La Técnica histológicaLa Técnica histológica Es el conjunto de Es el conjunto de

procedimientos que se procedimientos que se realizan en el laboratorio para realizan en el laboratorio para el estudio de la estructura del el estudio de la estructura del material biológico, desde el material biológico, desde el punto de vista microscópico.punto de vista microscópico.

Finalidad del estudio Finalidad del estudio microscópicomicroscópico

Conocimiento de la estructura Conocimiento de la estructura del organismo para del organismo para comprender los procesos comprender los procesos bioquímicos y fisiológicos bioquímicos y fisiológicos que en él tienen lugar. que en él tienen lugar.

Diagnóstico de procesos Diagnóstico de procesos patológicos.patológicos.

OrganismoOrganismo

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

CongelaciónCongelación

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

TTééccnniiccaa

HHiissttoollóóggiiccaa

OtrosOtros

Finalidad de la FijaciónFinalidad de la Fijación

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

Detiene la dinámica funcional y los procesos enzimáticos del organismo.

Evita los procesos de autolisis (degradación por enzimas propios) y putrefacción (degradación bacteriana).

Conservar las estructuras de la manera más fidedigna posible al estado vivo.

Modifica la reactividad de los tejidos a los colorantes.

Protege de efectos traumáticos y evita la retracción de los tejidos.

Tipos de fijadoresTipos de fijadores

Físicos: Calor.Calor.

Químicos: Aldehídos. Mercurio. Alcoholes. Agentes oxidantes. Ácido pícrico y derivados.

Moléculas objeto de la fijaciónMoléculas objeto de la fijación

•Proteínas.

•Grasas.

•Hidratos de carbono.

Fijación de proteínasFijación de proteínas Coagulación: Alcohol. Actúa Coagulación: Alcohol. Actúa

extrayendo la capa de agua y como extrayendo la capa de agua y como consecuencia precipitan las proteínas.consecuencia precipitan las proteínas.

Desnaturalización: calor, agentes Desnaturalización: calor, agentes oxidantes. Consiste en un cambio de la oxidantes. Consiste en un cambio de la conformación de la proteína. conformación de la proteína.

Reticularización: Aldehídos. Forma Reticularización: Aldehídos. Forma puentes cruzados con las proteínas, puentes cruzados con las proteínas, adquiriendo éstas una configuración adquiriendo éstas una configuración rígida.rígida.

Fijación de lípidosFijación de lípidos

Tiene lugar a través de una cambio de la constitución

química de las moléculas. Se basa en un

endurecimiento, con lo cual se vuelven menos

solubles. Esto se consigue mediante:

Oxidación específica de lípidos.

Formación de sales insolubles.

Fijación de hidratos de carbonoFijación de hidratos de carbono La fijación de hidratos de carbono es La fijación de hidratos de carbono es

difícil. La mayoría de los difícil. La mayoría de los procedimientos se basan en procedimientos se basan en reacciones de precipitación, pero reacciones de precipitación, pero cuando los tejidos se introducen en cuando los tejidos se introducen en otros líquidos, los hidratos de otros líquidos, los hidratos de carbono se vuelven solubles. Es por carbono se vuelven solubles. Es por ello que hay que evitar que ello que hay que evitar que permanezcan durante mucho tiempo permanezcan durante mucho tiempo en soluciones acuosas.en soluciones acuosas.

Fijadores químicos más utilizadosFijadores químicos más utilizados

M. ópticaM. óptica M. electrónicaM. electrónica Paraformaldehido. Paraformaldehido. Glutaraldehido. Glutaraldehido. Tetróxido de osmio.Tetróxido de osmio. FormolFormol

Características de una buena fijaciónCaracterísticas de una buena fijación

Rapidez. Rapidez. Penetración. Penetración. Volumen de fijador. Volumen de fijador. Tiempo de fijación. Tiempo de fijación. Presión osmótica. Presión osmótica. pH óptimo. pH óptimo. Temperatura. Temperatura. Manipulación adecuada. Manipulación adecuada. Tamaño de la pieza.Tamaño de la pieza.

RapidezRapidez

Es importante que transcurra el Es importante que transcurra el mínimo tiempo posible entre la mínimo tiempo posible entre la muerte del animal y la fijación. muerte del animal y la fijación.

Hay que evitar que el tejido se Hay que evitar que el tejido se seque para evitar artefactos. seque para evitar artefactos.

Depende del tamaño de la Depende del tamaño de la pieza.pieza.

Fijación por inmersiónFijación por inmersión

Se introduce la pieza en un recipiente que contiene el fijador.

Fijación por perfusión

Se introduce el fijador en el árbol vascular del animal vivo y anestesiado.

