Universidad Autbnoma Metropolitana

lztapalapa

División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Proyecto de Investigación Terminal

Larrera : Bio logfa we1 imental

T J T U L O

EVALUACIóN DE LA CAPACIDAD DEL EXTRACTO ACUOSO

DE Polygonum aviculare L. PARA ESTIMULAR LA

HEMATOPOYÉSIS - In ” Vivo.

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M. en d E . Rodolfo Velasco Lezama

Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar 4 - 4 /-

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Alumna: Lorena Guevara Sánchez

Núm. de Matrícula: 90339529

México., D.& 15 de Julio de 1999

La hematopoyesis es el proceso de formación de las células de la sangre, tiene lugar en los

órganos hemopoyéticos principales de los mamíferos; la médula ósea, el bazo, los ganglios linfáticos

y el timo. El lugar más importante de la hematopoyesis es la médula ósea; el papel de el bazo, los ganglios linfáticos y el timo es el de formación y maduración de las células sanguíneas (1).

En la médula ósea, la población celular se está renovando continuamente, hay un número

reducido de células que tienen la capacidad de autorreplicación para perpetuar su especie y de

diferenciación. Estas células son llamadas tronco(stem) totipotenciales, que al diferenciarse dan

origen a células precursoras linfoides o mieloides (2). La descendencia inmediata de una célula

madre pluripotencial que tiene la capacidad de multiplicarse, pero que es capaz de diferenciarse en

un tipo Único de célula terminal, se designa célula madre unipotencial o célula madre dirigida o

compromciida y se le designa unidad formadora de colonias, ya que in vitro esta célula ?S capaz de

dar origen a colonias eritroides, megacariociticas o de granulocitoslmacrófagos, dependiendo de los

factores humorales o interleucinas estimulantes. Las células que conforman estas colonias son

estimldadas por las citocinas correspondientes y dan origen a los eritrocitos, leucocitos y plaquetas

que se encuentran en sangre circulante, cuyo número se mantiene constante a lo largo de la vida del

individuo (3).

Como es conocido, las células de la sangre cumplen con funciones especificas que contribuyen

a la homeostasis por ejemplo:

Los eritrocitos son responsables del intercambio de 02 y CO2 gaseoso entre los pulmones y los

tejidos, contribuyen además al mantenimiento del pH de la sangre.

Los leucocitos son las células responsables de la defensa inmunológica inespecífica y específica

del individuo, siendo esta última de tipo humoral o célular (4).

Finalmente, los trombocitos o plaquetas cuya función primordial es proteger las superficies

vasculares, promover la coagulación sanguínea para evitar la perdida de sangre cuando se pierde

la integridad vascular, son también importantes por su capacidad para adherirse a células

cancerosas y promover con ello la fagocitosis de dichas células (5).

La hematopoyesis puede visualizarse como un proceso complejo, dinámico, susceptible a

agentes químicos ,físicos o infecciosos, dando como resultado enfermedades o síndromes hipo o

hiperproliferativos de la médula ósea, provocando en el primer caso anemia, leucopenia o

trombocitopenia y leucemia, linfomas o mielomas en el segundo caso (6).

Una de las alteraciones hematológicas frecuentemente observables en la clínica púrpura

trombocitoponica idiopática, que como su nombre lo indica puede no tiene una causa precisa que la

desencadene, pero que se manifiesta como manchas de color rojo-púrpura por debajo de la piel,

resultantes de la extravasación y depósito de sangre. El término trombocitopenia se refiere

específicamente a la disminución de plaquetas por debajo de la cifra normal en la sangre periférica

(150,000 a 450,000 y que generalmente es consecuencia de los tres mecanismos siguientes:

1 .- producción insuficientes de plaquetas

2.- destrucciin utilización o pérdida acelerada

3.- distribución o almacenamiento inadecuado que pueden ser atribuidas a alteraciones cualitativas o

cuantitativas de las plaquetas o a trastornos de la coagulación sanguínea (7).

