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biotecnología

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Fernando Bravo Almonacid, Profesor de BiotecnologíaVegetal, UNQ. Investigador Adjunto (INGEBI-UBA-CONICET)Sonia Wirth, bióloga, becaria doctoral CONICET,INGEBI-UBA-CONICETMaría Eugenia Segretin, bióloga, becaria doctoral CONICET,INGEBI-UBA-CONICETMauro Morgenfeld, biólogo, becario doctoral ANPCyT,INGEBI-UBA-CONICET

Actualmente, la producción de biofármacos se realiza uti-lizando básicamente dos sistemas: microorganismos y cultivode células de mamífero.

Respecto al primer sistema, existe la dificultad asociada ala incapacidad que tienen las bacterias y hongos de produciren las proteínas animales ciertas modificaciones que en la ma-yoría de los casos son indispensables para su funcionalidad,como por ejemplo, el agregado de determinados azúcares (gli-cosilación). Además, el plegado incorrecto de la proteína y laformación de agregados insolubles limitan la obtención deproductos biológicamente activos o cuyo costo de purifica-ción sea económicamente sostenible.

Los cultivos de células de mamífero, en cambio, tienen laventaja de que permiten la síntesis de proteínas animales muysimilares a la original. Sin embargo, la obtención y manteni-miento de las líneas celulares es un proceso largo y costoso queimplica grandes inversiones adicionales cuando se pretendeincrementar la escala de producción.

Estos sistemas requieren de personal técnico especializadoy conllevan grandes riesgos económicos en caso de que ocu-rran contaminaciones en la línea de producción, aunque elcontaminante no sea patogénico para la salud humana.

Todas las dificultades mencionadas han intensificado losesfuerzos para desarrollar nuevos sistemas de producción demoléculas recombinantes seguras y a bajo costo.

En este entorno económico, la agricultura molecular, esdecir, la utilización de animales o plantas como biorreactorespara la producción de proteínas recombinantes, constituyeuna alternativa posible a los sistemas de producción basadosen microorganismos y cultivos de células.

LLaass ppllaannttaass ccoommoo bbiioorrrreeaaccttoorreess

La producción de proteínas terapéuticas en animales trans-génicos permite obtener productos muy similares a los sinte-

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tizados en el organismo animal original, pero requiere de untiempo de desarrollo muy largo y costoso. El aumento en laescala de producción es lento y se limita a los ciclos naturalesde crecimiento de la especie utilizada. Además, existe el riesgode contaminación con virus animales y priones. Es por elloque las ventajas asociadas a la producción de proteínas recom-binantes en biorreactores vegetales han transformado a éstosen una opción altamente competitiva.

La principal ventaja de las plantas como sistemas de pro-ducción es la disponibilidad prácticamente ilimitada de bio-masa que puede obtenerse utilizando la infraestructura yaexistente para la siembra, cosecha, almacenamiento y proce-samiento de los cultivos. El capital de inversión inicial y elcosto para el aumento en la escala de producción son relati-vamente bajos. Más aún, el volumen de producción es extre-madamente flexible y puede adaptarse rápidamente a las de-mandas del mercado incrementando o disminuyendo la su-perficie sembrada. Por otra parte, una vez establecido el cul-tivo, no se requiere de personal especializado, no hay riesgosde contaminación con patógenos animales, endotoxinas bac-terianas o secuencias de ADN oncogénicas y puede aprove-charse el conocimiento previo de los sistemas de molienda yextracción en las primeras etapas del proceso de purificación.Una ventaja adicional es que las plantas permiten el almace-namiento estable de la proteína recombinante en semillas ytubérculos, facilitando su conservación, transporte y distri-bución. Más aún, los mecanismos de síntesis y modificacio-nes posteriores son los propios de las células de mamíferos,permitiendo la producción y ensamblado de proteínas multi-méricas como los anticuerpos. Otro beneficio es que gozaríande una mayor aceptación pública que la utilización de anima-les transgénicos.

Cuando se comparan los costos de producción de proteí-nas recombinantes en distintos sistemas, se demuestra que –amenos que los niveles de proteína recombinante alcanzadossean excesivamente bajos– los costos de producción en plan-tas son generalmente inferiores a los de otros sistemas (ver re-cuadro).

Más del 85% del costo de producción de una proteína re-combinante depende del proceso de purificación. Al respecto,las plantas poseen ventajas propias que permiten reducir estosvalores, a través de la fabricación directa en tejidos comestibleso la acumulación en tubérculos o semillas. Las perspectivas deaumentar aún más los niveles de expresión (que se fabriqueuna mayor cantidad de la proteína de interés en los tejidos ve-getales) y el desarrollo de técnicas más baratas de purificación,permitirán producir proteínas recombinantes a costos entre10 y 100 veces inferiores a los de los fermentadores bacteria-nos.

