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INTRODUCCIÓN

La reproducción asistida se haconvertido en la única esperanza paramuchas parejas con problemas deinfertilidad. Sin embargo, esta técnicaresulta ineficiente, ya que tan solo entreun 10-30% de todos los embriones quese transfieren al útero maternoimplantarán y acabarán en embarazoevolutivo (Lieberman et al., 2001).

Muchos son los factores involucrados enla llegada a término del embarazo, perosin duda el protagonista de esta historiaes el embrión. El embrión humanodebido a su gran plasticidad es capaz deevolucionar incluso en condicionessubóptimas. Sin embargo esto podríatener ciertos costes, siendo una de lasprincipales causas de los fallos deimplantación en las técnicas de FIV.

Hasta hace relativamente poco tiempo laselección del embrión/es a transferir

estaba basada únicamente en criteriosmorfológicos. Estos parámetros, a pesarde tener la ventaja de ser no invasivos,tienen el inconveniente de ser a vecesinexactos y subjetivos. En los últimosaños, técnicas como la metabolómica y laproteómica son capaces de aportarinformación clínica importante acerca delos cambios que acontecen en elambiente del embrión. Con la creación delas ``ómicas´´ podremos identificarnuevos marcadores de viabilidadembrionaria no invasivos. Sin embargo,a día de hoy, se hace necesarioacompañar estas nuevas herramientascon criterios morfológicos paraseleccionar un embrión. Pero en un futurono muy lejano quizá podamos elegir unsolo embrión sin tener que fijarnosúnicamente en su aspecto. Porque lasapariencias a veces engañan….

METABOLÓMICA

La morfología de un embrión tiene un

valor predictivo limitado para determinarsu viabilidad y posibilidad de darembarazo, por lo que se necesitan nuevasherramientas que nos conduzcan a latransferencia embrionaria única (SET).

Una aproximación hacia el problema dela evaluación de la viabilidadembrionaria sería la valoración del perfilmetabólico del medio de cultivoconsumido por el embrión. Es lógicopensar que el metabolismo de unembrión sano podría alterar el medioque le rodea de forma distinta que unomenos sano y por lo tanto con menorpotencial implantatorio. El perfilmetabólico debería ofrecer la ventaja deevaluar de forma simultánea un grannúmero de analitos en el medio, yproducir un perfil que podría estarasociado con la viabilidad embrionaria.Se ha obtenido recientemente el perfilmetabólico del cultivo de embrioneshumanos mediante espectroscopíaRaman o NIR (Near-infrared

LAS APARIENCIAS A VECES ENGAÑAN, LA VERDADERA BELLEZAESTÁ EN EL INTERIOR.YOU CAN´T JUDGE A BOOK BY ITS COVER, TRUE BEAUTY IS WITHIN.

Olmedo Illueca, C.; Lozano Zamora, M.; Iñiguez Tornero, J. y Cuevas Sáiz, I. Consorcio Hospital General Universitario de Valencia (Unidad de Reproducción Humana). Avda / Tres Cruces s/n ValenciaCorreo electrónico: carla.olmedo@gmail.com

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RESUMEN

La evaluación de embriones mediante criterios morfológicos ha sido hasta ahora la única herramienta fiable de selección. Sinembargo, los avances en técnicas de biología molecular como la proteómica o la metabolómica nos permiten descubrir nuevosmétodos que, acompañados de los criterios morfológicos, nos permitan escoger los embriones con mayor potencial deimplantación. Con ello, no sólo conseguiremos aumentar las tasas de embarazo, sino que además evitaremos la necesidad detransferir más de un embrión y el posible riesgo de embarazo múltiple.

Palabras clave: marcadores no-invasivos, Viabilidad embrionaria, proteómica, metabolómica.

SUMMARY

Embryo evaluation using morphological criteria has been the unique trustworthy method of embryo selection. However, newadvances in molecular biology techniques like metabolomics and proteomics can permit to choose the embryo with the bestimplantation potential. Therefore, we will be able to increase pregnancy rates but furthermore avoid the need to trasnfer morethan one embryo and his multiple pregnancy risk.