En la médicina alopática la púrpura trombocitopenica es tratada con corticoides, inmunoglobulinas

que alteran la respuesta inmune del individuo, llegándole a crear inmunodeficiencias y en el menor

de los casos (10%) enfermedades autoinmunes como el Lupus Eritematoso Sistemico. En los casos

severos de púrpura trobocitopenica se practica la esplenectomía, sin embargo los pacientes con

bazo accesorio presentan caídas recurrentes que derivan enfermedades de pronóstico fatal (8). Por

Io que la población mexicana con tradición cultural hacia la medicina herbolaria utiliza las plantas

para eliminar o controlar estas enfermedades.

A través del conocimiento empírico la población mexicana utiliza Polygonum aviculare L.

(sanguinaria) para el detenimiento del sangrado. P. aviculare pertenece a la familia Poligonaceae, la

cual cuenta con muchas plantas consideradas medicinales. P. aviculare es una planta herbacea

anual de color verde pálido a verde azuloso. Es originaria de las regiones boreales y templadas,

encontrándose en climas semisecos y templados entre los 30 y los 250 metros sobe el nivel del mar.

De acuerdo con la descripción de Poligonum aviculare del libro 1V de Dioscórides., a la planta

se le denomina Polygonon, que en griego quiere decir llena de rodillas, Io que se refiere a los nudillos que se forman por la salida de las hojas y flores del tallo (9).

El códice Florentino el cual data del siglo XVI menciona que es eficaz contra las enfermedades de

la vejiga, si se toma su raíz. A finales del siglo XVIII, Vicente Cervantes, relata: "es vulneraría,

diurética, buena para el cálculo, dificultad de la orina y la hidropesía".

A través del conocimiento empírico la población mexicana utiliza Polygonum aviculare L.

(sanguinaria) para el detenimiento del sangrado. En la literatura se recomienda P. aviculare L. como

astringente y hemostática, se emplea para detener las hemorragias externas o internas, contra las

inflarnaciones gástricas y diarrea fuerte para ellos se emplean los tailos secos o frescos par&

preparar una infusión que se ingiere como agua de uso durante el día(9). También actúa

favorablemente sobre los intercambios metabólicos(l0). En el Distrito Federal se prepara decocción

de toda la planta y de ingiere contra las enfermedades renales. En Morelos se lavan con ella las

rozaduras de los bebes, las veces que sean necesarias (1 1).

HIPOTESIS

Considerando que la preparación acuosa de Polygonum aviculare L. es utilizada contra el

sangrado que provoca púrpura trombocitopénica, es posible que esta planta promueva la formación

y liberación de nuevas plaquetas, deteniendo de esta manera el sangrado. Por Io que ensayos in

vivo con animales de experimentación permitirán conocer si el extracto o una preparación acuosa de

la planta tiene las propiedades hematopoyéticas que el conocimiento popular le atribuye.

OBJETIVO

Determinar la capacidad del extracto acuoso de Polygonum aviculare L. para estimular la

producción de células hematopoyéticas en ratones sanos.

Con este trabajo se pretende conocer si Polygonum aviculare L. (sanguinaria) estimula la

hematopoyésis, particularmente la formación de plaquetas , nivel y tipo de células que son

estimuladas, lo que permitira respaldar o contraponer el conocimiento empírico respecto a las

propiedades antihemorragicas de la planta .

MÉTODO

La planta fue proveniente del poblado de Santa Ana Chiuatempan, Tlaxcala fue adquirida en el

mercado de Sonora, se dejo secar a temperatura ambienta protegida del sol y del polvo

posteriormente se molió manualmente y se coloca de las estructuras aéreas dela planta y se calentó

en agua a temperatura de reflujo durante 3.5 horas el extracto acuosos se concentro por

evaporación hasta sequedad, se concentro por evaporación y con ello se hicieron las siguientes

disoluciones con 0.4 , 0.2 y O.lg/ml del extracto en agua destilada.

