Isidro Masana Químico de Aplicaciones 17 de Octubre,...

Isidro MasanaQuímico de Aplicaciones17 de Octubre, 2003

Optimización Condiciones de Separación en HPLC

Horario: 11.00 - 12.00 a.m. CETTeléfono: 902 011.818 (desde España)+44 20 7162 0180 (desde fuera de España)

Coordinador: José Monge

Optimización Condiciones de Separación en HPLC

1.-Recopilación Información2.-Selección Columna

Selección Fase EstacionariaSelección Dimensiones Columna y Relleno

3.-Estrategias Optimización Composición del EluyenteOptimización en Condiciones IsocráticasOptimización en Condiciones de Gradientes

1.- Recopilación Información

Recopilación InformaciónLa puesta a punto de un nuevo método analítico suele ser muy laboriosa, toda fuente de información que permita reducir el tiempo de experimentación será de gran ayuda.

• Estudiar toda fuente de información:• Experiencia personal, aunque sólo sea en productos parecidos.• Contactar con gente del sector con posible experiencia en la analítica de interés.

• Bibliográfica• Internet:

Búsqueda notas de aplicación Agilent Technologies:http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteratureSearch.aspBúsqueda de cromatogramas Agilent Technologies:http://www.chem.agilent.com/scripts/chromatograms.aspWeb Agilent Technologies:http://www.chem.agilent.com Web Agilent Technologies en castellano:http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ESUS EPA, Pesticides: Analytical Methods & Procedures:http://www.epa.gov/oppbead1/methods/US EPA: Index of Residue Analytical Methods List 1 - B:

http://www.epa.gov/oppbead1/methods/ram12b.htm

OBJETIVO: Reducir en la medida de lo posible la LABORIOSA y COSTOSA EXPERIMENTACIÓN en Laboratorio

2.- Selección Columna

¿Long.: 30 - 50 - 75 -150 200 - 250 µm ?

???¿ C3 - C8 - C18 Fenilo - CN -

Silica ?

¿D.I.: 1.0 - 2.1-3.0 - 4.6 mm?

¿StableBond

Eclipse XDB Bonus-RP Extend ?

¿T.P.: 1.8 - 3.5 -5 - 7 - 10 µm ?

¿Fase Normal - Reversa -Intercambio Iónico - GPC -

GPC?

RECURRIR A TABLAS DE SELECCIÓN DE FASE ESTACIONARIA/MÓVIL• Tener en cuenta M analito:

• M < 2000 emplear columnas porosidad 60 a 120 A• M > 2000 emplear columnas porosidad > 300 A

• Tener en cuenta incompatibilidades/limitaciones de las columnas:• COLUMNAS DE SILICA: 2 < pH < 9 (excepto con Zorbax Extended: pH < 11.5)

(excepto con Zorbax StableBond: 1 < pH y 90º C18)

Alta Resistencia Mecánica• COLUMNAS POLIMERICAS 1 < pH < 13

Baja Resistencia Mecánica• Para trabajar en Fase Reversa con fases móviles 100% acuosas se

recomienda (para evitar el “colapso” de la fase estacionaria) la utilización de columnas que tengan insertado un grupo polar en medio de la cadena alquílica (hidrofóbica) (p.e. una amida en las Zorbax Bonus-RP).

• Columnas AMINO son incompatibles con ALDEHIDOS y CETONAS (por formación bases de Schiff).

• Temperatura: sino se indica lo contrario se recomienda trabajar a < 60ºC, o a <40ºC si se trabaja a pH’s neutros o básicos (si la presión no es elevada - temperaturas bajas pueden prolongar la vida de la columna)

Selección Fase Estacionaria

Selección Genérica de Fases Móviles / Estacionarias

Solubilidad

Peso Molecular

Analitos

Peso Molecular

Analitos

Soluble en disolvente orgánico

Soluble en agua

Peso Molecularinferior a

2000

Peso Molecularsuperior a

2000 Soluble en agua

Soluble en disolvente orgánico

Permeación de gel GPC

THF, Tolueno, Cloroformo

Fase Móvil

Soluble en Etanol

(moderadamente polar)

Fase Normal:CN *c

Fase reversa C18, C8*b

Fase reversa con Control ionización

C18, C8

Par iónico C18

MeOH, ACN, Isopropanol, THF,

CH2Cl2, n-Hexano*a

Empezar con n-Hexano, adicionar

CH2Cl2, AcOEt, THF Isopropanol

MeOH/Agua ACN/ Agua

Tampones en MeOH/AguaACN/Agua

HSA (para +) o TBA (para -) en tampónes MeOH-ACN/Agua

Fase reversa no acuosa C18*b

Adsorción (líquido-

sólido): Sílica F.Nor.: CN *c

F. Nor.:NH2, Adsorción:

Sílica

NH2, CN *c

Par Iónico C18

SCX, SAXIntercambio


CH2Cl2, AcOEt, THF, Isopropanol


CH2Cl2, AcOEt, THF, Isopropanol

MeOH/Agua ACN/Agua

HSA (para +) o TBA (para -)

en tampónes MeOH-ACN/Agua

Soluciones tampón que

varíen en fuerza iónica y pH

Filtración de gel GFC

Fase reversa*dC1·C18 de poro ancho

Intercambio iónico

Agua o soluciones tampón

MeOH/Agua ACN/Agua

Soluciones Tampón

*a Ojo MeOH y ACN no son totalmente miscibles con n-hexano

8 (XDB)CN)

Prop. Muestra 1ª OpciónMuestra 2ª OpciónFase Móvil

Soluble en n-Hexano (no polar)

No iónica

Ionizable

Iónica

HSA: ácido hexanosulfónicoTBA: hidróxido tetrabutilamonioTHF: tetrahidrofuranoMeOH: metanolACN: acetonitrilo

*b Por ejemplo una Zorbax Eclipse XDB C18 ó C*c Por ejemplo una Zorbax StableBond CN (SB-*d Por ejemplo una Zorbax 300-StableBond o 300-Extended

Características Genéricas de algunas Fases Estacionarias

Separación de compuestos no polares acompuestos de moderada polaridad

Separación de compuestos de moderada a elevada polaridad (solubles en agua)

Separación de péptidos y proteínas

Compuestos de polaridad moderada

NP:Separa compuestos polares de forma similar a la sílice no modificada / RP: Retiene menos que una C18 los compuestos apolares y algo más

los compuestos muy polares

Separación de compuestos con dobles enlaces

Utilizable en 3 modos distintos: fase normal, intercambio aniónico débil y fase reversa de

compuestos polares.

Igual que la fase Amino

Es menos polar que la sílice no modificada

Cromatografía de Intercambio iónico. Intercambiador catiónico.

Cromatografía de Intercambio iónico.Intercambiador aniónico.

