LAS VARIANTES CROMOSÓMICAS AFECTAN LA CALIDAD EMBRIONARIA

A R T I C U L O I I

INTRODUCCIÓN

El genoma se divide en dos partesfuncionalmente diferentes y que sepueden visualizar en los cromosomas enforma de eucromatina yheterocromatina. La eucromatina es laparte más activa del genoma y más ricaen genes. La heterocromatina se divideen heterocromatina facultativa, quecontiene información de algunos genes

que no se expresan o que se expresan enalgún momento (como el corpúsculo deBarr) y la heterocromatina constitutiva,formada por secuencias altamenterepetidas y comprimidas como secuenciasatélite, generalmente pobres en genes.Esta heterocromatina es polimórfica,probablemente debido a la intensidaddel ADN satélite.

Estos polimorfismos pueden afectar no

solamente al tamaño, sino también a lalocalización de la heterocromatina;aparentemente no tienen traducciónfenotípica (Mattei et al., 2003) y seconocen como variantes cromosómicas.Las variantes se deben al aumento deheterocromatina constitutiva y suelenser más frecuentes en los cromosomas 1,9, 16 y en los acrocéntricos. Estasvariantes cromosómicas se identifican anivel microscópico y pueden tener

LAS VARIANTES CROMOSÓMICAS AFECTAN LA CALIDADEMBRIONARIACHROMOSOMAL VARIANTS AFFECT EMBRYO QUALITY

Mireia Poveda1, Teresa Rubio2, Isabel Ochando3, Laura Gil1, Manuel Lloret1, José Jesús López-Gálvez1, Antonio Urbano3, Juan Manuel Moreno1,Joaquín Rueda3,4.1Unidad de Reproducción, Hospital Clínica Vistahermosa de Alicante2Unidad de Reproducción, Clínica Virgen de la Vega, Murcia3Unidad de Genética, Hospital Clínica Vistahermosa de Alicante4Área de Biología Celular, Universidad Miguel Hernández, Alicante e-mail: [email protected] · Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 10 mayo 2010

Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 119

RESUMEN

El objetivo de este estudio es evaluar si la presencia de alguna variante cromosómica en el cariotipo puede afectar a losresultados de los ciclos de ICSI.

Se ha realizado un estudio prospectivo de 81 ciclos de ICSI realizados en nuestro centro en los que algún miembro de la parejapresenta variantes cromosómicas y 169 ciclos de pacientes sometidos a la misma técnica pero con cariotipos normales. Enestos ciclos, se ha obtenido la media de ovocitos recuperados, media de ovocitos maduros, tasa de fecundación, porcentaje defallos de fecundación, porcentaje de embriones de grado A-B transferidos y tasa de gestación y aborto. Los resultados muestranque las variantes más frecuentes son las que afectan al cromosoma 9. Se observa que existen diferencias significativas en lacalidad de los embriones que se transfieren, empeorando en los ciclos con variantes cromosómicas. Los resultados nos sugierenque las variantes cromosómicas pueden tener un efecto sobre la gametogénesis, por lo que los embriones generados en estosciclos de ICSI en los que algún miembro de la pareja presenta variantes cromosómicas son de peor calidad, pero este hecho noafecta a la viabilidad embrionaria. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):19-23.

Palabras clave: infertilidad, variante cromosómica, gametogénesis, calidad embrionaria.

ABSTRACT

The aim of this study is to assess whether the presence of some variant chromosome in the karyotype may affect the outcomeof ICSI cycles.

We performed a prospective study of 81 ICSI cycles performed in our center in which one partner has chromosomal variants and169 cycles of patients undergoing the same technique but with normal karyotypes. In these cycles, we have obtained theaverage of oocytes retrieved, mean mature oocytes, fertilization rate, fertilization failure rate, percentage of A-B gradeembryos transferred and pregnancy rate and abortion.

The results show that the most frequent variants are affecting chromosome 9. It is noted that there are significant differencesin the quality of embryos transferred in cycles with worsening chromosome variants. We suggest that chromosome variantsmay have an effect on gametogenesis, so that the embryos produced in these cycles of ICSI in which a partner has chromosomevariants are worst but this not affect embryonic viability. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):19-23.