El extracto se administró a sendos grupos de 10 ratones machos CDI de 8-12 semanas de edad.

El extracto fue dado a los animales durante 5 días consecutivos de una semana (1% del peso

corporal) por vía oro-esofágica. Se incluyó un grupo testigo que recibió con la misma vía y esquema

agua destilada. 48 horas después todos los ratones se sangraron con cortes en la cola y punción

cardiaca y se les realizó biometría hemática. Se aislaron los fémures y se perfundieron con

disolución salina fisiológica para la cuantificación de células nucleadas y de megacariocitos.

La Biometría Hemmática incluye las siguientes determinaciones(l2)

Serie leucocitaria o fórmula blanca

Cuenta de leucocitos

Fórmula diferencial

Serie eritrocítica o fórmula roja

Cuenta de ertrocitos

Determinación del volumen globular porcentual o hematócrito

Dosificación de hemoglobina

Determinación del volumen globular medio y de la concentración de hemoglobina globular

Cuenta de reticulocitos

C) Serie plaquetaria

a) Cuantificación de plaquetas

D) Sedimentación globular

La cuantificación de células nucleares medulares se realizó por el método de Nakeff (12)

Las determinaciones de la biomatria hemática se realizaron con sangre y venosa, esta ultima fue

colocada en un tubo de ensaye que contenia EDTA.

A) Cuantificación de leucocitos

Se hizo una dilución de 1500 de la sangre (solución de Zap-oglobin II) para su cuantificación

en el contador de partículas ( Coulter Counter ZI). Con una apertura de 10.5- 31.5pm tomando

3 lecturas minimo.

2) Cuenta diferencial

1 .- Se tomó una gota de sangre de la cola del ratón, para hacer un frotis.

2.- Se utilizó colorante de Wright para tetíir el frotis dejándola 10 minutos

3.- Se lavo la laminilla con agua durante 2 minutos y se dejó secar a temperatura ambiente

4.- Se observo al microscopio con objetivo de inmersión y se contaron 200 leucocitos

B) Cuantificación de eritrocitos

Se hizo una dilución 1:lOOO de la sangre obtenida por punción cardiaca con una solución

lsoton I I para su cuantificación en el contador de partículas (Coulter Counter ZI). Con una

apertura de 8.28 - IOpm, tomando 3 lecturas mínimo.

Cuenta de reticulocitos

1 .- Con una pipeta Pasteur se coloco una gota de sangre en un tubo de ensayo

2.- Se le agrego 0.Olgr. de colorante de azul de metileno

3.- Se dejo incubar 30 minutos a 37oC

5.- Se preparó un frotis, se observó a inmersión

6.-Se contaron 100 células rojas y se anotaron los reticulocitos encontrados

7.- Se expresaron el número de reticulocitos observados por cada 100 eritrocitos contados

Determinación del hematocrit0 o volumen del paquete celular

1 .- Se I!eno un capilar con sangre

2.-Se centrifugo a 3,000 rpm durante media hora, se leyó el volumen celular, sobre la escala

derecha del tubo (escala de 0-100 de abajo hacia arriba)

3.- No se incluyo le la lectura la capa blanca correspondiente a leucocitos

Dosificación de hemoglobina

La curva de calibración se preparó diluyendo la disolución valorada de cianometahemoglobina

(Hylce No 701 17) con el reactivo de cianometahemiglobina y midiendo la absorbancia de cada

dilución a 540nm.

Se coloco los siguientes volúmenes de disolución de cianometahemoglobina y reactivo de

cianometahemoglobina, dentro de los tubos correspondientes y se mezclo.

Concentración de hemoglobina blanco 5 10 15 20 gldl

Disolución valorada de cianometahemoglobina 0.0. 1.25 2.5 3 75 5.0 ml.