Octadecil

Octil

Propil

Fenil

Ciano (Nitrilo)

Nitro

Amino

Dimetilamino

Diol

Ácido sulfónicoAmonio

Cuaternario

-(CH2)17 -CH3

-(CH2)7 -CH

-(CH2)3 -CH3

-(CH2)3 -

-(CH2)3-CN

-(CH2)3- -NO2

-(CH2)3 -NH2

-(CH2)3 -N(CH3)2

-(CH2)3 -O-CH2-CHOH-CH2OH

(CH2)3- -CH2-N-(CH3)3 Cl-+

C18 – ODS

C8 - MOS

C3

C6H5

CN

NO2

NH2 - APS

N(CH3)2

OH

SAX

SCX -(CH2)3 - -SO3 Na+-

FASE Grupo Grupo Orgánico Si-C Aplicaciones Típicas

Análisis Compuestos Ionizables: Interacciones Columnas Base Silica No Protegidas

Los silanoles ionizados efectuaran intercambio catiónico con las bases protonadas NH+R3, dando lugar a la

formación colas en los picos y reduciendo la repetibilidad del método. La presencia de metales en la

sílice incrementa la presencia de estos silanoles y aumenta la asimetría en compuestos básicos

La coexistencia de más de 1 mecanismo de separación (p.e. Partición + intercambio iónico)puede dar lugar a la formación de colas en los picos y pérdida de repetibilidad del método

Original ZORBAX SIL (1973)

Highly Purified (99.995%) ZORBAX Rx-SIL

Analito básico

Analito ácido

Adsorción + intercambio catiónico

Sólo Adsorción

Partícula Sílice Porosa

Zorbax

Partícula Sílice: Si-OH Si-O- + H+

Los ácidos desprotonados (carboxilatos) podrán competir por el protón de los silanoles no ionizados, dando lugar a la formación colas en los picos y reduciendo la repetibilidad

del método

Con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables se deberán tener presentes las posibles interacciones entre ambos

Estrategias Análisis de Compuestos Ionizables Básicos

•Estrategia A: Trabajar a pH< 3 NO interaccionan: Sílice NO Ionizada – Analito Básico Ionizado+a*

•Estrategia B: Trabajar a 3 <pH< 8 SI interaccionan: Sílice Ionizada– – Analito Básico Ionizado+

•Estrategia C: Trabajar a pH >8-9 NO interaccionan: Sílice Ionizada– –Analito Básico NO Ionizadob*a*al estar ionizado disminuirá su retención en RP b*compuestos muy básicos podrían aún estar ionizados

Retención en C18 de un

Analito Básico con un pKa=6.5

Consideraciones en Zona B:• Al poder estar analito y silica cargados +/- pueden establecerse interacciones secundarias del tipo “intercambio iónico” (además de la primaria de partición) pudiéndose producir la aparición de colas en el pico. Por ello se recomienda en este caso utilizar columnas tipo “End Capped” o añadiraditivos (p.e. 1%AcNH4 / 20mM TEA/ ...) en fase móvil para disminuir las colas.• Será importante una buena capacidad tamponadora y control del pH(especialmente en la zona pH 5-8 y alrededor del pKa del analito) para una buena reproducibilidad de tiempos de retención.

Carga Analito = Neutra

Carga Analito = Positiva

La estrategia A (a pH ácido) suele ser la 1ª a probar

Con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables se recomienda escoger un tipo de columna adecuada dependiendo de la estrategiautilizada para minimizar posibles interacciones “analito-silanoles”

Análisis Compuestos Ionizables: Selección Tipo de Columna para una “Resolución Duradera”

Rango pH1–6(8)

(2)3–8(9)(2)3–8(9)(2)3–11.5

•Estrategia A (a pH ácido)

•Estrategia B (a pH’s medios)

•Estrategia C (a pH básico)

Para una “Resolución Duradera” utilizar un tipo de columna optimizada para el pH de trabajo

Los voluminosos grupos (R) diisobutilo (C18) o diisopropilo

(C8,C3,CN,Aq, Fenilo) de las cadenas

laterales estabilizan el enlace de las columnas Zorbax StableBond y leproporcionan una largavida a pH’s muy ácidos

incluso a altas temperaturas

Zorbax STABLEBOND

Las columnas Zorbax tipo STABLEBOND ofrecen una

larga vida incluso a pH’s muy ácidos

Retención Tolueno a

pH=0.8 y 90ºC

3 meses

Volúmenes de columna bombeados a su través

analito

• El desarrollo de métodos con columnas Base Sílice y Analitos Ionizables suele empezar probando la “estrategia A” con una columna tipo Zorbax StableBond.• Estrategia A: Trabajar a pH < 3 : Sílice no Ionizada NO Interacciona con analitos Básicos– Analito Básicos estarán totalmente Ionizados+ (si su densidad de carga es muy elevada podrían ser poco retenidos)

– Compuestos ácidos estarán no ionizados (excepto ácidos pKa < 4)y así se maximizará su retención mediante RP y se evitará su interacción con los silanoles ácidos para competir por su protón:

Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una “Resolución Duradera” según Estrategia A : Zorbax StableBond y pH<3

Separación Inicial

Paso 1b

Paso 1e

Picos Solapados

Paso 1d

Picos Solapados

Paso 1a

Paso 2

INICIO

Probar Estrategia C

ZORBAX SB-C18 o SB-C8• pH 2 (1-3), tampón 20-50 mM• T = 30°C (ambiente - 80°C)

[90°C para SB-C18]• Ajuste % ACN para 0,5 < k´< 20

• Añada 20 mM TEA oAcetato TEA o1% AcNH4

• Reajuste el pH.

MUESTRA

• Varíe la temperaturahasta 80°C

(90°C para SB-C18)

• Aumente o disminuya el % de modif. orgánico en un 5% (v/v)

• COMPUESTOS BÁSICOS• Utilizar Par Iónico con MeOH y25-50 mM ácido hexanosulfónico,tampón 10 mM (pH ≤ 3)• Ajuste % MeOH para 0,5<k´<20

• Cambie mod. org. a MeOH o TF• Ajuste % orgánico para 0,5 < k´ < 20• Vuelva a comenzar en el PASO [2]

• Cambie funcionalidad de fase ligadaa SB-CN, SB-C3 o SB-Fenilo• Vuelva a comenzar en el PASO [1]

• Aumente o disminuyael % de modificadororgánico en un 5% (v/v)

• Cambie modif. Orgán.a ACN o THF• Ajuste para 0,5 < k´< 20

Continuar Desarrollo con Estrategia B

ZORBAX StableBondIdeal para pH < 3

Picos con cola

Picos Solapados

Paso 1

Paso 2a

Paso 1c

Varíe la temperatura dentro del rango

recomendado para la fase ligada.

Paso 3

Paso 4

Problemas de Espaciado de los picos

Compuestos Básicosinestables a pH’s ácidos

Picos Solapados

Picos Solapados

Picos Solapados

Picos Solapados

Picos Solapados

Compuestos BásicosPoco Retenidos

Probar Estrategias B ó C

Resumen* Optimización de Compuestos Ionizables según Estrategia A

• Empezar a bajo pH para una óptima reproducibilidad, retención y simetría de pico a largo plazo (si el analito no es estable utilizar estrategias B ó C)

• Empezar con StableBond C18 or C8 para máximo tiempo de vida Utilizar columnas de “Resolución Rápida” (3.5µm y p.e. 50 a 150mm de long.) para agilizar el desarrollo del método.

