dirigidos especialmente contra el antígeno buscado (es el llamado “anticuerpo primario”). Para amplificarlo se emplean también anticuerpos, dirigidos contra el anticuerpo primario (son los llamados “anticuerpos secundarios”). Finalmente, para visualizar el conjunto se emplea una combinación de Avidina, Biotina y Peroxidasa que permite, mediante una simple reacción química local, colorear y hacer visible al microscopio la cadena de anticuerpos.

Concepto

La inmunohistoquímica es un estudio histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico, correctamente fijada e incluida en parafina. El complejo antígeno - anticuerpo así formado, mediante la utilización de alguna de las técnicas específicas (peroxidasa antiperoxidas, fluoresceína, etc.), permite ser localizado e identificado dentro

La aplicación de los principios básicos

La tinción inmunohistoquímica en la investigación biomédica tiene un papel muy amplio. E implica muchas áreas de investigación. Sin embargo, la técnica de inmunohistoquímica tiene sus

INMUNOHISTOQUIMIC

A

limitaciones, por ejemplo, las células del tejido que la sustancia de ensayo antígeno, pero también es necesario tener una cierta concentración antes de la detección, la detección de la proteína inmunorreactiva no se puede determinar que nueva síntesis celular transporte de proteínas a partir oa través de proteínas de células, por lo tanto, en el diseño experimental debe tener plenamente en cuenta estas características. Si el experimento tiene necesidad de demostrar qué tipo de células de la síntesis de proteínas conocido requiere el uso de la técnica de hibridación in situ para resolver. Para guiar a los principiantes en el diseño experimental, el uso razonablemente inteligente de técnicas de inmunohistoquímica, para aplicar los principios básicos que se resumen a continuación:

1. Identificar los tipos de células y tejidos dentro de alguna forma de proteínas específicas de tejido, tales como proteína ácida fibrilar glial (gial proteína ácida fibrilar, GFAP) existe sólo en los astrocitos. Neurofilamentos (microfilamentos, NF) sólo está presente en las células nerviosas. Estos por lo general tienen una proteína llamada proteína marcadora específica de tejido (Proteiniliaker). La proteína marcada por un anticuerpo específico para determinar los tipos de células. Algunas células (Tabla células y células de melanoma, etc) en el microscopio de luz no es fácil de identificar, a través de la implementación de las proteínas específicas dentro de la tinción inmunohistoquímica citoplasma, se puede demostrar claramente que tales células contorno. Este papel de la neurociencia y la investigación clínica del cáncer patología es particularmente importante.

2. Uso de los productos de células para identificar el origen del producto de ciertas células como antígeno, los anticuerpos correspondientes preparados, células de modo de realización de la tinción inmunohistoquímica para identificar la fuente de productos de células. Tal como células endocrinas producen una variedad de hormonas, la mayor parte de las técnicas de tinción inmunohistoquímica para identificar disponibles, que pueden examinar la función de las células y la clasificación funcional para tumores endocrinos para la detección de tumores secretores de hormona ectópicos, etc, para entender la diferenciación celular. La tinción inmunohistoquímica (DAB cromógeno)

3. Determinar el grado de diferenciación de célula de un grado de la diferenciación del mismo tipo de células expresan diferentes proteínas de múltiples icónico, sobre la base de la identificación de estas diferentes proteínas para determinar el grado de diferenciación de las células. Por ejemplo, un símbolo de células neuroepiteliales proteína nestina (nestina), cuando la diferenciación de las células gliales radiales expresó vimentina (vimentina). En la ocurrencia de la diferenciación neuronal en las células neuronales se expresa neuronal Ⅲ tubulina β (TUJl), una diferenciación de las células del nervio en neuronas maduras, proteína de los neurofilamentos expresado (neurofilamentos, NF).