Reactivo de cianometahemoglobina 5.0 3.75 2.5 1.25 0.0 ml

Se leyó la absorbancia de cada uno de los tubos contra el blanco (13)

Se gráfico la absorbancia de dilución en las ordenadas contra su concentración en las abscisas.

Cuenta de Plaquetas:

1. Se llenó una pipeta para glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0.5

2. Se limpió la punta y se llenó hasta la marca de 101 con oxalato de amonio al 1 %.

3. Se agitó manualmente durante 2 minutos y 3 minutos en el agitador de pipetas

4. Se cargó la cámara de neubauer y se dejó en reposo 10 minutos en ambiente húmedo

5. Se contaron las plaquetas al microscopio con objetivo de 40X

Análisis estadístico.

Los resultados se expresan como, la media t desviación estándar y la prueba de t (student) para

pares de datos no agrupados.

T

0.4

0.2

o. I

'E S

g/mL

g/mL

g/mL

TIGO

a 0

U 6

D v)

0.4 glmL

0.2 g/mL

T

o. I

'E S

g/mL

TlGO

O.

O.

O.

TE

,4

#2

I

S

g/mL

g/mL

g/mL

TlGO

r m C

r m c o O o =i O v)

A O (D

I a' A ul (D

r

O O O O O O

I m

D

CONCLUSIONES:

l . Bajo las condiciones de experimentacion, únicamente la concentración 0.4 g/ml del extracto acuoso produjo incremento en la concentración de plaquetas en sangre de ratones.

2. Queda por conocer, si e! extracto estimula la liberación de plaquetas a partir de megacariocitos maduros o bien acelerar la maduración de megacariocitos para hacerlos productores de plaquetas.

3. El extracto acuoso de P. aviculare no estimula la hematopoyesis, ya que la concentración celular de la médula ósea no se modifica.

Los resultados muestran que los ratones que recibieron la concentracion de 0.4 glml del

extracto acuoso, presentaron como Único cambio incremento en la concentración de

plaquetas, lo que respaldaría el uso empírico como antihemorragico en los casos de púrpura

trombocitopénica (14 ).

Es posible que la planta provoque la liberación de plaquetas a partir de la poza de

megacariocitos maduros y que no estimule la diferenciación de célula madre hematopoyética

hacía precursores megacariocíticos, detectados mediante la reacción citoquímica de

tiocolinesterasa (15), cuya concentración no se modifica, de la misma manera que tampoco

se modifica el número de células nucleadas totales de la médula ósea.

Bajo las condiciones de experimentación, no se detectó actividad estimulante de la

proliferación de células hematopoyeticas, no obstante que es un extracto acuoso y que es

posible contenga péptidos o proteínas que pudieran actuar como lectinas mitogénicas (16).

La falta de actividad hematopoyética del extracto, podria atribgirse al calentamiento

prolongado para su obtención, lo que provocaría la desnaturalización, precipitación o

descomposición de las moléculas mitogénicas (proteínas) y con ello su actividad mitogénica.

Es importante determinar si este incremento es específico, esto es, si estimula la

trombopoyesis o es un mecanismo inespecífico (mecánico), provocando que las plaquetas se

liberen para marcar las partículas del extracto y así atraer a los macrófagos para la fagocitosis

de dichas partículas como sucede en la aterogénesis (17 ).

En las hojas de esta planta se ha reportado la presencia de flavonides del tipo de la

quercetina, cuya actividad en algunas células sobre todo vegetales se ha demostrado regula

el crecimiento al inhibir la actividad de la enzima indol-acético-oxidasa (1 8 )

En la planta completa también se han reportado taninos, los que precipitan proteinas,

funcionando como astringente, tanto en células del tracto intestinal como sobre la piel en las

quemaduras, en este caso al precipitarse las proteínas se funden los tejidos, estimulando con

ello la regeneración y cicatrización (19 ), es posible que este efecto aunado al efecto de las

plaquetas aglutinantes logre detener el sangrado extravascular.

BIBLIOGRAFÍA

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