Keywords: Non-invasive biomarkers, Embryo viability, proteomics, metabolomics

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Olmedo Illueca, C. et al. Las apariencias a veces engañan, la verdadera belleza está en el interior.

spectroscopy). Existe un método paradetectar el perfil metabólico en mediosde cultivo de embriones de FIV/ICSI quemuestra la habilidad para valorar elpotencial reproductivo de un embrión(Seli et al., 2007). Esa información seobtiene midiendo biológicamente lasconcentraciones de grupos funcionalesclave como R-OH, -SH, C-C, -CH, -OH y -NH mediante el uso de espectroscopiainfrarroja cercana (NIR). Estos sonsensibles a especies reactivas deloxigeno, y la variación entre embrionesviables y no viables puede ser resultadode una modificación oxidativa. Elespectro obtenido por NIR mostró unaumento en los grupos –OH y descensode los grupos –CH y –NH.

El modelo de estimación de la viabilidadenfatiza en las diferencias existentesentre –CH y –NH. Estos resultados sonconsistentes con el concepto de que unembrión, cuando madura, consume elmedio de cultivo modificando su pool. Esnotable que –SH,-CH,-NH y –OH sonbiomarcadores del estrés oxidativo y seha demostrado que afectan a laviabilidad embrionaria. Mediante unalgoritmo genético se discriminan losembriones que dan embarazo positivo ynegativo según su perfil metabólico.

Esto da como resultado un score deviabilidad embrionaria para medir elpotencial del embrión para desarrollarsede forma correcta, implantar y dar lugara una gestación evolutiva.

De forma retrospectiva se ha intentadocomprobar si el perfil metabólico de losconstituyentes se correlaciona con elembarazo cuando los embrionestransferidos se seleccionaron porcriterios morfológicos porque no todoslos embriones con buena calidadmorfológica implantan. Para ello lospacientes se dividieron en grupos.Aquellos con una tasa de implantacióndel 100% representaron el grupo cuyosembriones tenían potencial reproductivoprobado, y aquellos con una tasa del 0%se seleccionaron para representar a losembriones sin potencial deimplantación. Las muestras que seanalizan son aquellas obtenidas de día 3y día 5 de desarrollo post-inseminación.Se comparan ambas muestras mediantesus índices de viabilidad usando análisisestadístico de la t-Student y se

obtuvieron mejores resultados para lasmuestras en día 3. Los índices deviabilidad de las muestras conimplantación fueron mayores (0.94) quelos que no implantaron (0.56). Secrearon curvas ROC (Receiver operadorcharacteristic) para identificar el valorumbral con mejor mezcla de sensibilidady especificidad. Este valor umbral fuedespués aplicado a los datos paracalcular valores predictivos positivos ynegativos. La curva ROC indica quemediante el índice de viabilidad de 0.76podemos ser capaces de discriminarentre embriones con alto potencial conuna sensibilidad y especificidad del82.4% y 69% respectivamente. Y unaexactitud del 75.8%.

Las muestras obtenidas de blastocistosen día 5 fueron evaluadas de igualforma. Las muestras asociadas a laimplantación tuvieron unos índices devariabilidad más altos (-0.40) queaquellas con fallo de implantación (-0.81). Se completó una curva ROC queidentificó el mejor valor umbral de -0.43. Usando este valor, la sensibilidad yespecificidad fue del 100%.

Los resultados sugieren que losembriones que implantan y acaban enembarazo modifican su ambiente deforma distinta que los que no implantan.Si se compara la exactitud de loscriterios morfológicos y losmetabolomicos, estos últimos tienen un15% más de acierto que los morfológicosdespués de la transferencia única (SET)en día 3 post-inseminación y un 40% endía 2, cuando la transferencia se lleva acabo independientemente de loscriterios morfológicos

Por tanto los cambios en el medio decultivo por oxidación pueden ser unindicador del potencial y sonindependientes de los criteriosmorfológicos.

En la práctica estos datos sugieren quela metabolómica podría usarse junto conla morfología para seleccionar unembrión.

La GM-CSF (Granulocite Macrophage-colony stimulating factor) es unacitokina perteneciente a la familia defactores de crecimiento hematopoyéticossecretada por el tracto femenino de

humanos y mamíferos al comienzo delembarazo. Su función es regular elnúmero y viabilidad de los blastocistos ysu presencia en el ambiente constituye unelemento clave en la implantación,crecimiento y desarrollo fetal.

Esta citokina varía su concentración enfunción de la edad de la paciente. Enaquellas menores de 30 años laconcentración es significativamentemayor que en aquellas con 37 años omás. También se ha visto que existerelación entre la G-CSF y los niveles deEstradiol. A medida que aumenta laconcentración de citokina en suerodisminuye el nivel de Estradiol. Existecorrelación entre los niveles de G-CSF yestradiol en suero el día de la punción.En cambio no había diferencias entrefolículos de ovocitos fecundados y nofecundados. El hecho de que los nivelesfueran superiores en líquido folicularnos indica la producción intrafolicular deesta citokina y el papel auto/paracrinoque ejerce en el ambiente folicular.