Resumiendo lo expuesto, la producción económicamenterentable de proteínas recombinantes en plantas implica cum-plir con tres requisitos primordiales: a) elevar los niveles de ex-presión, b) reducir los costos de purificación, y c) lograr unproducto de características idénticas o similares al sintetizadoen el sistema nativo.

PPrrootteeíínnaass eexxpprreessaaddaass eenn ppllaannttaass:: vvaaccuunnaass yy oottrrooss eejjeemmppllooss

Una de las aplicaciones más prometedoras de las plantascomo biorreactores es su potencial uso para la producción deantígenos en tejidos comestibles (vacunas comestibles). Laproducción de proteínas antigénicas en los tejidos vegetales

permitiría protegerlas de la degradación en el tracto gastroin-testinal, un factor crítico para desarrollar una vacuna oral exi-tosa. A su potencial bajo costo de producción, se suma la ven-taja de su fácil distribución y administración. La expresión entejidos de almacenamiento (en tubérculos, por ejemplo) en losque las proteínas son estables a temperatura ambiente, permi-tiría obviar la necesidad de establecer y mantener una cadenade frío, una de las limitaciones económicas más importantespara la distribución de las vacunas en muchas regiones geográ-ficas del mundo. Sin embargo, no se puede obviar el principaldesafío en la producción de una vacuna que todo sistema deproducción debe enfrentar; esto es, que el antígeno debe con-servar su integridad estructural y actividad funcional para in-ducir una respuesta inmune protectora. Es importante men-cionar que, dada la necesidad de aplicar dosis controladas delos compuestos farmacológicos, se plantea la producción decápsulas con tejido vegetal procesado en lugar del consumo dematerial vegetal fresco sin procesar.

Hasta la actualidad, se han expresado en plantas un núme-ro considerable de antígenos, que incluyen potenciales vacu-nas contra los agentes causales de diarreas, como los rotavirus,las cepas enteropatogénicas de Escherichia. coli, el Vibrio cho-lerae y el virus Norwalk, así como contra las infecciones pro-ducidas por los virus de la hepatitis B y C, HIV, virus respira-torio sincicial, virus del papiloma humano, virus de la rabia yel virus aftosa. También se ha reportado la expresión de antí-genos para vacunas contra agentes patógenos bacterianos co-mo Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Bacillusanthracis y el parásito responsable de la malaria, Plasmodiumfalciparum, entre otros. Algunos de estos antígenos ya se eva-luaron en ensayos clínicos en humanos, incluyendo la inmu-nización por ingestión de hojas de lechuga que contienen alantígeno de superficie del virus de la hepatitis B humana

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biotecnología(HBsAg), tubérculos de papa que expresan la subunidad B dela toxina de E. coli enteropatogénicas, o la cápside del virusNorwalk, y hojas de espinaca que protegen contra la rabia. Entodos ellos se observó algún tipo de respuesta inmune, tantosistémica como en mucosas, lo que alienta sobre la posibilidadde desarrollar vacunas orales contra éstos y otros patógenoshumanos.

Otros ejemplos de proteínas terapéuticas expresadas exito-samente en plantas incluyen los anticuerpos que reconocen alantígeno de superficie del virus de la hepatitis B humano(HBsAg), a la glicoproteína B del virus del herpes simple hu-mano de tipo 2, HSV-2, anticuerpos anti-esperma para su uti-lización como anticonceptivos, anti-idiotipos del linfoma noHodkins y un reactivo para diagnósticodel HIV. Dentro de esta clase de molécu-las cabe destacar el caso de una IgA secre-toria expresada en tabaco que reconoce unantígeno de Streptococcus mutans, el prin-cipal agente causal de la caries dental. Enensayos clínicos llevados a cabo en huma-nos, en los que se aplicó este anticuerpoen forma tópica luego del tratamiento conun antiséptico, se verificó una protecciónefectiva y específica contra la recoloniza-ción por S. mutants durante al menos cua-tro meses (www.planetbiotechnology-.com).