4. Seguimiento de las fibras nerviosas y su área de proyección para ello métodos inmunohistoquímicos son a menudo asociados con el transporte axonal Combinación trazadores para estudiar los vínculos entre las neuronas. Axonal método de los trazadores de transporte es el uso de ciertas sustancias puede ser nervio consumo finales. Calidad del haz transporte retrógrado Warp a las características del cuerpo celular. Método histoquímica muestra el esquema de las neuronas. Comúnmente se utiliza trazadores peroxidasa de rábano picante y oro fluorescente. Por ejemplo. Para observar el sistema nervioso periférico o el sistema nervioso central de un núcleos de proyección de las fibras nerviosas. En primer trazador inyectado en animales terminaciones nerviosas de fibra partes de los animales sobrevivieron durante algún tiempo a la espera de las

fibras nerviosas de las partes salientes dibujadas, primero por medio de trazadores químicos a través de posicionamiento organizacional, re-introducción de la inmunohistoquímica para determinar su naturaleza.

5. En las aplicaciones clínicas, tales como la identificación de las lesiones patológicas, las lesiones pequeñas encontraron explorar fenotipo diferenciado de origen tumoral o para determinar el estadio del tumor, el tratamiento y el pronóstico de guía. Asistido diagnóstico de la enfermedad y la clasificación, encontrar otra etiología infecciosa.

Operaciones vinculadas

Equipo

1) 18cm olla de acero inoxidable de presión o una estufa o microondas médica;

2) baño de agua

Reactivos

1) solución tampón de PBS (pH 7,2 ~ 7,4): NaCl 137mmol / l, Kcal 2,7 mmol / L, Na2HPO4 4,3 mmol / L, KH2PO4 1,4 mmol / L.

2) 0,01 mol / l de tampón citrato (CB, pH 6,0, 1000 ml): 3 g citrato de sodio, 0,4 g de ácido cítrico.

3) 0,5 mol / l de solución tampón de EDTA (pH 8,0): 700 ml disuelto 186.1gEDTA · 2H2O, con 10 mmol / L NaOH se ajustó a pH 8,0, agregar agua a 1000 ml.

4) 1 mol / L de tampón TBS (pH 8,0): Base 121gTris disueltos en 800 ml, se ajustó con HCl 1N pH 8,0, añadir agua hasta 1000 ml.

5) digestión de la enzima: una, solución de tripsina al 0,1%: un 0,1% de CaCl2 (pH 7,8) preparación. B, solución de pepsina 0.4%: preparado con HCl 0,1 N.

6) 3% de metanol-solución de H2O2: con H2O2 al 30% y 80% preparación de la solución de metanol.

7) sello de agente de monta:

TECNICAS

La principal aplicación de las técnicas de IHQ radica en la identificación y diferenciación de tipos celulares, especialmente en el caso de neoplasias de fenotipo dudoso o indeterminable mediante la valoración habitual con tinción de hematoxilina y eosina. Existen otras aplicaciones, como la valoración pronóstica de ciertos tumores (marcadores de progresión) o la identificación de agentes infecciosos.

Aplicaciones en Patología Oncológica:

1. Clasificación de neoplasias indiferenciadas: carcinoma / sarcoma / linfoma / melanoma (Tabla 1)

2. Identificación de metástasis de origen desconocido.

3. Distinción Carcinoma / Adenocarcinoma (Tabla 2).

4. Distinción Carcinoma / Mesotelioma. 5. Identificación de carcinomas neuroendocrinos. 4. Distinción y clasificación de Sarcomas (Tabla 3)

. 5. Distinción Hiperplasias linfoides / Linfomas y subclasificación de Linfomas ( T o B) (Tabla 4).

Relación de Anticuerpos Primarios disponibles :

Citopat Veterinaria dispone del siguiente banco de anticuerpos primarios:

• AE1: proteína expresada por la mayoría de epitelios simples y epitelio basal epidérmico.

• AE3: proteínas (queratinas) de alto peso molecular presentes en epitelios de transición (ej. Urotelial) y escamosos (epidermis).