El tiempo que transcurre entre la muerte y la fijación es mínimo. Es el mejor método para fijar tejido nervioso y muestras para Microscopía electrónica.

Penetración del fijadorPenetración del fijador

Depende de la difusibilidad de cada fijador individual, la cual es constante para cada uno de ellos. Para evitar este problema se puede cortar la pieza en secciones de 2 a 3 mm.

Los más rápidos son el formol y el alcohol. El más lento el glutaraldehido.

Volumen del fijadorVolumen del fijador

Debe estar en una proporción de al menos

10:1 entre fijador y tejido.

Si esto no se puede conseguir, se puede

solucionar el problema cambiando el fijador

a de terminados intervalos.

La agitación mejora la penetración del

fijador.

Tiempo de fijaciónTiempo de fijación

No deben permanecer los No deben permanecer los tejidos en el fijador durante tejidos en el fijador durante mucho tiempo. mucho tiempo.

Para Microscopía óptica, un Para Microscopía óptica, un tiempo adecuado puede ser tiempo adecuado puede ser entre 24 horas y algunos días. entre 24 horas y algunos días.

En Microscopía electrónica, 12-En Microscopía electrónica, 12-18 horas es suficiente.18 horas es suficiente.

pH óptimopH óptimo

Se debe utilizar el fijador a un Se debe utilizar el fijador a un pH neutro, en el rango de 6 a 8, pH neutro, en el rango de 6 a 8, para lo cual se tampona el para lo cual se tampona el fijador, con un buffer a pH 7.fijador, con un buffer a pH 7.

TemperaturaTemperatura

El aumento de la temperatura El aumento de la temperatura favorece las reacciones favorece las reacciones químicas de autolisis, y también químicas de autolisis, y también incrementa la velocidad de la incrementa la velocidad de la fijación. fijación.

Para evitar la autolisis se puede Para evitar la autolisis se puede realizar la fijación a 4ºC.realizar la fijación a 4ºC.

OsmolaridadOsmolaridad

Es importante la concentración del fijador teniendo en

cuenta la osmolaridad de los tejidos, con el fin de que

no se produzca ni retracción ni hinchazón de los

mismos.

Para ajustar la osmolaridad del fijador se suele

emplear sacarosa.

Preparación para Preparación para microtomíamicrotomía

Congelación. Congelación. Inclusión.Inclusión.

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

CongelaciónCongelación

CongelaciónCongelación

En caso de que sea necesario un diagnóstico rápido de un proceso patológico.

Realización de inmunocitoquímica.

La pieza se corta en un criostatoLa pieza se corta en un criostato

CongelaciónCongelación

Para evitar la formación de cristales de hielo

durante la congelación se realiza una

crioprotección mediante inmersión del tejido en

sacarosa al 30 % antes de la misma.

Las piezas deben congelarse rápidamente por

inmersión en isopentano sumergido a su vez en

nitrógeno líquido (-195 °C).

InclusiónInclusión

Consiste en sustituir el agua de Consiste en sustituir el agua de los tejidos por otra sustancia los tejidos por otra sustancia líquida que penetra en el tejido y líquida que penetra en el tejido y los rodea. Así, los tejidos se los rodea. Así, los tejidos se endurecen para formar un endurecen para formar un bloque sólido que pueda ser bloque sólido que pueda ser cortado.cortado.

InclusiónInclusión

Lavado.

Deshidratación.

Diafanización.

Infiltración.

Confección bloque.

Lavado.

Deshidratación.

Diafanización.

Infiltración.

Confección bloque.

AutotecnicónAutotecnicón

LavadoLavado

Se realiza para retirar el exceso del fijador, ya que éste

puede tener un efecto nocivo impidiendo el buen desarrollo

de la inclusión o de la coloración.

Estos inconvenientes se pueden eludir lavando las piezas

después de la fijación con el tampón en el cual ha sido

preparado el fijador.

DeshidrataciónDeshidratación

Como el tejido fijado se halla en Como el tejido fijado se halla en solución acuosa y el medio de inclusión solución acuosa y el medio de inclusión no es soluble en agua, no puede ser no es soluble en agua, no puede ser infiltrado directamente con el agente de infiltrado directamente con el agente de inclusión. inclusión.

Por ello se deshidrata en una serie de Por ello se deshidrata en una serie de alcoholes crecientes desde el alcohol alcoholes crecientes desde el alcohol de 70% al de 100% en que se elimina de 70% al de 100% en que se elimina totalmente el agua del tejido. totalmente el agua del tejido.

Con ella se endurecen las piezas.Con ella se endurecen las piezas.

Diafanización o aclaramientoDiafanización o aclaramiento

Consiste en la eliminación del Consiste en la eliminación del agente de deshidratación con agente de deshidratación con una sustancia miscible en el una sustancia miscible en el agente de inclusión. agente de inclusión.