Además de los antígenos y anticuer-pos, existen diversos ejemplos de proteí-nas de uso farmacológico e industrial ex-presadas en tejidos vegetales. La produc-ción de somatotropina humana (hST) ensemillas de tabaco, la seroalbúmina huma-na (HSA) en papas, la aprotinina bovina en semillas de maíz,y el factor estimulante de granulocitos y macrófagos (hGM-CSF) en semillas de tabaco son sólo algunos de ellos. Entreellos podemos destacar la expresión en tabaco de la lipasa gás-trica canina, utilizada para el tratamiento de insuficienciaspancreáticas y fibrosis quística, que se encuentra en la etapa deensayos clínicos (www.meristem-therapeutics.com). Un ejem-plo de desarrollo local en nuestro laboratorio es la expresióndel factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF) enplantas de tabaco (ver recuadro aparte). El hEGF es un factormitogénico que interviene en el desarrollo, diferenciación, re-paración y protección de tejidos epiteliales. Se emplea para eltratamiento de heridas y quemaduras, como agente reparadoren transplantes de córnea y para el tratamiento de úlceras gás-tricas y otras afecciones gastrointestinales.

Además de la expresión de proteínas terapéuticas, se estánutilizando plantas como biorreactores para la producción deenzimas de uso industrial, como la avidina de pollo y la trip-sina bovina producidas en semillas de maíz (ambas aprobadaspara su comercialización, www.prodigene.com); suplementosalimenticios como la fitasa del hongo Aspergillus niger en se-millas de tabaco y colza, o polímeros como el colágeno, la se-da de araña y plásticos biodegradables.

EEssttrraatteeggiiaass ppaarraa llaa ooppttiimmiizzaacciióónn ddee llaa pprroodduucccciióónn

La optimización de los niveles de producción de la proteí-na recombinante puede lograrse siguiendo diversas estrategias.La elección de la misma o combinación de ellas dependerá de

las características de la proteína a sintetizar, de la especie vege-tal utilizada y de las necesidades de producción. Generalmen-te, es difícil predecir cuál de estos aspectos tendrá mayor im-pacto para producir con éxito una proteína particular. Ello re-quiere, por lo tanto, ensayar múltiples variables para lograr ni-veles óptimos de producción. Los elementos a tener en cuen-ta son la elección del sistema de expresión y del germoplasmaa transformar y el uso de herramientas moleculares para el di-seño de las construcciones genéticas que contengan las se-cuencias de las proteínas a expresar.

En cuanto a la elección del sistema de expresión, las opcio-nes comprenden dos grandes grupos: integrativos y no inte-grativos. El primer grupo se refiere a aquellos sistemas que

permiten la integración estable de la construc-ción genética en el genoma vegetal, tanto en elnúcleo como en las organelas. Resulta en unatransformación estable y heredable, pero re-quiere etapas de cultivo de tejidos y métodosde transformación eficientes. La transforma-ción de cloroplastos (organela característica delas células vegetales que contiene su propio ge-noma) ha resultado ser una alternativa muy in-teresante para la expresión de proteínas por nu-merosas ventajas, entre ellas, el gran número decloroplastos por célula y el gran número de co-pias de su material genético dentro de cada clo-roplasto, lo que permitiría alcanzar altos nive-les de expresión. Más aun, al no transmitirselos cloroplastos al polen en la mayoría de lasplantas, el riesgo de transmisión horizontal aespecies relacionadas es nulo.

Los sistemas no integrativos, en cambio, norequieren de la integración del transgén, son

más rápidos, pero no son heredables a la progenie. En este úl-timo grupo se encuentran la transformación transitoria convectores virales y por agroinfiltración.

Otros factores a tener en cuenta a la hora de decidir unaestrategia para la producción de proteínas en plantas incluyenla elección de la especie vegetal, así como también en qué par-te u órgano de la planta ha de expresarse dicha proteína (ho-jas, tubérculos, semillas, raíces, suspensiones celulares) paraobtener mayor estabilidad y/o mejores condiciones para su al-macenamiento, etc.

Por último, y no menos importante, existen muchas herra-mientas moleculares que permiten optimizar el sistema, e in-cluyen la elección de elementos genéticos reguladores para ex-presar la proteína en tejidos vegetales específicos, la fusión aotras proteínas y la localización de la proteína en distintoscompartimentos intracelulares para aumentar su estabilidady/o facilitar su purificación. Se ha demostrado que es posibledirigir la proteína recombinante al espacio intercelular (apo-plasto), lo que permite su secreción a través de las raíces (rizo-secreción). Se puede purificar entonces la proteína recombi-nante del medio que rodea las raíces de las plantas transgéni-cas que crecen en un sistema hidropónico.

De todo lo expuesto se desprende que las plantas se pre-sentan como un sistema con numerosas ventajas frente a losotros disponibles para la producción de proteínas recombi-nantes de aplicación terapéutica o industrial. Aunque para ca-da proteína en particular se deban evaluar distintas alternati-vas hasta encontrar aquella en la que los niveles de expresiónsean óptimos, es de esperar que a corto plazo la utilización de

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las plantas como biorreactores sea la op-ción más atractiva.