• 20-50mM Tampón pH 1 – 3 para óptimo perfil del picoSi los picos presentan colas añadir al tampón 20mM TEA ó 1% AcNH4

• Empezar con un elevado porcentaje de acetonitrilo o metanol para el reconocimiento inicial de la muestra

• Ajustar % orgánico* para maximizar la resolución y ajustar la retención entre (0.5) 1<k’<10 (20) Factor Capacidad: k’= (tr-t0)/t0 Si los compuestos básicos no se retienen añadir utilizar “Par Iónico” o la estrategia C

• Modificar selectividad cambiando a metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano si no se consigue suficiente resolución

• Modificar selectividad cambiando de fase estacionaria si no se consigue suficiente resolución: SB-CN, SB-Phenyl, SB-C3

• Utilizar temperaturas elevadas 80ºC (90) si interesa reducir lostiempos de análisis.* Más adelante se presentará una estrategia para la optimización de la composición de fase móvil.

Cambios de Selectivad con Distintas Fases Estacionarias Tipo StableBond

Columna: ZORBAX SB4,6 x 75 mm, 3,5 µm

Fase móvil: 30% ACN70% NaH2PO4, pH 2,5

Flujo: 1,0 ml/minTemperatura: 35°CMuestra: 1. Estriol

2. Daidzen3. Quercetin4. Genistein5. Dietilestilbestrol

Columnas: ZORBAX StableBond4,6 x 150 mm, 5 µm

Fase móvil: 0 – 100% B en 18,8 minA: 50 mM NaH2PO4,pH 2,5 en 95% H2O / 5% ACNB: 50 mM NaH2PO4, pH 2,5 en 47% H2O / 53% ACN

Flujo: 1,0 ml/minTemperatura: 26°CDetección UV: 254 nmMuestra: 1. Procaina

2. Lidocaina3. d-Cinconina4. Butacaina5. Tetracaina

Las columnas CN puede llegar a permitir analizar en isocráticomezclas de compuestos polares y apolares, que con C18/C8 requerirían gradientes de concentración. Ello es posible gracias a que la fase CN, con respecto a una C18/C18 reduce la retención de los compuestos NO polares

y aumenta la de los compuestos más polares. Es una buena opción para el análisis isocrático de analitos con muy distinta polaridad

Incrementar la Temperatura para Reducir el Tiempo de Análisis

Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 mmMobile Phase: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y

0.07% ácido fosfórico26% MeOH

Flow Rate: 1 mL/minDetection: UV 280 nmSample: Vitaminas B

min.

Acorta a 1/3 el tiempo análisis

Baja Temperatura

OptimizaciónMétodo

AltaTemperatura

• La posibilidad de trabajar a temperaturas elevadas permitirá agilizar la realización de pruebaspara estudiar la influencia en la separación de distintos parámetros, la alta estabilidad térmica de las columnas StableBond: hasta 80ºC (90 para las SB-C18) amplían esta posibilidad.

Especificaciones Rellenos Zorbax StableBond

RECORDATORIO: para una buena repetibilidad de los tiempos de retención será especialmente importante un buen control del pH de la fase móvil, cuando éste sea próximo al pKa (+/-1 (2)) de alguno de los analitos, dada la gran variabilidad en su grado de ionización en esta zona

99% ionización1% ionizaciónpH=pK-290% ionización10% ionizaciónpH=pK-150% ionización50% ionizaciónpH=pK10% ionización90% ionizaciónpH=pK+11% ionización99% ionizaciónpH=pK+2

Comp. BásicosComp. ÁcidospH

x100 x100

Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una “Resolución Duradera” según Estrategia B: Zorbax Eclipse XDB a pH 7

Paso 6a

Paso 5

Sílice Ionizada– – Analito Básico Ionizado+ SI interaccionan

Estr. A • COMPUESTOS ÁCIDOS• Utilizar Par Iónico con MeOH y25-50 mM Tetrabutilamonio fosf.

Paso 5bCompuestos Ácidos

Poco Retenidos

IA B(9).

ZORBAX XDB-C18 o XDB-C8• pH 7 (6-9), tampón 20-50 mM• T = 30°C (ambiente - 40°C)• Ajuste % MeOH para 0,5 < k´< 20

ESTRATEG(3) 6<pH<8

en tampón 10 mM (pH > 7)• Ajuste % MeOH para 0,5<k´<20

Las columnas Zorbax Eclipse al estar doblemente

desactivadas no requieren la adición de TEA ó AcNH4 para eliminar colas en compuestos

básicos

Estr. CPaso 5e

Probar Estrategia

C

• Cambie modif. Orgán.a ACN o THF• Ajuste para 0,5 < k´< 20

Picos Solapados

• Cambie funcionalidad de fase ligadaa XDB-Fenilo o Bonus-RP• Vuelva a comenzar en el PASO [5]

Paso 8Picos Solapados

Picos Solapados

Paso 5d

Picos SolapadosPaso 6

ente o disminuya el % de ánico en un 5% (v/v)

Paso 7


Picos Solapados

• Aumente o disminuyael % de modificadororgánico en un 5% (v/v)

Paso 5c

Varíe la temperatura dentro del rango

recomendado para la fase ligada.

Picos SolapadosPicos

Solapados• Varíe la temperatura

hasta 60°C • Aummodif. org

• Cambie mod. org. a AcN o THF• Ajuste % orgánico para 0,5 < k´ < 20• Vuelva a comenzar en el PASO [6]

Resumen* Optimización de Compuestos Ionizables según Estrategia B a pH Medio• Se deben utilizar columnas Desactivadas (“End Capped”) o añadir aditivos (p.e. 1%AcNH4 /

20mM TEA/ ...) en fase móvil para disminuir las colas.• Será importante una buena capacidad tamponadora y un buen control del pH.• Si el compuesto ionizable no se resuelve bien a pH ácido (estrategia A), intentar pH medio

p.e. pH 7 (6–8) con una fase doblemente desactivada como la Eclipse XDB-C18 o C8 y seguir el mismo proceso descrito para StableBond (slide 14 - excepto pH utilizado). En estas condiciones se suele aumentar la retención de los compuestos básicos con pK’s inferiores o próximos al pH de trabajo (+ 1unidad pH).

• Si se requiere cambiar la selectividad utilizar la fase Eclipse XDB-Fenilo como alternativa.

SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 mm Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 mm

Fase móvil: 20% Metanol / 80% (20 mM fosfato+10 mM TEA ajust. pH 7) Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: ambienteDetección: UV 254 nm Muestra: 1. Nizatidina 2. Famotidina 3. Cimetidina 4. Pirenzipina

pH 3 pH 7

Time (min)0 2

2

1

3

4

4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 14Time (min)

2

1

3

4

Al subir el pH de 3 a 7 disminuirá el grado de protonación de

compuestos básicos débiles (pK’spróximos a 7) aumentando su

retención

Esquema de Optimización de Compuestos Ionizables para una “Resolución Duradera” según Estrategia C a pH Básico con Zorbax Extended

Estrategia C: Trabajar a pH > 9 (típico 10.5)Sílice Ionizada– – Analito Básico NO Ionizadob* NO interaccionan

b*compuestos muy básicos podrían aún estar ionizados

- Para optimizar seguir el mismo proceso descrito para StableBond (slide 14 - excepto pH utilizado).