Keywords: infertility, chromosomal variation, gametogenesis, embryo quality.

af.interior:Maquetaci n 1 22/06/2010 10:32 PÆgina 19

A R T Í C U L O I I

Mireia Poveda et al. Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria.

diferente tamaño, morfología ypropiedades tintoriales, pudiéndosetrasmitir a la descendencia o aparecer denovo, estimándose su incidencia de un3,12% en la población general (Bhasin,2005). Se sabe que muchos de los genesnecesarios para la viabilidadembrionaria y la fertilidad residen en laheterocromatina; es por ello que lapresencia de estas variantes se harelacionado con diferentes procesospatológicos entre los que está lainfertilidad (Madon et al., 2005;Minocherhomji et al., 2009).

Algunos estudios señalan que en casosde abortos espontáneos y en lainfertilidad idiopática, la presencia devariantes cromósomicas en uno o ambosmiembros de la pareja es más frecuente(Dubey et al., 2005). Además, estudiosrecientes han demostrado que existeuna mayor prevalencia de las anomalíascromosómicas numéricas y variantespolimórficas en pacientes sometidos aprocesos de reproducción asistida, talescomo la fecundación in vitro e inyecciónintracitoplasmática de espermatozoides(Minocherhomji et al., 2009), teniendoen estos ciclos menores tasas deembarazo e implantación (Scholtes etal., 1998). El objetivo de nuestro estudioes evaluar si la existencia en el cariotipode alguna variante cromosómica puedeafectar a los resultados de los ciclos deICSI.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha realizado un estudio prospectivode 250 ciclos de ICSI, de los cuales en 81de ellos al menos un miembro de lapareja presentaba una variantecromosómica en el cariotipo. Losresultados de estos 81 ciclos se hancomparado con 169 ciclos realizadosdesde Junio a Septiembre de 2008 depacientes no seleccionados, sometidos ala misma técnica pero con cariotiposnormales.

De los ciclos estudiados, se excluyeronlos ciclos en los que se ha utilizadosemen procedente de biopsia testiculary ciclos en los que el número de ovocitosrecuperados es menor a 3, eliminandoasí tanto el factor masculino severocomo las bajas respondedoras, en losque los fallos de fecundación son másfrecuentes.

En todos estos ciclos se han obtenido lossiguientes datos: media de ovocitosrecuperados, media de ovocitosmaduros, tasa de fecundación,porcentaje de fallos de fecundación,porcentaje de embriones de buenacalidad (grado A-B) transferidos y tasasde gestación clínica y aborto.

Se ha comparado también la presenciade variantes por sexos, con el fin deobservar si la presencia de las variantescromosómicas tiene el mismo efectosobre los ciclos de ICSI, si se presenta enel cariotipo del hombre o en el de lamujer.

Procedimiento FIV-ICSI

A todas las mujeres se les aplicó unprotocolo de hiperestimulación ováricacontrolada (HOC), siguiendo losprotocolos de estimulación largo conagonistas, con antagonistas o corto,dependiendo de la indicaciónginecológica. En todos ellos se utilizópara la estimulación ovárica medicaciónrecombinante. La ovulación fue inducidacon 10.000 UI de hCG, que se administrócuando los folículos alcanzaron undiámetro igual o mayor de 18 mm. Lapunción folicular se efectuó por víatransvaginal ecoguiada a las 36 horas dela inyección de hCG. La fase lútea fueapoyada con progesterona vía vaginal uoral, comenzando el mismo día de lapunción.

Los ovocitos recuperados fueronfecundados siguiendo el protocoloestándar, utilizando los medios decultivo comerciales Vitrolife®. Lafecundación de los ovocitos se confirmócon la presencia de dos pronúcleos y doscuerpos polares entre las 16-19 horastras la inseminación. A los embrionesprocedentes de estos ciclos, se lesrealizó un seguimiento de su evolución yaspecto morfológico desde el día de lapunción hasta el día de su transferencia(67-71 horas post-ICSI). Dependiendode su morfología y desarrollo, estosembriones fueron catalogados en cuatrocategorías siguiendo los criterios devaloración morfológica de ASEBIR(Ardoy et al., 2007).

La transferencia se realizó mediantecontrol ecográfico y dos semanasdespués se solicitó una ß-hCG para

confirmar el embarazo. Se considerógestación clínica cuando se visualizólatido cardiaco fetal.

Estudio citogenético

El estudio del cariotipo se llevó a cabo enlinfocitos de sangre periférica,cultivados a 37º C durante 72 horas endos cultivos paralelos con Chromosome(Genycell Biotech) y RPMI suplementadocon suero fetal y fitohemaglutinina.

Se analizaron un mínimo de 20metafases y se cariotiparon al menos 3metafases por caso, teñidas con bandasG (Seabright, 1971), según lasdirectrices de la ECA (EuropeanCytogeneticists Association) (Hastingset al., 2007).