Los trabajos realizados en el labora-torio fueron financiados por los siguien-tes subsidios:

Proyecto PICT 2000 Nº 08-03529,ANPCyT y Proyecto BID 802/OC-ARPICT 00 nº 08-08702.

LLeeccttuurraa rreeccoommeennddaaddaa

Chadd H., y Chamow S. (2001). Therapeuticantibody expression technology. Current Opi-nion in Biotechnology, 12:188-194.Daniell, H., Streatfield, S. y Wycoff, K. (2001 a).Medical molecular farming: production of anti-bodies, biopharmaceuticals and edible vaccinesin plants. Trends in Plant Science, 6: 219-226.Fischer, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P.y Twyman R. (2004). Plant-based production ofbiopharmaceuticals. Current Opinion in PlantBiology, 7:152-158.Giddings, G (2001). Transgenic plants as proteinfactories. Current Opinion in Biotechnology, 12:450-454.Kusnadi, A., Nikolov, Z. y Howard, J. (1997).Production of recombinant proteins in transge-nic plants: practical considerations. Biotechno-logy and Bioengineering, 56: 473-484.Larrick, J. y Thomas, D. (2001) Producing pro-teins in transgenic plants and animals. CurrentOpinion in Biotechnology, 12: 411-418.Ma J., Drake P., y Christou P., (2003). The pro-duction of recombinant pharmaceutical proteinsin plants. Nature Reviews Genetics, 4: 794-805.Maliga P. (2004). Plastid transformation in hig-her plants. Annu. Rev. Plant Biol., 55:289-313.Mason, H., Warzecha, H., Mor, T. y Arntzen, C(2002). Edible plant vaccines: applications forprophylactic and therapeutic molecular medici-ne. Trends in Molecular Medicine, 8: 324-329.Mor, T., Gomez-Lim, M. y Palmer, K. (1998).Perspective: edible vaccines a concept coming ofage. Trends in Microbiology, 6: 449-453.Peterson, R., y Arntzen C. (2004) On risk andplant-based biopharmaceuticals Trends in Bio-technology, 22: 64-66.Sala, F., Rigano, M., Barbante, A., Basso, B.,Walmsley, A. y Castiglione, S (2003). Vaccineantigen production in transgenic plants: strate-gies, gene constructs and perspectives. Vaccine,21: 803-808.Smith, M. y Glick, B. (2000). The Production ofantibodies in plants: An idea whose time has co-me? Biotechnology Advances, 18: 85-89.Twyman, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou,P. y Fischer, R (2003). Molecular farming inplants: host systems and expression technology.Trends in Biotechnology, 21: 570-578.Wirth S., Calamante G., Mentaberry A., Buss-mann L., Lattanzi M., Barañao L. y Bravo-Al-monacid F. (2004) Expression of active epider-mal growth factor (hEGF) in tobacco plants byintegrative and non-integrative systems. Mol.Breeding, 13: 23-35.Wirth S. (2005) Desarrollo de sistemas de expre-sión integrativos y no integrativos para la pro-ducción de biofármacos en plantas de tabaco. Te-sis Doctoral, Facultad de Ciencias Exactas y Na-turales, Universidad de Buenos Aires.

Estimación de los costos deproducción en función delnivel de expresión de IgA endistintos sistemas y asumiendo que los costos de purificación y las pérdi-das que ocurren durante este proceso son iguales en todos los casos.

Tomado de Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.

Expresión de Factor de Crecimiento Epidérmicohumano (hEGF) en plantas de tabaco

En el laboratorio se desarrolló un proyecto para la expresión de factor decrecimiento epidérmico humano (hEGF) en plantas de tabaco. Se evalua-ron distintos sistemas de expresión integrativos (transformación nuclear yde cloroplastos) y no integrativos. Para corroborar que el hEGF producidoen plantas era igual funcionalmente al comercial, ensayamos si era capazde inducir el efecto típico de esta proteína: la expansión de células del cu-mulus de ovocitos bovinos. El medio dela maduración de los ovocitos se suple-mentó con extracto de una planta sintransformar, con hEGF comercial, o conextractos de una planta de tabaco trans-formada a nivel nuclear con el gen dehEGF. Con éste y otros resultados pudi-mos concluir que el hEGF producido entabaco se comporta igual que el comer-cial. Además, observamos que las plan-tas de tabaco que fabrican hEGF lo se-cretan a través de sus raíces, lo que fa-cilitaría su purificación. La proteínahEGF puede detectarse con un anticuer-po marcado donde crecieron las raíces de las plantas transgénicas (fle-chas), pero no donde crecieron las raíces de las plantas sin transformar.

Tomado de Wirth y col., Mol. Breeding, 2004

Comparación de costos para distintos sistemas deproducción de proteínas