Paso 10

Estr. B

Paso 10a

Paso 9

ZORBAX Extended-C18 • pH 10.5 (9-12), tampón 5mM NH4OH o TEA, o 20-50 mM Borato u otro tamp.• T = 25°C (ambiente - 40°C)• Ajuste % MeOH para 0,5 < k’ < 20

Picos Solapados

• Varíe la temperaturahasta 60°C

• Cambie a AcN o THF• Ajuste el % de modif. orgánico para 0,5 < k < 20


Estr. C

• Pruebe otro modo de HPLC• Contacte con Agilent Technologies: tel. 901.11.6890

Las columnas Zorbax Extended al estar doblemente desactivadas no requieren la adición de TEA ó

AcNH4 para eliminar colas en compuestos básicos

Ejemplo Compuestos Muy Básicos mediante Estrategia CExtend-C18 para una adecuada Retención y Eficacia a pH’s muy básicosColumna: Zorbax Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Flujo: 1.0 mL/min Detección: UV 254 nm Temperatura: ambiente Muestra: 1. Procainamida pKa 9.2

2. N-acetilprocainamida 3. N-propionilprocainamida

50% 25 mM Na2HPO4, pH 7.050% MeOH

50% 20 mM TEA, pH 1150% MeOH

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

2

13

Time (min) 0.0 2.5 5.0 7.5

2

1

3

Time (min)

Platos1: 49032: 76213: 7567

Platos1: 94752: 88233: 8794

Al trabajar a pH 11 (2 unidades por encima del

pK de la procaimida) está deja de estar

protonada y aumenta muy apreciablemente la eficacia de la separación

Procainamida pKa 9.2

• La mayor simetría y retención obtenida a pH 11 proporcionará un método más robusto, aunque requerirá utilizar una columna como la Zorbax Extended-C18 adecuada para trabajar a pH’s de hasta 11.5

Análisis de Compuestos Especialmente Difíciles mediante Fases Especiales

COMPUESTOS MUY BÁSICOS

• Pueden presentar importantes colas

• Pueden ser difíciles de retener suficientemente (k’>1 (0.5))

• Opción 1 = ESTRATEGIA C:Zorbax Extend-C18 a elevado pH para mejor retención y simetría del pico

• Opción 2 = Estrategia B pero con columna Bonus-RP para mejor simetría del pico

COMPUESTOS MUY POLARES

• Pueden ser difíciles de retener suficientemente (k’>1 (0.5))

• Pueden requerir altos porcentajes de fases acuosas

• Opción 1: SB-Aq para mayor retención con fases móviles altamente acuosas

• Opción 2: Bonus-RP para utilizar con fases móviles altamente acuosas

Ejemplo Compuestos Muy Básicos mediante Opción 2 Bonus-RP para una óptima simetría

El grupo amida (polar) insertado en medio de la cadena evita: 1.- Minimiza las interacciones “analito-silanoles” proporcionando una excelente simetría2.- El “colapso” (plegamiento sobre si misma) de la cadena alquílica cuando se trabaja con soluciones totalmente acuosas.

0 1 2 3 4 5 6Time (min)

1

2

3

B. Bonus-RPA. Alquil C8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min)

2

3

1

Factor de Cola

1: 1.12: 1.13: 1.1

Factor de Cola

1: 1.82: 1.73: 2.1

Columna: 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Movil: A (col. Alquil C8) : 75% 25 mM NH4Ac, pH 5.5 / 25% ACNB (col. Bonus RP) : 80% 25 mM NH4Ac, pH 5.5 / 20% ACN

Flow Rate: 1.5 mL/min Detection: UV 254 nm Sample: 1. Doxylamine 2. Chlorpheniramine 3. Triprolidine

Grupo AMIDA Polar

Permite trabajar a pH’s muy ácidos

Ejemplo Compuestos Muy Polares mediante Opción 1 ZORBAX SB-Aq proporciona una excelente Retención de Compuestos Muy Polares

2

1

3

4 5

Columna: Zorbax SB-Aq, 4.6 x 150 mm, 5µmFase Móvil: 90% 0.2% TFA

10% ACNTemperatura: 25°CFlujo: 1.5 mL/min.Detección: UV 254 nmMuestra: 1. Maleato

2. Fenilefrina3. Fenilpropanolamina4. Pyrilamina5. Clorofenilamina

160 2 4 6 8Time (min)

10 12 14

• Estos pequeños compuestos polares son difíciles de retener con la mayoría de columnas • La SB-Aq proporciona una excelente retención incluso con un 90% de fase móvil acuosa, y admite pH’s muy ácidos (1<pH<8)

Selección Columnas Zorbax según Código USP (Farmacopea Americana)

Zorbax SAX / SynChropack SAXIntercambio aniónico

fuertemente básico de amonio cuaternario

USP L14

Zorbax GF-250 / Zorbax GF-450 Relleno Esférico Base Sílice con Capacidad Separación

Proteínas de 4.000 a 40.000 Daltons por SEC

USP L33

Zorbax TMSTrimetilsilano en sílice por. 3-10 µmUSP L13

Zorbax GF-250USP L35

Fenilo en sílice porosa5 a 10 µm

CN en sílice porosa 3 a 10 µm

Intercambio Catiónicofuertemente ácido

-NH2 con sílice pososa 10µm

C8 en sílice porosa 5 a 10 µm

Sílice porosa

5 a 10 µm

C18 sílice porosa o micropart. cerám.

3 a 10 µm

Descripción

Zorbax NH2 / Hyp APS / LiChrospher NH2USP L8

Zorbax SCX / SynChropack SCXUSP L9

Zorbax StableBond-Fenilo (SB-Fenilo) / Eclipse XDB-Fenilo (XDB-Fenilo) / Zorbax-FeniloUSP L11

Zorbax StableBond-CN (SB-CN) / Zorbax-CN /LiCrospher CNUSP L10

Zorbax StableBond-C8 (SB-8) / Eclipse XDB-C8 (XDB-8) / Hyp MOS / Hyp BDS-C8 / LiCrospher RP-8 / LiCrospher RP-Select B USP L7

Zorbax RX-Sil / Zorbax Sil / Hyp / LiC 60 SIUSP L3

Zorbax StableBond-C18 (SB-18) / Eclipse XDB-C18 (XDB-18) / Zorb. Rx-C18 / Zorb. ODS / Zorb. ODS classic / Hyp ODS / Hyp BDS-C18 / LiC RP-18 / Pur RP-18 / Sup RP-18 / Nuc 100-5 C18 / Vy 218TP / SynC C18

