La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y...
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La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de bandeado G en cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética molecular de hibridación por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación por genómica comparativa (CGH).
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Esta técnica es para sangre periférica.
La muestra debe ser 5ml de sangre venosa recogida en tubo con anticoagulantes de heparina de litio. Se coge la capa de leucocitos.
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Se debe identificar el tubo y la historia clínica dándole un número de registro.
El paciente no debe haber sido transfundido en los últimos 2 meses. La extracción debe hacerse en ayunas (preferiblemente). Anotar en el mismo cuaderno, el día de la siembra y si el cultivo va a ser de 48 o 72 horas.
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Centrifugar la muestra durante 5 min a 1000 r.p.m.Si la muestra está turbia ó muy ictericia hay que realizar un
lavado con suero fisiológico, volviendo a centrifugar y decantando el sobrenadante del lavado.
Preferiblemente hay que pasar a la fase de siembra en las primeras 24 horas, si no es posible debe mantenerse la muestra a 4º C en la nevera.
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El medio RPMI se debe suplementar, por cada 100ml de medio RPMI se añade:
• 11 ml de suero bovino fetal al 20% (para enriquecer el
medio).• 0.75 ml de penicilina al 2% (para evitar la contaminación).• 1ml e glutamina al 2% (aa esencial para el crecimiento
celular).• 1.5 ml de buffer hepes (para mantener el pH del medio).
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En campana estéril, y para cada cultivo coger 2 tubos de 10 ml (específicos para cultivo), identificar cada tubo con el número de registro y en uno de ellos se debe de poner Be (bromuro de etidio, se le añade para obtener cromosomas con más bandas).
• Añadir a cada tubo 5 ml de medio.• Echar 0.5 ml de muestra en cada uno de los tubos.• Añadir 0.15 de fitohemaglutina PHA (mitógeno de linfocitos
T).• Homogeneizar, poner el tapón y colocarlos en una gradilla
inclinada. Meterlos en la estufa de cultivos a 37º C durante 72 horas; cada día se deberán mover suavemente.
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A las 72 horas de cultivo: • Añadir a cada tubo 0.25 ml de Colcemid (para la división celular en la
metafase). Además, al tubo de Be se le añadirá 0.1 ml de bromuro de etidio.
• Sacar los tubos de la estufa y centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar sobrenadante con una pipeta Pasteur dejando 1 ml.
• Añadir a cada tubo 5 ml de solución de KCl y ponerlos durante 18 min al baño (37º C). Es para realizar un choque hipotónico, para que las células se hinchen.
• Centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar el sobrenadante con una pipeta evitando tocar el pellet celular.
• Preparar la solución fijadora Carnoy en l momento (metanol/ac acético, en proporción 1:3).
• Realizar con la solución de Carnoy 4 lavados del pellet, cada uno seguido de centrifugación y decantado. En el último lavado, se decanta y resuspende el botón manualmente, añadiendo 1-2 ml de Carnoy, dependiendo del tamaño del pellet celular.
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Impregnar el portaobjetos con una solución fijadora de Ac acético al 45%.Realizar la extensión “tirando” la gota de muestra.
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Con microscopio de contraste de fases y objetivo de 10X, se verifica la calidad de las preparaciones. Una buena preparación debe tener un número suficiente de metafases bien extendidas y libres de citoplasma. Influye la temperatura, la humedad y el choque hipotónico. La alta temperatura y la humedad favorecen las buenas extensiones, así como la altura desde la que se realiza la extensión.
Una vez realizadas las extensiones, se colocan a 371 C en estufa. Se dejan envejecer 1 semana aproximadamente, hasta su posterior tinción.
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Una vez que las extensiones han envejecido en la estufa se procede a tratarlas para su posterior análisis.
• Se coloca el porta en una solución de sales de citrato de sodio durante 10 min.
• Se lavan con agua y se sumergen en tripsina durante 6 seg y se vuelven a lavar.
• Y se tiñen durante 1,5 min. El colorante se prepara con una mezcla de 2 ml de Wrigh, 3 ml de Sorensen y 3 ml de buffer.
• Se lavan, se dejan secar y se meten en xilol para limpiar la preparación de posibles residuos.
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• Se mira la preparación en el microscopio con el objetivo de 10X.
• Cuando se encuentra una metafase abierta se cambia de objetivo al de 100X con aceite de inmersión.
• Se deben observar del orden de 15-30 metafases para ver si existe alguna alteración.
• Cuando vayamos encontrando las metafases vamos apuntando en una hoja las coordenadas para luego encontrarlas en el cytovisión.
• En el cytovisión se coloca el porta y se pone en las coordenadas que hemos apuntado antes.
• Se mira con el microscopio de contraste de fases con el objetivo de 10X y después con el de 100X.
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• Con un programa informático se hace una foto a lo que hay en el porta y se ajusta la luz hasta que se vean claramente los cromosomas y sus bandas.
• El cariotipador se encarga de realizar un agrupamiento automático, pero no todos los cromosomas se agrupan correctamente, es entonces cuando los tenemos que colocar manualmente.
• Una vez realizado el cariotipo se imprime y se lleva a los médicos correspondientes.
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Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su longitud y a la posición del centrómero. De esta manera, el cariotipo humano queda formado así:• Grupo A: Se encuentran los pares cromosómicos 1, 2 y 3. Se caracterizan por ser cromosomas muy grandes, casi metacéntricos. En concreto, 1 y 3 metacéntricos; 2 submetacéntrico.• Grupo B: Se encuentran los pares cromosómicos 4 y 5. Se trata de cromosomas grandes y submetacéntricos (con dos brazos muy diferentes en tamaño).• Grupo C: Se encuentran los pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Son cromosomas medianos submetacéntricos.• Grupo D: Se encuentran los pares cromosómicos 13, 14 y 15. Se caracterizan por ser cromosomas medianos acrocéntricos con satélites.
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• Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18. Son cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17 y 18.• Grupo F: Se encuentran los pares cromosómicos 19 y 20. Se trata de cromosomas pequeños y metacéntricos.• Grupo G: Se encuentran los pares cromosómicos 21, 22, Y. Se caracterizan por ser cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con satélites).
Mediante el cariotipado se pueden analizar anomalías numéricas y estructurales, cosa que sería muy difícil de observar mediante genética mendeliana.
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Trisomia delPar 21.