Microscopía ópticaMicroscopía óptica Microscopía electrónicaMicroscopía electrónica XilolXilol Óxido de PropilenoÓxido de Propileno

Medios de inclusiónMedios de inclusión

M. ópticaM. ópticaM. ópticaM. óptica

M. electrónicaM. electrónicaM. electrónicaM. electrónica

Parafina. Parafina. Celodina.Celodina.

Parafina. Parafina. Celodina.Celodina.

Metacrilato. Metacrilato. Lowicryl. Lowicryl. Epon. Epon. Araldita.Araldita.

Metacrilato. Metacrilato. Lowicryl. Lowicryl. Epon. Epon. Araldita.Araldita.

InfiltraciónInfiltración

Finalmente, el tejido es

infiltrado en el agente de

inclusión.

Resumen del proceso de inclusión

Medios de inclusión: resinasMedios de inclusión: resinas

Los agentes inclusores más utilizados en microscopia

electrónica son la Araldita y el Epon.

Polimerizan en la estufa a 60 °C en 48 horas.

Metacrilato.

Lowicryl: polimeriza a bajas temperaturas (-20ºC o con

luz UV), por lo que se utiliza cuando el tejido no puede

someterse a altas temperaturas.

Medios de inclusión: ParafinaMedios de inclusión: Parafina

Son químicamente cadenas de Son químicamente cadenas de hidrocarburos saturadas de entre 22 hidrocarburos saturadas de entre 22 a 28 átomos de carbono. a 28 átomos de carbono.

Sus puntos de fusión dependen de Sus puntos de fusión dependen de la longitud de la cadena; cuanto más la longitud de la cadena; cuanto más larga, mayor será su punto de larga, mayor será su punto de fusión. fusión.

Las parafinas utilizadas en la Las parafinas utilizadas en la técnica histológica poseen puntos de técnica histológica poseen puntos de fusión entre 45 y 60 °C. fusión entre 45 y 60 °C.

Confección del bloqueConfección del bloque

Microscopía óptica:

enfriamiento.

M. electrónica:

polimerización.

CorteCorteLos tejidos deben ser cortados en finas secciones que serándepositadas sobre la superficie de un portaobjetos.

El grosor de la sección dependerá del tipo de microtomo elegido, según el microscopio en el que se vaya a observar.

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

CongelaciónCongelación

Tipos de micrótomosTipos de micrótomos

Micrótomo de parafina: 7-10

micras. Criostato: 7-10 micras. M. de congelación: 10-25 micras.

Vibratomo: secciones gruesas de 50

micras. Ultramicrotomo:secciones semifinas de 1 micra y secciones ultrafinas de 60-90 nanometros para observar en microscopía electrónica de transmisión.

Corte para microscopía ópticaCorte para microscopía óptica

Los cortes se recogen en

portaobjetos para su

observación en el

microscopio óptico.

Corte de secciones incluidas en Corte de secciones incluidas en parafinaparafina

Las secciones se dejan flotar en un baño de agua caliente a 37ºC, que elimina las posibles arrugas.

A continuación se recogen en un portaobjetos.

Corte por congelaciónCorte por congelación

Los cortes realizados en un criostato (todo el proceso se realiza en una cámara a -20ºC), o en un micrótomo de congelación.

Se recogen directamente en un portaobjetos.

Corte en ultra micrótomoCorte en ultra micrótomo

Los cortes se recogen en

rejillas metálicas que sirven

de soporte para su

observación en el

microscopio electrónico.

TinciónTinción

Para lograr contraste suficiente entre los distintos componentes de las células y poderlos diferenciar con el microscopio óptico, se emplean diversos colorantes.

Cuando un componente absorbe abundante colorante, aumenta la densidad óptica y disminuye la amplitud de las ondas luminosas que lo atraviesan.

Tiene aspecto más oscuro que los componentes que absorben poco colorante. El colorante absorbido imparte su color a la luz que sale del componente que lo absorbió.

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

TinciónTinción

Utiliza varios colorantes con

diferente capacidad para teñir

diversos componentes

celulares.

Es necesario desparafinar e

hidratar los cortes invirtiendo

el orden de la inclusión en

parafina.

MontajeMontaje

La sección teñida debe cubrirse con un cubreobjetos para proteger el tejido y poderlo observar durante años.

FijaciónFijación

InclusiónInclusión

CorteCorte

TinciónTinción

MontajeMontaje

Material de estudioMaterial de estudio

ObservaciónObservación

MontajeMontaje

Previamente a la colocación del cubreobjetos se cubre con una resina inmiscible en agua.

Ejemplos:

•Eukitt. •Bálsamo de Canadá. •Permount.

•Entellán.