USP L1

Opciones de Fases Estacionarias Zorbax (y otrasofrecidas por Agilent Technologies):

Código USP

Zorb.:Zorbax / LiC: Licrospher / Pur:Purospher / Sup:Superspher / Hyp: Hypersil / Nuc:Nucleosil / Vy:Vydac / Syn:SynChropak

Selección de Fases Estacionarias según el pH de Fases Móviles Típicas en LC/MS

+++xxxx

Hidróxido AmónicopKa = 9.2

Típicas Fases Móviles en LC/MS

+++++++++Bonus-RP

++++++Extend-C18

++++++++Eclipse XDB

++++++Rx-C18

+++++++++StableBond

Acetato*pKa = 4.8

Formiato*pKa = 3.8

+++

TFAÁcido fuerte

pKa< 2

Fases Estacionarias(Zorbax)

* Usado como ácidos fórmico ó acético o como sus respectivas sales amónicas

+++ : Opción óptima ++ : Opción adecuada x : Opción inadecuada

Fases Estacionarias Específicas

Análisis de PAH’s mediante Fase Reversa y gradientes de

concentraciónPAH’s (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos)• PAH Columns

Fase base sílice tipo Diol para separación en Modo mixto

intercambio iónico/ fase reversa de oligos

Heterodeoxioligo-nucleótidos y

purificación de oligonucleótidos

• ZORBAX Oligo

fragmentos PCR, DHPLC, RAPD, RFLP

Fragmentos DNA de doble cadena

(dsDNA) de 20-1500 p.b. (pares de base)

• ZORBAX Eclipse dsDNA

Columna de Fase Reversa (Asahipak ODP-50) para análisis isocrático de Aniones con AcN/H2O+aditivo par iónico

Aniones en Aguas (F,Cl,Br,PO4, NO2,

NO3,SO4) mediante detección UV/VIS

• Anion Chromatography Kit Column

Columna base sílice funcionalizada con grupos amino para el Análisis de Azúcares por

Fase Normal con mezclas Agua/Acetonitrilo

Mono y Disácaridos• ZORBAX Carbohydrate

Análisis por Fase Reversa y derivatización automática pre-

columna (OPA+FMOC) con MeOH,AcN y tampón Fosfato

(Zorbax) ó Acetato (Aminoquant)

Aminoácidos• Zorbax Eclipse AAA• Aminoquant

ObservacionesAplicaciónFase Estacionaria

Selección Dimensiones Columna y Tamaño delRelleno ¿Long.: 30 - 50 - 75 -

150 - 200 - 250 mm ?

?C3 - C8 - C18 Fenilo - CN -

Silica

StableBond

Eclipse XDB Bonus-RP

Extend

Fase Normal - Reversa -Intercambio Iónico - GPC

–GFC

?

?¿D.I.: 1.0 - 2.1-3.0 - 4.6 mm?

¿T.P.: 1.8 - 3.5 -5 - 7 - 10 µm ?

Selección de la Longitud Columna yTamaño de Partícula del Relleno• La Eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula • El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna.• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo flujo y nº platos proporcionados por la columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder Resolución.

8.6min/3.5min = 2.458.6 3.50 5 min.

2

34

5

6 7 8

1 Longitud columna: 25 cmHypersil ODS, 5 µm Longitud columna: 12 cm

Hypersil ODS, 3 µm

0 min.3

Eluyente: CH3OH/H2O/THF (15/60/25)Flujo: 1.5 ml/minDetector: UV-254 nm, 0.08 AUFSVolumen muestra: 20 mlPicos:

1.- Disolvente2.- Aldosterona, 0.01 mg/ml3.- Estriol, 0.1 mg/ml4.- Androstendiona, 0.008 mg/ml5.- Testosterona, 0.008 mg/ml6.- Estrona, 0.5 mg/ml7.- 17-b-Estradiol, 0.5 mg/ml8.- Progesterona, 0.01 mg/ml

Eluyente: CH3OH/H2O/THF (15/60/25)Flujo: 1.5 ml/minDetector: UV-254 nm, 0.08 AUFSVolumen muestra: 20 mlPicos:

1.- Disolvente2.- Aldosterona, 0.01 mg/ml3.- Estriol, 0.1 mg/ml4.- Androstendiona, 0.008 mg/ml5.- Testosterona, 0.008 mg/ml6.- Estrona, 0.5 mg/ml7.- 17-b-Estradiol, 0.5 mg/ml8.- Progesterona, 0.01 mg/ml

4 67

23

8Proporciona Igual

Resolución y reduce en más del 50% el tiempo

de análisis y el consumo de disolvente

Nº Platos

1

Longitud Columna TP.:10 µm TP.: 5 µm TP.: 3 µm

25cm 7.000 15.000 30.00012cm 3.500 7.500 15.0006cm 1.750 3.750 7.5003cm 900 1.800 3.750

5

Selección Diámetro Interno de la Columna:Aumento Sensibilidad y Ahorro Disolvente

• Reduciendo el D.I. de la columna, pero manteniendo la cantidad inyectada, se mejorará sensibilidad y se ahorrará disolvente. La resolución no cambiará siempre y cuando no se inyecte un volumen excesivo (dependerá del disolvente de la muestra) y la exigencia de un menor volumen muerto del sistema no la haga disminuir si el HPLC no está preparado para ello.

• Consumo Disolvente y Flujo: DI 2.1mm = DI 4.6mm / 5 DI 3mm = DI 4.6mm / 2.35• Sensibilidad: DI 2.1mm = DI 4.6mm x 5 DI 3mm = DI 4.6mm x 2.35

Volumen muerto conexiones+celda detector << Volumen muerto columna

200 ng Bifenil

Columna: Zorbax SB C18

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0.3mm.

0.5mm.

1mm.

4.6mm. ¡ VOLUMEN MUERTO !

¡ Ojo con las conexiones !

Máximo D.I. (mm) recomendable

Código Capilares Metálicos

0.12 Rojo 0.17 Verde 0.25 Azul

D.I. Columna (mm)

2.14.04.6

Código capilares PEEK

Rojo (0.13)

Amarillo (0.18)Azul

Capilares de conexión a utilizar según D.I. columna

Mejora de la Sensibilidad con laReducción del D.I. de la Columna

AplicaciónFlujotípicoD.I. Columna

Ganancia Teórica en Sensibilidad

• En Nano / Cap - LC se pueden inyectar volúmenes “muy grandes” (p.e. 8 µl en nano-LC) mediante configuraciones multi-válvulas.• La Nano-LC interesa cuando se dispone de muy poca de muestra y/o se requiere máxima sensibilidad (p.e. en Proteómica).