Análisis estadístico

Se utilizó el test de la Chi-cuadrado dePearson para calcular la significaciónestadística de los datos y analizar lacorrelación, si la hay, entre las variablesde los grupos con variante y sin variantecromosómica. Para ello, se utilizó elprograma SPSS. Se ha considerado queexisten diferencias significativamenteestadísticas cuando p<0,05.

RESULTADOS

De los 250 ciclos de ICSI estudiados a losque se les realizó un estudiocitogenético, se encontró algunavariante polimórfica del cariotipo en 81ciclos; en tres de estos ciclos ambosmiembros de la pareja presentabanalgún tipo de variante. En éstos seobservó que las variantes cromosómicasmás frecuentes fueron las que afectan alcromosoma 9, presente en un 73% de loscasos (el 37% de los ciclos en mujeres yel 36% en hombres), siendo la variante9qh+ la que se presentó con másfrecuencia, en un 65% de los casos. Lavariante 21ps+ se presenta en un 14,3%de los ciclos en mujeres y en un 7,14% delos ciclos en hombres. El resto devariantes está en un porcentaje inferioral 10%. La distribución de los pacientesportadores de algún tipo de variantecromosómica se muestra en la Tabla I, yen la Figura 1 se identifica algunoscromosomas con variantes cromatínicas.

Los resultados de los ciclos de ICSI en

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ambos grupos, en los que hemosexcluido las bajas respondedoras y losciclos con biopsias testiculares, seobservan en la Tabla II. Estos resultadosmuestran que no existen diferenciasentre los dos grupos en cuanto a

promedio en la edad de la mujer. Lamedia de ovocitos maduros recuperadostras la punción no es significativamentemayor en los ciclos con variantescromosómicas que en los ciclos sinvariantes. A pesar de que la tasa de

fecundación es muy similar en ambosgrupos, el porcentaje de fallos defecundación es mayor, pero nosignificativo, en los ciclos en los quealguno de los miembros de la parejatiene alguna variante de la normalidadque en los ciclos con cariotiposnormales. Se observan diferenciasestadísticamente significativas en lacantidad de embriones de buena calidadtransferidos en día 3 de cultivo, de formaque los embriones obtenidos en los ciclosdonde algún miembro de la pareja tieneun cariotipo con variante cromosómicason significativamente de peor calidadque los embriones obtenidos en los ciclosdonde los progenitores tienen cariotiposnormales.

Las tasas de embarazo y aborto fueronmuy similares en ambos grupos, sinpresentar diferencias estadísticamentesignificativas.

En cuanto a los resultados obtenidos sicomparamos el efecto de las variantespor sexos, no observamos diferenciassignificativas en ningún parámetro(Tabla III).

DISCUSIÓN

El resultado más importante delpresente trabajo es que las variantescromosómicas tienen relación directacon la calidad embrionaria, si bien estehecho parece no afectar a la viabilidaddel embrión.

Se sabe que los factores genéticos tienenun papel muy importante en laesterilidad (Matzuk et al., 2008). Lasrazones genéticas de la infertilidad soncomplejas y tienen distintasconsecuencias. Estas causas pueden sercromosómicas, monogénicas omultifactoriales, y pueden afectar acualquier etapa del desarrolloembrionario (Shah et al., 2003).

Está bien establecido el papel que lasalteraciones cromosómicas juegan en lainfertilidad, y su diagnóstico (Duzcan etal., 2003); sin embargo, el efecto de lasvariantes cromosómicas está lejos deaclararse, habiéndose convertido en uncampo de controversia en citogenéticaclínica reproductiva (Madon et al.,2005). Existen autores que concluyenque las variantes cromosómicas no

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Figura 1. Diferentes tipos de variantes que implican a distintos cromosomas.

Tabla I. Distribución de los pacientes portadores de variantes cromosómicas.

Tabla II. Resultado de los ciclos de ICSI. En ambos grupos se han eliminado bajas respondedoras (menos de3 ovocitos recuperados) y ciclos con sémenes de biopsias.*P<0.05



Mireia Poveda et al. Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria.

tienen efectos fenotípicos y, por otrolado, también hay un númeroconsiderable de publicaciones queaportan datos en sentido contrario(Madon et al., 2005; Gardner et al.,2004; Wyandt et al., 2004).

