Francheska Camilo González

Junio/2013

Laboratorio 6: Biología Molecular

6-I Transformación bacteriana

La transformación genética son mutaciones genéticas que suceden por una alteración causada por

un organismo huésped adquiere un DNA extraño y lo expresa como un gen extraño. Este tipo de

mutación puede observarse cuando se introduce un gen resistente a antibiótico ampicilina en una

cepa bacteriana que no es resistente a tal antibiótico. Entonces, si ocurre susceptibilidad

bacteriana al incorporarse al ADN extraño, estas se convertirán o mutaran en bacterias que son

resistentes a la ampicilina.

Colonias Bacterianas

Son millones de células individuales de un tipo de bacteria (ej: Escherichia coli), luego de crecer

en una placa Petri Luria Broth (LB) agar.

Escherichia coli

Figure: E. coli Bacteria

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/ecoli.html, Accessed: 6/26/13

Escherichia coli es la bacteria que más comúnmente habita en el intestino de los humanos. Esta

bacteria se reproduce rápidamente, dividiéndose y formando colonias visibles compuestas con

millones de células durante la noche. E. coli no tiene un núcleo verdadero y los genes

reproductivos están presentes en un único cromosoma, y algunas cepas de esta bacteria contienen

plásmidos y moléculas pequeñas de DNA, las cuales llevan genes especializados para funciones

específicas, como la resistencia a ciertos medicamentos.

Plásmidos

Los plásmidos son piezas circulares de DNA localizadas en el exterior del cromosoma bacteriano

primario. Estos tienen sus propios genes para llevar a cabo funciones especializadas, y en la

ingeniería genética son utilizados para la introducción de genes extraños a una célula bacteriana.

Existen células bacterianas como E. coli que contienen un plásmido “ampr+”, el cual es un gen

que confiere resistencia a antibióticos ampicilina. También existen células bacterianas que

carecen del plásmido ampR, siendo células “ampR-”, siendo sensibles a antibióticos, y muriendo

por la presencia de estos. Esto es importante porque una célula (ampR-) puede mutar por

alteraciones o transformaciones genéticas y convertirse en una célula resistente a la ampicilina

(ampR+), por la adquisición de un plásmido que contiene un gen ampR.

Células competentes

Las células bacterianas de E.coli son propensas a incorporar un ADN extraño si ocurre alguna

alteración en la pared celular. Cuando ocurre este suceso, estas células se hacen “competentes”

mediante un proceso que utiliza cloruro de calcio y de choque térmico. La tasa de crecimiento en

las células no es constantes, por tanto aquellas células que experimentan un crecimiento muy

rápido tienden a ser competentes con mayor facilidad que las células en otras entapas de

crecimiento.

Figure: Competent Cells

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/competen.html Accessed: 6/26/13

Diseño experimento I

1. Conceptos básicos para un procedimiento estéril

Figure: Design of the Experiment I

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design1.html, Accessed: 6/26/13

Ejercicio 1: Procedimiento de transformación de E.coli

Utilizando los pasos ilustrados, se procederá a utilizar plásmidos que contienen ampR, para

transformar células de Escherichia Coli que carecen de este gen. También se procederá a preparar

un segundo grupo bacteriano a partir de células de E. coli, las cuales representaran al grupo

control y demostraran que esta bacteria no crece en un agar que contiene ampicilina, con

excepción de bacterias de E. coli en las cuales hubo una transformación genética. El

procedimiento ilustrado se utilizara para los dos grupos experimentales (E. coli con plásmido

“ampr+” y E. coli “control”), con excepción del paso #2, e donde se agrega plásmidos ampR, el

cual no se realizara en las células “control”.

Figure: Transformation Procedure

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/tranproc.html, Accessed: 6/26/13

Figure: Transformation Procedure: Step 1-6

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/hotfr01.html, Accessed: 6/26/13

Figure: Place the Stages of Transformation in Order

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/test1.html, Accessed: 6/26/13

Análisis de resultados I:

Si en agar no hay existencia de ampicilina, E. coli va a crecer en esta, pero si por el contrario hay

ampicilina en el agar, colonias de E. coli no crecerán en esta, a menos que estas células

bacterianas sean transformadas por la adición de plásmidos con ampR.