Mediante Western-Blot y técnicasinmunohistoquímicas se han localizadossus receptores en el ovario,principalmente en las células de lagranulosa y células luteales.

Se realizó un estudio comparativo de losembriones procedentes de líquidofolicular con concentraciones porencima y por debajo de 20 pg/ml, queconstituye el ratio del embrión peor y elmejor. Para decidir el valor límite de G-CSF que determina que concentración decitokina marca el potencial deimplantación de cada ovocito y sucorrespondiente embrión se realizó unacurva ROC. El valor límite por debajo delcual no ocurre la implantación es 20pg/ml. Sin embargo, cuando laconcentración supera 24 pg/ml el valorpredictivo positivo alcanza un 40%.

Los resultados muestran claramenteque pacientes embarazadas revelabanun aumento constante de citokinadesde la transferencia a laimplantación. Sin embargo aquellas que no resultaron embarazadasmostraban un ligero aumento seguidode un descenso los dias 6-8 deestimulación, marcando con ello elcomienzo de un nuevo ciclo.

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Otros autores pretenden identificar lasdiferencias en el perfil proteico entreblastocistos humanos usando Arrays. Seanalizan un total de 120 proteínas delmedio de cultivo (CCM, Vitrolife) deblastocistos. Si se compara el perfilproteico de aquellos blastocistos queimplantaron respecto a los que noimplantaron se encuentran diferenciasúnicamente en dos proteínas, que sonCXCL13 (B-cell attracting homingchemokine) y GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor).Estas dos proteínas disminuían su nivel enel medio de cultivo de embriones viables.La GM-CSF es un factor que previene laapoptosis (Sjoblom et al., 2002) ypromueve el desarrollo in vitro (Sjoblomet al., 1999). Y no sólo es esencial para eldesarrollo, sino también para laimplantación (Robertson et al., 2007).Podría por tanto ser considerado unbiomarcador de viabilidad embrionaria.

La CXCL13 no tiene funcionesrelacionadas con la implantación o eldesarrollo, pero si para el sistemainmune aunque no se conoce demasiadoacerca de ella.

Por tanto, la G-CSF tiene un papelprimordial en el desarrollo folicular, laimplantación, la ovulación y elmantenimiento del embarazo.Constituye un biomarcador no invasivoque promueve la transferencia únicaporque evalúa al ovocito de formaindividual y nos ayuda a identificar elmejor protocolo de estimulación. Pero eluso de estas proteínas como criterio deselección embrionaria necesita aún demás estudios.

Las células de la granulosa son las únicasencargadas de producir la hormona anti-mÜlleriana (AMH) desde el nacimiento.Esta hormona alcanza su máximo nivelen la pubertad y continúa presente enedad adulta a nivel basal.

Hasta ahora sólo se conocía su funcióncomo factor pronóstico de la reservaovárica. Se ha visto que los niveles dehormona son más bajos en mujeres conbaja respuesta que en aquellas conrespuesta normal (Elgindy et al,2008).Sin embargo esta hormonaademás de predecir la edad ováricaconstituye un marcador de calidadembrionaria.

Parece que la cantidad de oocitos y lacalidad de los embriones soninversamente proporcionales a la edadde la mujer, cuya respuesta ovárica,como hemos citado anteriormente, sepredice con la concentración de dichahormona en suero. Cuando laconcentración de hormona es elevada enlíquido folicular el día de laadministración de hCG, la calidadembrionaria, la tasa de implantación y,por tanto, la de embarazo aumentan.

Otros autores demuestran que enaquellas pacientes cuyos oocitosfecundaron, la concentración de AMH enlíquido folicular fue más elevada que enaquellas a las que no les fecundaron.

Según S.L.Broer et al., 2008 la AMHtiene la misma capacidad de predecirbaja respuesta ovárica a la estimulacióny no embarazo en FIV que el recuento defolículos antrales.

Para determinar la concentración dehormona se puede utilizar un ELISA,concluyendo que un desarrolloembrionario mejor de lo normal y unastasas elevadas de embriones de buenacalidad se correlacionan con unincremento de AMH en el líquidofolicular. Por lo tanto, la determinaciónde AMH en líquido folicular resultaría útilen la predicción de calidad embrionaria.