Nano-Electrospray

Nano LC 100 µm75 µm50 µm

500 nl/min250 nl/min100 nl/min

Micro LC 1 mm800 µm

40 µl/min20 µl/min

LC Capilar 300 µm180 µm

4 µl/min2 µl/min

LC Estándar 4.6 mm2.1 mm

1000 µl/min200 µl/min

~ 1~ 5

~ 20~ 30

~ 200~ 600

~ 2000~ 3500~ 8500

x10

x200

Req

uerir

á H

PLC

’sad

ecua

dos

Nan

o-11

0011

00 C

apila

r

3.-Optimización Composición del Eluyente• Optimización en Condiciones Isocráticas• Optimización en Condiciones de Gradientes

Optimización Resolución Cromatográfica

0,2

0,5

1

23

4 510

20

0,000,100,200,300,400,500,600,700,800,901,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

K'

k'/k

'+1

k'/k'+1

k' k'/k'+1 T. análisis0,2 0,17 1.2 x T0

0,5 0,33 1.5 x T0

1 0,50 2 x T0

2 0,67 3 x T0

3 0,75 4 x T0

4 0,80 5 x T0

5 0,83 6 x T0

10 0,91 11 x T0

20 0,95 21 x T0

La mejora de Resolución es muy importante al

incrementar la retención hasta K’= 5

x 2 10%K’: 5 10x 2100%K’: 0.5 2x 2 40%Long. x 2

Incremento Tiempo Análisis

% Mejora Resolución

Parámetro Modificado

RETENCIÓNPoder Eluotrópico Eluyente% modificador Orgánico

SELECTIVIDADFase Estacionaria y SoportepH Fase Móvil (si pH próximo a pK)

Modificador Orgánico y su %Aditivos Fase MóvilTemperatura

Rs = f ( K’/[K’+1] )FLOW

3 µm

5 µm

10 µm

N

< 2 µm (STM)

OBJETIVO Rs > 1.5 (2)* 1 < K'< 10Rs= 0.25 N1/2 ((α- 1)/ α ) (K'/(K'+1))ISOCRÁTICO:

EFICACIATamaño Partícula del RellenoLongitud de la ColumnaExcesivos Volúmenes Muertos (-)Flujo:

El incrementar la retención por encima de K’=5 apenas mejorará la resolución

Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.56 ( Tr / w50%)1/2

α = (T2 – T0)/(T1 – T0) K’ = (Tr – T0) / T0* Para picos de tamaños muy distintos se recomienda Rs > 2

1.-DESARROLLO INICIAL: OBJETIVO: LOCALIZAR EL ULTIMO PICO DE LA MUESTRA.Empezar con gradiente 5-100% orgánico en 20 min. Flujo 1-1.5 ml/min.O bien con 100% orgánico (si no se dispone de equipo de gradientes).

Optimización Condiciones Isocráticas *Ejemplo optimizacion para Fase Reversa*:

Rs=2(T1-T2)/(Wb1+Wb2)Rs=0.25 ((α- 1)/ α ) N1/2 (K'/(K'+1)) OBJETIVO Rs > 1.5 (2) 1 < K'< 10

2.-OPTIMIZACION PODER ELUOTROPICOReducir sistemáticamente %orgánico (80,60,50,40%,....), o bien tener en cuenta:

OBJETIVO: MEJORAR RESOLUCION.

• DISMINUCION 10% ORGANICO ===> K’2 = (2 ó 3) x K’1 K’1 = (Tr-To)/To Log K’ =aprox flineal(%orgánico)• PARA CADA COMPONENTE EXISTE UN UMBRAL DE %ORGÁNICO POR DEBAJO DEL CUAL,

ÉSTE QUEDA RETENIDO EN CABEZA DE COLUMNA.• ESTE UMBRAL CORRESPONDE APROX. AL 50% DEL QUE PRODUCE K'= 1

3.- OPTIMIZAR "MODIFICADOR ORGANICO" OBJETIVO: MEJORAR SELECTIVIDAD.Emplear tabla de isoeluotropicidades, para cambiar "modificador orgánico"sin cambiar poder eluotrópico

4.- OPTIMIZAR MEZCLA TERNARIA DE "MODIFICADORES ORGANICOS"Con la ayuda de un diagrama ternario optimizar la mezcla de modificadores

MEZCLA TERNARIA

MEZCLA BINARIA

ACETONITRILO/AGUA

METANOL / AGUA

THF / AGUA

FASE REVERSA

CLORURO METILENO / HEXANO

THF / HEXANOAcOEt/HEXANO

FASE NORMAL

* Las condiciones descritas hacen referencia a Fase Reversa (con agua y solvente orgánico). Si se trabaja en Fase Normal habrá que sustituir el concepto de “solvente orgánico” por el de “solvente más polar” y el de “agua” por “solvente menos polar”.

Composición Fase Móvil "versus"Fuerza Elutrópica

Acetonitrilo / Agua

Metanol / Agua

Tetrahidrofurano / Agua

72%

53%

80%

%MeOH %ACN %THF20 15 1040 30 2560 50 3880 72 53

100 98 72

%ACN %MeOH %THF20 30 1840 50 3060 72 4580 85 58

100 >100 72

%THF %MeOH %ACN20 35 2840 65 5560 88 8280 >100 >100

100 >100 >100

“Ejemplo” Optimización Mezcla Ternaria de "Modificadores Orgánicos"

A

B

C

METANOL / AGUA 80/20

K'= 1 K'= 10ACETONITRILO/AGUA 70/30THF / AGUA

MEZCLA CH3OH/ACN/H2O 40/35/25


A

BC

K'= 1 K'= 10

ACETONITRILO / AGUA 70/30A

B

C

METANOL / ACETONITRILO / AGUA 40/35/25

K'= 1 K'= 10K'= 5

GRADIENT ELUTION

Ejemplo Comparativo de Elución Isocrática “versus” Gradientes


2

3

45

6


2

3

4

5

GRADIENTE CH3OH/H2O 70/30 A 100/0 1

2

3

45

6 7

METANOL / AGUA 90/101+23

7

4

56

Si K’último pico / K’primer pico > 20 mejor utilizar gradientes

Estrategia Optimización Gradientes de Concentración

GRADIENT ELUTION

(Ejemplo en FASE REVERSA)

Rs=0.25 ((α-1)/ α ) N1/2 (K'/(K'+1)) OBJETIVO Rs > 1.5 (2) 1 < K'< 10K‘: valor promedio de K’ durante el gradienteTiempo equilibrado columna (aprox.)* = 0.15 x T0 x %

* Se podría disminuir equilibrando la columna a un flujo mayor.

1.-DESARROLLO INICIAL:Gradiente 5-100% orgánico en 20 min. *a

Seleccionar Tg óptimo para gradiente 5-100% *b

% orgánico100%

50%

0%0 min.20 40 60

*a Se recomienda empezar con un 5% de solvente orgánico para evitar el colapso de las fases estacionarios standard.

Flujo 1-1.5 ml/min.

2.-OPTIMIZACION PENDIENTE GRADIENTE

% orgánico100%

50%

0%0

% orgánico

20 40 60 min.

a) Si Globalmente Falta Resolución Incrementar Tg a 40/60 min

b) Si Globalmente Sobra Resolución Reducir Tg a 10/15 min.

100%

50%

0%0 10 15 20 min.

inicialinicial

Óptimo en el ejemplo

propuesto*b Si el primer pico aparece muy retenido se puede avanzar empezando con más de un 5% de solvente orgánico.