Figure: Analysis of Results I

Source: Pearson Education, Inc.

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Etiquetar los resultados experimentales: evidencia

Figure: Label the Results of Your Experiment

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Lab Quiz: evidencia

Figure: Lab Quiz I

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/quiz1.html, Accessed: 6/26/13

6-2 Electroforesis

Para la década de 1960, se descubrió la existencia enzimas en las bacterias que cortan el DNA de

organismos extraños, protegiendo las células de invasores (ej: virus). Estas son enzimas de

restricción o endonucleasas de restricción, y son capaces de reconocer y cortar secuencias

específicas de DNA. El descubrimiento de estas enzimas fue de utilidad para la ingeniería

genética, pues hizo posible que se pudiera cortar el DNA en fragmentos, para luego analizar y

utilizar estos en otros procedimientos.

¿Cómo funcionan las enzimas de restricción?

Estas enzimas de restricción, al igual que el resto de las enzimas son específicas, por tanto

tenderán a cortar fragmentos precisos en la secuencia de DNA, y la secuencia de reconocimiento

en una cadena de DNA lee en una dirección opuesta en la hebra complementaria.

Figure: How Do Restriction Enzymes Work?

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/enzwork.html, Accessed: 6/26/13

Mediante las ilustraciones se pudo observar que ocurrieron tres distintas secuencias de

reconocimiento, pero en las primeras dos se produjeron extremos pegajosos o cohesivos y en la

última ilustración se produjeron “extremos romos”.

Cortar DNA utilizando enzimas de restricción

El DNA debe mezclarse con una o más enzimas de restricción en un pequeño tubo de plástico

para centrifugar. En el ejemplo, el volumen total de la mezcla es de aproximadamente 20 µl

(0.02ml). La mayoría de las reacciones de enzimas de restricción son incubadas a 37 ° C durante

una hora, para luego analizar el DNA en otros tipos de reacciones, como por ejemplo, la

transformación bacteriana.

Figure: Cutting DNA with Restriction Enzymes

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http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/cutdna.html, Accessed: 6/26/13

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es un procedimiento utilizado para separar moléculas a base de la

velocidad del movimiento a través de un gel en un campo eléctrico. En este procedimiento, la

dirección del movimiento es afectada por la carga de las moléculas y la velocidad de movimiento

es afectada por el tamaño y la forma, la fuerza del campo eléctrico, y la densidad del gel. Como

el DNA es una molécula con carga negativa, esta tendera a moverse en dirección hacia el polo

positivo del gel cuando se aplica una corriente eléctrica. Si el DNA es reducido en las enzimas de

restricción, los fragmentos van a migrar en distintos ritmos, siendo los fragmentos mas pequeños

los que se moverán con mayor rapidez y migraran más lejos durante el periodo de tiempo en el

que es aplicada una corriente eléctrica.

Diseño experimental II

Utilizando tres muestras de DNA obtenidas de un virus del bacteriófago lambda (λ). Estas

muestras serán una de DNA sin cortar, una con la enzima de restricción HINDIII, y una con

EcoRI. Con estas se procederá a separar fragmentos de DNA por electroforesis, teñir el DNA

para visualizarlo, y determinar el tamaño de los fragmentos formados en la digestión EcoRI.

Figure: Design of the Experiment II

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design2.html, Accessed: 6/26/13

Procedimiento:

1. Preparación del Gel

Figure: Preparing the Gel

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/prepare.html, Accessed: 6/26/13

Luego de la preparación del gel, este será colocado en una cámara de electroforesis y cubierto, y

este será colocado en posición donde los pozos estén situados en el extremo del electrodo

negativo.

El aparato está listo para cargarse, pero en este aun no debe ser encendida la electricidad.

2. Carga del Gel

Como el DNA no puede ser visto sin ser tenido (tintes especiales), se procede a añadir un tinte de

seguimiento para cada tubo de reacción. Recalcando que este tinte no manchara el DNA, sino

que las moléculas del colorante se moverán a una velocidad similar como la del DNA. También

se deberá añadir sacarosa o glicerol a la mezcla para que esta tenga la densidad necesaria que

permita hundirse en el pozo.