La HLA-G es una molécula del complejomayor de histocompatibilidad (MHC)tipo I no clásica. Adopta siete isoformas,resultado del splicing alternativo de unmismo RNA inmaduro, cuatro seencuentran ligadas a la membrana(HLA-G1,-G2, -G3, -G4) y las otras tresformas son solubles (sHLA-G5, -G6, -G7), además presenta una limitadadistribución en los tejidos,expresándose de forma selectiva por lascélulas del citotrofoblasto velloso en lainterfase materno-fetal.

Desarrolla un papel importante en lainmunoprotección del embrión, por ellopodría jugar un papel esencial endiálogo madre-embrión protegiendo alfeto de ser rechazado por la madre.

Desde la primera vez que fueidentificado en medios de cultivoembrionario (HTF Irvine Scientific, CA,USA) o (KSOM Gibco BRL, Grand Island,

NY, USA) (Jurisicova et al., 1999)algunos artículos relacionan suconcentración con una mayor tasa dedivisión embrionaria o con unacondición imprescindible para lograrembarazo, pero todos la asocian con unmayor éxito en la tasa de implantaciónde dichos embriones (Noci et al., 2005;Sher et al., 2005).

Sin embargo no todos los trabajos estánde acuerdo con estos hallazgos. Algunosautores solo detectan s-HLA-G entrofoblasto y no en cultivos deembriones de 8 células ni tampoco enblastocistos. Todos estos desacuerdospodrían venir dados por la especificidady la sensibilidad de los medios dedetección utilizados y por el tipo demedio de cultivo utilizado. Además,parece que también se observavariabilidad entre diferentes lotes delmismo medio.

En cualquier caso, la detección de s-HLA-G podría ser un posible biomarcadorde la capacidad implantatoria delembrión, ya que seria un método noinvasivo que permitiría realizar laselección embrionaria sin atenderúnicamente a criterios morfológicos.

PROTEÓMICA

Se conoce poco sobre la producción deproteínas del embrión de humano, enparticular de las proteínas que produceel embrión y son secretadas al medio quele rodea (secretoma). Las proteínas sonresponsables de la mayoría de funcionesque dictan como un embrión reaccionaráa su ambiente.

Los avances en espectroscopia de masashan sido revolucionarios para laproteómica. Mediante el uso de perfilesde expresión se identifican proteínasimplicadas en procesos biológicos.

Surface-enhanced láser desorption andionization time-of-flight massspectroscopy (SELDI-TOF MS) es uno delos mas recientes desarrollos de laproteómica basado en capturarproteínas y péptidos por superficiesquímicamente modificadas y esaltamente sensible para el análisis demuestras biológicas complejas. Lasensibilidad del SELDI-TOF MS permite elanálisis de pequeñas concentraciones de

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proteínas secretadas por el embrión a lolargo de su desarrollo.

La novedad está en que utilizasuperficies químicas en chips quepermiten capturar subclases deproteínas. Una vez unidas al chip lasproteínas son ionizadas usando un láserque desorbe en un gas cargadopositivamente. El tubo del TOF crea unvacío que permite la separación einterpretación de iones de acuerdo a sumasa/carga.

Usando SELDI-TOF MS se ha desarrolladoun sistema capaz de analizar el proteomade un blastocisto humano, y la meta esidentificar las proteínas y los eventoscríticos que ocurren justo antes de laimplantación.

Se utilizan blastocistos de morfologíasimilar pero con diferencias en el tipo yla intensidad de algunas proteínas ypéptidos. Cuando los blastocistos secompararon por análisis estadístico conembriones degenerados se encontraronmuchas diferencias en proteínascargadas negativamente.

Los datos han identificado un potencialcandidato implicado en apoptosis einhibición del crecimiento, la Heparin-binding epidermal growth factor (EGF)-like growth factor precursor (HB-EGF)es un potencial candidato implicadocon la interacción entre eltrofoectodermo y el epitelio luminal del útero materno en la implantacióndel blastocisto. Es un estimulador delcrecimiento, relacionado con elhatching.

Otro de los candidatos es la cystatin-likeprecursor. Como se sabe que las cistatinasinhiben las cisteína proteinasas, el feed-back positivo de esta proteínacontribuiría al fallo de implantación deembriones degenerados.

Los estudios han demostrado que losembriones, cada 24 horas secretandistintas proteínas. Esos perfilesproteicos caracterizan el estadio dedesarrollo de ese embrión por susecretoma solo, independientemente dela morfología. Los análisis revelan laexpresión de varios biomarcadoresdiferentes solo en puntos específicoscada 24 horas.