Optimización Gradientes de ConcentraciónGRADIENT

ELUTION

3.-OPTIMIZAR % ORGANICO INICIAL (Xi)

4.-OPTIMIZAR % ORGANICO FINAL (Y)Reducir % orgánico final a 80,60,40%,...manteniendo constante la pendiente del gradiente

El correspondiente Tg vendrá dado por:

Tg = (Xi ópt.- Y) (Tg óptimo)/(100-Xi ópt.)

Aumentar % orgánico inicial de 5 a 15,30,40%,...

El correspondiente Tg vendrá dado por:

Tg = (100- X) (Tg óptimo)/(100-5)

manteniendo constante la pendiente del gradiente para que el primer pico eluya aprox. a 2xT0 (K’=1)*a

5.-OPTIMIZAR PERFIL MEDIANTE GRADIENTE MULTILINEAL

minutos

SI FALTA RESOLUCION EN LA ZONA FINAL.

SI FALTA RESOLUCION EN LA ZONA INICIAL.

6.-OPTIMIZAR SELECTIVIDAD CAMBIANDOMODIFICADOR ORGANICO

minutos

Disminuir la pendiente del gradiente donde falteresolución e incrementarla donde sobre. *b

Resolver picos aún solapados, mediante un cambiode selectividad al cambiar de "modificador orgánico".

¡ OJO CON LOS CAMBIOS DE ORDEN DE ELUCION !

Nuevo Óptimo en el ejemplo propuesto: 30

Óptimo previo en el ejemplo propuesto

minutos

% orgánico100%

50%

0%

0 20 40

X Óptimo inicial en el ejemplo propuesto

30

18

18

% orgánico100%

% orgánico100%

50%

0%

0 20 40

50%

0%

0 20 40

Y

Xi

30Nuevo Óptimo en el ejemplo propuesto: 18

*a Se deberá aumentar la retención si coeulye con algún otro pico. *b Con gradientes multilineales ir resolviendo los solapamientos en orden creciente de tiempo de retención

Conviene minimizar la variación en %orgánico para minimizar el tiempo de equilibrado de la columna

GRADIENT ELUTION“Factor de Capacidad / Retención” en

GradientesK‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Parámetro dependiente de:• Analito • Modificador Orgánico

Flujo (ml/min)

“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes

Volumen muerto de la columna

Tiempo del gradiente (min) % de incremento de Modificador Orgánico•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico. •Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula

2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.

Si K’ se mantiene constante el poder de separación no variará

EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando FAl mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C84.6x50, 3.5µm

Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 minFase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: MetanolFlujo: 2 y 3 mL/minTemperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina 4. Lidoflazina 5. Flunarizina

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/minTg = 3 min

3min

0.0 0.5

F = 3.0 mL/minT

1

2 3

4

5

1.0 1.5 2.0 Time (min)

g = 2 min

2min

“Factor de Capacidad / Retención” en Gradientes: ejemplo Mejora Separación

GRADIENT ELUTION

K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S) Si K’ se aumenta el poder de separación mejorará

4.6 x 150 mm, 5 µmN = 12,000(V0=1.5ml)

EJEMPLO 3 - MEJORA RESOLUCIÓN : Reducir V0 (el resto de parámetros no se modifican )

4.6 x 75 mm, 3.5 µm (V0=0.75ml)N = 10,000

EJEMPLO 2 – MEJORA RESOLUCIÓN: Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )

Columna: ZORBAX SB-C84.6 x 150 mm, 5 µm

Gradiente: 20 – 60% B en 10 ó 60 minFase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: AcetonitriloFlujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°CMuestra Herbicidas: 1. Tebuthiuron 2. Prometon

3. Prometryna 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 10 minFase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: AcetonitriloFlujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°CMuestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon


15min

Tg = 10 min

0 5 10 15Time (min)

1,2

34 5

8

6,7

4

2

0 25 50Time (min)

13

5

86

7

Tg = 60 min

15min

50min

2

0 5 10 Time (min)

13

4

5

6 7

8

12min

1,2

34 5

6

7

8

0 5 10 15Time (min)

“Factor de Capacidad / Retención” en Gradientes: ejemplo Optimización de Múltiples Parámetros

GRADIENT ELUTION

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 15 y 60 minFase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: AcetonitriloFlujo: 1.0 y 2.0 mL/minTemperatura: 35°CMuestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon


K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S) Si K’ se mantiene constante el poder de separación no variará

Time (min)

4.6 x 150 mm, 5µmV0 = 1.5mlF = 1.0 mL/minTg = 60 min

1x60/1.5 = 40 = FxTg/V0 = 2x15/0.75 = 40 4.6 x 75 mm, 3.5µmV0 = 0.75mlF = 2.0 mL/minTg = 15 min

Constante

K’ no varía

Se mantiene poder de separación

0 20 40 0 5 10

2

3

45

67

8

1

7min

Time (min)

34 5

6

7

8

1 2

40min

¡¡¡Se reduce Tiempo análisis a 1/6 pero se mantiene la

Separación !!!

EJEMPLO 4 – OPTIMIZACIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Tg/4 + F x 2 + V0 /2 (el resto de parámetros no se modifican ( FxTg /V0)) =Cte. K’ no varía )

Algunas Direcciones Web de Utilidad>> Acceso a la página web para búsqueda y visualización de Notas de Aplicación y otras publicaciones de Agilent Technologies:

http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteratureSearch.asp

>> Acceso web para inscripción a los Agilent "e-seminars" (gratuita)*,bastará conectarse a la dirección de internet:

http://webshop.chem.agilent.com* En el período Setiembre - Noviembre 2003 se programaran 10 “e-seminars” en Español sobre HPLC - LC/MS+CE/MS - CE - GC - GC/MS y Validación de Métodos Analíticos

>> Acceso web del grupo de análisis químico de Agilent Technologies:http://www.chem.agilent.com

>> Acceso web española de Agilent Technologies que permite acceso directo información por técnicas analíticas y productos: HPLC, LC/MS, GC, GC/MS, Electroforesis Capilar, UV/VIS, Columnas y accesorios,.....

http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ES

Próximos “e-seminars” en Español

- Consideraciones Prácticas en LC/MS y CE/MS (LC/MS – CE/MS)

- Análisis de Aniones y Cationes por Electroforesis Capilar (CE)

- Nuevo Software para Automatizar la Validación de Métodos en Laboratorios Regulados (HPLC – GC – CE – LC/MS – CE/MS – otros)

- Mantenimiento Básico en Cromatografía de Gases (GC)

- Operativa y Mantenimiento en GC-MS (GC/MS)

- Congelar los tiempos de retención en nuestro GC y GC-MS (GC/MS)

- Desorción Térmica- GC/MS: Análisis medioambiental de aire (GC/MS)

Está previsto impartirlos en el período Setiembre - Noviembre 2003; si desea más información por favor contacte con: [email protected]