Nota: Se deben transferir cuidadosamente 5-10 µl de cada tubo de reacción en un pozo utilizando

una micropipeta.

Figure: Loading the Gel

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/loadgel.html, Accessed: 6/26/13

3. Electroforesis

Se debe colocar la parte superior de la cámara de

electroforesis y conectar la cabrería eléctrica para el gel, y

de esta forma al encender la unidad de electroforesis, la

combinación de DNA/tinte de seguimiento comenzara a

moverse hacia el electrodo positivo.

Figure: Electrophoresis

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/electro.html, Accessed: 6/26/13

4. Ejecución del Gel

Aunque el DNA no pueda verse a simple vista, el movimiento de este puede ser controlado

mediante el colorante de seguimiento, y la unidad deberá apagarse cuando este colorante se haya

movido hacia la parte final del gel.

5. Tinción de ADN y fotografía

Después de realizar la electroforesis, se procederá a manchar el DNA para poder visualizar este,

proceso en el cual se deberá sumergir el gel utilizado en azul de metileno para que este se una al

DNA. Luego se procederá a enjuagar varias veces el gel con agua, para eliminar el exceso del

colorante en el gel, y se observara que el DNA aparece como bandas azules que son visualmente

accesibles cuando la luz pasa a través del gel. Para terminar esta parte se procederá a fotografía

el gel para analizar este, y si no hay una cámara para fotografiar el gel, este debe ser envuelto en

una envoltura de plástico, en la cual utilizando un marcador se procederá a delinear los pozos y a

localizar las bandas azules.

Figure: Staining and Photographing the DNA

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/stainpho.html, Accessed: 6/26/13

Análisis de resultados II

Cada fragmento de DNA posee un numero particular de nucleótidos, y para determinar el tamaño

de los fragmentos de DNA producidos por enzimas de restricción particulares, realizan este

experimento utilizando fragmentos del DNA desconocido, y otros fragmentos de DNA conocidos

que actuaran como marcador. En el experimento anterior el marcador fue el DNA cortado con

HindIII, y utilizando este se puede proceder a determinar el tamaño de los fragmentos de la

digestión con EcoRI. Esto se puede realizar al medir la distancia de cada fragmento HindIII que

migraron en el gel, Mediante una curva estándar se determinaran el tamaño de los fragmentos de

la digestión EcoRI.

Figure: Making a Standard Curve

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/hindcurv.html, Accessed: 6/26/13

Quiz: evidencia

Figure: Lab Quiz II

Source: Pearson Education, Inc.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/quiz2.html, Accessed: 6/26/13

Resumen

La transformación genética son mutaciones que ocurren por una alteración en el que un

organismo huésped adquiere un DNA extraño y lo expresa como un gen extraño. Cuando ocurren

este tipo de mutaciones genéticas se producen cambios en interacción las células bacterianas, ya

sea en los requisitos que le permiten crecer o en los factores que le brindan resistencia ante

medicamentos. Un ejemplo de esto, es crecimiento de una célula (ej. E. coli) en un medio de

agar en el que antes de que ocurriera una mutación genética (E. coli con una adición de

plásmidos con ampR) esta tipo de medio la bacteria no crecía, y por tanto este factor de

crecimiento indica que la célula bacteriana adquirió a su vez, resistencia a tratamiento o

antibiótico con la que antes era tratada y eliminada. Mediante la electroforesis se pueden separar

moléculas a base del movimiento a través de un gel en un campo eléctrico. Esta moléculas de

DNA se combinan con un tinte de seguimiento, el cual permite distinguir los fragmentos de

DNA, para que después de teñir el gel con azul de metileno poder determinar los fragmentos del

DNA desconocido a partir de fragmentos de un DNA conocido (marcador), y se concluye que al

medir las distancias recorridas por los fragmentos en una curva estándar, y se puede obtener una

aproximación del tamaño del fragmento desconocido que deseamos determinar.

Referencias:

Knapp, T. Molecular Biology. Available: June 26, 2013.

http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/intro.html