Tinción para GFAP: marcaje específico para astrocitos (en marrón) en un corte de tejido nervioso. El marcaje se limita de forma muy específica a las zonas que contienen el antígeno buscado. La tinción en azul de fondo se emplea como contraste. 4 CitopatVeterinaria s.l. Diagnósticos Anatomopatològics Font del Remei, 28-30 08023 Barcelona Tlf. 93 213.68.13 Fax: 93 285.20.91 info@citopatveterinaria.com • Alfa-AT (alfa-1-antitripsina): proteína enzimática intralisosomal presente en células histiocíticas (histiocitomas vs mastocito más, histiocitosis). • Cadenas Kappa y Lambda: marcadores de células plasmáticas y sus neoplasias. • CAM5.2: cito queratina de bajo peso molecular. Marcador de célula epitelial que permite identificar como tales carcinomas pobremente diferenciados. • CD3: marcador muy específico de células T, útil en el fenotipaje de linfomas. • CD31: proteína expresada por las células endoteliales, útil en el diagnóstico de angiosarcomas. • CD45RA (4KB5): presente en células linfocíticas de tipo B, una subpoblación de célula T y célula monocítica. • CD79a: marcador de célula B, útil en el tipaje de linfomas. • CEA (antígeno carcinoembrionario): proteína que expresan muchos adenocarcinomas (pulmón, páncreas, vías biliares, gastrointestinales, endometriales. • CROM (cromogranina) y SYN (sinaptofisina): proteínas presentes en muchos tipos de célula endocrina y neuronal. Presentes en la mayor parte de tumores neuroendocrinos bien diferenciados. • DES (desmina): proteína presente en células musculares lisas, estriadas y cardíacas, útil en la identificación de leiomiosarcomas y rabdomiosarcomas, principalmente éstos últimos. • ER (receptores de estrógenos): proteína presente en el tejido glandular mamario. Presente en la mayoría de lesiones bien diferenciadas. Su presencia en neoplasias carcinomatosas tiene implicaciones terapéuticas y pronósticas. • GFAP (glial fibrillary acidic protein): presente en astrocitos y célula ependimarias, ausente en oligodendrocitos y neuronas. Positivo en la mayor

parte 5 CitopatVeterinaria s.l. Diagnòstics Anatomopatològics Font del Remei, 28-30 08023 Barcelona Tlf. 93 213.68.13 Fax: 93 285.20.91 info@citopatveterinaria.com • de astrocitomas (se pierde parcial o completamente en gliomas multiformes o de alto grado). Presente también en paragangliomas, feocromocitomas. • HMB-45: antígeno presente en la mayor parte de lesiones melánicas, benignas o malignas. • LCA (antígeno leucocitario común): expresado en linfocitos B y T y sus neoplasias. Útil en la identificación básica de un linfoma frente carcinomas, sarcomas o melanomas. • MBP (myelin basic protein): proteína presente, entre otras, en célula de schwann, útil en la identificación de neoplasias de este origen. • MIB-1 / Ki-67: proteína intranuclear que participa en en el ciclo celular. Su presencia e intensidad dan idea del índice de proliferación de una neoplasia maligna y tiene, por tanto, utilidad pronóstica. • NF (neurofilamentos): proteína expresada por neuronas. Positivo en neuroblastomas y feocromocitomas. • NSE: proteína poco específica presente en algunos gliomas, neoplasias de origen neural y neuroendocrino. • PANk: “cocktail” de queratinas útil en el diagnóstico de carcinomas o la detección de micrometástasis. • PR (receptores de progesterona): receptores hormonales presentes en el tejido glandular mamario. Su presencia en neoplasias carcinomatosas tiene implicaciones terapéuticas y pronósticas. • S100: proteína útil en la identificación de neoplasias de diferenciación neural y melánica. • VIM (vimentina): proteína presente en las células de estirpe mesenquimatosa. Permite identificar como tales neoplasias sarcomatosas mal diferenciadas. 6 CitopatVeterinaria s.l.

BIBLIOGRAFIA:

http://www.efn.uncor.edu/departamentos/divbioeco/morfoani/GUIA%20HISTOTECNOLOGIA%20APLICADA%202015.pdf

http://es.swewe.net/word_show.htm/?276797_1&La_inmunohistoqu%C3%ADmica