El análisis del secretoma de blastocistoshumanos que se desarrollan revelódiferencias significativas en la expresiónde una proteína de 8.5-kDa. Losembriones que se desarrollaroncorrectamente mostraron fuerteexpresión de esa proteína mientras quelos degenerados mostraron ausencia.Esta proteína también se detectasignificativamente en estadio deblastocisto y es el biomarcador másabundante en el secretoma en día 5. Estaproteína ha sido identificada como laubiquitina y está implicada enimplantación.

En cuanto a biomarcadores de viabilidad,los blastocistos humanos de morfologíassimilares muestran perfiles proteicosdistintos. Los embriones degenerados ylos que se desarrollan también varían encuanto a las proteínas implicadas enapoptosis e inhibición de crecimiento.En blastocistos de una misma paciente ycon morfologías similares variaenormemente su huella dactilarmetabólica (Gardner et al., 2001).

Esto indica que existen diferenciassignificativas en la expresión deproteínas independientemente de lamorfología.

El recambio aminoacídico constituye unmétodo no-invasivo de selecciónembrionaria basado en eldepleción/aparición de aminoácidos enel medio de cultivo (Leese, 1994;Houghton, 2002; Brison, 2004). Pareceestar relacionado con la habilidad de unembrión para implantar y dar embarazo.Esto es independiente de otrosindicadores de embarazo como la edadmaterna, reserva ovárica y número decélulas embrionarias y grado.

El análisis mediante HPLC (Highperformance liquid cromatography)permite ver los cambios que se producenen la concentración de aminoácidos en elmedio de cultivo individual de embrioneshumanos cada 24 horas. Los datosobtenidos retrospectivamente llevan a laconclusión de que existen diferenciasclaras en el recambio aminoacídico entreembriones evolutivos y no evolutivos.

En la figura 1 se puede ver laconcentración relativa de 18aminoácidos en el medio de cultivo,

junto con la concentración en aquellospacientes con y sin consecución deembarazo.

Los análisis muestran que la Asparragina(Asn), Glicina (Gly) y leucina (Leu) estánrelacionadas con el embarazo clínico ynacimiento. Leu, Gly y Serina (Ser) sonlas menos abundantes en el medio deembriones de ciclos exitosos mientrasque Asn y Arginina( Arg) son los másabundantes.

El número de células y el Embryo Scoreparece que se correlacionan únicamentecon la Glu. No sabemos exactamente queaspectos de la viabilidad embrionaria sereflejan en el recambio amino acídico,pero lo que si se sabe es que losaminoácidos cuyo recambio predice laformación del blastocisto no son losmismos que predicen el embarazo(Houghton et al., 2002). Losblastocistos formados in vitro sepredicen mediante la Ala, Arg, Gln, Met yAsn entre los días 2 y 3 post-inseminación (Houghton et al., 2002)mientras que para el embarazo se midenla Asn, Gly y Leu entre los días 1 y 2 post-inseminación. Esto refleja el hecho deque no todos los blastocistos formadosin vitro son viables. A lo largo deldesarrollo los embriones pasan denecesitar Leu en día 2-3, Ser, Arg y Leuen 8 células y Ser, Leu, Arg, Met y Valinadurante el paso de mórula a blastocisto.En cambio los embriones que sedetienen usan 7 y 6 aminoácidos en día2-3 en 8 células.

Esto nos da una idea de las necesidadesnutricionales del embrión y su posiblerelación con la fisiología y desarrollo delmismo. Y nos indica que los embrionesque se detienen son metabólicamentemás activos que los embriones que sedesarrollan. Esto implica que la calidadoocitaria debe jugar un rol mayor en ladeterminación de la viabilidadembrionaria puesto que la activacióndel genoma no se detecta hasta estadiode 4-8 células.

CONCLUSIÓN

Actualmente, continuamos trabajando deforma rutinaria en la valoraciónmorfológica de gametos/embriones, perogracias a los estudios que se estánrealizando se confirma que los embriones

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no son entidades estáticas, sino queintercambian metabolitos con el medioque les rodea y a su vez lo modifican,pudiéndose utilizar las medidas de esamodificaciones como herramientas deselección adicionales a la morfología.

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Fig 1. Box plots of the 18 individual amino acids showing the medians (thicker lines), inter-quartile ranges(boxes), ranges (whiskers; excluding outliers) and outlying observations (open circles) for amino acidappearance in the culture medium. Open boxes are the cycles that did not achieve a pregnancy and shadedboxes those yielding a pregnancy. P-values are for a Mann–Whitney test comparing the two groups for eachamino acid.

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