[email protected] http://webshop.chem.agilent.com

(o telefónicamente: 901.11.6890)

http://webshop.chem.agilent.com/

ANEXOS VARIOS

• Selección Fases Estacionarias de Exclusión Molecular Base Sílice

• Fases Poliméricas de Exclusión Molecular

• Selección Configuración Columna según Aplicación

• Flujos Elevados para Reducir el Tiempo de Análisis con Columnas de Resolución Rápida

Selección Fases Estacionarias de Exclusión Molecular: Separación por Tamaño• Se deberá escoger un disolvente adecuado para la muestra

(GPC: solventes orgánicos / GFC: solventes acuosos /SEC:”size exclusion chromatography”)• El tamaño de poro de la columna deberá adecuado al rango de tamaño y resolución necesaria de los analitos a separar. Para ampliar rango y resolución se pueden conectar varias columnas en serie (conectarlas en orden ascendente de tamaño de poro – las de mayor poro más cerca del detector)• Se puede escoger entre columnas Base Sílice o Base Polimérica:

Rango Peso Molecular

Fase Estacionaria

5x102 – 1x1061x105 – 1x1071x104 – 1x1063.000 – 3x105500 – 1x104

PSM Bimodal PSM Bimodal SPSM 3000PSM 1000 ó

PSM 1000SPSM 300 ó PSM 300S

PSM 60 ó PSM 60S

BASE SÍLICE (GPC+GFC): ZORBAX PSM (“porous silica microspheres”) (6.2mm x 250mm x 5µm)

GPC+GFC: Solventes Orgánicos y Acuosos

Las Zorbax PSM pueden utilizarse tanto con solventes orgánicos (GPC) como con soluciones acuosas (GFC). Los tipos S (p.e. PSM 60S - desactivados por silanización) no deben ser usados con soluciones totalmente acuosas. Rango pH 2–7. Alta Resistencia Mecánica

1x104 – 9x1054.000 – 4x105Rango Peso Molecular300Å y 6 µm150Å y 4 µmTamaño Poro y Partícula

ZORBAX GF-450ZORBAX GF-250Fase Estacionaria

BASE SÍLICE (GFC): ZORBAX GF (“gel filtration”): Especificaciones: pH 3-8.5 / hasta 5000psi y < 3ml/min

GFC: Solventes Acuosos Separación Anticuerpos

Fases Poliméricas de Exclusión Molecular: Separación por Tamaño

Velu

MAB

CD

E

PLgel

“Mixed Bed”

<1.000

50

<4.000

100


Tamaño Poro

4x105 –4x107

4x104 –4x106

4.000 –4x105

1.000 –4x104

500 –2x104

1061051041.000500

BASE POLIMÉRICA (GPC): PLgel (poliestireno-divinilbencenoaltamente entrecruzado) (7.5mm x 300mm (5 y 10µm)

- Las columnas PLgel y PLgel “Mixed Bed” son para utilizar con solventes orgánicos

BASE POLIMÉRICA (GFC): PLgel aquagel-OH (7.5mm x 300mm (8 µm)

BASE POLIMÉRICA (GPC): PLgel “Mixed-Bed” (poliestireno-divinilbenceno altamente entrecruzado) (7.5mm x 300mm (3 a 20µm)

1.000 – 4x107

Mixed A

500 – 1x107

Mixed B


Fase Estacionaria

< 3x104200 – 4x105200 – 3x106

Mixed EMixed DMixed C

100 – 3x104

30

1x104 –2x105

40


Tamaño Poro

100 – 1x1072x105 –1x107

5x104 –1x106

Mixed6050

M

Velu

GPC: Solventes Orgánicos

GFC: Solventes Acuosos

Curvas Calibración

con Poliestireno

PLgel106

105

104

103

50010050

- Las columnas PL aquagel-OH son adecuadas para solventes acuosos y análisis de polímeros neutros polares

Selección Configuración Columna según Aplicación

Preparativa

100-1000mg

Preparativa en pequeña escala

10-100mg

Analítica(Preparat. Analítica.: 1-10mg)

Analítica

Alta sensitibilidad

LC/MS

Mayor sensitibilidad

LC/MS

Max sensitibilidad

LC/MS

Aplicaciones

20 – 60 mL/min5, 750 – 25021.2Preparativa

4 – 10 mL/min550 – 2509.4Semi-preparativa

1 – 4 mL/min3.5, 515 – 2504.6Analítica

0.3 – 1.0 mL/min3.5, 5150, 2503.0“Solvent Saver”*

0.1 – 0.3 mL/min3.5, 515 – 1502.1“Narrow Bore”

30 – 60 µL/min3.5, 530 – 1501.0“MicroBore”

1 – 10 µL/min3.5, 535 – 2500.3, 0.5Capilar

Rango

Flujos

Tamaño Particula

(µm)

Longitud

(mm)

D.I.

(mm)Tipo

Columna

* Las columnas de 3mm reducen el consumo de eluyente al 43% del consumido por las de 4.6mm. (las de 2.1mm al 20%).

Flujos Elevados para Reducir el Tiempo de Análisis con Columnas de Resolución Rápida Columna: Zorbax Rapid Resolution StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 µm

Sample: 1. Acetaminofenona 2. Cafeína 3. 2-Acetamidofenol4. Acetanilida 5. Ácido Acetilsalicílico 6. Ácido Salicílico 7. Acetofenetidina

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0Time (min)

1

23

45 6

7

1

23

45 6

7

1

23

45 6

7

Presión

90 bar

133 bar

181 barRs2,1 = 2.1

Rs2,1 = 2.2

Rs7,6 = 2.2

Rs7,6 = 2.2

30 segundos!!!

2 mL/min

3 mL/min

4 mL/minFLOW

3 µm

5 µm

10 µm

N

< 2 µm (STM)

Las columnas cortas de 3.5µm o STM (sub two micron < 2µm) apenas pierden eficacia a flujos muy elevados

Columnas de Resolución Rápida para Reducir el Tiempo de Análisis

Time (min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

12 3

4

1

2 34

1

2 34

1

2 3 4

1

23 4

4.6 x 150 mm, 5 mm

4.6 x 75 mm, 3.5 mm

4.6 x 50 mm, 3.5 mm

4.6 x 30 mm, 3.5 mm

4.6 x 15 mm, 3.5 mm

Las columnas cortas con 3.5µm o STM (sub two micron < 2µm) son muy útiles para Análisis muy Rápidos (muy útiles p.e. en desarrollo de métodos)

Cierre / Conclusiones Finales “e-Seminar”

Gracias por asistir a este seminario electrónico organizado por Agilent Technologies.

Deseamos les haya resultado útil.

Nuestros “e-seminars” se imparten regularmente. Por favor visite nuestras webs:

www.agilent.com/chem http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ES (versión española)

http://webshop.chem.agilent.com

opia de la presentación de la dom/iccdocs/pubDocument.shtml

Si le interesa, puede descargarse una c irección:http://webshop.chem.agilent.c

Si tienen dudas adicionales, por favor contacte: Isidro Masana

[email protected] (o telefónicamente: 901.11.6890)

Isidro Masana Químico de Aplicaciones 17 de Octubre,...

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