En los últimos años, varios estudios hananalizado la relación de las alteracionescromosómicas y la infertilidad(Nakamura et al., 2001). En alguno deestos estudios se ha visto que lasvariantes cromosómicas se encuentranen una frecuencia más elevada enpacientes infértiles que en la poblacióngeneral (Yakin et al., 2005; Madon et al.,2005; Rueda et al., 2007). De hecho, ennuestro medio hemos observado quesobre un 12% de los pacientes queacuden a consulta de reproducción porfallo reproductivo presentan algún tipode variante cromosómica (Rueda et al.,2007). Se ha observado que lasvariantes polimórficas en loscromosomas 1, 9, 16, y en el cromosomaY son más frecuentes en la personasinfértiles que en la población general(Madon et al., 2005), habiéndosesugerido que la presencia de estasvariantes en uno o ambos miembros dela pareja podría incrementar lafrecuencia de abortos de repetición einfertilidad idiopática (Dubey et al.,2005). La mayor parte de datos indicanque la variante cromosómica másfrecuente, con gran diferencia, afecta alcromosoma 9, como así observamos

también en el presente estudio.

Se sabe que la región pericéntrica delcromosoma 9 situada entre las regiones9p11-12 y 9q11-12/13 es rica enheterocromatina en la que abundanrepeticiones de DNA satélite. Lasecuenciación del DNA y la cartografíadel cromosoma 9 ha permitidodemostrar, recientemente, que estecromosoma es estructuralmente muypolimórfico y contiene la región máslarga de heterocromatina que hay en losseres humanos (Humphray et al., 2004).Es necesario analizar estudiosmoleculares genéticos y análisisepigenéticos de las regionesheterocromáticas para ver si puedenafectar a genes vecinos implicados eninfertilidad.

Al comparar los ciclos de ICSI en los queal menos un miembro de la parejapresentaba alguna variantecromosómica en el cariotipo con losciclos en los que los cariotipos de ambosprogenitores son normales, observamosque no existen diferencias significativasentre los dos grupos en cuanto a la tasade fecundación y los fallos defecundación. Tampoco hay diferencias enla tasa de embarazo, pero, sin embargo,la calidad de los embriones que setransfieren empeora en los ciclos convariantes cromosómicas, y, a pesar deque la tasa de aborto no essignificativamente mayor en los ciclos

con variantes, si hay una tendencia aque ésta sea mayor cuando los cariotiposestán alterados. El empeoramiento de lacalidad embrionaria cuando algúnmiembro de la pareja presenta variantespolimórficas en el cariotipo nos lleva apensar en la presencia de algunaalteración en los gametos y, de hecho,un número significativo de los varonescon variantes cromosómicas tienen unascifras de aneuploidias por encima de lonormal (Rueda et al., 2007), lo quesugiere que las variantes cromosómicaspodrían tener un efecto sobre la meiosis.Varios estudios han demostrado que lapresencia de variantes cromosómicasestá relacionada con la alteración de laespermatogénesis (Kayhan et al., 2005),observándose que estas variantes sonmás frecuentes en pacientes conoligozoospermia severa o azoospermiaque en pacientes con oligozoospermialeve o normozoospermia (Riccaboni etal., 2008).

A pesar de la alta incidencia de variantescromosómicas en pacientes infértiles,está lejos de dilucidarse su mecanismode acción. Es más, el presente estudiopone de manifiesto que cuando losgametos de los portadores de variantesse emplean para ICSI, a pesar de la peorcalidad embrionaria, no hay efectossobre la viabilidad del embrión.

Recientemente, se ha demostrado quelas variantes cromosómicas no tienenrelación con los abortos de repetición,pero sí con la infertilidad primaria(Minocherhomji et al., 2009). Datos denuestro grupo indican que las parejascon algún miembro con cariotipoportador de variante del cromosoma 9tienen peores tasas de fecundación quelos pacientes con cariotipos normalescuando se hace IA (Ochando et al.,2007), hecho que no ocurre cuando es laICSI la técnica empleada.

Parece pues, que los pacientesportadores de variantes cromosómicasoriginan una mayor tasa de gametos conanomalías posiblemente implicadas enel reconocimiento celular pero que, unavez producida la fecundación, laafectación sobre la viabilidad delembrión sería mínima. La conclusiónprincipal de nuestro trabajo es que losportadores de variantes cromosómicas,se beneficiarían de la técnica ICSI; por

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Tabla III.Resultados de los ciclos de ICSI. Distribución por sexos.




ello, es fundamental destacar laimportancia del estudio citogenéticocomo parte del diagnóstico de la parejacon fallo reproductivo, y de los donantesde gametos.

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